CN108196053A - 一种捕获白细胞的微流体装置及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是捕获白细胞的微流体装置及其制造方法，其结构包括样品信道和支撑主体，样品信道内壁上沉积有若干岛型微纳米金结构。其制造方法，包括：一、微流体通道的制作；二、纳米金岛的生成；三、纳米金岛的生物功能化修饰。本发明的优点：样品信道通过化学修饰使其表面具有微纳米结构，强化细胞表面接触能力，信道表面生物功能化，通过简易特异性生物功能化修饰，可在短时间内在目标样品中以不伤害细胞生物特征的方式有效减少白细胞数量约45％，同时保证了目标细胞活性和目标细胞纯度，且通过大量减低样品中白细胞数量，使后续少量细胞纯化芯片更容易发挥效用，提升了少量细胞纯化效率，大大提升后续分子分析可行性，满足后续各种基因检测需求。

Description

一种捕获白细胞的微流体装置及其制造方法
技术领域
本发明涉及的是一种捕获白细胞的微流体装置及其制造方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)目前为液态检体(Liquidbiopsy)的常用指针研究对象之一，学术界与产业界在近几年纷纷投入大量人力物力于液体活检的研究中，许多新创公司也因此而兴起。然而，捕捉循环肿瘤细胞相较于捕捉循环肿瘤DNA在技术上仍然较为困难，其中一个较大的难题即为捕获肿瘤细胞的纯度不足。
现有技术在检测临床样本中的循环肿瘤细胞的纯化过程中，遇到最常见的问题就是白细胞的污染细胞(血液中白细胞的数量为106个/mL)从而导致捕获的循环肿瘤细胞纯度不足，造成了下游分子分析的困难。现有技术的纯化方式，会先对外周血做梯度离心，再借助抗体富集或粒径分选等手段从提取的外周血单核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)中纯化出循环肿瘤细胞，该方法虽然能大幅减少红细胞的干扰，但是白细胞的数量依然非常多，循环肿瘤细胞的纯度依旧不足，即使目前商业化的分子扩增工具已经十分丰富，循环肿瘤细胞的下游分子分析依然是个挑战。
发明内容
本发明提出的是一种捕获白细胞的微流体装置及其制造方法，其目的旨在克服现有循环肿瘤细胞纯化技术存在的上述不足，在对诸如循环肿瘤细胞这一类外周血中的稀有细胞进行富集和捕获之前，选择性得去除掉大部分白细胞，以确保后续获得的循环肿瘤细胞纯度更适合后续的分子分析。
本发明的技术解决方案：一种捕获白细胞的微流体装置，其结构包括样品信道和支撑主体，样品信道是整体呈螺旋形的聚乙烯圆管，样品信道一端设辨识信道入口，样品信道另一端设辨识信道出口，样品信道外侧与支撑主体固定连接，样品信道内壁上沉积有若干岛型微纳米金结构，所述的岛型微纳米金结构经过生物溶液的生物功能化修饰反应；所述的生物溶液为浓度0.1-50uM的可辨识白细胞表面抗原的抗体、适体或短胜肽溶液。
优选的，所述的生物溶液为浓度0.1-50uM的Anti-CD45抗体溶液于新鲜PBS或浓度0.1-50uM的适体溶液于新鲜PBS。
一种捕获白细胞的微流体装置的制造方法，该方法包括以下步骤：
一、微流体通道的制作
取一聚乙烯圆管围成螺旋管，作为样品信道,样品信道一端为辨识信道入口，另一端为辨识信道出口，构成微流体通道，样品信道外侧与支撑主体固定连接；
二、纳米金岛的生成
1)以去离子水于室温下清洗管道，室温干燥1h，
2)先以1-20mM的HAuCl4去离子水溶液于室温下浸润管道5-20min，
3)再以1-20mM的NaBH4去离子水溶液于室温下浸润管道5-20min，并以40-100rpm摇匀，
4)接着以1-20mM的HAuCl4去离子水溶液与1-20mM的氨水的体积比为1:1的混和溶液浸润管道，于室温下反应20-120min并以60-100rpm摇晃，使管道内沉积出岛型微纳米金结构，即纳米金岛，反应后使用去离子水于室温下充分洗涤；
三、纳米金岛的生物功能化修饰
1)以300uL的新鲜PBS 0.1-2.0mL/hr流速于室温下润洗管道内的岛型微纳米金结构,
