JP2762259B2 - 磁気応答性螢光ポリマーの使用方法 - Google Patents

磁気応答性螢光ポリマーの使用方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、磁気応答性螢光ポリマー粒子に関する。
【０００２】発明の背景 本発明は、１９８７年１０月２６日に提出された米国出
願番号第１１３２９４号の一部継続である。
【０００３】イムノアッセイ，アフィニティー精製等の
ような多くの生物学的技術においては、遊離の画分から
結合した画分を分離する必要がある。磁性粒子が所望の
分離を促進するために使用されてきた。
【０００４】磁性粒子は、種々の工程を用いて種々の粒
子状の磁性体から作られており、様々な特徴を有する。
例えば、イケダ等の米国特許第４５８２６２２号にはゼ
ラチン，水溶性多糖類、リン酸ナトリウム及び強磁性体
物質よりなる磁性粒子が開示されており、米国特許第４
６２８０３７号及び第４５５４０８８号にはポリマー性
シランの被膜に囲まれた磁性金属酸化物コアよりなる磁
性粒子が開示されており、米国特許第４４５２７７３号
には水溶性多糖類又は官能基を有するその誘導体で被覆
された強磁性酸化鉄（Ｆｅ3 Ｏ4 ）のコアを有する離散
コロイドサイズの粒子が開示されており、そしてＭａｎ
ｓｆｉｅｌｄの米国特許第４２９７３３７号には粒子状
担体としての磁性ガラス又は結晶含有材料が開示されて
いる。
【０００５】発明の概要 本発明は、磁気応答性螢光ポリマー粒子（以下、磁性螢
光粒子という）を、形状および組成に関りなく直径で約
１乃至１００μｍの平均サイズを有する螢光ポリマー性
粒子から製造する新規の方法を提供する。本発明の螢光
磁性粒子は、平均サイズ約１μｍ以下の磁気応答性金属
酸化物（以下、金属酸化物という）を先ず製造し、次い
で螢光ポリマー性コア粒子を金属酸化物を含有するポリ
マー層で被覆することによって調製することができる。
これらの螢光磁性粒子の表面は、所望の表面特性を与え
るために、ポリマー又は官能基を有するポリマーよりな
る別の層で更に被覆することができる。
【０００６】これらの螢光磁性粒子のスペクトル特性
は、単一の螢光染料又は数種の螢光染料の組合せにな
る、種々の螢光染料を組み込んだコア粒子を使用するこ
とにより変化させることができる。別に、本発明の螢光
磁性粒子は、モノマーに可溶で且つ非螢光ポリマー性コ
ア粒子，金属酸化物及びモノマーの存在下にて重合条件
に耐えることができる単一の螢光染料又は数種の染料の
組合せになる、種々の螢光染料を組み込むことによって
調製することができる。
【０００７】本発明により製造される螢光磁性粒子はサ
イズにおいて単分散性であり、粗い表面を有し、そして
５％乃至５０％，好ましくは１０％乃至２５％の磁性金
属酸化物含量を有する。これらの螢光磁性粒子の螢光強
度は、金属酸化物による陰影を変化させるために磁性金
属酸化物含量を変えることにより、及び／又は螢光ポリ
マーコア粒子に組み込む螢光染料の量を変えることによ
り、調整することができる。
【０００８】これらの特徴を有する粒子は、イムノアッ
セイ及び広範な種類の生物医学的用途に有用であること
が見い出されている。これらの螢光磁性粒子は、抗原，
抗体，酵素又はＤＮＡ／ＲＮＡのような生物学的材料の
受動的又は共有結合による結合に使用することができ、
また種々のタイプのイムノアッセイ，ＤＮＡ／ＲＮＡハ
イブリダイゼーションアッセイ，アフィニティー精製，
細胞分離，食作用及び他の生物医学的用途のための固相
として使用することができる。生物学的材料を結合した
又は結合していないこれらの螢光磁性粒子は、ウエル中
