TW202102853A - 磁響應性粒子及使用其之免疫測定方法、免疫測定用試藥 - Google Patents

Abstract

本發明係一種感應磁響應性粒子，其具備：磁響應性粒子，該磁響應性粒子具有核心粒子及至少一層以上之磁性層，該磁性層配置於核心粒子上且由具有磁性之金屬及/或其氧化物之微粒子所構成；及與載持於磁響應性粒子上之目標物產生特異性作用之物質；且磁響應性粒子之重量平均粒徑之變異係數為15%以下。本發明提供一種具有優異之磁分離性之磁響應性粒子。

Description

磁響應性粒子及使用其之免疫測定方法、免疫測定用試藥

本發明係關於一種用於免疫測定用試藥之磁響應性粒子及使用其之免疫測定方法、免疫測定試藥。

先前，作為由包含活體內物質之試樣測定或精製作為目標之蛋白質等之方法，已知有如下方法：使與目標物產生特異性作用之物質於固相載體固定化，與活體試樣中之目標物鍵結，藉由進行洗淨而將未鍵結之目標物以外之物質去除，從而測定鍵結於固相載體之目標物之量。

於將未鍵結之物質去除時，就容易分離、回收之方面而言，作為固相載體，使用有磁響應性粒子。作為此種粒子，例如於專利文獻1中，記載有於核粒子之表面形成有磁性體層，且於其上形成有聚合物層之臨床檢查藥用粒子。然而，所揭示之粒子只能獲得粒徑較寬之粒子。

於專利文獻2中，揭示有藉由使非磁性金屬氧化物於磁性體混合存在下進行縮聚，而磁性體含有率顯著提高，於免疫測定中實現較高之感度之粒子。然而，於所揭示之製造方法中，只能獲得粒度分佈較寬之粒子，故而於用作臨床檢查藥之情形時，有測定再現性惡化之問題、或若磁性體含有率過高則對免疫反應產生影響而無法準確測定之虞。又，所揭示之粒子係於非磁性氧化物中包含超常磁性金屬氧化物粒子者，由於比重較高、沈澱性較高，故而有於製成免疫測定試藥時難以操作之問題。 [先前技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：日本特開2004-205481 專利文獻2：日本特開2013-019889

[發明所欲解決之課題]

本發明之目的在於提供一種具有優異之磁分離性、可實現高感度之免疫測定用試藥、用於其之磁響應性粒子。 [解決課題之技術手段]

本發明者等人為了解決上述之課題而進行了努力研究，結果發現：藉由將每個磁響應性粒子之磁性體含有率設為固定，可獲得磁分離性良好、實現高感度之免疫測定試藥之磁響應性粒子。即，本發明係關於以下之內容。 [1]一種感應磁響應性粒子，其具備：磁響應性粒子，該磁響應性粒子具有核心粒子及至少一層以上之磁性層，該磁性層配置於核心粒子上且由具有磁性之金屬及/或其氧化物之微粒子所構成；及與載持於磁響應性粒子上之目標物產生特異性作用之物質；且磁響應性粒子之重量平均粒徑之變異係數為15%以下。 [2]如[1]之感應磁響應性粒子，其中，磁響應性粒子之體積平均粒徑之變異係數為20%以下。 [3]一種感應磁響應性粒子，其具備：磁響應性粒子，該磁響應性粒子具有核心粒子及至少一層以上之磁性層，該磁性層配置於核心粒子上且由具有磁性之金屬及/或其氧化物之微粒子所構成；及與載持於磁響應性粒子上之目標物產生特異性作用之物質；且感應磁響應性粒子之重量平均粒徑之變異係數為15%以下。 [4]如[3]之感應磁響應性粒子，該感應磁響應性粒子之體積平均粒徑之變異係數為20%以下。 [5]如[1]至[4]中任一項之感應磁響應性粒子，其中，於磁性層與目標物產生特異性作用之物質之間，進而具有由非磁性之金屬氧化物及/或有機金屬化合物所構成之非磁性層。 [6]如[1]至[5]中任一項之感應磁響應性粒子，其中，與目標物產生特異性作用之物質藉由1段或多段之反應而化學鍵結於磁性層上。 [7]如[1]至[6]中任一項之感應磁響應性粒子，其中，與目標物產生特異性作用之物質經由1段或多段之化學鍵結而鍵結於非磁性層上。 [8]一種異質性免疫測定方法，其係使用[1]至[7]中任一項之感應磁響應性粒子。 [9]一種免疫測定試藥，其係使用[1]至[7]中任一項之感應磁響應性粒子。 [發明之效果]

根據本發明，提供一種均勻地含有磁性體、具有優異之磁分離性、且表面上之目標物之鍵結阻礙極少之磁響應性粒子及使用其之發揮較高之性能之免疫測定用試藥。

以下，列舉實施形態而進行本發明之說明，但本發明並不限定於以下之實施形態。

1.磁響應性粒子及其製法 以下，對各要素等詳細地說明。

1.1核心粒子 本發明之磁響應性粒子具有配置於成為核心之粒子（核心粒子）上之至少一層以上之由具有磁性之金屬及/或其氧化物之微粒子所構成之磁性層。 本發明之核心粒子可為無機材料，亦可為有機材料，並無特別限定，但於用於免疫測定試藥之情形時，比重較小者之分散性優異，故而較佳為使用樹脂構成之樹脂粒子。樹脂粒子基本上為非磁性物質，例如可使用聚合物等有機物質。

作為構成上述樹脂粒子之材料，並無特別限定，例如可列舉：聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚四氟乙烯、聚異丁烯、聚丁二烯等聚烯烴；聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸甲酯等丙烯酸樹脂；丙烯酸酯與二乙烯苯之共聚樹脂；聚對苯二甲酸烷二酯；聚碸；聚碳酸酯；聚醯胺；苯酚-甲醛樹脂；三聚氰胺-甲醛樹脂；苯并胍胺甲醛樹脂；脲甲醛樹脂等。構成該等樹脂微粒子之材料可單獨使用，亦可併用兩種以上。