2)新鲜制备生物溶液待用，即浓度为0.1-50uM的可辨识白细胞表面抗原的抗体、适体或短胜肽溶液，
3)将制备的生物溶液注于具有岛型微纳米金结构的管道中，于室温下停留时间30-120min，进行生物功能化修饰反应,
4)反应完后，以新鲜PBS于室温下清洗生物功能化修饰反应后的具有岛型微纳米金结构的管道2次，即得到捕获白细胞的微流体装置。
优选的，所述的步骤三2)新鲜制备生物溶液中的生物溶液为浓度0.1-50uM的Anti-CD45抗体溶液于新鲜PBS或浓度0.1-50uM的适体溶液于新鲜PBS。
一种捕获白细胞的微流体装置的使用方法，将待纯化样品从辨识信道入口注入样品信道中，经由正压或者负压的方式将样品流经本样品信道，流速为0.1-5mL/hr，在辨识信道出口处，将纯化后的细胞溶液以微量离心管收集，或直接连接到少量细胞纯化系统，进行进一步的微量细胞捕捉。
本发明的优点：本发明捕获白细胞的微流体装置的样品信道通过化学修饰使其表面具有微纳米结构，以强化细胞的表面接触能力，且信道表面生物功能化，使用本发明捕获白细胞的微流体装置，与现有技术相比，虽然操作时间略长十五分钟，但是通过其简易的特异性生物功能化修饰，可在短时间内在目标样品中以不伤害细胞生物特征的方式有效减少白细胞的数量约45％，同时保证了目标细胞的活性和目标细胞的纯度，且通过大量减低样品中白细胞数量，使后续的少量细胞纯化芯片更容易发挥效用，提升了少量细胞的纯化效率，大大提升了后续分子分析的可行性，满足后续各种基因检测的需求。
附图说明
图1是本发明捕获白细胞的微流体装置的结构示意图。
图中的1是样品信道、2是辨识信道入口、3辨识信道出口、4是支撑主体。
具体实施方式
下面结合实施例和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
如图1所示，一种捕获白细胞的微流体装置，其结构包括样品信道1和支撑主体4，样品信道1是整体呈螺旋形的聚乙烯圆管，样品信道1一端设辨识信道入口2，样品信道1另一端设辨识信道出口3，样品信道1外侧与支撑主体4固定连接，样品信道1内壁上沉积有若干岛型微纳米金(Au)结构，所述的岛型微纳米金结构经过生物溶液的生物功能化修饰反应。
所述的生物溶液为浓度0.1-50uM的可辨识白细胞表面抗原的任何抗体(antibody)、适体(aptamer)或短胜肽(peptide)溶液。
比如，所述的生物溶液可优选为浓度0.1-50uM的Anti-CD45抗体溶液于新鲜PBS(磷酸盐缓冲液)或浓度0.1-50uM的适体溶液于新鲜PBS。
一种捕获白细胞的微流体装置的制造方法，该方法包括以下步骤：
一、微流体通道的制作
取一聚乙烯圆管围成螺旋管，取适当管长，作为样品信道,样品信道一端为辨识信道入口，另一端为辨识信道出口，构成微流体通道，样品信道外侧与支撑主体固定连接；
二、纳米金岛的生成
1)以去离子水(deionized water,DI water)于室温下清洗管道，室温干燥1h，
2)先以1-20mM的HAuCl4(四氯金酸)去离子水溶液于室温下浸润管道5-20min，
3)再以1-20mM的NaBH4(硼氢化钠)去离子水溶液于室温下浸润管道5-20min，并以40-100rpm摇匀，
4)接着以1-20mM的HAuCl4去离子水溶液与1-20mM的氨水的体积比为1:1的混和溶液浸润管道，于室温下反应20-120min并以60-100rpm摇晃，使管道内沉积出岛型微纳米金结构，即纳米金岛，反应后使用去离子水于室温下充分洗涤；
三、纳米金岛的生物功能化修饰
1)以300uL的新鲜PBS 0.1-5mL/hr流速于室温下润洗管道内的岛型微纳米金结构,
2)新鲜制备生物溶液待用，即浓度0.1-50uM的可辨识白细胞表面抗原的任何抗体、适体或短胜肽溶液，比如浓度0.1-50uM的Anti-CD45抗体溶液于新鲜PBS或浓度0.1-50uM的适体溶液于新鲜PBS，
3)将制备的生物溶液注于具有岛型微纳米金结构的管道中，于室温下停留时间30-120min，进行生物功能化修饰反应,
