TWI724639B - 樹脂-白金複合體、標記物質、免疫學測定法、免疫學測定用試劑、分析物的測定方法、用以對分析物進行檢測或定量的分析物測定用套組、側向流型層析用測試條 - Google Patents
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Abstract
本發明的樹脂-白金複合體100包括樹脂粒子10及白金粒子20,且將白金粒子20固定於樹脂粒子10上。樹脂-白金複合體100中,白金粒子20的一部分可於樹脂粒子10的表層部60中三維地分佈。於該情形時,三維地分佈的白金粒子20的一部分可局部地於樹脂粒子10外露出,其餘的一部分可內包於樹脂粒子10內。白金粒子20中,較佳為存在完全內包於樹脂粒子10內的內包粒子30、具有包埋於樹脂粒子10內的部位及於樹脂粒子10外露出的部位的局部露出粒子40、及吸附於樹脂粒子10的表面的表面吸附粒子50。
Description
本發明是有關於一種例如可較佳地用於免疫學測定等用途中的樹脂-白金複合體及利用其的標記物質、免疫學測定法、免疫學測定用試劑、分析物(analyte)的測定方法、分析物測定用套組及側向流(lateral flow)型層析用測試條(test strip)。
於生物體內存在無數種化學物質,因此對生物體內的特定微量成分進行定性、定量分析是極為重要的技術。於醫療、製藥、健康食品、生物科技(biotechnology)、環境等領域中,僅作用於生物體內的特定部位(化學物質)的藥品及食品、檢測生物體的略微變化的分析裝置及診斷劑等與所述技術一併發展。
關於所述分析技術之一,有免疫分析(immunoassay)。其亦被稱為免疫學測定法,為利用作為免疫反應之一的抗原-抗體間的特異性反應而對微量成分進行定性、定量分析的方法。抗原-抗體間反應由於感度或反應的選擇性高,故於所述領域中被廣泛地使用。免疫分析根據其測定原理而有各種測定法。例如可列舉:酵素免疫測定法(Enzyme immunoassay,EIA)、放射性免疫測定法(Radio immunoassay,RIA)、化學發光免疫測定法(Chemiluminescent immunoassay,CLIA)、螢光免疫測定法(Fluorescent Immunoassay,FIA)、乳膠(latex)等的凝集法(乳膠凝集(Latex agglutination,LIA)、顆粒凝集(Particle agglutination,PA))、免疫層析法(Immunochromatography assay,ICA)、紅血球凝集法(Hemagglutination,HA)、紅血球凝集抑制法(Hemagglutination inhibiion,HI)等。再者,除了免疫分析以外,有物理/化學測定法、生物學測定法等。
免疫分析中,根據抗原及抗體反應而形成複合體時的變化(抗原、抗體或複合體的濃度變化),來對抗原或抗體進行定性或定量檢測。於檢測該些物質時,藉由使標記物質與抗體、抗原或複合體結合,檢測感度增大。
因此,標記物質的標記能力可謂是影響免疫分析的檢測能力的重要的要素。於所述例示的免疫分析中,可使用紅血球(HA的情形)、乳膠粒子(LIA的情形)、螢光色素(FIA的情形)、放射性元素(RIA的情形)、酵素(EIA的情形)、化學發光物質(CLIA的情形)等作為標記物質。
再者,於使用經著色的微粒子作為標記物質的情形時,不使用特殊的分析裝置便可藉由目測來確認檢出,故期待可進行更簡便的測定。此種經著色的微粒子可列舉金屬及金屬氧化物的膠體狀粒子、經色素著色的乳膠粒子等(專利文獻1、專利文獻4等)。然而,所述膠體狀粒子是藉由粒徑及製備條件來決定色調,故存在以下問題:難以獲得所需的鮮豔的深色調,即視認性不充分。
另外,所述經著色的乳膠粒子存在以下問題:由色素所得的著色的效果低,目測判定性不充分。再者,若為了解決該問題而欲增加色素的著色量,則存在以下問題:色素將乳膠的表面覆蓋,乳膠粒子原本的表面狀態受損,故難以使抗原或抗體結合。另外,亦存在以下問題:於薄膜過濾器等層析介質的孔隙內發生堵塞;或乳膠粒子發生非特異凝集;或雖藉由增加色素的著色料而深深地著色,但未必與性能的提昇有關。
為了提高所述標記物質的視認性,揭示有如下的免疫層析方法:於結合有標記物質的抗體(標記抗體)與抗原反應而形成複合體後,進一步使其他金屬對該些標記物質進行修飾,由此使標記物質的檢測感度增幅(專利文獻2及專利文獻5)。然而,該方法操作煩雜,難以穩定地增幅。另外,需要特殊裝置等而耗費測定成本,因此認為可應用的用途及使用環境受到限定。
另外,揭示有一種著色乳膠,其包含結合於聚合物系乳膠粒子的表面的金奈米粒子(專利文獻3)。
藉由使金奈米粒子結合於聚合物系乳膠粒子的表面,該金奈米粒子自身作為著色劑而於目測判定性或檢測感度的提高方面發揮作用,另一方面,金奈米粒子自身對抗原或抗體的結合性亦優異,因此即便使金奈米粒子結合直至成為充分的深色的程度,亦可使充分量的抗原或抗體結合。
所述著色乳膠是對苯乙烯-丙烯酸共聚物乳膠及作為金奈米粒子的前驅物的HAuCl的分散液照射γ射線,由此使金奈米粒子結合於所述乳膠的表面而成。然而,所述著色乳膠是使金奈米粒子僅於乳膠的表面結合,因此表現出表面電漿子共振的金粒子的擔載量有限,而且金奈米粒子容易脫離。結果,有作為免疫學測定用試劑的視認性或感度不充分之虞。另外,因照射γ射線等電磁放射線,故有對乳膠造成損傷之虞。進而,專利文獻3的說明書中,揭示有所述乳膠徑或金奈米粒徑的較佳範圍,但並未表明是否於實施例中於該些較佳範圍內進行了驗證,並非較佳範圍的規定的依據。
另外,於專利文獻4中揭示有一種經金屬金被覆的聚合物乳膠粒子,且啟示了將其應用於顯微鏡檢查法及免疫分析法中可利用的試劑。
然而,關於所述經金屬金被覆的聚合物乳膠粒子,並未揭示聚合物乳膠粒子的材質或粒徑。進而,關於作為免疫分析法中可利用的試劑的效果,並無驗證。因此,金屬金及聚合物乳膠粒子的作為試劑的效果不明。
另外,於非專利文獻1中揭示有一種使聚-2-乙烯基吡啶乳膠粒子上擔載金奈米粒子而成的微凝膠,且根據金奈米粒子的定域型表面電漿子共振的行為的變化而確認了微凝膠的粒徑的pH響應性。然而,所述微凝膠中,於所述乳膠粒子的表層附近以單層而擔載有金奈米粒子。因此,可認為金奈米粒子的擔載量少,無法獲得對於免疫分析而言有效的深色調。另外,並未對微凝膠的材質、結構、組成等進行研究,對免疫學測定試劑等具體用途的效果不明。
根據以上內容,雖期待將結合或被覆有金奈米粒子的乳膠粒子作為免疫學測定用的試劑,但於現有的技術中,耐久性或視認性不充分。另外,即便視認性高,可應用的用途及使用環境亦受到限定。
現有技術文獻 專利文獻
專利文獻1:日本專利特開平5-10950號公報
專利文獻2:日本專利特開2011-117906號公報
專利文獻3:日本專利特開2009-168495號公報
專利文獻4:日本專利特開平3-206959號公報
專利文獻5:日本專利特開2009-192270號公報
非專利文獻
非專利文獻1:K.赤松(K. Akamatsu)、M.島田(M. Shimada)、T.鶴崗(T. Tsuruoka)、H.繩舟(H. Nawafune)、S.藤井(S. Fujii)及Y.中村(Y. Nakamura);「朗謬(Langmuir)」,2010,26,1254-1259
[發明所欲解決之課題]
為了將樹脂-金屬複合體用作免疫學測定中的標記物質,必須使其穩定地結合於抗體等配體(ligand)。然而,於藉由樹脂-金屬複合體來標記配體的情形時,即便可形成穩定的結合狀態,亦未必可獲得優異的檢測感度。例如,微細的樹脂-金屬複合體容易發生凝集。若發生凝集,則不僅操作性大幅度地降低,而且有時作為標記物質的樹脂-金屬複合體的濃度產生不均,檢測感度大幅度地降低。
本發明的目的在於提供一種於與抗體等配體結合的狀態下不易發生凝集、操作性優異的樹脂-金屬複合體,例如本發明的目的在於提供一種於免疫學測定中可進行高感度的判定的免疫學測定用樹脂-金屬複合體。
[用以解決課題之手段]
本發明者等人進行了潛心研究,結果發現,藉由將多個白金粒子固定於樹脂粒子上而成的樹脂-白金複合體可解決所述課題,從而完成了本發明。
即,本發明的樹脂-白金複合體包括樹脂粒子、及與所述樹脂粒子相比而較小的多個白金粒子,且將多個所述白金粒子固定於所述樹脂粒子上。
本發明的樹脂-白金複合體中,所述白金粒子中的至少一部分粒子可於所述樹脂粒子的表層部中三維地分佈。於該情形時,多個所述白金粒子的60 wt%~100 wt%可存在於所述表層部中。
於本發明的樹脂-白金複合體中,所述白金粒子可不於所述樹脂粒子的徑向上重合而固定於該樹脂粒子的表面。
本發明的樹脂-白金複合體中,所述白金粒子的平均粒徑可為1 nm~80 nm的範圍內。於該情形時,樹脂-白金複合體的平均粒徑可為50 nm~1000 nm的範圍內。
本發明的樹脂-白金複合體中,較佳為所述白金粒子的平均粒徑為1 nm~50 nm的範圍內,更佳為1 nm~30 nm的範圍內,最佳為1 nm~15 nm的範圍內。於該些情形時,樹脂-白金複合體的平均粒徑較佳為100 nm~600 nm的範圍內。
本發明的樹脂-白金複合體中,相對於樹脂-白金複合體的重量,所述白金粒子的擔載量可為5 wt%~70 wt%的範圍內。
本發明的樹脂-白金複合體中,所述樹脂粒子可為於結構中具有可吸附白金離子的取代基的聚合物粒子。
本發明的標記物質包括所述任一種樹脂-白金複合體。於該情形時,可使抗原或抗體吸附於所述樹脂-白金複合體的表面而使用。
本發明的免疫學測定法使用所述任一種標記物質。
本發明的免疫學測定用試劑包括所述任一種樹脂-白金複合體。
本發明的分析物的測定方法為對試樣中所含的分析物進行檢測或定量的方法。該分析物的測定方法的特徵在於:使用側向流型層析用測試條來進行包括下述步驟(I)~步驟(III)的步驟,其中所述側向流型層析用測試條含有薄膜(membrane)、及將與所述分析物特異地結合的捕捉配體固定於該薄膜上而成的判定部;
步驟(I):使試樣所含的所述分析物與標記抗體接觸的步驟,其中所述標記抗體是以所述任一種樹脂-白金複合體將與該分析物特異地結合的抗體標記而成;
步驟(II):於所述判定部中,使步驟(I)中形成的含有分析物及標記抗體的複合體與捕捉配體接觸的步驟;
步驟(III):對所述樹脂-白金複合體的定域型表面電漿子共振、及來源於由電子遷移所致的光能吸收的顯色強度進行測定的步驟。
本發明的分析物測定用套組為使用側向流型層析用測試條,而用以對試樣中所含的分析物進行檢測或定量的分析物測定用套組。該分析物測定用套組包含:側向流型層析用測試條,含有薄膜、及將與所述分析物特異地結合的捕捉配體固定於該薄膜上而成的判定部;以及檢測試劑,含有標記抗體,該標記抗體是以所述任一種樹脂-白金複合體將與所述分析物特異地結合的抗體標記而成。
本發明的側向流型層析用測試條是用以對試樣中所含的分析物進行檢測或定量。該側向流型層析用測試條含有:薄膜;判定部,其是於所述試樣展開的方向上,將與所述分析物特異地結合的捕捉配體固定於所述薄膜上而成;以及反應部,位於較該判定部更靠上游側,且含有標記抗體,該標記抗體是以所述任一種樹脂-白金複合體將與所述分析物特異地結合的抗體標記而成。
[發明的效果]
本發明的樹脂-白金複合體例如與抗體等配體結合的狀態下的分散性優異,不易發生凝集。另外,本發明的樹脂-白金複合體具有將多個白金粒子固定於樹脂粒子上而成的結構,故白金粒子的擔載量多,另外,白金粒子不易自樹脂粒子脫離。另外,白金粒子除了定域型表面電漿子共振以外,表現出由電子遷移所致的光能吸收。因此,本發明的樹脂-白金複合體可作為操作性、耐久性、視認性、目測判定性、檢測感度優異的材料,以例如EIA、RIA、CLIA、FIA、LIA、PA、ICA、HA、HI等的免疫學測定用標記物質、免疫學測定用試劑、醫藥、固體觸媒、顏料、塗料、導電性材料、電極、感測器元件等目的而較佳地應用。於將本發明的樹脂-白金複合體用於免疫學測定的情形時,操作性、耐久性及視認性優異,且無需追加特殊的裝置或作業步驟便可進行高感度的判定。
以下,一面適當參照圖式,一面對本發明的實施形態加以詳細說明。圖1為本發明的一實施形態的樹脂-白金複合體的剖面示意圖。樹脂-白金複合體100包括樹脂粒子10及白金粒子20。樹脂-白金複合體100中,將白金粒子20固定於樹脂粒子10上。樹脂粒子10為與白金粒子20相比而較大的粒子。即,樹脂-白金複合體100中,於大的樹脂粒子10上固定有相對較小的多數個白金粒子20。如圖1所示,樹脂-白金複合體100總體的粒徑D1、樹脂粒子10的粒徑D2及白金粒子20的粒徑D3的關係為D1>D2>D3。
另外,樹脂-白金複合體100中,白金粒子20的一部分可於樹脂粒子10的表層部60中三維地分佈。於該情形時,三維地分佈的白金粒子20的一部分可局部地於樹脂粒子10外露出,且其餘一部分可內包於樹脂粒子10內。具體而言,如圖1所示,白金粒子20中,較佳為存在完全內包於樹脂粒子10內的白金粒子(以下亦稱為「內包粒子30」)、具有包埋於樹脂粒子10內的部位及於樹脂粒子10外露出的部位的白金粒子(以下亦稱為「局部露出粒子40」)、及吸附於樹脂粒子10的表面的白金粒子(以下亦稱為「表面吸附粒子50」)。
例如於將樹脂-白金複合體100用於免疫學測定用標記物質或免疫學測定用試劑的情形時,將抗體或抗原固定於樹脂粒子10的表面或局部露出粒子40或表面吸附粒子50的表面而使用。此時,於局部露出粒子40及表面吸附粒子50上固定有所述抗體或抗原,另一方面,並未固定於內包粒子30上。然而,局部露出粒子40、表面吸附粒子50及內包粒子30均除了定域型表面電漿子共振以外,表現出由電子遷移所致的光能吸收,因此不僅是局部露出粒子40及表面吸附粒子50,內包粒子30亦有助於提高免疫學測定用標記物質及免疫學測定用試劑的視認性。進而,局部露出粒子40及內包粒子30與表面吸附粒子50相比,與樹脂粒子10的接觸面積較大,除此以外,發揮由包埋狀態所得的固定(anchor)效果等,故物理吸附力強,不易自樹脂粒子10脫離。因此,可使利用樹脂-白金複合體100的免疫學測定用標記物質及免疫學測定用試劑的耐久性、穩定性優異。
以下,以將樹脂-白金複合體100應用於免疫學測定用標記物質(以下亦簡稱為「標記物質」)或免疫學測定用試劑(以下亦簡稱為「試劑」)的情形為例加以說明。
對於內包粒子30而言,其表面全部經構成樹脂粒子10的樹脂所覆蓋。另外,對於局部露出粒子40而言,其表面積的5%以上且小於100%經構成樹脂粒子10的樹脂所覆蓋。就免疫學測定用標記物質及免疫學測定用試劑的耐久性的觀點而言,其下限較佳為表面積的20%以上,更佳為30%以上。另外,表面吸附粒子50較佳為其表面積的超過0%且小於5%經構成樹脂粒子10的樹脂所覆蓋。
另外,相對於樹脂-白金複合體100的重量,樹脂-白金複合體100上的白金粒子20(內包粒子30、局部露出粒子40及表面吸附粒子50的合計)的擔載量較佳為5 wt%~70 wt%。若為該範圍,則樹脂-白金複合體100的作為標記物質的視認性、目測判定性及檢測感度優異。若白金粒子20的擔載量小於5 wt%,則有抗體或抗原的固定量變少,檢測感度降低的傾向。白金粒子20的擔載量更佳為15 wt%~70 wt%,進而佳為15 wt%~60 wt%。再者,含有白金粒子20的樹脂-白金複合體100與其他金屬粒子(例如含有金粒子的樹脂-金複合體)相比,即便為更少的擔載量,亦可作為標記物質而獲得優異的視認性、目測判定性及檢測感度。
另外,較佳為白金粒子20的10 wt%~90 wt%為局部露出粒子40及表面吸附粒子50。若為該範圍,則可充分確保白金粒子20上的抗體或抗原的固定量,故作為標記物質的感度高。更佳為白金粒子20的20 wt%~80 wt%為局部露出粒子40及表面吸附粒子50,就免疫學測定用標記物質及免疫學測定用試劑的耐久性的觀點而言,進而佳為表面吸附粒子50為20 wt%以下。
另外,於將樹脂-白金複合體100用於免疫學測定的情形時,為了獲得優異的檢測感度,以白金粒子20的60 wt%~100 wt%、較佳為75 wt%~100 wt%、更佳為85 wt%~100 wt%存在於表層部60中為宜,更佳為以自樹脂粒子10的表面起於深度方向上存在於粒子半徑的40%的範圍內為宜。另外,存在於表層部60中的白金粒子20的5 wt%~90 wt%為局部露出粒子40或表面吸附粒子50的情況下,可充分確保白金粒子20上的抗體或抗原的固定量,故作為標記物質的感度變高而較佳。換言之,以存在於表層部60中的白金粒子20的10 wt%~95 wt%為內包粒子30為宜。