於本發明中，核心粒子之平均粒徑較佳為0.5〜10 μm，進而較佳為1〜5 μm，最佳為2.5〜4 μm。若核心粒子之平均粒徑未達0.5 μm，則每一個粒子之磁性體可附著之面積較小，有無法獲得充分之磁分離性之情形。又，若核心粒子之平均粒徑超過10 μm，則於使磁性體附著後用作生物化學用載體之情形時，有作為反應場之表面積較小之情形。

所謂磁分離性，係表示磁響應性粒子對磁鐵之響應性之指標，可於磁響應性粒子水分散液中放入磁鐵，例如利用分光光度計（日立製作所製造之U-3900H）算出伴隨時間經過之吸光度之衰減率而進行評價。衰減率越大，則對磁鐵之響應性越良好，可謂為於用作免疫測定用試藥之情形時，可短時間且高效率地分離目標物之磁響應性粒子。

又，關於核心粒子之體積平均粒徑之變異係數（CV值），為20%以下，較佳為15%以下，更佳為10%以下。若於核心使用CV值較大之粒子，則每一個粒子之表面積有偏差，於形成磁性層時，有使磁性體被覆量產生偏差之可能性。被覆量之偏差與磁分離性之偏差有關，於用作免疫測定試藥時，可能會導致測定再現性之惡化，故而不理想。關於粒徑之控制，於核心粒子之製造步驟中進行粒徑控制之方法、於製作核心粒子後藉由分級而進行粒徑控制之方法均可應用，又，亦可將該等方法併用。

本發明中之平均粒徑例如可藉由下述方式求出：利用掃描式電子顯微鏡（Hitachi High-Technologies股份有限公司製造之「S-4800」）觀察粒子，將於觀察圖像中隨機地選擇之50個各粒子之最大直徑進行算術平均。

本發明中之體積平均粒徑係例如利用雷射繞射散射法粒度分佈測定裝置（Beckman Coulter公司製造之「LS 13 320」）進行測定所獲得之體積平均粒徑。

上述核心粒子亦可於粒子表面具備反應性官能基。其例如可用作被覆磁性體時之鍵結場等。

上述核心粒子亦可使用吸附或吸收有液體物質或固體物質微粉末之粒子。藉此，可獲得內部或/及表面包含上述液體物質或固體物質之磁性體被覆粒子。再者，上述物質之吸收或吸附意指於粒子表面及細孔內部之吸收或吸附、或附著等，該吸收及吸附可藉由先前公知之方法、例如含浸等而實施。

1.2磁性體 於本發明中，被覆核心粒子表面之具有磁性之金屬及/或具有磁性之金屬氧化物可使用僅單獨一種，亦可將兩種以上組合而使用。又，該金屬及/或金屬氧化物亦可於粒子表面具備反應性官能基。其可用作例如被覆核心粒子時之鍵結場。

關於上述具有磁性之金屬及/或具有磁性之金屬氧化物，就磁分離性之觀點而言，較佳為包含選自週期表第4〜6週期之第8〜10族記載之金屬、及鑭系元素中之至少一種。或者，較佳為氧化鐵系之物質、具體而言為MFe₂ O₄ （M＝Co、Ni、Mn、Zn、Mg、Cu、Li_0.5 Fe_0.5 等）所表示之鐵氧體、Fe₃ O₄ 所表示之磁鐵礦、或γFe₂ O₃ 。尤其作為飽和磁化較強且剩餘磁化較少之磁材料，最佳為Fe₃ O₄ 、γFe₂ O₃ 。

1.3磁性層 於本發明中之磁性體被覆粒子（以下，於本說明書中稱為「磁響應性粒子」）中，藉由使具有磁性之金屬及/或金屬氧化物吸附於核心粒子之表面而形成磁性層。此處，金屬及/或金屬氧化物可藉由物理吸附或化學鍵結而被覆於樹脂粒子之表面。本發明中之所謂金屬及/或金屬氧化物之物理吸附，係指不伴隨化學反應之吸附、鍵結，作為例，可列舉：熔融鍵結或吸附、融合鍵結或吸附、氫鍵結、凡得瓦鍵結、靜電相互作用、異質凝聚等。藉由化學鍵結之被覆係指於樹脂粒子表面、及該金屬及/或金屬氧化物表面，各者所具備之官能基藉由化學反應而鍵結，從而使該金屬及/或金屬氧化物載持於核心粒子表面。其中，就製備之簡便性而言，更佳為藉由物理吸附之被覆。

亦可對同一核心粒子，使用具有磁性之金屬及/或金屬氧化物，實施複數次複合化，而製造磁響應性粒子。於各步驟中，用於複合化之金屬及/或金屬氧化物並無特別限制，可使用僅單獨一種，亦可將兩種以上組合而使用。又，金屬及/或金屬氧化物之添加方法並無特別限制，可為一次性方式、分批方式或連續添加方式之任一種。又，於將兩種以上以任意之比率組合而使用之情形時，添加順序並無特別限制，可以任意之順序及組合進行添加，例如可將全部混合而添加，亦可將全部分開添加，亦可將一部分混合並將另一部分分開添加等。關於添加次數，並無特別限制。

又，亦可視需要於複合時添加磁性體以外之功能性物質作為形成磁性層之物質。關於此種功能性物質之種類，並無特別限制，可根據複合化之目的而自有機物質或無機物質中適宜選擇，不限於僅單獨一種，亦可將兩種以上組合而使用。此處所謂之目的，係指例如追加電性之賦予或著色等磁分離性之賦予以外之功能。

