JPH04102062A - 粒子免疫側定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床検査機器における体液中の微量成分等の免
疫測定方法に関する。

〔従来の技術〕

従来、磁性粒子と蛍光性粒子を用いた免疫測定法として
は、特開昭６１−１２８１６８号公報に記載のように、
磁性粒子と蛍光性粒子の表面に抗体や抗原を固定し、測
定対象と反応させ、粒子の凝集を起こさせ、その凝集塊
を磁石で測定容器底に引き寄せ、蛍光性粒子に励起光を
照射し、生しる蛍光の強度を測定していた。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術では測定用容器底に抗体や抗原が存在しな
いため、容器底への固定は磁力のみに頼っている。また
蛍光性粒子と磁性粒子で抗体や抗原をはさんでいるため
、粒子表面の固定化抗体や抗原の特異性を適切に選択し
ないと、容器底に集めた抗原抗体反応生成物である粒子
塊から蛍光性粒子が遊離しやすいという問題があった。

また磁石を取り除くと粒子が遊離するため、磁石で粒子
塊を常に引き寄せておく必要があるので、装置化や処理
能力に問題があった。さらに抗原抗体反応に関与せず、
磁石で測定容器に固定された粒子が除去できないため、
蛍光計測を妨害するという問題があった。

本発明はこのような問題点を解決し、高感度で迅速かつ
高精度な免疫測定法を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成するために、まず蛍光性と磁性を兼備し
た微粒子の表面に抗体や抗原を固定した。

また測定容器を固定用固相とするために抗体や抗原を固
定した。さらに測定容器底の励起光で照射される部分に
抗体や抗原を固定し、この部分の下方に磁石を置くこと
により、抗体や抗原の結合した粒子を集中させ、局部的
に粒子濃度を高くすることができるようにした。

以下、本発明の詳細な説明する。

まず、蛍光性と磁石を合わせ持つ粒子を入手した。これ
は通常の市販粒子であり、磁性体を核とし、その周囲に
蛍光性物質を混入させたポリスチレンで層を形成させた
ものである。これ以外にも蛍光物質と磁性物質とを封入
した微粒子で表面に抗体や抗原を結合できるものであれ
ば、特に上記の粒子に限定されることはない。また粒子
径についても、凝集させる必要はないので、特に蛍光測
定に差し支えのないものであれば、限定されない。

粒子表面への抗体や抗原の固定化は物理的ないしは化学
的に吸着させても良いし、官能基を利用して共有結合的
に固定しても良い。その場合の固定方法は通常の蛋白質
の固定方法と同じもので差し支えない。抗原としては、
例えば、蛋白質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、
ポリヌクレオチドワイルスなどが利用できる。蛍光物質
としては通常の蛍光試薬であれば特に限定されない０例
えば、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体。

クマリン誘導体、希土類元素などはこのような目的に使
用できる。磁性物質としてはマグネタイトやフェライト
等の磁場を与えると磁化し、容易に分層できる物質が望
ましい。

測定容器は抗原抗体反応容器を兼ねる。材質は蛍光性で
ないものが望ましく、抗体や抗原を結合できる性質を有
するものである必要がある。透明な材質であれば容器底
より励起光を照射してもよい。また磁石で粒子を集中さ
せる測定容器底の部分のみに抗体や抗原を結合させるた
めに、他の反応に関与しない部分には、血清アルブミン
やゼラチンなどの蛋白質をコーティングしたり、プラス
チックフィルム等で覆うなどの処理を施した。

粒子や測定容器に固定する抗体としては、ポリクローナ
ル、モノクローナルのいずれも使用可能であるが、モノ
クローナル性であれば、粒子の凝集を起こしにくいので
、より効果的である。さらに粒子上の抗体と測定容器底
の抗体の特異性が異なるようにすることが望ましい。

抗原抗体反応は粒子と測定成分との間で第１段の反応を
行い、次に測定容器底面の抗体または抗原と第２段目の
反応を行わせる方法や測定容器底に測定成分を第１段目
の反応として結合させ、次に粒子を固相上の結合した測
定成分と第２段目の反応として反応させる方法を用いる
。反応しなかった粒子は磁石を測定容器から離した後、
洗浄液や緩衝液で分離する。