此處所謂所述「表層部」,是指以樹脂-白金複合體100的最外側的位置(即,局部露出粒子40或表面吸附粒子50的突出端部)為基準,自樹脂粒子10的表面起於深度方向上的粒子半徑的50%的範圍。另外,所謂所述「三維地分佈」,是指白金粒子20不僅於樹脂粒子10的面方向上而且於深度方向上亦分散。
如上文所述,內包粒子30亦除了定域型表面電漿子共振以外,表現出由電子遷移所致的光能吸收,因此不僅是局部露出粒子40及表面吸附粒子50,內包粒子30亦有助於提高免疫學測定用標記物質及免疫學測定用試劑的視認性。就此種視認性提高的觀點而言,樹脂-白金複合體100例如較佳為如圖2A所示,內包粒子30自樹脂粒子10的表面起於深度方向上集中分佈於一定的範圍內,於樹脂粒子10的中心附近不存在內包粒子30。更具體而言,為了有效地表現出由內包粒子30所得的定域型表面電漿子共振以外的由電子遷移所致的光能吸收,例如於樹脂粒子10的粒徑D2為800 nm時,以自樹脂粒子10的表面起於深度方向上於例如0 nm~200 nm的範圍內存在70 wt%以上、較佳為80 wt%以上、更佳為90 wt%~100 wt%的內包粒子30為宜。尤其於所有內包粒子30(100 wt%)分佈的區域(內包粒子分佈區域)為距樹脂粒子10的表面例如0 nm~100 nm的範圍內的情形時,除了由內包粒子30所得的定域型表面電漿子共振以外,可使由電子遷移所致的光能吸收的表現最大化,故較佳。
另外,樹脂-白金複合體100亦可不具有內包粒子30。例如亦可如圖2B所示般,於樹脂-白金複合體100中,所有白金粒子20不於樹脂粒子10的徑向上重合而固定於樹脂粒子10的表面。於該情形時,白金粒子20包含局部露出粒子40及表面吸附粒子50。
樹脂粒子10較佳為於結構中具有可吸附白金離子的取代基的聚合物粒子。尤佳為含氮聚合物粒子。含氮聚合物中的氮原子容易化學吸附作為視認性優異、容易將抗原或抗體固定的白金粒子20的前驅物的[PtCl6]2-等陰離子性離子,故較佳。於本實施形態中,將含氮聚合物中所吸附的白金離子還原而形成白金粒子20,故所生成的白金粒子20的一部分成為內包粒子30或局部露出粒子40。另外,丙烯酸聚合物般的含羧酸基的聚合物及聚苯乙烯磺酸般的含磺酸基的聚合物(以下一併稱為「可吸附陽離子性離子的聚合物」)可藉由所含有的羧酸基及磺酸基而化學吸附Pt2+般的陽離子性離子,故較佳。例如藉由將化學吸附的Pt2+還原而形成白金粒子20,可製作與所述含氮聚合物粒子相同的結構。另外,例如容易吸附作為銀、鎳、銅等金屬的前驅物的陽離子性離子,藉由使用該些聚合物,亦可製作與白金的合金,故較佳。
另一方面,於結構中具有可吸附白金離子的取代基的含氮聚合物以外的樹脂粒子、例如聚苯乙烯等的情形時,難以將所述白金離子吸附至樹脂內部。結果,所生成的白金粒子20的大部分成為表面吸附粒子50。如上文所述,表面吸附粒子50與樹脂粒子10的接觸面積小,故樹脂與金屬的接著力小,有白金粒子20自樹脂粒子10脫離的影響大的傾向。
所述含氮聚合物為於主鏈或側鏈中具有氮原子的樹脂,例如有多胺、聚醯胺、多肽、聚胺基甲酸酯、聚脲、聚醯亞胺、聚咪唑、聚噁唑、聚吡咯、聚苯胺等。較佳為聚-2-乙烯基吡啶、聚-3-乙烯基吡啶、聚-4-乙烯基吡啶等多胺。另外,於側鏈中具有氮原子的情形時,例如可廣泛地利用丙烯酸系樹脂、酚樹脂、環氧樹脂等。
另外,所述可吸附陽離子性離子的聚合物為於主鏈或側鏈中具有羧酸基、磺酸基等的樹脂,例如可廣泛地利用聚丙烯酸、羧酸乙烯酯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯基磺酸、聚苯乙烯磺酸等。
所述含氮聚合物及可吸附陽離子性離子的聚合物亦可為與公知的聚合性單體的共聚物。此處,共聚物可例示無規共聚物、嵌段共聚物、交替共聚物、聚合物彼此交聯而成的共聚物。另外,亦可使兩種以上的單體共聚合而形成樹脂粒子10,亦可使單體與存在於樹脂粒子10的表面的官能基反應,將其作為聚合活性末端而進一步聚合。其共聚合組成並無限定,較佳為所述含有可吸附白金離子的取代基的單體為10 mol%以上。
具有白金粒子20的樹脂-白金複合體100與具有其他金屬種的粒子的樹脂複合體相比較,於與抗體等配體結合的狀態下不易產生凝集,分散性極為優異。另外,白金粒子20對氧化等變質的耐受性強,保存穩定性亦優異。進而,白金粒子20例如於250 nm~900 nm的範圍的廣泛波長下表現出來源於定域型表面電漿子共振的吸收,進而,藉由表現出由電子遷移所致的光能吸收,而呈現出接近黑色的強顯色,故藉由將樹脂-白金複合體100用作標記物質,於免疫學測定中可獲得高的視認性,亦可提高分析物的檢測感度。於該情形時,藉由使用白金粒子20,與其他金屬(例如金)的粒子相比,能以少的擔載量而獲得優異的檢測感度。因此,若平均粒徑同等,則樹脂-白金複合體100與具有其他金屬種的粒子的樹脂複合體相比,顯示出明顯高的檢測感度。
白金粒子20可僅包含白金,或亦可為白金與其他金屬的合金。白金合金包含白金與白金以外的金屬種,是指含有1重量%以上的白金的合金。此處,與白金形成合金的其他金屬種並無特別限制,例如較佳為銀、鎳、銅、金、鈀等,更佳為保存穩定性、視認性優異的金、鈀等。
另外,藉由掃描式電子顯微鏡(SEM)觀察而測長的白金粒子20的平均粒徑(即,圖1中的粒徑D3的平均值)例如較佳為1 nm~80 nm。於白金粒子20的平均粒徑小於1 nm的情形或超過80 nm的情形時,不易表現出定域型表面電漿子共振及由電子遷移所致的光能吸收,故有感度降低的傾向。就將樹脂-白金複合體100用於免疫學測定的情形時獲得高的檢測感度的觀點而言,白金粒子20的平均粒徑較佳為1 nm以上且50 nm以下,更佳為1 nm以上且30 nm以下,進而佳為1 nm以上且20 nm以下,最佳為1 nm以上且15 nm以下。尤其於白金粒子20的平均粒徑為15 nm以下的情形時,於將樹脂-白金複合體100用作免疫層析的標記物質的情形時可獲得特別優異的檢測感度。
另外,樹脂-白金複合體100的平均粒徑(即,圖1中的粒徑D1的平均值)例如較佳為50 nm~1000 nm。若樹脂-白金複合體100的平均粒徑小於50 nm,則例如有白金粒子的擔載量變少的傾向,故有相較於相同尺寸的白金粒子而著色變弱的傾向,若超過1000 nm,則於製成標記物質或試劑時,有於薄膜過濾器等層析介質的孔隙內容易堵塞的傾向、或分散性降低的傾向。就提高製成標記物質或試劑時的分散性、並且於將樹脂-白金複合體100用於免疫學測定的情形時獲得高的檢測感度的觀點而言,樹脂-白金複合體100的平均粒徑較佳為100 nm以上且600 nm以下,更佳為250 nm以上且600 nm以下,最佳為300 nm以上且600 nm以下。尤其若樹脂-白金複合體100的平均粒徑為300 nm以上,則於將樹脂-白金複合體100用作免疫層析的標記物質的情形時可穩定地獲得優異的檢測感度。此處,樹脂-白金複合體100的粒徑是指將樹脂粒子10的粒徑加上局部露出粒子40或表面吸附粒子50的突出部位的長度所得的值,可藉由雷射繞射/散射法、動態光散射法或離心沈降法來測定。
[樹脂-白金複合體的製造方法]
樹脂-白金複合體100的製造方法並無特別限定。例如於藉由乳化聚合法所製造的樹脂粒子10的分散液中,添加含有白金離子的溶液,使白金離子吸附於樹脂粒子10(以下稱為「白金離子吸附樹脂粒子」)。進而,將所述白金離子吸附樹脂粒子添加至還原劑溶液中,由此將白金離子還原而生成白金粒子20,獲得樹脂-白金複合體100。
另外,例如含有白金離子的溶液可列舉氯化白金酸(H2PtCl6)水溶液、氯化白金(PtCl2)溶液等。另外,亦可使用白金錯合物代替白金離子。
另外,亦可使用以下溶劑代替水來作為含有白金離子的溶液的溶劑:甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、第二丁醇、第三丁醇等含水醇或醇,鹽酸、硫酸、硝酸等酸等。
另外,所述溶液中,視需要亦可添加例如聚乙烯醇等水溶性高分子化合物、界面活性劑、醇類;四氫呋喃、二乙醚、二異丙醚等醚類;伸烷基二醇、聚伸烷基二醇、該些二醇的單烷基醚或二烷基醚、甘油等多元醇類;丙酮、甲基乙基酮等酮類等各種水混合性有機溶劑等添加劑。此種添加劑於促進白金離子的還原反應速度、另外控制所生成的白金粒子20的大小的方面有效。
另外,還原劑可使用公知者。例如可列舉:硼氫化鈉、二甲基胺硼烷、檸檬酸、次磷酸鈉、水合肼、鹽酸肼、硫酸肼、甲醛、蔗糖、葡萄糖、抗壞血酸、異抗壞血酸、次膦酸鈉、對苯二酚、羅雪鹽(Rochelle salt)等。其中,較佳為硼氫化鈉或二甲基胺硼烷、檸檬酸。
關於還原劑溶液,視需要可添加界面活性劑,或調整溶液的pH值。關於pH值調整,可使用硼酸或磷酸等緩衝劑、鹽酸、硫酸等酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀等鹼進行調整。
進而,藉由利用還原劑溶液的溫度來調整白金離子的還原速度,可控制所形成的白金粒子20的粒徑。
另外,於將所述白金離子吸附樹脂粒子中的白金離子還原而生成白金粒子20時,可將所述白金離子吸附樹脂粒子添加至還原劑溶液中,亦可將還原劑添加至所述白金離子吸附樹脂粒子中,就容易生成內包粒子30及局部露出粒子40的觀點而言,較佳為前者。
另外,為了保持樹脂-白金複合體100於水中的分散性,例如亦可添加檸檬酸、聚-L-離胺酸、聚乙烯基吡咯啶酮(polyvinylpyrrolidone)、聚乙烯基吡啶、聚乙烯醇、迪斯帕畢克(DISPERBYK)194、迪斯帕畢克(DISPERBYK)180、迪斯帕畢克(DISPERBYK)184(日本畢克化學(BYK Chemie Japan)公司製造)等分散劑。
進而,可藉由硼酸或磷酸等緩衝劑、鹽酸、硫酸等酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀等鹼來調整pH值,保持分散性。
具有以上構成的樹脂-白金複合體100尤其藉由使抗原或抗體吸附於白金粒子20的表面,可作為標記物質而較佳地應用於例如EIA、RIA、CLIA、FIA、LIA、PA、ICA、HA、HI等免疫學測定法。另外,尤其可較佳地用作低濃度範圍(高感度區域)內的目測判定性優異的免疫學測定用標記物質或免疫學測定用試劑的材料。另外,免疫學測定用標記物質或免疫學測定用試劑的形態並無特別限定,例如能以使樹脂-白金複合體100分散於水、或pH值經調整的緩衝液中而成的分散液的形式使用。
使抗原或抗體吸附於所述白金粒子20的表面的方法並無特別限定,可使用公知的物理吸附及化學吸附的方法。例如可列舉:使樹脂-白金複合體100浸漬於含有抗原或抗體的緩衝液中並進行培養(incubate)等物理吸附;或於抗原或抗體中導入SH基,使其與樹脂-白金複合體100反應而形成Pt-SH鍵等化學吸附。其中,就白金粒子20與抗原或抗體的結合變牢固的方面而言,較佳為化學吸附。
繼而,對使用樹脂-白金複合體100作為標記物質的分析物的測定方法、側向流型層析用測試條及分析物檢測/定量套組加以說明。
[側向流型層析用測試條]
首先,一面參照圖3,一面對本發明的一實施形態的側向流型層析用測試條(以下有時簡單地記作「測試條」)加以說明。如後述,該測試條200可較佳地用於本發明的一實施形態的分析物的測定方法中。
測試條200包括薄膜110。薄膜110於試樣的展開方向上依序設有試樣添加部120、判定部130及吸液部140。
<薄膜>
測試條200中所使用的薄膜110可應用通常的測試條中用作薄膜材料者。薄膜110例如顯示出毛細管現象,是由包含於添加試樣的同時試樣展開般的微細多孔性物質的非活性物質(不與分析物160、各種配體等反應的物質)所形成。薄膜110的具體例可列舉:包含聚胺基甲酸酯、聚酯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚偏二氟乙烯、尼龍、纖維素衍生物等的纖維狀或不織纖維狀基質(matrix)、膜、濾紙、玻璃纖維濾紙、布、棉等。該些物質中,較佳可使用包含纖維素衍生物或尼龍的膜、濾紙、玻璃纖維濾紙等,更佳可使用硝基纖維素膜、混合硝基纖維素酯(硝基纖維素與乙酸纖維素的混合物)膜、尼龍膜、濾紙。
為了使操作更簡便,測試條200較佳為包括支撐薄膜110的支撐體。支撐體例如可使用塑膠等。
<試樣添加部>
測試條200亦可具有用以添加含有分析物160的試樣的試樣添加部120。試樣添加部120為用以於測試條200中接受含有分析物160的試樣的部位。試樣添加部120是形成於試樣展開的方向上較判定部130更靠上游側的薄膜110上,或者,亦可將包含例如纖維素濾紙、玻璃纖維、聚胺基甲酸酯、聚乙酸酯、乙酸纖維素、尼龍、棉布等材料的試樣添加墊設置於薄膜110上而構成試樣添加部120。
<判定部>
於判定部130中,固定有與分析物160特異地結合的捕捉配體131。捕捉配體131只要與分析物160形成特異性結合,則可無特別限制地使用,例如可較佳地使用對分析物160的抗體等。捕捉配體131是以於對測試條200提供試樣的情形時亦不自判定部130移動的方式而固定。捕捉配體131只要藉由物理結合或吸附或者化學結合或吸附等而直接或間接地固定於薄膜110上即可。
另外,判定部130只要為含有標記抗體150及分析物160的複合體170與和分析物160特異地結合的捕捉配體131接觸般的構成,則並無特別限定。例如可於薄膜110上直接固定捕捉配體131,或者亦可於經固定於薄膜110上的包含纖維素濾紙、玻璃纖維、不織布等的墊上固定捕捉配體131。
<吸液部>
吸液部140例如是由纖維素濾紙、不織布、布、乙酸纖維素等吸水性材料的墊所形成。所添加的試樣的展開前線(front line)到達吸液部140後的試樣的移動速度視吸液部140的材質、大小等而不同。因此,可藉由選定吸液部140的材質、大小等而設定最適於分析物160的檢測/定量的速度。再者,吸液部140為任意的構成,亦可省略。
測試條200視需要亦可更含有反應部、控制部等任意的部位。
<反應部>
雖省略圖示,但測試條200中,亦可於薄膜110上形成有含有標記抗體150的反應部。反應部可設於試樣流動的方向上較判定部130更靠上游側。再者,亦可將圖3中的試樣添加部120用作反應部。於測試條200具有反應部的情形時,若將含有分析物160的試樣供給於反應部或試樣添加部120,則可於反應部中使試樣所含的分析物160與標記抗體150接觸。於該情形時,藉由將試樣簡單地供給於反應部或試樣添加部120,可形成含有分析物160及標記抗體150的複合體170,故可進行所謂一步(one-step)式的免疫層析。
反應部只要含有與分析物160特異地結合的標記抗體150,則並無特別限定,亦可於薄膜110上直接塗佈標記抗體150而成。或者,反應部例如亦可將使包含纖維素濾紙、玻璃纖維、不織布等的墊(複合墊(conjugate pad))中含浸有標記抗體150的物品固定於薄膜110上而成。
<控制部>
雖省略圖示,但測試條200中亦可形成有控制部,該控制部是於試樣展開的方向上,將與標記抗體150特異地結合的捕捉配體固定於薄膜110上而成。藉由與判定部130一起而於控制部中亦測定顯色強度,可確認供給於測試條200的試樣展開而到達反應部及判定部130,正常進行了檢查。再者,控制部可除了使用與標記抗體150特異地結合的其他種類的捕捉配體代替捕捉配體131以外,與所述判定部130同樣地製作,採用相同的構成。
[分析物的測定方法]
繼而,對使用測試條200進行的本發明的一實施形態的分析物160的測定方法加以說明。
本實施形態的分析物160的測定方法為對試樣中所含的分析物160進行檢測或定量的分析物160的測定方法。本實施形態的分析物160的測定方法使用測試條200,該測試條200含有薄膜110、及將與分析物160特異地結合的捕捉配體131固定於該薄膜110上而成的判定部130。而且,本實施形態的分析物160的測定方法可包括下述步驟(I)~步驟(III);
步驟(I):使試樣所含的所述分析物160與標記抗體150接觸的步驟,其中所述標記抗體150是以具有將多個白金粒子20固定於樹脂粒子10上的結構的樹脂-白金複合體100將與該分析物160特異地結合的抗體標記而成;
步驟(II):於判定部130中,使步驟(I)中形成的含有分析物160及標記抗體150的複合體170與捕捉配體131接觸的步驟;
步驟(III):對樹脂-白金複合體100的定域型表面電漿子共振、及來源於由電子遷移所致的光能吸收的顯色強度進行測定的步驟。
步驟(I):