亦可對同一核心粒子，使用磁性體及/或功能性物質，實施複數次複合化。於各步驟中，用於複合化之磁性體及/或功能性物質並無特別限制，可使用僅磁性體，亦可使用僅功能性物質，亦可使用磁性體與功能性物質兩者。又，關於磁性體與功能性物質任一者，可使用僅單獨一種，亦可將兩種以上組合而使用。進而，各者之添加方法並無特別限制，可為一次性方式、分批方式或連續添加方式之任一種。於將兩種以上以任意之比率組合而使用之情形時，添加順序並無特別限制，可以任意之順序及組合進行添加，例如可將全部混合而添加，亦可將全部分開添加，亦可將一部分混合並將另一部分分開添加等。關於添加次數，亦無特別限制。

於對於同一核心粒子使用具有磁性之金屬及/或金屬氧化物而實施複數次複合化之情形時，可於磁性層上形成非磁性層後，進而形成磁性層，亦可將磁性層與非磁性層交替地形成複數層。

磁響應性粒子中之磁性體含有率為10重量%以上，較佳為50重量%以下。若磁性體之含有率為50重量%以上，則作為最終產物之磁響應性粒子之比重亦較大，沈澱性上升，而顧慮粒子之分散性變差。又，若磁性體含有率變高，則相應地使重量平均粒徑之變異係數（CV值）變高，有對製成免疫測定試藥之情形之再現性等產生不良影響之虞。若未達10重量%，則無法獲得充分之磁分離性，於製成免疫測定試藥之情形時，變得難以分離、回收。

磁響應性粒子之分散性可藉由分散率進行評價，可由磁響應性粒子之集磁前之吸光度與集磁及分散後之吸光度而算出吸光度之變化率。分散率為85%以上，較佳為90%以上，進而較佳為95%以上。若分散率未達85%，則有於磁分離後無法使磁性粒子充分地再分散，而使測定精度、測定感度及測定再現性降低之情況。

磁響應性粒子之重量平均粒徑之變異係數（CV值）較佳為15%以下，進而較佳為10%以下。重量平均粒徑之CV值表示粒徑之偏差與密度之偏差。表示CV值越低，則粒徑越均勻且密度越均勻，CV值越高，則粒徑或密度或其兩者越不均勻。本發明之重量平均粒徑之CV值係例如藉由圓盤離心式粒徑分佈測定裝置（CPS Instruments公司製造之「DC24000UHR」）所獲得之值。重量平均粒徑之CV值為10%以下而較低之本發明之粒子中，各粒子間之磁性體含有率（量）一致。因此，與先前之磁響應性粒子相比，磁分離性良好。

磁響應性粒子之平均粒徑較佳為0.5〜10 μm，進而較佳為1〜8 μm，最佳為2〜5 μm。本發明之平均粒徑係例如藉由掃描式電子顯微鏡（Hitachi High-Technologies股份有限公司製造之「S-4800」）所獲得之值。

磁響應性粒子之體積平均粒徑之CV值為20%以下，較佳為15%以下，更佳為10%以下。體積平均粒徑之CV值係反映粒徑之偏差之值，且表示該值越低，則粒徑越均勻，該值越高，則粒徑越不均勻。

磁響應性粒子之磁分離性較佳為40%以上，進而較佳為50%以上，最佳為60%以上。

再者，由金屬及/或金屬氧化物所構成之磁性層為10〜200 nm左右，下述之由金屬氧化物及/或有機金屬化合物所構成之非磁性層為10〜500 nm左右，最終獲得之磁響應性粒子之平均粒徑為0.5〜10 μm左右。

1.4非磁性層 本發明之磁響應性粒子亦可於磁性層表面具有非磁性之金屬氧化物及/或非磁性之有機金屬化合物之層。該非磁性層係為了磁性層之塗佈及/或粒子本身之功能性賦予而形成。

於作為以免疫測定試藥為代表之生物化學用載體之用途中，可根據目的選擇非磁性層之表面之特性。根據以下記載之方法，藉由形成非磁性層，可牢固地防止雜質自粒子之溶出、磁性體本身之溶出、或雜質自磁性層之溶出，尤其可實現作為免疫測定試藥用載體粒子更佳之狀態。

非磁性層可藉由下述方式形成：於粒子之存在下，添加作為主原料之非磁性之金屬氧化物及/或非磁性之有機金屬化合物、及視需要之其他副原料，於液相中進行反應。此時使用之非磁性之金屬氧化物及/或非磁性之有機金屬化合物較佳為具有可與磁性體表面反應之官能基。藉由使用與磁性體表面直接反應之金屬氧化物及/或有機金屬化合物，而使磁性層與非磁性層牢固地鍵結，將密接性保持為較高，於磁性層構成成分之漏出防止及固定化之方面顯示良好之效果。相對於此，於使用以乙烯系單體等為代表之自由基聚合性單體之情形時，不與磁性體直接鍵結，故而磁性層與聚合物層之密接性較差，磁性層構成部分之固定化不充分，且有引起構成成分之漏出或形狀、磁分離性之不穩定化之情況。

使磁性表面與非磁性層反應之方法並無特別限定，例如可列舉：共價鍵結或配位鍵結。

以下，對非磁性層之主原料進行記載。方便起見，僅例示單分子化合物，但只要於1分子內包含一個以上之可與磁性體表面反應之官能基即可，亦可為複數個單分子縮聚而成之二聚物〜多聚物。又，關於包含可與磁性體反應之官能基之數量，並無特別限定。

非磁性之金屬氧化物及/或非磁性之有機金屬化合物較佳為包含選自Si、Ge、Ti、Zr中之至少一種，且如上所述具有可與磁性層表面反應之官能基者。具體而言，可例示：以四乙基正矽酸鹽等烷氧基矽烷及其水解物為代表之矽烷化合物、以鍺四乙氧化物等烷氧基鍺及其水解物為代表之鍺化合物、以鈦四乙氧化物等烷氧基鈦及其水解物為代表之鈦化合物、以鋯四丁氧化物等烷氧基鋯及其水解物為代表之鋯化合物等。此處，鑒於粒子之分散性維持，非磁性層之比重儘量小者較佳，於上述之例示中，最佳為矽烷化合物。