4)反应完后，以新鲜PBS于室温下清洗生物功能化修饰反应后的具有岛型微纳米金结构的管道2次，即得到捕获白细胞的微流体装置。(为降低非特异性吸附，修饰后的芯片应该考虑包被，用BSA或者带巯基的蛋白或者巯基乙醇。)
本捕获白细胞的微流体装置在使用时，将待纯化样品(全血或PBMC)从辨识信道入口注入样品信道中，经由正压或者负压的方式将样品流经本样品信道，流速为0.1-5mL/hr，视样品情况而定。在辨识信道出口处，可用不同的方式收集细胞：可将纯化后的细胞溶液以微量离心管收集，也可直接连接到少量细胞纯化系统，进行进一步的微量细胞捕捉。
实施例1
一种捕获白细胞的微流体装置的制造方法，该方法包括以下步骤：
一、微流体通道的制作
取一聚乙烯圆管围成螺旋管，取30公分管长，作为样品信道,样品信道一端为辨识信道入口，另一端为辨识信道出口，构成微流体通道，样品信道外侧与支撑主体固定连接；
二、纳米金岛的生成
1)以去离子水于室温下清洗管道，室温干燥1h，
2)先以5mM的HAuCl4去离子水溶液于室温下浸润管道5min，
3)再以5mM的NaBH4去离子水溶液于室温下浸润管道5min，并以40rpm摇匀，
4)接着以2mM的HAuCl4去离子水溶液与2mM的氨水的体积比为1:1的混和溶液浸润管道，于室温下反应20min并以60rpm摇晃，使管道内沉积出岛型微纳米金结构，即纳米金岛，反应后使用去离子水于室温下充分洗涤；
三、纳米金岛的生物功能化修饰
1)以300uL的新鲜PBS 0.5mL/hr流速于室温下润洗管道内的岛型微纳米金结构,
2)新鲜制备生物溶液待用，即50uM的500uL Anti-CD45抗体溶液于PBS,
3)将制备的生物溶液注于具有岛型微纳米金结构的管道中，于室温下停留时间30min，进行生物功能化修饰反应,
4)反应完后，以新鲜PBS于室温下清洗生物功能化修饰反应后的具有岛型微纳米金结构的管道2次，即得到捕获白细胞的微流体装置。
本捕获白细胞的微流体装置在使用时，将待纯化样品全血从辨识信道入口注入样品信道中，经由正压的方式将样品流经本样品信道，流速为0.5mL/hr。在辨识信道出口处，将纯化后的细胞溶液以微量离心管收集，进行进一步的微量细胞捕捉。
实施例2
一种捕获白细胞的微流体装置的制造方法，该方法包括以下步骤：
一、微流体通道的制作
取一聚乙烯圆管围成螺旋管，取50公分的管长，作为样品信道,样品信道一端为辨识信道入口，另一端为辨识信道出口，构成微流体通道，样品信道外侧与支撑主体固定连接；
二、纳米金岛的生成
1)以去离子水于室温下清洗管道，室温干燥1h，
2)先以10mM的HAuCl4去离子水溶液于室温下浸润管道5min，
3)再以10mM的NaBH4去离子水溶液于室温下浸润管道5min，并以50rpm摇匀，
4)接着以5mM的HAuCl4去离子水溶液与5mM的氨水的体积比为1:1的混和溶液浸润管道，于室温下反应20min并以100rpm摇晃，使管道内沉积出岛型微纳米金结构，即纳米金岛，反应后使用去离子水于室温下充分洗涤；
三、纳米金岛的生物功能化修饰
1)以300uL的新鲜PBS 2.0mL/hr流速于室温下润洗管道内的岛型微纳米金结构,
2)新鲜制备生物溶液待用，即50uM的500uL适体溶液于PBS,
3)将制备的生物溶液注于具有岛型微纳米金结构的管道中，于室温下停留时间30min，进行生物功能化修饰反应,
4)反应完后，以新鲜PBS于室温下清洗生物功能化修饰反应后的具有岛型微纳米金结构的管道2次，即得到捕获白细胞的微流体装置。
本捕获白细胞的微流体装置在使用时，将待纯化样品PBMC从辨识信道入口注入样品信道中，经由者负压的方式将样品流经本样品信道，流速为1.0mL/hr。在辨识信道出口处，直接连接到少量细胞纯化系统，进行进一步的微量细胞捕捉。
实施例3
一种捕获白细胞的微流体装置的制造方法，该方法包括以下步骤：
一、微流体通道的制作
取一聚乙烯圆管围成螺旋管，取40公分的管长，作为样品信道,样品信道一端为辨识信道入口，另一端为辨识信道出口，构成微流体通道，样品信道外侧与支撑主体固定连接；
二、纳米金岛的生成
1)以去离子水于室温下清洗管道，室温干燥1h，
2)先以15mM的HAuCl4去离子水溶液于室温下浸润管道5min，