步驟(I)為使試樣所含的分析物160與標記抗體150接觸的步驟。只要形成含有分析物160及標記抗體150的複合體170,則接觸的態樣並無特別限定。例如可對測試條200的試樣添加部120或反應部(省略圖示)供給試樣,於該反應部中使分析物160與標記抗體150接觸,亦可於對測試條200供給試樣之前,使試樣中的分析物160與標記抗體150接觸。
步驟(I)中形成的複合體170於測試條200上展開而移動,到達判定部130。
步驟(II):
步驟(II)中,於測試條200的判定部130中,使步驟(I)中形成的含有分析物160及標記抗體150的複合體170與捕捉配體131接觸。若使複合體170與捕捉配體131接觸,則捕捉配體131與複合體170的分析物160特異地結合。結果,複合體170於判定部130中被捕捉。
再者,捕捉配體131不與標記抗體150特異地結合,故於未與分析物160結合的標記抗體150到達判定部130的情形時,該未與分析物160結合的標記抗體150通過判定部130。此處,於測試條200中形成有固定有與標記抗體150特異地結合的其他捕捉配體的控制部(省略圖示)的情形時,通過判定部130的標記抗體150繼續展開,於控制部中與該其他捕捉配體結合。結果,未與分析物160形成複合體170的標記抗體150於控制部中被捕捉。
於步驟(II)之後,視需要亦可於步驟(III)之前,實施例如利用水、生理鹽水、磷酸緩衝液等生化學檢查中通用的緩衝液來清洗測試條200的清洗步驟。可藉由清洗步驟將未於判定部130、或判定部130及控制部中被捕捉的標記抗體150(未與分析物160結合、未形成複合體170的標記抗體150)去除。
藉由實施清洗步驟,可於步驟(III)中,於對判定部130、或判定部130及控制部中的樹脂-白金複合體100的定域型表面電漿子共振、及來源於由電子遷移所致的光能吸收的顯色進行測定時,使背景(background)的顯色強度減低,可提高信號/背景比,進一步提高檢測感度或定量性。
步驟(III):
步驟(III)為對樹脂-白金複合體100的定域型表面電漿子共振、及來源於由電子遷移所致的光能吸收的顯色強度進行測定的步驟。於所述步驟(II)或視需要實施清洗步驟後,於測試條200中,對樹脂-白金複合體100的定域型表面電漿子共振、及來源於由電子遷移所致的光能吸收的顯色強度進行測定。
再者,於測試條200中形成有控制部的情形時,藉由步驟(II),於控制部中利用其它捕捉配體來捕捉標記抗體150而形成複合體。因此,於步驟(III)中,於測試條200中,不僅於判定部130中而且於控制部中亦可產生定域型表面電漿子共振、及來源於由電子遷移所致的光能吸收的顯色。如此,藉由與判定部130一起而於控制部中亦測定顯色強度,可確認供給於測試條200的試樣是否正常展開而到達反應部及判定部130。
<試樣及分析物>
本實施形態的分析物的測定方法中的試樣只要含有蛋白質等可成為抗原的物質作為分析物160,則並無特別限定。例如可列舉含有目標分析物160的生物體試樣(即,全血、血清、血漿、尿、唾液、痰、鼻腔或咽喉擦拭液、腦脊髓液、羊水、乳頭分泌液、眼淚、汗、自皮膚的滲出液、組織或細胞及自糞便的萃取液等)或食品的萃取液等。視需要,為了容易地產生標記抗體150及捕捉配體131與分析物160的特異性結合反應,亦可於所述步驟(I)之前對試樣所含的分析物160進行前處理。此處,前處理可列舉:使用酸、鹼、界面活性劑等各種化學藥品等的化學處理,或使用加熱、攪拌、超音波等的物理處理。尤其於分析物160為流感病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP)抗原等通常不於表面露出的物質的情形時,較佳為進行利用界面活性劑等的處理。可考慮特異性結合反應、例如抗原抗體反應等捕捉配體131與分析物160的結合反應性,使用非離子性界面活性劑來作為用於該目的之界面活性劑。
另外,所述試樣亦可利用通常的免疫學分析法中所用的溶劑(水、生理鹽水、或緩衝液等)或水混合有機溶劑適當進行稀釋。
所述分析物160例如可列舉:腫瘤標記物、信號傳導物質、激素等蛋白質(包括多肽、寡肽等)、核酸(包括單鏈或雙鏈的脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)、核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)、多核苷酸、寡核苷酸、肽核酸(Peptide nucleic acid,PNA)等)或具有核酸的物質、糖(包括寡糖、多糖類、糖鏈等)或具有糖鏈的物質、脂質等其他分子,只要與標記抗體150及捕捉配體131特異地結合,則並無特別限定,例如可列舉:癌胚抗原(Carcino-Embryonic Antigen,CEA)、人表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)蛋白、前列腺特異抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)、糖類抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9,CA19-9)、α-胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)、免疫抑制酸性蛋白(Immunosuppressive Acidic Protein,IAP)、癌抗原15-3( Cancer Antigen 15-3,CA15-3)、癌抗原125(Cancer Antigen 125,CA125)、雌激素受體(estrogen receptor)、黃體激素受體(progesterone receptor)、便隱血(feces occult blood)、肌鈣蛋白(troponin)I、肌鈣蛋白T、肌酸激酶MB(Creatine Kinase-MB,CK-MB)、C反應蛋白(C-Reactive protein,CRP)、人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin,HCG)、黃體成長激素(Luteinizing Hormone,LH)、促卵泡激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、梅毒抗體、流感病毒人血紅蛋白(influenza virus human hemoglobin)、披衣菌(Chlamydia)抗原、A群β溶血性鏈球菌抗原、乙型肝炎表面(Hepatitis B surface,HBs)抗體、HBs抗原、輪狀病毒(Rotavirus)、腺病毒(Adenovirus)、白蛋白(Albumin)、糖化白蛋白等。該些物質中,較佳為藉由非離子性界面活性劑而可溶化的抗原,更佳為病毒的核蛋白質般形成自集合體的抗原。
<標記抗體>
標記抗體150是用於在步驟(I)中與試樣所含的分析物160接觸,形成含有分析物160與標記抗體150的複合體170。標記抗體150是以具有將多個白金粒子20固定於樹脂粒子10上的結構的樹脂-白金複合體100將與分析物160特異地結合的抗體標記化而成。此處所謂「標記化」,是指於步驟(I)~步驟(III)中,以樹脂-白金複合體100不自標記抗體150脫離的程度,藉由化學結合或吸附或者物理結合或吸附等將樹脂-白金複合體100直接或間接地固定於抗體上。例如,標記抗體150可於抗體上直接結合樹脂-白金複合體100而成,或亦可經由任意的連結子(linker)分子將抗體與樹脂-白金複合體100結合而成,或亦可分別固定於不溶性粒子上而成。
另外,於本實施形態中,「抗體」並無特別限制,例如除了多株抗體(polyclonal antibody)、單株抗體(monoclonal antibody)、藉由基因重組所得的抗體以外,可使用與抗原具有結合能力的抗體斷片[例如H鏈、L鏈、Fab、F(ab')2等]等。另外,作為免疫球蛋白,可為免疫球蛋白G(Immunoglobulin,IgG)、IgM、IgA、IgE、IgD的任一種。關於抗體的產生動物種,以人為代表,亦可為人以外的動物(例如小鼠、大鼠、兔子、山羊、馬等)。抗體的具體例可列舉:抗PSA抗體、抗AFP抗體、抗CEA抗體、抗腺病毒抗體、抗流感病毒抗體、抗HCV抗體、抗IgG抗體、抗人IgE抗體等。
<標記抗體的較佳製作方法>
繼而,列舉標記抗體150的較佳製作方法來進行說明。標記抗體150的製造可至少包括以下的步驟A;
步驟A)於第一pH值條件下使樹脂-白金複合體100與抗體混合並結合,由此獲得標記抗體150的步驟,
較佳為更包括步驟B;
步驟B)於第二pH值條件下對標記抗體150進行處理的步驟。
[步驟A]
於步驟A中,於第一pH值條件下將樹脂-白金複合體100與抗體混合而獲得標記抗體150。步驟A較佳為使固體狀的樹脂-白金複合體100於分散於液相中的狀態下與抗體接觸。
關於第一pH值條件,就於維持樹脂-白金複合體100的分散及抗體的活性的狀態下使樹脂-白金複合體100與抗體均勻地接觸的觀點而言,較佳為pH值2~10的範圍內的條件,進而更佳為例如pH值5~9的範圍內。關於使樹脂-白金複合體100與抗體結合時的條件,若pH值小於2,則有時因強酸性導致抗體變質而失活,若pH值超過10,則將樹脂-白金複合體100與抗體混合時凝集而分散變困難。然而,於抗體不因強酸性而失活的情形時,於pH值小於2的條件下亦可進行處理。
步驟A較佳為於經調整為第一pH值條件的結合用緩衝液(Binding Buffer)中進行。例如於經調整為所述pH值的結合用緩衝液中混合既定量的樹脂-白金複合體100,充分混合。結合用緩衝液例如可使用經調整為既定濃度的硼酸溶液等。結合用緩衝液的pH值的調整例如可使用鹽酸、氫氧化鈉等來進行。
繼而,於所得的混合液中添加既定量的抗體,充分攪拌、混合,由此可獲得含有標記抗體的溶液。如此所得的含有標記抗體的溶液例如可藉由離心分離等固液分離方法而以固體部分的形式僅分取標記抗體150。
[步驟B]
於步驟B中,於第二pH值條件下對步驟A中所得的標記抗體150進行處理,藉此進行抑制對標記抗體150的非特異性吸附的封閉(blocking)。於該情形時,使藉由固液分離方法所分取的標記抗體150於第二pH值條件下於液相中分散。
關於第二pH值條件,就保持抗體的活性並且抑制標記抗體150的凝集的觀點而言,例如較佳為pH值2~10的範圍內,就抑制標記抗體150的非特異性吸附的觀點而言,更佳為pH值5~9的範圍內。關於封閉的條件,若pH值小於2則有時因強酸性導致抗體變質而失活,若pH值超過10,則標記抗體150凝集而分散變困難。
步驟B較佳為使用經調整為第二pH值條件的封閉用緩衝液(Blocking Buffer)來進行。例如於既定量的標記抗體150中添加經調整為所述pH值的封閉用緩衝液,於封閉用緩衝液中使標記抗體150均勻地分散。封閉用緩衝液例如較佳為使用不與被檢測物結合的蛋白質的溶液。封閉用緩衝液中可使用的蛋白質例如可列舉牛血清白蛋白( albumin)、蛋白白蛋白、酪蛋白、明膠等。更具體而言,較佳為使用經調整為既定濃度的牛血清白蛋白溶液等。封閉用緩衝液的pH值的調整例如可使用鹽酸、氫氧化鈉等來進行。標記抗體150的分散時,例如較佳為使用超音波處理等分散方法。如此可獲得標記抗體150均勻地分散的分散液。
所述步驟A及步驟B中,具有白金粒子20的樹脂-白金複合體100不易發生由pH值所致的凝集,能以酸性~鹼性的廣範圍的pH值進行處理。另一方面,例如於具有金粒子的樹脂-金複合體的情形時,於步驟A中,於pH值超過7的條件下有樹脂-金複合體彼此凝集的傾向,另外,於步驟B中,於pH值超過9的條件下有樹脂-金複合體彼此凝集的傾向。因此,本發明中所用的樹脂-白金複合體100亦有不易受到標記抗體的製作條件的限制等優點。
如以上所述般可獲得標記抗體150的分散液。例如可藉由離心分離等固液分離方法,自該分散液中以固體部分的形式而僅分取標記抗體150。另外,視需要可實施清洗處理、保存處理等。以下,對清洗處理、保存處理加以說明。
(清洗處理)
清洗處理中,於藉由固液分離方法所分取的標記抗體150中添加清洗用緩衝液,於清洗用緩衝液中使標記抗體150均勻地分散。分散時,例如較佳為使用超音波處理等分散方法。清洗用緩衝液並無特別限定,例如可使用經調整至pH值8~9的範圍內的既定濃度的托立斯(Tris)緩衝液、甘胺醯胺緩衝液、精胺酸緩衝液等。清洗用緩衝液的pH值的調整例如可使用鹽酸、氫氧化鈉等來進行。標記抗體150的清洗處理視需要亦可重複進行多次。
(保存處理)
保存處理為於藉由固液分離方法所分取的標記抗體150中添加保存用緩衝液,於保存用緩衝液中使標記抗體150均勻地分散。分散時,例如較佳為使用超音波處理等分散方法。保存用緩衝液例如可使用於清洗用緩衝液中添加有既定濃度的抗凝集劑及/或穩定劑的溶液等。抗凝集劑例如可使用蔗糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖所代表的糖類或甘油、聚乙烯醇所代表的多元醇等。穩定劑並無特別限定,例如可使用牛血清白蛋白、蛋白白蛋白、酪蛋白、明膠等蛋白質。如此般可進行標記抗體150的保存處理。
於以上的各步驟中,可進而視需要而使用界面活性劑或疊氮化鈉、對羥基苯甲酸酯等防腐劑。
[分析物測定用套組]
本發明的一實施形態的分析物測定用套組例如為使用測試條200,而用以根據本實施形態的分析物的測定方法對試樣中所含的分析物160進行檢測或定量的套組。
本實施形態的分析物測定用套組包含:
測試條200,含有薄膜110、及
將與所述分析物160特異地結合的捕捉配體131固定於薄膜110上而成的判定部130;以及
檢測試劑,含有標記抗體150,該標記抗體150是以具有將多個白金粒子20固定於樹脂粒子10上的結構的樹脂-白金複合體100將與分析物160特異地結合的抗體標記而成。
本實施形態的分析物測定用套組視需要可更包含其他構成要素。
於使用本實施形態的分析物測定用套組時,可使試樣中的分析物160與檢測試劑中的標記抗體150接觸而實施步驟(I)後,對測試條200的反應部或試樣添加部120供給試樣,依序實施步驟(II)、步驟(III)。或者,亦可於較測試條200的判定部130更靠上游側塗佈檢測試劑,使其適當乾燥而形成反應部後,於所形成的反應部或較該反應部更靠上游側的位置(例如試樣添加部120)添加試樣,依序實施步驟(I)~步驟(III)。
[實施例]
繼而,藉由實施例對本發明加以具體說明,但本發明不受該些實施例的任何限定。於以下的實施例、比較例中只要無特別說明,則各種測定、評價如下。
<樹脂-金屬複合體的吸光度測定>
關於樹脂-金屬複合體的吸光度,將經製備成0.01 wt%的樹脂-金屬複合體分散液(分散介質:水)放入至光學用白板玻璃製池(光路長10 mm)中,使用瞬間多通道測光系統(大塚電子公司製造,MCPD-3700),於金的情形時測定570 nm的吸光度,於白金的情形時測定700 nm的吸光度。於金的情形時,將570 nm下的吸光度為0.9以上視為○(良好),0.5~小於0.9視為△(可),小於0.5視為×(不可)。於白金的情形時,將700 nm下的吸光度為0.6以上視為○(良好),0.1~小於0.6視為△(可),小於0.1視為×(不可)。再者,關於著色乳膠,以與所述金及白金相同的基準進行評價。
<固體成分濃度測定及金屬擔載量的測定>
於磁製坩堝中加入1 g的濃度調整前的分散液,於70℃下進行3小時熱處理。測定熱處理前後的重量,藉由下述式算出固體成分濃度。
固體成分濃度(wt%)=[乾燥後的重量(g)/乾燥前的重量(g)]×100
另外,對所述熱處理後的樣本進一步於500℃下進行5小時加熱處理,測定加熱處理前後的重量,根據下述式來算出金屬擔載量。金屬擔載量(wt%)=[500℃加熱處理後的重量(g)/500℃加熱處理前的重量(g)]×100
<樹脂-金屬複合體的平均粒徑的測定>
使用碟片式離心式粒度分佈測定裝置(CPS碟片式離心機(Disc Centrifuge)DC24000 UHR,CPS儀器(CPS instruments,Inc.)公司製造)進行測定。測定是以使樹脂-金屬複合體分散於水中的狀態而進行。
<利用免疫層析的評價>
使用各實施例等中製作的樹脂-金屬複合體標記抗體分散液,進行下述所示的利用免疫層析法的測定,對樹脂-金屬複合體分散液的性能進行評價。
(評價方法)
評價時,使用流感A型評價用單株篩選(Monocloscreen)(艾德特克(Adtec)公司製造),比較5分鐘後、10分鐘後、15分鐘後的顯色水準。於性能評價中,抗原是使用流感A型陽性對照(APC)的2倍稀釋列(1倍~1024倍)(APC稀釋前的病毒的濃度為5000 FFU/ml)。
(評價順序)