進而，於用於非磁性層之主原料之金屬氧化物及/或有機金屬化合物中，除了與磁性層表面反應之官能基以外，藉由使用具備具有其他功能之部分之金屬氧化物及/或有機金屬化合物，亦可使磁響應性粒子具備源自該金屬氧化物及/或有機金屬化合物之功能。

關於上述具備具有其他功能之部分之金屬氧化物及/或有機金屬化合物，以矽烷化合物為例而詳細地列舉具體例，關於所使用之該金屬氧化物及/或有機金屬化合物，並不限定於該等。

例如可列舉：乙烯基三甲氧基矽烷、乙烯基三乙氧基矽烷、7-辛烯基三甲氧基矽烷等含乙烯基之化合物；2-(3,4-環氧環己基)乙基三甲氧基矽烷、3-縮水甘油氧基丙基甲基二甲氧基矽烷、3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基矽烷、3-縮水甘油氧基丙基甲基二乙氧基矽烷、3-縮水甘油氧基丙基三乙氧基矽烷、8-縮水甘油氧基辛基三甲氧基矽烷等含環氧基之化合物；對苯乙烯基三甲氧基矽烷等含苯乙烯基之化合物；3-甲基丙烯醯氧基丙基甲基二甲氧基矽烷、3-甲基丙烯醯氧基丙基三甲氧基矽烷、3-甲基丙烯醯氧基丙基甲基二乙氧基矽烷、3-甲基丙烯醯氧基丙基三乙氧基矽烷、8-甲基丙烯醯氧基辛基三甲氧基矽烷等含甲基丙烯醯基之化合物；3-丙烯醯氧基丙基三甲氧基矽烷等含丙烯醯基之化合物；N-2-(胺基乙基)-3-胺基丙基甲基二甲氧基矽烷、N-2-(胺基乙基)-3-胺基丙基三甲氧基矽烷、3-胺基丙基三甲氧基矽烷、3-胺基丙基三乙氧基矽烷、3-三乙氧基矽烷基-N-(1,3-二甲基-亞丁基)丙基胺、N-苯基-3-胺基丙基三甲氧基矽烷、N-(乙烯基苄基)-2-胺基乙基-3-胺基丙基三甲氧基矽烷鹽酸鹽、N-2-(胺基乙基)-8-胺基辛基三甲氧基矽烷等含胺基之化合物；三-(三甲氧基矽烷基丙基)異氰尿酸酯等含異氰尿酸酯基之化合物；3-脲基丙基三烷氧基矽烷等含脲基之化合物；3-巰基丙基甲基二甲氧基矽烷、3-巰基丙基三甲氧基矽烷等含巰基之化合物；3-異氰酸基丙基三乙氧基矽烷等含異氰酸基之化合物；3-三甲氧基矽烷基丙基琥珀酸酐等含羧酸酐之化合物；3-三甲氧基矽烷基丙基琥珀酸酐之水解物等含羧酸之化合物等。

其中，於用作生物化學用載體之情形時，較佳為含環氧基之化合物、含胺基之化合物、含巰基之化合物、含羧酸酐之化合物、含羧酸之化合物。又，同樣地亦較佳為於向粒子之導入前後實施官能基轉換，而提高與活體相關物質之反應性者，例如使含乙烯基之化合物-含苯乙烯基之化合物之雙鍵部氧化而環氧化者；以及將含乙烯基之化合物、含苯乙烯基之化合物導入至粒子後，使雙鍵部氧化而成為環氧基者等。

以上所記載之用於非磁性層之主原料之金屬氧化物及/或有機金屬化合物可為單獨一種，亦可為兩種以上之任意之比率之組合。於使用兩種以上之該金屬氧化物及/或有機金屬化合物之情形時，兩種以上之該金屬氧化物及/或有機金屬化合物之組合亦可為如下之任一種：具備具有其他功能之部分之金屬氧化物及/或有機金屬化合物之兩種以上之組合、不具有其他功能之金屬氧化物及/或有機金屬化合物之兩種以上之組合、一種以上之具備具有其他功能之部分之金屬氧化物及/或有機金屬化合物與一種以上之不具有其他功能之金屬氧化物及/或有機金屬化合物之組合。

非磁性層之形成中之金屬氧化物及/或有機金屬化合物之添加方法並無特別限制，可為一次性方式、分批方式或連續添加方式之任一種。又，於以任意之比率將兩種以上組合而使用之情形時，添加順序並無特別限制，可以任意之順序及組合進行添加，例如可將全部混合而添加，亦可將全部分開添加，亦可將一部分混合並將另一部分分開添加等。關於添加次數，亦無特別限制。

亦可對表面由磁性層被覆之核心粒子，反覆實施非磁性層之被覆、磁性層之被覆。例如考慮對表面由磁性層被覆之核心粒子，由非磁性層被覆，進而依序由磁性層、非磁性層被覆其表層者等。此時，只要包含至少一層之磁性層且最表層為非磁性層，則被覆次數（層之數量）、以及對於核心粒子之被覆層整體中之磁性層/非磁性層之各者之數量（詳細成分）及種類並無限制。再者，於包含兩層以上之磁性層之情形時，與包含僅一層之磁性層之情形相比，可提高最終粒子之磁性體含有率，進一步提高磁響應性。

於形成非磁性層時，除了主原料之金屬氧化物及/或有機金屬化合物以外，亦可視需要使用副原料。關於副原料，並無特別限制，根據本發明，例如於使磁性體表面與金屬氧化物及/或有機金屬化合物反應之情形時，通常添加酸或鹼進行反應之情況較多。

於磁性層表面形成有非磁性層之磁響應性粒子之重量平均粒徑之變異係數（CV值）較佳為15%以下，進而較佳為10%以下。又，平均粒徑較佳為0.5〜10 μm，進而較佳為1〜8 μm，最佳為2〜5 μm。體積平均粒徑之CV值為20%以下，較佳為15%以下，更佳為10%以下。