3)再以15mM的NaBH4去离子水溶液于室温下浸润管道5min，并以80rpm摇匀，
4)接着以10mM的HAuCl4去离子水溶液与10mM的氨水的体积比为1:1的混和溶液浸润管道，于室温下反应20min并以75rpm摇晃，使管道内沉积出岛型微纳米金结构，即纳米金岛，反应后使用去离子水于室温下充分洗涤；
三、纳米金岛的生物功能化修饰
1)以300uL的新鲜PBS 1.0mL/hr流速于室温下润洗管道内的岛型微纳米金结构,
2)新鲜制备生物溶液待用，即50uM的200uL Anti-CD45短胜肽溶液于PBS,
3)将制备的生物溶液注于具有岛型微纳米金结构的管道中，于室温下停留时间30min，进行生物功能化修饰反应,
4)反应完后，以新鲜PBS于室温下清洗生物功能化修饰反应后的具有岛型微纳米金结构的管道2次，即得到捕获白细胞的微流体装置。
本捕获白细胞的微流体装置在使用时，将待纯化样品全血从辨识信道入口注入样品信道中，经由正压的方式将样品流经本样品信道，流速为1mL/hr。在辨识信道出口处，将纯化后的细胞溶液以微量离心管收集，进行进一步的微量细胞捕捉。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种捕获白细胞的微流体装置，其特征包括样品信道(1)和支撑主体(4)，样品信道(1)是整体呈螺旋形的聚乙烯圆管，样品信道(1)一端设辨识信道入口(2)，样品信道(1)另一端设辨识信道出口(3)，样品信道(1)外侧与支撑主体(4)固定连接，样品信道(1)内壁上沉积有若干岛型微纳米金结构，所述的岛型微纳米金结构经过生物溶液的生物功能化修饰反应；所述的生物溶液为浓度0.1-50uM的可辨识白细胞表面抗原的抗体、适体或短胜肽溶液。
2.如权利要求1所述的一种捕获白细胞的微流体装置，其特征是所述的生物溶液为浓度0.1-50uM的Anti-CD45抗体溶液于新鲜PBS或浓度0.1-50uM的适体溶液于新鲜PBS。
3.如权利要求1所述的一种捕获白细胞的微流体装置的制造方法，其特征是该方法包括以下步骤：
一、微流体通道的制作
取一聚乙烯圆管围成螺旋管，作为样品信道,样品信道一端为辨识信道入口，另一端为辨识信道出口，构成微流体通道，样品信道外侧与支撑主体固定连接；
二、纳米金岛的生成
1)以去离子水于室温下清洗管道，室温干燥1h，
2)先以1-20mM的HAuCl4去离子水溶液于室温下浸润管道5-20min，
3)再以1-20mM的NaBH4去离子水溶液于室温下浸润管道5-20min，并以40-100rpm摇匀，
4)接着以1-20mM的HAuCl4去离子水溶液与1-20mM的氨水的体积比为1:1的混和溶液浸润管道，于室温下反应20-120min并以60-100rpm摇晃，使管道内沉积出岛型微纳米金结构，即纳米金岛，反应后使用去离子水于室温下充分洗涤；
三、纳米金岛的生物功能化修饰
1)以300uL的新鲜PBS 0.1-2.0mL/hr流速于室温下润洗管道内的岛型微纳米金结构,
2)新鲜制备生物溶液待用，即浓度为0.1-50uM的可辨识白细胞表面抗原的抗体、适体或短胜肽溶液，
3)将制备的生物溶液注于具有岛型微纳米金结构的管道中，于室温下停留时间30-120min，进行生物功能化修饰反应,
4)反应完后，以新鲜PBS于室温下清洗生物功能化修饰反应后的具有岛型微纳米金结构的管道2次，即得到捕获白细胞的微流体装置。
4.如权利要求3所述的一种捕获白细胞的微流体装置的制造方法，其特征是所述的步骤三2)新鲜制备生物溶液中的生物溶液为浓度0.1-50uM的Anti-CD45抗体溶液于新鲜PBS或浓度0.1-50uM的适体溶液于新鲜PBS。
5.如权利要求1或2所述的一种捕获白细胞的微流体装置的使用方法，其特征是将待纯化样品从辨识信道入口注入样品信道中，经由正压或者负压的方式将样品流经本样品信道，流速为0.1-5mL/hr，在辨识信道出口处，将纯化后的细胞溶液以微量离心管收集，或直接连接到少量细胞纯化系统，进行进一步的微量细胞捕捉。
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