於96孔板的各孔中分別加入3 μl的樹脂-金屬複合體標記抗體分散液,分別混合100 μl的APC的2倍稀釋列(1倍~1024倍)及陰性對照。繼而,於流感A型評價用單株篩選中添加50 μl,評價5分鐘後、10分鐘後、15分鐘後的顯色水準。顯色水準是使用金膠體判定用顏色樣本(艾德特克(Adtec)公司製造)來判定。
<金屬粒子的平均粒徑的測定>
關於金屬粒子的平均粒徑的測定,將樹脂-金屬複合體分散液滴加至帶有碳支撐膜的金屬性絲網上而製作基板,藉由場發射式掃描電子顯微鏡(STEM;日立高新技術(Hitachi High-technologies)公司製造,SU-9000)觀測基板,根據所得的圖像來測定金屬粒子的面積平均徑。
<分散性的評價>
於0.1 mL的1 wt%的樹脂-金屬複合體中添加0.9 mL的結合用緩衝液,充分混合。進而,添加100 μg的抗流感A型單株抗體,於室溫下用3小時進行顛倒攪拌,藉由目測來判定所得的樹脂-金屬複合體標記抗體的分散性。關於結合用緩衝液,以如下三種來進行評價。
結合用緩衝液a:以HCl將100 mM的硼酸溶液調整為pH值≒3
結合用緩衝液b:100 mM的硼酸溶液 pH值≒6.5
結合用緩衝液c:以NaOH將100 mM的硼酸溶液調整為pH值≒8.5。
關於分散性的判定,於樹脂-金屬複合體標記抗體未凝集而未沈降的情形時視為〇(良好),於樹脂-金屬複合體標記抗體凝集而沈降的情形時視為×(不良)。將分散性評價的例子示於圖4中。於圖4中,朝向左側表示樹脂-金屬複合體標記抗體未凝集而未沈降的情形,右側表示凝集而沈降的狀態。再者,圖4是考慮到與樹脂-金複合體標記抗體有關的結果而記載者。
[實施例1]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](3.00 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於300 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,49.50 g)及二乙烯基苯(DVB,0.50 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於18.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.250 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑370 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、45分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(90 ml)中添加245 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(90 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑382 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整而獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體分散液的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.70。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為5 nm,白金的擔載量為38.5 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
使用所得的樹脂-白金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b、結合用緩衝液c全部為○。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值8.5(結合用緩衝液c)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
於1 ml(0.1wt%)的所得的樹脂-白金複合體分散液中混合100 μg的流感抗體,於室溫下攪拌約3小時而使抗體與樹脂-白金複合體結合。以最終濃度成為1%的方式添加牛血清白蛋白溶液,於室溫下攪拌2小時而將樹脂-白金複合體表面封閉。以12000 rpm於4℃下進行5分鐘離心分離而進行回收,懸浮於含有0.2%牛血清白蛋白的緩衝液中而製作樹脂-白金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-白金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-白金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表1確認到,樹脂-白金複合體標記抗體對512倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[實施例2]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](1.50 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於300 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,49.50 g)及二乙烯基苯(DVB,0.50 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於18.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.50 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑430 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、45分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(90 ml)中添加245 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(90 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑454 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整而獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體分散液的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.70。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為5 nm,白金的擔載量為37.7 wt%。將所得的樹脂-白金複合體的表面的掃描式電子顯微鏡(SEM)照片示於圖5中,將其剖面的掃描式穿透電子顯微鏡(STEM)照片示於圖6中。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。再者,白金粒子的98 wt%自樹脂粒子的表面起於深度方向上存在於粒子半徑的40%的範圍內。
使用所得的樹脂-白金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b、結合用緩衝液c全部為○。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值8.5(結合用緩衝液c)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
進行與實施例1相同的操作,製作樹脂-白金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-白金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-白金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表2確認到,樹脂-白金複合體標記抗體對1024倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[實施例3]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](2.00 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於300 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,48.00 g)及二乙烯基苯(DVB,2.00 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於18.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.50 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑380 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、45分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(90 ml)中添加245 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(90 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑393 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整而獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體分散液的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.74。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為6 nm,白金的擔載量為38.0 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。再者,白金粒子的93 wt%自樹脂粒子的表面起於深度方向上存在於粒子半徑的40%的範圍內。
使用所得的樹脂-白金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b、結合用緩衝液c全部為○。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值8.5(結合用緩衝液c)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
進行與實施例1相同的操作,製作樹脂-白金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-白金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-白金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表3確認到,樹脂-白金複合體標記抗體對512倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[實施例4]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](1.00 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於300 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,48.00 g)及二乙烯基苯(DVB,2.00 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於18.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.50 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑420 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、45分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(90 ml)中添加245 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(90 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑432 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整而獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體分散液的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.77。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為5 nm,白金的擔載量為38.2 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。再者,白金粒子的97 wt%自樹脂粒子的表面起於深度方向上存在於粒子半徑的40%的範圍內。
使用所得的樹脂-白金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b、結合用緩衝液c全部為○。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值8.5(結合用緩衝液c)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
進行與實施例1相同的操作,製作樹脂-白金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-白金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-白金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表4確認到,樹脂-白金複合體標記抗體對1024倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[實施例5]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](5.00 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於389.5 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,48.00 g)及二乙烯基苯(DVB,2.00 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於50.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.50 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑200 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、45分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(90 ml)中添加245 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(90 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑215 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整而獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體分散液的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.57。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為6 nm,白金的擔載量為37.1 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。再者,白金粒子的83 wt%自樹脂粒子的表面起於深度方向上存在於粒子半徑的40%的範圍內。