1.5載持用物質及活體相關物質之載持 ＜目標物＞ 本發明中之所謂目標物，意指成為測定、捕捉對象之物質，例如為存在於活體中、或血液（全血）、紅血球、血清、血漿、尿、唾液或喀痰等源自活體之試樣中之物質，可例示：病變組織、病變細胞、CRP（C反應性蛋白）、IgA、IgG、IgM等炎症相關標記物、血纖維蛋白分解產物（例如D二聚物）、可溶性血纖維蛋白、TAT（凝血酶-抗凝血酶複合體）、PIC（血纖維蛋白溶酶-血纖維蛋白溶酶抑制劑複合體）等凝固、纖溶標記物；氧化LDL、BNP（腦性鈉利尿肽）、H-FABP（心臟型脂肪酸鍵結蛋白）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）等循環相關標記物；脂聯素等代謝相關標記物；CEA（癌胎兒性抗原）、AFP（α-胎蛋白）、PIVKΑ-II、CA19-9、CA125、PSA（前列腺特異抗原）等腫瘤標記物；HBV（B型肝炎病毒）、HCV（C型肝炎病毒）、沙眼披衣菌、淋菌等感染病相關標記物；KL-6等呼吸器相關標記物；過敏原特異IgE（免疫球蛋白E）、激素、藥物等。

＜作用之物質＞ 於本發明中，作為對目標物產生特異性作用之物質，可列舉：蛋白質、肽、胺基酸、脂質、糖質、DNA、RNA、受體、半抗原、生物素、抗生物素蛋白等，分子量之高低及天然、合成之來源並無特別限制，例如可列舉：利用免疫反應之免疫學測定法中可使用之抗體或抗原。又，所謂「作用」，意指反應、鍵結等。

上述磁響應性粒子之主要用途係以免疫測定試藥為代表之生物化學用載體。可以該粒子作為載體，將目標物、目標物之類似物質、或對目標物產生特異性作用之物質（以下，有時將該等統稱並簡記為「載持用物質」）固定化，藉此製作成為生物化學用載體之磁響應性粒子（以下，稱為「感應磁響應性粒子」）。

使載持用物質於本發明之磁響應性粒子固定化，而製造感應磁響應性粒子之方法並無特別限定。可藉由先前公知之物理及/或化學鍵結而固定化。於藉由化學鍵結而固定化之情形時，可如段落0042中所例示，藉由使用具有活體相關物質鍵結性之官能基之金屬氧化物及/或有機金屬化合物而形成非磁性層，而使存在於磁響應性粒子表面之官能基作為載持用物質鍵結之支架，而使載持用物質固定化。

較佳為藉由上述方法，於磁響應性粒子之表面設置環氧基、胺基、巰基、羧基、羧酸酐結構，經由該等結構而使載持用物質載持於粒子表面。

又，亦可預先使與上述載持用物質特異性鍵結之活體相關物質載持於磁響應性粒子，於反應系中經由該活體相關物質而使載持用物質鍵結於磁響應性粒子。作為可用於該用途之活體相關物質，例如可列舉：抗生物素蛋白及抗生蛋白鏈菌素等。關於此種載持有用於經由與載持用物質之鍵結之活體相關物質之磁響應性粒子，亦可視作感應磁響應性粒子。

所獲得之感應磁響應性粒子係視需要利用各種高分子化合物或蛋白質（例如牛血清白蛋白等）實施被覆（封閉）處理，於適當之緩衝液中進行分散而用作感應磁性粒子分散液。感應粒子分散液可用作免疫測定用試藥。進而，可將用於測定之稀釋液（緩衝液）或標準物質等進行組合，而用作測定試藥套組。

感應磁響應性粒子之重量平均粒徑之變異係數（CV值）較佳為15%以下，進而較佳為10%以下。又，平均粒徑較佳為0.5〜10 μm，進而較佳為1〜8 μm，最佳為2〜5 μm。體積平均粒徑之CV值為20%以下，較佳為15%以下，更佳為10%以下。

上述免疫測定用試藥或稀釋液亦可為了提高測定感度、或促進目標物與載持用物質間之特異反應而含有各種增感劑。又，上述之免疫測定用試藥或稀釋液亦可為了抑制因存在於測定試樣中之測定對象物質以外之物質引起之非特異反應、或提高測定試藥之穩定性等而含有各種高分子化合物或蛋白質、及其分解物、胺基酸、界面活性劑等。

本發明之免疫測定試藥中之測定對象物質測定方法係使用上述本發明之磁響應性粒子而進行，除此以外，並無特別限定，例如只要依據該領域中通常進行之文獻（例如，「酵素免疫測定法第2版」石川榮治等編寫，醫學書院，1982年）記載之三明治法、競爭法等進行即可。

目標物之測定包括試樣、感應磁響應性粒子、所標記之目標物鍵結物質、標記測定對象物質或其類似物質等之接觸、及B/F分離（鍵結標記抗體與未鍵結標記抗體之分離）之步驟。前者只要藉由通常進行之攪拌、混合等處理而使磁性粒子分散即可。後者例如係藉由如下方式進行：利用磁性粒子之磁性，自反應槽之外側等藉由磁鐵等使磁性粒子聚集，排出反應液並添加洗淨液後，將磁鐵去除，使磁性粒子混合並分散，並進行洗淨。亦可重複1〜3次上述操作。作為洗淨液，只要為通常該領域中所使用者，則並無特別限定。

目標物之測定結果係使用標記物質，標記出目標物或其類似物質等，由其量或活性之測定值而算出。作為標記物質或其活性之測定方法，可無特別限定地使用通常進行之方法。具體而言，例如可列舉：放射免疫測定法（RIA）、酵素免疫測定法（EIA）、螢光免疫測定法（FIA）、電化學發光法（ECLIA）、化學發光免疫測定法（CLIA及CLEIA）、吸光度測定、表面電漿子共振等。於測定時所使用之光學機器亦無特別限定，代表性而言，只要為臨床檢查中廣泛使用之生物化學自動分析機，則可使用任一種。