〔作用〕

磁性および蛍光性を兼備する粒子は磁力で移動し、光の
照射により蛍光を生しるので、反応の効率を高めること
ができ、しかも容易に検出できる。

しかも抗体や抗原を表面に固定できることで、担体とし
て働くことも可能である。

本発明では、測定容器に抗体や抗原を固定しであるので
、磁石を抗原抗体反応後測定容器から離しても、測定成
分を固相に捕えた粒子は遊離することはない。一方、反
応に関与しなかった粒子は容易に洗浄により分離できる
。

〔実施例〕

以下、本発明の詳細な説明する。

（実施例１） ヒトの血清腫ようマーカーのひとつであるα−フェトプ
ロティン（以下ＡＦＰと略す）の測定に用いた例を示す
。

第１図に反応の原理を示す。スライドグラスｌに凹みを
作り、この底面にγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ンの水溶液を少量入れ、加熱することで、アミノシラン
化した。次に、ゲルタールアルデヒド０．１％溶液をこ
れに注入し、３０分室温で反応させ、溶液を除去し、こ
こに抗Ａ　Ｆ　Ｐ抗体を１００μＱ（抗体濃度Ｑ　、　
１　ｍｇ　／　ｍ　Ｑ　）　ａ　’ｌ、４℃で１晩置き
、抗体２を固定化した。このようにして潤製したスライ
ドガラス１にＡＦＰを含む試料血清を１００μΩずつ分
注し、スライドガラス１上の抗体２と結合させた。不要
の共存物質を洗浄用緩衝液（ｐＨ７，４，５０ｍＭりん
酸緩衝液）で除去した。

次に、カルボキシ基導入蛍光性磁気粒子（ポリサイエン
ス社製）懸濁液に抗ＡＦＰ抗体の溶液を加え、水溶性カ
ルボジイミドを用いて抗体を常法のように固定化した。

粒子径は特に限定されないが、１μｍ以下のものがよく
混合分散し、反応効率も高かった。

粒子濃度を０．１％　とした上記溶液６を、ＡＦＰを捕
えたスライドガラス１上に添加した。ここで、図の４が
蛍光性磁性粒子である。また、スライドガラス１の下方
にはガラスに接して永久磁石片５を置き、３０分間室温
でガラス１と磁石５を一体にして振動させた。反応後磁
石５を遠ざけ、洗浄用緩衝液で洗浄し、未反応の粒子を
除去した。

次にスライドガラス１を反射蛍光測定装置（図示せず）
の照射部位に置いた。ガラス上の粒子に励起光４００ｎ
ｍの光を照射し、生じた蛍光を４５０ｎｍ付近で計測し
た。

第２図は標準ＡＦＰ溶液について同様の操作を行って作
成した検量線を示す。本発明の実施例による検量線６は
、磁性のない蛍光虫干を用いた場合の検量線７と比較す
ると、蛍光強度が約５倍となり、蛍光磁性粒子を用いる
ことにより、粒子の局部的な濃縮が行え、反応効率が良
くなることがわかる。したがって短時間で感度良く測定
できる。

（実施例２） 本発明をヒト血清のβ２−マイクログロブリン（β２−
ｍと略す）の測定に適用した例を説明する。

本実施例では、まず小試験管に抗体を固定した蛍光性磁
性粒子を試料とともに入れ、１０分間撹拌した。蛍光性
磁性粒子表面にはカルボキシル基が存在し、実施例１と
同様に抗体をあらかしめ固定化しておいた。抗体には抗
β、−ｍ　モノクローナル抗体（マウス由来）を用いた
。

抗β２−ｍ　モノクローナル抗体（マウス由来）で、粒
子表面の抗体と特異性が異なる抗体を固定化した凹みを
有するガラススライドに、粒子と抗原の反応液を注入し
、反応させた。ガラススライドの凹みの下には、これに
接して磁石片を接触させておき、抗原と粒子の反応結合
体は磁力でスライド底面に近より、底面に局在するよう
になった。