使用所得的樹脂-白金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b、結合用緩衝液c全部為○。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值8.5(結合用緩衝液c)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
進行與實施例1相同的操作,製作樹脂-白金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-白金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-白金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表5確認到,樹脂-白金複合體標記抗體對128倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[實施例6]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](2.50 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,5.00 g)溶解於400 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,24.75 g)及二乙烯基苯(DVB,0.25 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於22.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.25 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑140 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、45分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(90 ml)中添加245 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(90 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑154 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整而獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體分散液的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.48。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為3 nm,白金的擔載量為34.5 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
使用所得的樹脂-白金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b、結合用緩衝液c全部為○。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值8.5(結合用緩衝液c)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
進行與實施例1相同的操作,製作樹脂-白金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-白金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-白金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表6確認到,樹脂-白金複合體標記抗體對64倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[實施例7]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](0.25 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,5.00 g)溶解於325 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,24.75 g)及二乙烯基苯(DVB,0.25 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於18.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.25 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑260 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、45分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(90 ml)中添加245 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(90 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑265 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整而獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體分散液的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.83。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為3 nm,白金的擔載量為35.8 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
使用所得的樹脂-白金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b、結合用緩衝液c全部為○。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值8.5(結合用緩衝液c)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
進行與實施例1相同的操作,製作樹脂-白金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-白金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-白金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表7確認到,樹脂-白金複合體標記抗體對128倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[實施例8]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](0.50 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於300 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,49.50 g)及二乙烯基苯(DVB,0.50 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用1分鐘滴加已溶解於18.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.50 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑512 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、45分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(90 ml)中添加245 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(90 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑537 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整而獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體分散液的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.75。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為6 nm,白金的擔載量為39.0 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
使用所得的樹脂-白金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b、結合用緩衝液c全部為○。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值8.5(結合用緩衝液c)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
進行與實施例1相同的操作,製作樹脂-白金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-白金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-白金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表8確認到,樹脂-白金複合體標記抗體對1024倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[實施例9]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](1.00 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於300 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,48.00 g)及二乙烯基苯(DVB,2.00 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於18.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.50 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑420 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、45分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(90 ml)中添加245 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(90 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用120分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑432 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整而獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體分散液的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.72。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為28 nm,白金的擔載量為38.2 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
使用所得的樹脂-白金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b、結合用緩衝液c全部為○。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值8.5(結合用緩衝液c)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
進行與實施例1相同的操作,製作樹脂-白金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-白金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-白金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表9確認到,樹脂-白金複合體標記抗體對512倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[比較例1]
<免疫層析的評價>
於1 ml(0.1 wt%)的著色乳膠(默克密理博((Merck Millipore)公司製造,著色艾斯塔波(Estapor)功能性粒子,K1030,平均粒徑:392 nm,570 nm下的吸光度為0.83,700 nm下的吸光度為0.36)混合100 μg的流感抗體,於室溫下攪拌約3小時而使抗體與著色乳膠結合。以最終濃度成為1%的方式添加牛血清白蛋白溶液,於室溫下攪拌2小時而將著色乳膠封閉。以12000 rpm於4℃下進行5分鐘離心分離而回收,懸浮於含有0.2%牛血清白蛋白的緩衝液中而製作著色乳膠標記抗體。
使用所製作的著色乳膠標記抗體,進行下述所示的利用免疫層析法的測定,對著色乳膠的性能進行評價。
(評價方法)
評價時,使用流感A型評價用單株篩選(艾德特克(Adtec)公司製造),比較5分鐘後、10分鐘後、15分鐘後的顯色水準。於性能評價中,抗原是使用流感A型陽性對照(APC)的2倍稀釋列(1倍~1024倍)(APC稀釋前的病毒的濃度為5000 FFU/ml)。
(評價順序)
於96孔板的各孔中分別加入3 μl的著色乳膠標記抗體,分別混合100 μl的APC的2倍稀釋列(1倍~1024倍)及陰性對照。繼而,於流感A型評價用單株篩選中添加50 μl,評價5分鐘後、10分鐘後、15分鐘後的顯色水準。顯色水準是使用金膠體判定用顏色樣本(艾德特克(Adtec)公司製造)來判定。將其結果示於以下。