於將磁響應性粒子如上所述用作以免疫測定試藥為代表之生物化學用載體時，磁分離性之高度非常重要。藉由使用磁分離性優異之粒子，可使洗淨、精製高效率，降低粒子損耗量，故而可尤其於免疫測定試藥中顯示較高之性能。上述本發明之磁響應性粒子可實現較高之磁分離性，故而作為以免疫測定試藥為代表之生物化學用載體較佳。 [實施例]

2.實施例 以下，列舉實施例更詳細地說明本發明，但本發明並不受該等任何限制。

實施例及比較例中所獲得之粒子之平均粒徑及CV值、平均密度之CV值磁分離性、磁性體含有率係藉由以下之方法而測定。

2.1物性測定方法 2.1.1平均粒徑 藉由下述方式求出：利用掃描式電子顯微鏡（Hitachi High-Technologies股份有限公司製造之S-4800）觀察粒子，將於觀察圖像中隨機選擇之50個各粒子之最大直徑進行算術平均。

2.1.2體積平均粒徑CV值之測定 藉由雷射繞射散射法粒度分佈測定裝置（Beckman Coulter公司製造之「LS 13 320」）測定體積平均粒徑分佈，算出體積平均粒徑CV值。

2.1.3重量平均粒徑之CV值之測定 藉由圓盤離心式粒徑分佈測定裝置（CPS Instruments公司製造之「DC24000UHR」）測定重量平均粒徑分佈，算出重量平均粒徑CV值。具體而言，將8%及24%蔗糖溶液進行混合，使施加有濃度梯度之溶液以5000 rpm進行旋轉，投入調整為吸光度：1.0之粒子水分散液（0.1 mL），進行測定。

2.1.4磁分離性之評價 藉由分光光度計（日立製作所股份有限公司製造之U-3900H）測定550 nm之吸光度並用於評價。於設置於分光光度計之石英單元之底部，於放置有磁鐵（2800G，W10 mm×D10 mm×H1 mm）之狀態下，投入調整為吸光度：1.0之粒子水分散液（1.3 mL），測定試樣投入後5秒後與125秒後之吸光度。算出該120秒之吸光度衰減率而作為磁分離性之指標。

2.1.5磁性體含有率之測定 磁響應性粒子之磁性體含量係由在空氣下將粒子加熱至1000℃時之使樹脂部分分解所得之殘渣而求出。即，預先準確地計量磁響應性粒子之乾燥重量（A），藉由示差熱熱重量同步測定裝置（Hitachi High-Technologies股份有限公司製造之TG-DTA6300）以5 ℃/min之速度自35℃升溫至1000℃，於1000℃維持5分鐘後而獲得殘渣，測定該殘渣之重量（B），將B相對於A之比率以百分率求出而作為磁性體含有率。

2.1.6.分散性之評價 作為試樣溶液，準備將波長550 nm之吸光度調整為1.0之磁性粒子分散於水中而成之液。於設置於分光光度計（日立製作所公司製造之「U-3900H」）之石英單元中，投入試樣溶液1.3 mL，測定波長550 nm之吸光度。其次，使用磁鐵（28000G，W40 mm×D40 mm×H10 mm），進行集磁直至上清液之吸光度成為0。其後，藉由漩渦攪拌器以2000 rpm使磁性粒子分散5分鐘，測定波長550 nm之吸光度。由集磁前之吸光度及集磁及分散後之吸光度，藉由以下之式算出吸光度之變化率而作為分散率。 分散率（%）＝{（集磁及分散後之吸光度）/（集磁前之吸光度）}×100

2.2.1實施例1-1 將作為樹脂粒子之Micropearl EX-003（粒徑3.01 μm，CV 3.1%，積水化學工業股份有限公司製造）2.0 g於離子交換水40.0 g中進行超音波分散，獲得核心粒子分散液。 繼而，一面於超音波照射下攪拌，一面添加磁性流體EMG 707（Ferrotec股份有限公司製造）4.0 mL，進而進行30分鐘超音波分散。將所獲得之分散液進行過濾，利用離子交換水進行洗淨，將剩餘之磁性流體去除，藉此獲得磁響應性粒子[1]。

2.2.2實施例1-2 將實施例1-1中所獲得之磁響應性粒子[1]1.0 g於乙醇400 g中進行超音波分散後，添加28%氨水溶液（Nacalai Tesque股份有限公司製造）10 mL、四乙基正矽酸鹽1.0 g、8-縮水甘油氧基辛基三甲氧基矽烷3.0 g，進行3小時超音波分散。將所獲得之分散液進行過濾後，反覆3次於離子交換水中之分散、離心分離，藉此獲得表面具有環氧基之磁響應性粒子EP[1]。

將上述磁響應性粒子EP[1]於PBS中以成為3.0重量%之方式進行超音波分散後，於試管中分取0.5 mL。藉由磁鐵而使磁響應性粒子EP[1]於試管壁面聚集後，將分散介質去除，添加抗KL-6抗體之PBS溶液（0.75 mg/mL）0.5 mL，藉由於25℃攪拌一夜而使其感應，獲得抗KL-6抗體感應磁響應性粒子[1]。其後，添加1.0重量%BSA溶液1.5 mL，於25℃攪拌4小時。藉由磁鐵而使感應磁響應性粒子於試管壁面聚集後，將分散介質去除，重新添加1.0重量%BSA溶液1.5 mL，使其分散。重複3次該操作，製成抗KL-6抗體感應磁響應性粒子[1]分散液。