室温で３０分反応させた後、磁石を遠ざけ、実施例１と
同様にして測定を行った。

第３図に標準β２−ｍ溶液を用いて作成した検量線を示
す。本発明を実際の血清に適用した結果、良好な結果が
得られた。

（実施例３） 本発明をヒト血清中のＡＦＰに適用した実施例１と同様
に測定に適用したが、ガラススライドの底面の磁石と接
触する部分に抗体を固定化した例を示す。ガラススライ
ド凹部（直径６ＩＩＩＩＩ）の中央部直径３閣の円形部
分を残し、残りのガラス面に接着テープをはりつけ、そ
の後アミノシラン化処理を行った。そして実施例１と同
様にゲルタールアルデヒド０．１％溶液で抗体を固定化
した。この後テープをはがし、テープのはりついていた
面には牛血清アルブミン１％溶液でブロッキングを施し
た。

次に実施例１と同様に試料を反応させ、抗体を固定した
蛍光性磁性粒子を続いて反応させた。粒子を注ぐまえに
、ガラススライド下方に直径２．６Ｉの円盤状永久磁石
をガラス面に接するように置いた。残りの操作は実施例
１と同じに行い、スライドガラス凹部の中心部の蛍光粒
子に励起光を絞って照射し、その反射蛍光強度を測定し
た。得られた蛍光強度はスライドガラス底面全面に抗体
を固定化した場合の約２倍の蛍光強度が得られた。

検量線もＡＦＰの１０−”ｔｏ　Ｑ　／　ｎ　　から１
Ｏ−７ｒａｏｎ／Ｑの範囲で良好であった。

〔発明の効果〕

本発明は、以上説明したように構成されているので以下
に記載するような効果を奏する。

抗体や抗原を固定化した粒子が１種類でよいので調製に
手間どらず、コストが低くできる。また蛍光粒子と磁性
粒子の表面の抗体同士、抗原同士の間で抗原または抗体
の争奪が起きることもなく、反応効率や精度の低下がな
い。また、本発明は、凝集反応を検出するものではない
ので、不要な粒子を除去でき、高感度な計測ができる。

さらに、反応領域を狭くでき、粒子密度を濃くできるの
で高感度で迅速な測定ができ、具体的には従来の反応時
間の１／２以下にできる。また、液中で抗原抗体反応生
成物を形成することにより、反応時間を１７３にしても
良好な感度を保つことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の原理を示す反応系の側断面図、第２図
は本発明をＡＦＰの測定に応用したときの検量線を示す
測定図、第３図は本発明のβ、−マイクログロブリン定
量への応用時の検量線を示す￥７１　（２） ′ｆＪ　３回 ′！！１ｌｉ２　図 β２ ７Ｉ濠Ｌ（，１辺 旬、、ＥＡＦｒ　（ｐＪ　（Ｉυ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗原または抗体を、蛍光粒子を計測することで定量
   する免疫測定法において、磁性を有し、かつ蛍光性を有
   する粒子を、抗体または抗原の担体とすることを特徴と
   する免疫測定法。 ２、磁性を有し、かつ蛍光性を有する粒子上に抗体また
   は抗原を固定化し、これを用いる免疫測定法において、
   粒子上の抗体または抗原と、固相上の抗体または抗原で
   、それぞれに反応する抗原または抗体をはさみこむこと
   を特徴とする免疫測定法。 ３、請求項第２項記載の免疫測定法において、磁性かつ
   蛍光性の粒子を固相上の一定の領域に磁石により集中さ
   せ、粒子濃度を高めて反応を行わせることを特徴とする
   免疫測定法。 ４、請求項第２項記載の免疫測定法において、磁性かつ
   蛍光性の粒子表面の抗体または抗原と測定対象の抗原ま
   たは抗体とを液相中で反応させた後、磁力により該粒子
   を固相上の測定対象物質に対する固定化抗体または抗原
   と接近させることを特徴とする免疫測定法。