根據所述表10確認到,著色乳膠標記抗體對16倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
將以上的實施例1~實施例9、比較例1中的700 nm下的吸光度的測定結果彙總示於表11及表12中。
[比較例2]
<金膠體的合成>
於500 ml三口圓底燒瓶中加入250 ml的1 mM的氯化金酸水溶液,使用加熱回流裝置,一面劇烈攪拌一面使其沸騰,沸騰後添加25 ml的38.8 mM的檸檬酸鈉水溶液,確認到溶液由淡黃色變化為深紅色。一面攪拌一面繼續加熱10分鐘後,於室溫下進行攪拌30分鐘左右,放置冷卻。使用孔徑2 μm的薄膜過濾器對溶液進行過濾,移至三角燒瓶中並保存於冷暗處。所製作的金膠體的平均粒徑為12.3 nm。另外,關於吸光度,依照所述方法進行測定,結果為1.32。
<免疫層析的評價>
於1 ml的所得的金膠體(OD=10)中混合100 μg的流感抗體,於室溫下攪拌約3小時,使抗體與金膠體結合。以最終濃度成為1%的方式添加牛血清白蛋白溶液,於室溫下攪拌2小時而將金膠體表面封閉。以12000 rpm於4℃下進行5分鐘離心分離而回收,懸浮於含有0.2%牛血清白蛋白的緩衝液中而製作金膠體標記抗體。
使用所製作的金膠體標記抗體,進行下述所示的利用免疫層析法的測定,對金膠體的性能進行評價。
(評價方法)
評價是與比較例1同樣地進行。
(評價順序)
於96孔板的各孔中分別加入3 μl的金膠體標記抗體,分別混合100 μl的APC的2倍稀釋列(1倍~1024倍)及陰性對照。繼而,於流感A型評價用單株篩選中添加50 μl,評價5分鐘後、10分鐘後、15分鐘後的顯色水準。顯色水準是使用金膠體判定用顏色樣本(艾德特克(Adtec)公司製造)來判定。將其結果示於以下。
根據所述表13確認到,金膠體標記抗體對32倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[比較例3]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](1.00 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於300 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,48.00 g)及二乙烯基苯(DVB,2.00 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於18.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.500 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑420 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、60分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(50 ml)中添加1233 ml的純水後,添加30 mM的氯化金酸水溶液(100 ml),於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化金酸去除。其後,進行濃度調整,製備2.5 wt%的金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於1580 ml的純水中添加所述2.5 wt%的金離子吸附樹脂粒子分散液(42.4 ml),一面以160 rpm於20℃下攪拌,一面用2分鐘滴加528 mM的二甲基胺硼烷水溶液(10 ml)後,於室溫下攪拌2小時,由此獲得平均粒徑438 nm的樹脂-金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化、濃度調整,由此獲得1 wt%的樹脂-金複合體分散液。關於所製作的樹脂-金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.98。另外,所形成的金粒子的平均粒徑為25.0 nm,金的擔載量為54.7 wt%。於該樹脂-金複合體中,金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附金粒子,至少一部分金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
使用所得的樹脂-金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b為○,但結合用緩衝液c為×。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值3.0(結合用緩衝液a)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
於1 ml(0.1 wt%)的所得的樹脂-金複合體分散液中混合100 μg的流感抗體,於室溫下攪拌約3小時而使抗體與樹脂-金複合體結合。以最終濃度成為1%的方式添加牛血清白蛋白溶液,於室溫下攪拌2小時而將樹脂-金複合體表面封閉。以12000 rpm於4℃下進行5分鐘離心分離而回收,懸浮於含有0.2%牛血清白蛋白的緩衝液中而製作樹脂-金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表14確認到,樹脂-金複合體標記抗體對256倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[比較例4]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](2.00 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於300 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,48.00 g)及二乙烯基苯(DVB,2.00 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於18.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.500 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑380 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、60分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(50 ml)中添加1233 ml的純水後,添加30 mM的氯化金酸水溶液(100 ml),於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化金酸去除。其後,進行濃度調整,製備2.5 wt%的金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於1580 ml的純水中添加所述2.5 wt%的金離子吸附樹脂粒子分散液(42.4 ml),一面以 160 rpm於20℃下攪拌,一面用2分鐘滴加528 mM的二甲基胺硼烷水溶液(10 ml)後,於室溫下攪拌2小時,由此獲得平均粒徑399 nm的樹脂-金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化、濃度調整,由此獲得1 wt%的樹脂-金複合體分散液。關於所製作的樹脂-金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.96。另外,所形成的金粒子的平均粒徑為25.0 nm,金的擔載量為53.2 wt%。於該樹脂-金複合體中,金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附金粒子,至少一部分金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。再者,金粒子的100%存在於表層部中。
使用所得的樹脂-金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b為○,但結合用緩衝液c為×。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值3.0(結合用緩衝液a)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
進行與比較例3相同的操作,製作樹脂-金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表15確認到,樹脂-金複合體標記抗體對256倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[比較例5]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](3.00 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於300 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,49.50 g)及二乙烯基苯(DVB,0.50 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於18.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.250 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑370 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、60分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(50 ml)中添加1233 ml的純水後,添加30 mM的氯化金酸水溶液(100 ml),於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化金酸去除。其後,進行濃度調整,製備2.5 wt%的金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於1580 ml的純水中添加所述2.5 wt%的金離子吸附樹脂粒子分散液(42.4 ml),一面以160 rpm於20℃下攪拌,一面用2分鐘滴加528 mM的二甲基胺硼烷水溶液(10 ml)後,於室溫下攪拌2小時,由此獲得平均粒徑393 nm的樹脂-金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化、濃度調整,由此獲得1 wt%的樹脂-金複合體分散液。關於所製作的樹脂-金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.92。另外,所形成的金粒子的平均粒徑為14.9 nm,金的擔載量為55.8wt%。於該樹脂-金複合體中,金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附金粒子,至少一部分金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。再者,金粒子的71%存在於表層部中。
使用所得的樹脂-金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b為○,但結合用緩衝液c為×。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值3.0(結合用緩衝液a)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
進行與比較例3相同的操作,製作樹脂-金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表16確認到,樹脂-金複合體標記抗體對64倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[比較例6]
<樹脂粒子的合成>
於450 g的純水中添加2-乙烯基吡啶(2-VP,9.945 g)及二乙烯基苯(DVB,0.097 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於10.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.100 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑290 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、60分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(50 ml)中添加1233 ml的純水後,添加30 mM的氯化金酸水溶液(100 ml),於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化金酸去除。其後,進行濃度調整,製備2.5 wt%的金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於1580 ml的純水中添加所述2.5 wt%的金離子吸附樹脂粒子分散液(42.4 ml),一面以160 rpm於20℃下攪拌,一面用4分鐘滴加528 mM的二甲基胺硼烷水溶液(10 ml)與528 mM的硼酸水溶液(10 ml)的混合溶液後,於室溫下攪拌2小時,由此獲得平均粒徑295 nm的樹脂-金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化、濃度調整,由此獲得1 wt%的樹脂-金複合體分散液。關於所製作的樹脂-金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為1.35。另外,所形成的金粒子的平均粒徑為9.0 nm,金的擔載量為50.4 wt%。於該樹脂-金複合體中,金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附金粒子,至少一部分金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
使用所得的樹脂-金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b為○,但結合用緩衝液c為×。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值3.0(結合用緩衝液a)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
進行與比較例3相同的操作,製作樹脂-金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表17確認到,樹脂-金複合體標記抗體對64倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
[比較例7]
<樹脂粒子的合成>