2.2.3實施例1-3 使抗生蛋白鏈菌素於0.1 M硼酸水溶液中溶解，製備0.1 μg/mL之抗生蛋白鏈菌素溶液。 將實施例1-2中所獲得之磁響應性粒子EP[1]於0.1 M硼酸水溶液中以成為3.0重量%之方式進行超音波分散後，於試管中分取0.5 mL。藉由磁鐵而使磁響應性粒子EP[1]於試管壁面聚集後，將分散介質去除，添加上述抗生蛋白鏈菌素溶液0.5 mL，於37℃攪拌18小時，藉此獲得抗生蛋白鏈菌素感應磁響應性粒子[1]。其後，添加1.0重量%BSA溶液0.5 mL，於反應溫度37℃攪拌4小時。藉由磁鐵而使感應磁響應性粒子於試管壁面聚集後，將分散介質去除，重新添加1.0重量%BSA溶液1.5 mL，使其分散。重複3次該操作，獲得抗生蛋白鏈菌素感應磁響應性粒子[1]分散液。

2.2.4實施例2-1 將作為樹脂粒子之Micropearl SP-203（粒徑3.02 μm，CV4.9%，積水化學工業股份有限公司製造）2.0 g於離子交換水40.0 g中進行超音波分散，獲得核心粒子分散液。 繼而，一面於超音波照射下進行攪拌，一面添加磁性流體EMG707（Ferrotec股份有限公司製造）4.0 mL，進而進行30分鐘超音波分散。將所獲得之分散液進行過濾，利用離子交換水進行洗淨，將剩餘之磁性流體去除，藉此獲得磁響應性粒子[2]。

2.2.5實施例2-2 使用實施例2-1中所製備之磁響應性粒子[2]，除此以外，進行與實施例1-2相同之操作，獲得抗KL-6抗體感應磁響應性粒子[2]、及抗KL-6抗體感應磁響應性粒子[2]分散液。

2.2.6實施例3-1 將作為樹脂粒子之Micropearl SP-203（粒徑3.02 μm，CV4.9%，積水化學工業股份有限公司製造）2.0 g於離子交換水40.0 g中進行超音波分散，獲得核心粒子分散液。 繼而，一面於超音波照射下進行攪拌，一面添加磁性流體EMG707（Ferrotec股份有限公司製造）5.0mL，進而進行30分鐘超音波分散。將所獲得之分散液進行過濾，利用離子交換水進行洗淨，將剩餘之磁性流體去除，藉此獲得磁響應性粒子[3]。

2.2.7實施例3-2 使用實施例3-1中所製備之磁響應性粒子[3]，除此以外，進行與實施例1-2相同之操作，獲得抗KL-6抗體感應磁響應性粒子[3]、及抗KL-6抗體感應磁響應性粒子[3]分散液。

2.3.1比較例1-1 作為磁響應性粒子，將Magnosphere MS300 Tosyl（JSR Life Science股份有限公司製造）設為磁響應性粒子[4]。

2.3.2比較例1-2 將上述磁響應性粒子[4]於PBS中以成為3.0重量%之方式進行超音波分散後，於試管中分取0.5 mL。藉由磁鐵而使磁響應性粒子[4]於試管壁面聚集後，將分散介質去除，添加抗KL-6抗體之PBS溶液（0.75 mg/mL）0.5 mL，藉由於25℃攪拌一夜而使其感應，獲得抗KL-6抗體感應磁響應性粒子[4]。其後，添加1.0重量%BSA溶液1.5 mL，於25℃攪拌4小時。藉由磁鐵而使感應磁響應性粒子於試管壁面聚集後，將分散介質去除，重新添加1.0重量%BSA溶液1.5 mL，使其分散。重複3次該操作，製成抗KL-6感應磁響應性粒子[4]分散液。

2.3.3比較例2 將作為樹脂粒子之Micropearl SP-203（粒徑3.02 μm，CV4.9%，積水化學工業股份有限公司製造）2.0 g於10 mM之NaCl水溶液40.0 g中進行超音波分散，獲得核心粒子分散液。 繼而，一面於超音波照射下進行攪拌，一面添加磁性流體EMG707（Ferrotec股份有限公司製造）8.0 mL，進而進行30分鐘超音波分散。將所獲得之分散液靜置3分鐘，將上清液去除後，於離子交換水中進行再分散後，進行過濾，利用離子交換水進行洗淨，藉此獲得磁響應性粒子[5]。

2.3.4參考例 將磁性流體EMG707（Ferrotec股份有限公司製造）設為2.0 mL，除此以外，進行與實施例2-1相同之操作，製作磁響應性粒子[6]。

將對於實施例1-1〜3-2及比較例1-1〜2、參考例之粒子測定體積平均粒徑之CV值、重量平均粒徑CV值、磁性體含有率、磁分離性、分散率所得之結果示於表1。 [表1]

編號	粒子種類	平均粒徑（μm）	重量平均粒徑CV（%）	體積平均粒徑CV（%）	磁性體含有率（%）	磁分離性（%）	分散率（%）
實施例1-1	磁響應性粒子[1]	3.10	6.1	7.4	20.6	63	95
實施例1-2	抗KL-6抗體感應磁響應性粒子[1]	3.18	6.2	7.5	-	62	94
實施例1-3	抗生蛋白鏈菌素感應磁響應性粒子[1]	3.18	6.2	7.4	-	62	93
實施例2-1	磁響應性粒子[2]	3.08	8.3	9.2	17.8	58	98
實施例2-2	抗KL-6抗體感應磁響應性粒子[2]	3.15	8.4	9.3	-	57	97
實施例3-1	磁響應性粒子[3]	3.17	13.1	16.9	30.3	44	92
實施例3-2	抗KL-6抗體感應磁響應性粒子[3]	3.26	13.3	17.1	-	43	90
比較例1-1	磁響應性粒子[4]	2.95	19.2	30.3	18.0	35	96
比較例1-2	抗KL-6抗體感應磁響應性粒子[4]	2.95	19.2	30.4	-	35	96
比較例2	磁響應性粒子[5]	3.38	16.4	19.3	55.4	82	50
參考例	磁響應性粒子[6]	3.04	5.8	6.3	9.8	40	98