於450 g的純水中添加2-乙烯基吡啶(2-VP,9.90 g)及二乙烯基苯(DVB,0.10 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於10.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.100 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑110 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、120分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(50 ml)中添加1233 ml的純水後,添加30 mM的氯化金酸水溶液(100 ml),於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化金酸去除。其後,進行濃度調整,製備2.5 wt%的金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於1580 ml的純水中添加所述2.5 wt%的金離子吸附樹脂粒子分散液(42.4 ml),一面以160 rpm於20℃下攪拌,一面用4分鐘滴加528 mM的二甲基胺硼烷水溶液(10 ml)與528 mM的硼酸水溶液(10 ml)的混合溶液後,於室溫下攪拌2小時,由此獲得平均粒徑120 nm的樹脂-金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化、濃度調整,由此獲得1 wt%的樹脂-金複合體分散液。關於所製作的樹脂-金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為1.14。另外,所形成的金粒子的平均粒徑為13.0 nm,金的擔載量為52.0 wt%。於該樹脂-金複合體中,金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附金粒子,至少一部分金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
使用所得的樹脂-金複合體,依照所述「分散性的評價」,對使抗體結合時的分散性進行評價,結果結合用緩衝液a、結合用緩衝液b為○,但結合用緩衝液c為×。因此,於以下的免疫層析的評價中,以pH值3.0(結合用緩衝液a)來進行流感抗體的結合及利用牛血清白蛋白的封閉。
<免疫層析的評價>
進行與比較例3相同的操作,製作樹脂-金複合體標記抗體分散液。
使用所製作的樹脂-金複合體標記抗體分散液,進行利用免疫層析法的測定,對該樹脂-金複合體分散液的性能進行評價。將其結果示於以下。
根據所述表18確認到,樹脂-金複合體標記抗體對32倍稀釋的抗原顯示出良好的顯色。
將以上的比較例1~比較例7中的570 nm下的吸光度的測定結果彙總示於表19中。
[實施例10]
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](1.00 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於300 g的純水中後,添加4-乙烯基吡啶(4-VP,48.00 g)及二乙烯基苯(DVB,2.00 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於18.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.500 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑438 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、45分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(90 ml)中添加245 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(90 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後,以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑447 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整,由此獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.80。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為5 nm,白金的擔載量為37.5 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面 吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
[實施例11]
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](1.00 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於300 g的純水中後,添加3-乙烯基吡啶(3-VP,48.00 g)及二乙烯基苯(DVB,2.00 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於18.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.500 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑429 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、45分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(90 ml)中添加245 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(90 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後,以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑436 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整,由此獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.81。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為5 nm,白金的擔載量為38.1 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
[實施例12]
將甲基丙烯酸-2-(二異丙基胺基)乙酯(DPA、10.3 g)、聚(丙二醇)二丙烯酸酯(0.2 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,2.0 g)溶解於85 g的純水中後,於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於70℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於2.00 g的純水中的過氧二硫酸銨(ASP,0.10 g),以150 rpm於70℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑338 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、45分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(90 ml)中添加245 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(90 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後,以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑351 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整,由此獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.75。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為6 nm,白金的擔載量為37.9 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
[實施例13]
於實施例9中製作的1 wt%的樹脂-白金複合體分散液(45 ml)中,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(36 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(2500 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備10 wt%的吸附有白金離子的樹脂-白金複合體分散液。
繼而,於383 ml的純水中添加所述10 wt%的吸附有白金離子的樹脂-白金複合體分散液(5.5 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用120分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後,以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑454 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(2500 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整,由此獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為1.02。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為38 nm,白金的擔載量為51.0 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
[實施例14]
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](0.50 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於300 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,48.00 g)及二乙烯基苯(DVB,2.00 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用0.5分鐘滴加已溶解於18.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.500 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑613 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、40分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(90 ml)中添加245 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(90 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後,以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑675 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整,由此獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.85。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為7 nm,白金的擔載量為38.2 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
[實施例15]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](5.00 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於389.5 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,48.00 g)及二乙烯基苯(DVB,2.00 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於50.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.500 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑200 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、60 分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(80 ml)中添加308 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(12 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(5100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後,以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑205 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(5100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整,由此獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.17。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為5 nm,白金的擔載量為7.1 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
[實施例16]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](5.00 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,10.00 g)溶解於389.5 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,48.00 g)及二乙烯基苯(DVB,2.00 g),於氮氣氣流下以150 rpm於30℃下攪拌50分鐘,繼而於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用2分鐘滴加已溶解於50.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.500 g),以150 rpm於60℃下攪拌3.5小時,由此獲得平均粒徑200 nm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、60分鐘)使其沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該操作進行3次後,藉由透析處理將雜質去除。其後,進行濃度調整而獲得10 wt%的樹脂粒子分散液。