實施例1〜3之磁響應性粒子係無論感應前後，重量平均粒徑之CV值均為15%以下，體積平均粒徑之CV均為20%以下，與相同程度之粒徑、且重量平均粒徑之CV值為15%、體積平均粒徑之CV大於20%之比較例1之磁響應性粒子相比，磁分離性優異。本發明之磁響應性粒子之重量平均粒徑之CV值為15%以下，且每個磁響應性粒子中所含有之磁性體均勻，故而顯示優異之磁分離性。 又，比較例2之磁響應性粒子係藉由磁精製而將重量平均粒徑之CV製備為15%以上者。由於磁性體含量較高，故而表現較高之磁分離性，但由於粒子之比重較大，故而顯示較低之分散性。

再者，實施例3之磁響應性粒子及感應磁響應性粒子之體積平均粒徑之CV值為15%以上，故而具有實用上之磁分離性，但與實施例1、2之磁響應性粒子及感應磁響應性粒子相比，磁分離性顯示較低之值。該情況提示，若體積平均粒徑之偏差增大，則磁分離亦變得不均勻。

對於上述實施例及比較例中所獲得之粒子之一部分，藉由以下之方法進行實用性評價。

2.4.1試藥評價 使用使抗KL-6抗體於粒子表面固定化之實施例1-2中所獲得之感應磁響應性粒子及比較例1-2之感應磁響應性粒子，進行以下所示之免疫測定，求出KL-6濃度使用0 U/mL進行免疫測定之情形、及使用5000 U/mL之標準溶液及將標準溶液稀釋為10、50、100、500、1000、2500 U/mL之各抗原溶液進行免疫測定之情形之發光量之差。

釕錯合物標記抗KL-6抗體之製作： 於聚丙烯管中添加抗KL-6抗體之PBS溶液（2.0 mg/mL）0.5 mL，繼而，添加Ru-NHS（1 mg/mL）13 μL。於25℃振動攪拌後，使用Sephadex G25管柱進行精製，供於評價。

KL-6免疫測定法： 藉由以電化學發光免疫測定法作為測定原理之自動分析裝置（Sekisui Medical公司製造之「Picorumi III」）進行發光量之測定。於反應溶液200 μL中添加試樣20 μL後，添加抗KL-6抗體鍵結磁性粒子25 μL。於30℃反應9分鐘後，添加10 mM Tris緩衝液350 μL，一面利用磁鐵捕獲粒子，一面進行3次洗淨。繼而，添加包含1.0 μg/mL之釕錯合物標記抗KL-6抗體之釕標記抗體液200 μL，於30℃進行9分鐘反應後，添加10 mM Tris緩衝液350 μL，一面利用磁鐵捕獲粒子，一面進行3次洗淨。添加包含0.1 M三丙基胺之發光電解液300 μL，送液至電極表面，測定鍵結於粒子之釕錯合物之發光量。

依據上述方法，將關於實施例1-2、比較例1-2之感應磁響應性粒子之實用性評價結果示於以下。 [表2]

	實施例1-2	比較例1-2
KL-6濃度[U/mL]	測定值	與0 U/mL之發光量差	測定值	與0 U/mL之發光量差
0	1097	0	1019	0
10	2364	1268	1026	7
50	8113	7016	1448	429
100	12954	11858	2301	1282
500	64891	63794	4281	3262
1000	144868	143771	9411	8392
2500	358228	357131	28978	27959
5000	621638	620541	90041	89022
發光量[counts]

實施例1-2之粒子與比較例1-2之粒子相比，於與相同濃度之抗原反應時，與0 U/mL之發光量差較大，感度較高，即顯示良好之試藥性能。實施例1-2之粒子與比較例1-2之粒子相比，重量平均粒徑之CV值、體積平均粒徑之CV值均較低，磁分離性優異。抗體感應後之液體中之粒子之運動均勻，於利用磁鐵捕獲粒子時，大部分之粒子無偏差，而被高效率捕捉，故而認為於試藥評價中顯示良好之試藥性能。 [產業上之可利用性]

根據本發明，提供一種高感度之免疫測定試藥，其藉由使用重量平均粒徑之CV值為15%以下之磁響應性粒子，而容易地載持活體相關物質，具有藉由優異之磁分離性獲得之較高之分離、精製效率。

無

無

Claims (9)

1. 一種感應磁響應性粒子，其具備： 磁響應性粒子，該磁響應性粒子具有核心粒子及至少一層以上之磁性層，該磁性層配置於上述核心粒子上且由具有磁性之金屬及/或其氧化物之微粒子所構成；及 與載持於上述磁響應性粒子上之目標物產生特異性作用之物質；且 上述磁響應性粒子之重量平均粒徑之變異係數為15%以下。
2. 如請求項1之感應磁響應性粒子，其中，上述磁響應性粒子之體積平均粒徑之變異係數為20%以下。
3. 一種感應磁響應性粒子，其具備： 磁響應性粒子，該磁響應性粒子具有核心粒子及至少一層以上之磁性層，該磁性層配置於上述核心粒子上且由具有磁性之金屬及/或其氧化物之微粒子所構成；及 與載持於上述磁響應性粒子上之目標物產生特異性作用之物質；且 上述感應磁響應性粒子之重量平均粒徑之變異係數為15%以下。
4. 如請求項3之感應磁響應性粒子，其中，上述感應磁響應性粒子之體積平均粒徑之變異係數為20%以下。
5. 如請求項1至4中任一項之感應磁響應性粒子，其中，於上述磁性層與目標物產生特異性作用之物質之間，進而具有由非磁性之金屬氧化物及/或有機金屬化合物所構成之非磁性層。
6. 如請求項1至5中任一項之感應磁響應性粒子，其中，與上述目標物產生特異性作用之物質藉由1段或多段之反應而化學鍵結於上述磁性層上。
7. 如請求項1至6中任一項之感應磁響應性粒子，其中，與上述目標物產生特異性作用之物質經由1段或多段之化學鍵結而鍵結於上述非磁性層上。
8. 一種異質性免疫測定方法，其係使用請求項1至7中任一項之感應磁響應性粒子。
9. 一種免疫測定試藥，其係使用請求項1至7中任一項之感應磁響應性粒子。