於所述樹脂粒子分散液(80 ml)中添加296 ml的純水後,添加400 mM的氯化白金酸水溶液(12 ml),以60 rpm於30℃下攪拌3小時後,於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(5100 rpm、30分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,將該作業重複3次,由此將多餘的氯化白金酸去除。其後,進行濃度調整,製備5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液。
繼而,於3825 ml的純水中添加所述5 wt%的白金離子吸附樹脂粒子分散液(55 ml),一面以160 rpm於3℃下攪拌,一面用20分鐘滴加132 mM的二甲基胺硼烷水溶液(110 ml)後,以160 rpm於3℃下攪拌1小時。其後,以160 rpm於25℃下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑210 nm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(5100 rpm、60分鐘)使所述樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,將該作業重複3次後,藉由透析處理進行純化,由此去除雜質。其後,進行濃度調整,由此獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於所製作的樹脂-白金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.33。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為5 nm,白金的擔載量為15.4 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
[實施例17]
對於實施例3中所得的樹脂-白金複合體,進一步進行1次使所述白金離子吸附的步驟、及利用二甲基胺硼烷水溶液的還原步驟(總計2次),由此獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。依照所述方法對如此所製作的樹脂-白金複合體分散液的吸光度進行測定,結果為1.07。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為9 nm,白金的擔載量為51.0 wt%,樹脂-白金複合體的平均粒徑為399 nm。
另外,進一步進行2次使所述白金離子吸附的步驟、及利用二甲基胺硼烷水溶液的還原步驟(總計4次),由此獲得樹脂-白金複合體分散液。依照所述方法對如此所製作的樹脂-白金複合體的1 wt%分散液的吸光度進行測定,結果為1.24。另外,所形成的白金粒子的平均粒徑為11 nm,白金的擔載量為59.1 wt%,樹脂-白金複合體的平均粒徑為403 nm。
將以上的實施例10~實施例17中的700 nm下的吸光度的測定結果彙總示於表20及表21中。
[與標記抗體的製作有關的試驗例]
[製作例1]
<樹脂粒子的合成>
將阿麗誇特(Aliquat)336[奧德里奇(Aldrich)公司製造](1.00 g)及聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMA,2.00 g)溶解於80 g的純水中後,添加2-乙烯基吡啶(2-VP,9.90 g)及二乙烯基苯(DVB,0.100 g),於氮氣氣流下以250 rpm於60℃下攪拌30分鐘。攪拌後,用5分鐘滴加已溶解於9.00 g的純水中的2,2-偶氮雙(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽(AIBA,0.100 g),以250 rpm於60℃下攪拌6小時,由此獲得平均粒徑0.36 μm的樹脂粒子。藉由離心分離(9000 rpm、10分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除後,使其再次分散於純水中,獲得2.1 wt%的樹脂粒子分散液。
<樹脂-白金複合體的合成>
於2.1 wt%的樹脂粒子分散液(7.62 g)中添加30 mM的氯化白金酸水溶液(42.7 g),於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3000 rpm、10分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,由此將多餘的氯化白金酸去除後,使其再次分散於16 g的純水中,製備白金離子吸附樹脂粒子分散液。用2分鐘將白金離子吸附樹脂粒子分散液(16 g)滴加至3.3 mM的二甲基胺硼烷水溶液(640 ml)中後,於3℃下攪拌1小時,進而於室溫下攪拌3小時,由此獲得平均粒徑0.37 μm的樹脂-白金複合體。藉由離心分離(3000 rpm、120分鐘)使該樹脂-白金複合體沈澱,將上清液去除後,添加適量的純水而再次使其分散,藉由超濾膜進行純化,由此獲得1 wt%的樹脂-白金複合體分散液。關於該樹脂-白金複合體分散液中的樹脂-白金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為0.70。另外,所述樹脂-白金複合體分散液中的樹脂-白金複合體中的白金粒子的平均粒徑為3 nm,白金的擔載量為33.3 wt%。於該樹脂-白金複合體中,白金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包白金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出白金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附白金粒子,至少一部分白金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
[製作例2]
<樹脂-金複合體的合成>
於製作例1中所合成的2.1 wt%的樹脂粒子分散液(19.09 g)中添加30 mM的氯化金酸水溶液(106.6 g),於室溫下放置24小時。其後,藉由離心分離(3000 rpm、10分鐘)使樹脂粒子沈澱,將上清液去除,由此將多餘的氯化金酸去除後,使其再次分散於40 g的純水中,製備金離子吸附樹脂粒子分散液。用4分鐘將金離子吸附樹脂粒子分散液(20 g)滴加至3.3 mM的二甲基胺硼烷水溶液(600 ml)中後,於8℃下攪拌1小時,進而於室溫下攪拌5小時,由此獲得平均粒徑0.38 μm的樹脂-金複合體。藉由離心分離(3000 rpm、120分鐘)使樹脂-金複合體沈澱,將上清液去除後,添加適量的純水而再次使其分散,藉由超濾膜進行純化,由此獲得1 wt%的樹脂-金複合體分散液。關於該樹脂-金複合體分散液中的樹脂-金複合體的吸光度,依照所述方法進行測定,結果為1.0。另外,樹脂-金複合體中的金粒子的平均粒徑為22.0 nm,金的擔載量為49.1 wt%。於該樹脂-金複合體中,金粒子包含完全內包於樹脂粒子內的內包金粒子、具有包埋於樹脂粒子內的部位及於樹脂粒子外露出的部位的局部露出金粒子、及吸附於樹脂粒子的表面的表面吸附金粒子,至少一部分金粒子於樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
[試劑等]
於試驗例、參考試驗例中使用以下試劑等。
抗流感A型單株抗體(7.15 mg/mL/PBS):艾德特克(Adtec)股份有限公司製造
結合用緩衝液a:以NaOH將100 mM的硼酸溶液調整為pH值≒8.5。
結合用緩衝液b:以NaOH將100 mM的硼酸溶液調整為pH值≒7.5。
封閉用緩衝液a:以HCl將1重量%牛血清白蛋白溶液調整為pH值≒8.5。
封閉用緩衝液b:以HCl將1重量%牛血清白蛋白溶液調整為pH值≒9.5。
清洗用緩衝液:以HCl將5 mM的托立斯溶液調整為pH值≒8.5。
保存用緩衝液:於清洗用緩衝液中以成為10重量%濃度的方式添加有蔗糖。
流感A型陽性對照(APC):使用樣本處理液(艾德特克(Adtec)股份有限公司製造)將流感A型病毒鈍化抗原(艾德特克(Adtec)股份有限公司製造)稀釋100倍而製備。APC的抗原濃度相當於5000 FFU/ml。
陰性對照:樣本處理液(艾德特克(Adtec)股份有限公司製造)
PtNCP珠(beads):製作例1中所得的樹脂-白金複合體(1重量%;平均粒徑370 nm)
AuNCP珠:製作例2中所得的樹脂-金複合體(1重量%;平均粒徑380 nm)
[試驗例1]
(結合步驟)
於微管[艾比斯(Ibis)(註冊商標;亞速旺(As-One)公司製造)2 mL]中,投入0.1 mL的PtNCP珠作為樹脂-金屬複合體,添加0.9 mL的結合用緩衝液a。藉由顛倒混合而充分混合後,添加100 μg的抗流感A型單株抗體,於室溫下用3小時進行顛倒攪拌,獲得含有經樹脂-白金複合體標記的抗流感A型單株抗體的含標記抗體的溶液A-1。
(封閉步驟)
繼而,將含有標記抗體的溶液A-1加以冰浴冷卻後,以12000 rpm用5分鐘進行離心分離,將上清液去除後,於固體成分殘渣中添加1 mL的封閉用緩衝液a,用10秒鐘~20秒鐘進行超音波分散處理,進而於室溫下用2小時進行顛倒攪拌,獲得含有標記抗體的溶液B-1。
(清洗處理)
繼而,將含有標記抗體的溶液B-1加以冰浴冷卻後,以12000 rpm用5分鐘進行離心分離,將上清液去除後,於固體成分殘渣中添加1 mL的清洗用緩衝液,用10秒鐘~20秒鐘進行超音波分散處理。將該操作重複3次而作為清洗處理。
(保存處理)
繼而,冰浴冷卻後,以12000 rpm用5分鐘進行離心分離,將上清液去除後,於固體成分殘渣中添加1 mL的保存用緩衝液,用10秒鐘~20秒鐘進行超音波分散處理,由此獲得含有標記抗體的溶液C-1。
<性能評價>
於96孔板的12孔中分別加入3 μL的含有標記抗體的溶液C-1,分別混合100 μL的APC的2倍稀釋列(1倍~1024倍稀釋,分別表示為APC×1~APC×1024)及陰性對照。繼而,於流感A型評價用單株篩選中添加50 μL,評價5分鐘後、10分鐘後、15分鐘後的顯色水準。將其結果示於表22中。再者,表22中的數值越大,意味著顯色水準越高(顯色越強)。
根據表22確認到,含有標記抗體的溶液C-1對256倍稀釋的抗原亦顯示出良好的顯色,具有優異的標記性能。
[參考試驗例1]
於試驗例1的結合步驟中使用AuNCP珠代替PtNCP珠,且使用結合用緩衝液b代替結合用緩衝液a的情形時,樹脂-金複合體會凝集,故難以獲得含有標記抗體的溶液。
[參考試驗例2]
於試驗例1的結合步驟中使用AuNCP珠代替PtNCP珠的情形時,樹脂-金複合體會凝集,故難以獲得含有標記抗體的溶液。
[參考試驗例3]
於試驗例1的結合步驟中使用AuNCP珠代替PtNCP珠,且於封閉步驟中使用封閉用緩衝液b代替封閉用緩衝液a,結果樹脂-金複合體會凝集,故難以獲得含有標記抗體的溶液。
以上,以例示的目的對本發明的實施形態進行了詳細說明,但本發明不受所述實施形態的限制。例如於所述實施形態中,對將本發明的樹脂-白金複合體應用於免疫學測定的情形進行了詳細敍述。然而,本發明的樹脂-白金複合體不限於免疫學測定,亦可應用於其他用途中。尤其本發明的樹脂-白金複合體於與抗原或抗體等配體結合的狀態下發揮優異的分散性,故適於用於醫藥等用途中。
10‧‧‧樹脂粒子
20‧‧‧白金粒子
30‧‧‧內包粒子
40‧‧‧局部露出粒子
50‧‧‧表面吸附粒子
60‧‧‧表層部
100‧‧‧樹脂-白金複合體
110‧‧‧薄膜
120‧‧‧試樣添加部
130‧‧‧判定部
131‧‧‧捕捉配體
140‧‧‧吸液部
150‧‧‧標記抗體
160‧‧‧分析物
170‧‧‧複合體
200‧‧‧測試條
D1~D3‧‧‧粒徑
圖1為表示本發明的一實施形態的樹脂-白金複合體的剖面的結構的示意圖。
圖2A為表示樹脂-白金複合體的一態樣的剖面的結構的示意圖。
圖2B為表示樹脂-白金複合體的另一態樣的剖面的結構的示意圖。
圖3為表示使用本發明的一實施形態的側向流型層析用測試條的分析物的測定方法的概要的說明圖。
圖4為表示樹脂-金屬複合體標記抗體的分散性評價的結果的一例的照片。
圖5為實施例2中所得的樹脂-白金複合體的掃描式電子顯微鏡(Scanning Electronic Microscopy,SEM)照片。
圖6為實施例2中所得的樹脂-白金複合體的剖面的掃描式穿透電子顯微鏡(Scanning Transmission Electronic Microscopy,STEM)照片。
10‧‧‧樹脂粒子
20‧‧‧白金粒子
30‧‧‧內包粒子
40‧‧‧局部露出粒子
50‧‧‧表面吸附粒子
60‧‧‧表層部
100‧‧‧樹脂-白金複合體
D1~D3‧‧‧粒徑
Claims (18)
- 一種樹脂-白金複合體,包括:樹脂粒子、及與所述樹脂粒子相比而較小的多個白金粒子,且將多個所述白金粒子固定於所述樹脂粒子上,並且包含具有包埋於所述樹脂粒子內的部位及於所述樹脂粒子外露出的部位的白金粒子,所述樹脂粒子為含氮聚合物粒子或者可吸附陽離子性離子的聚合物。
- 如申請專利範圍第1項所述的樹脂-白金複合體,其中所述白金粒子中的至少一部分粒子於所述樹脂粒子的表層部中三維地分佈。
- 如申請專利範圍第1項所述的樹脂-白金複合體,其中多個所述白金粒子直接固定於所述樹脂粒子上。
- 如申請專利範圍第1項所述的樹脂-白金複合體,其中所述白金粒子的平均粒徑為1nm~80nm的範圍內。
- 如申請專利範圍第4項所述的樹脂-白金複合體,其平均粒徑為50nm~1000nm的範圍內。
- 如申請專利範圍第1項所述的樹脂-白金複合體,其中所述白金粒子的平均粒徑為1nm~50nm的範圍內。
- 如申請專利範圍第1項所述的樹脂-白金複合體,其中所述白金粒子的平均粒徑為1nm~30nm的範圍內。
- 如申請專利範圍第1項所述的樹脂-白金複合體,其中所述白金粒子的平均粒徑為1nm~15nm的範圍內。
- 如申請專利範圍第6項所述的樹脂-白金複合體,其平均粒徑為100nm~600nm的範圍內。
- 如申請專利範圍第1項所述的樹脂-白金複合體,其中相對於樹脂-白金複合體的重量,所述白金粒子的擔載量為5wt%~70wt%的範圍內。
- 如申請專利範圍第1項所述的樹脂-白金複合體,其中所述樹脂粒子為於結構中具有可吸附白金離子的取代基的聚合物粒子。
- 一種標記物質,包括如申請專利範圍第1項所述的樹脂-白金複合體。
- 如申請專利範圍第12項所述的標記物質,其是使抗原或抗體吸附於所述樹脂-白金複合體的表面而使用。
- 一種免疫學測定法,使用如申請專利範圍第12項所述的標記物質。
- 一種免疫學測定用試劑,包括如申請專利範圍第1項所述的樹脂-白金複合體。
- 一種分析物的測定方法,其是對試樣中所含的分析物進行檢測或定量,並且所述分析物的測定方法的特徵在於:使用側向流型層析用測試條進行包括下述步驟(I)~步驟(III)的步驟,其中所述側向流型層析用測試條含有薄膜、及將 與所述分析物特異地結合的捕捉配體固定於所述薄膜上而成的判定部;步驟(I):使試樣所含的所述分析物與標記抗體接觸的步驟,其中所述標記抗體是以如申請專利範圍第1項所述的樹脂-白金複合體將與所述分析物特異地結合的抗體標記而成;步驟(II):於所述判定部中,使步驟(I)中形成的含有分析物及標記抗體的複合體與捕捉配體接觸的步驟;步驟(III):對所述樹脂-白金複合體的定域型表面電漿子共振、及來源於由電子遷移所致的光能吸收的顯色強度進行測定的步驟。
- 一種用以對分析物進行檢測或定量的分析物測定用套組,其是使用側向流型層析用測試條,而用以對試樣中所含的分析物進行檢測或定量的分析物測定用套組,其包含:側向流型層析用測試條,含有薄膜、及將與所述分析物特異地結合的捕捉配體固定於所述薄膜上而成的判定部;以及檢測試劑,含有標記抗體,所述標記抗體是以如申請專利範圍第1項所述的樹脂-白金複合體將與所述分析物特異地結合的抗體標記而成。
- 一種側向流型層析用測試條,用以對試樣中所含的分析物進行檢測或定量,並且所述側向流型層析用測試條含有:薄膜;判定部,其是於所述試樣展開的方向上,將與所述分析物特 異地結合的捕捉配體固定於所述薄膜上而成;及反應部,位於較該判定部更靠上游側,且含有標記抗體,所述標記抗體是以如申請專利範圍第1項所述的樹脂-白金複合體將與所述分析物特異地結合的抗體標記而成。
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