に正しい数の粒子が放出されていることを確認するため
の、及びアッセイ中における粒子の損失をチェックする
ためのマーカーとして働かせるために、種々のアッセイ
用の非磁性粒子に対して種々の比率で組み込むことがで
きる。
【０００９】目的及び利点 本発明の目的は次の通りである。
【００１０】直ちに入手し得るポリマー粒子より磁気応
答性螢光ポリマー粒子を容易に製造する方法を開発する
こと。
【００１１】中等度の沈降と速い磁気分離を有する磁気
応答性螢光ポリマー粒子の製造方法を開発すること。
【００１２】生物学的材料を受動的吸着又は共有結合に
より結合させるための種々の表面電荷と官能基を有する
磁気応答性螢光ポリマー粒子の製造方法を開発するこ
と。
【００１３】これらの磁気応答性螢光ポリマー粒子を用
いた医学的，生物学的，診断的及び産業的用途を開発す
ること。
【００１４】本発明の利点は次のものを含む。
【００１５】約１乃至１００μｍのサイズの広範な種類
の螢光ポリマーコア粒子を容易に磁気応答性粒子に変え
ることができる。
【００１６】用途に応じて金属酸化物の含量を変化させ
ることができる。
【００１７】共有結合のために表面を誘導体化して種々
の官能基を導入することができる。
【００１８】得られるポリマーに種々の表面特性を与え
るために、種々のモノマーを最終的な被覆に用いること
ができる。
【００１９】架橋された又は架橋されていない磁気応答
性螢光ポリマー粒子のいずれをも製造することができ
る。
【００２０】単分散性の磁気応答性螢光ポリマー粒子を
製造することができる。
【００２１】発明の詳細な記述 本発明の螢光磁性粒子は、先ず約１μｍ以下の平均サイ
ズの金属酸化物を製造することにより調製することがで
きる。金属酸化物は、２価又は３価の金属塩の混合物，
好ましくは第１鉄及び第２鉄の硫酸塩又は塩化物と水酸
化ナトリウム溶液との混合物を加熱し沈澱させることに
より製造する。金属酸化物の所望のサイズ及び磁気特性
を得るためには、２価の金属塩の３価の金属塩に対する
モル比は０．５乃至２．０，好ましくは０．５乃至１．
０の範囲で変化させることができる。２価の金属塩の３
価の金属塩に対するモル比が金属酸化物のサイズに影響
することが観察されている。すなわち、２価の金属塩の
３価の金属塩に対するモル比が小さい程、金属酸化物の
サイズは小さくなる。２価の金属塩の３価の金属塩に対
するモル比はまた得られる磁性粒子の色にも影響する。
すなわち、モル比が小さい程得られる磁性粒子の褐色が
かった色は明るくなる。好ましくは、金属酸化物は超常
磁性又は常磁性であるが、強磁性金属酸化物もまた使用
することができる。ただしこの場合は洗浄の際磁気分離
の代わりに遠心が用いられる。
【００２２】他の２価の遷移金属塩，例えばマンガン，
マグネシウム，コバルト，ニッケル，亜鉛及び銅の塩で
第１鉄塩を置き換えてもよい。
【００２３】金属酸化物が沈澱した後、上澄のｐＨが中
性となるまで、２５０×ｇの遠心で数回それを洗浄す
る。金属酸化物を脱イオン水に再懸濁し、高速で機械的
に攪拌して金属酸化物結晶の凝集物を破砕する。更に２
５０×ｇで遠沈しても金属酸化物の全部がペレット状に
なってしまうことはない。小さいサイズの金属酸化物結
晶を含有する上澄を集め、ペレットは脱イオン水に再懸
濁する。この操作を少なくとも３回又は大部分の金属酸
化物が２５０×ｇではもはやペレット状にならなくなる
迄繰り返す。この方法で得られる金属酸化物のサイズは
通常２．０μｍ未満である。大きい結晶を除くための１
００×ｇの低速遠心により、サイズが０．８μｍ未満と
なる。
【００２４】平均サイズ１．０μｍ以下の金属酸化物を
モノマーと混合し、開始剤の存在下に１乃至１００μｍ
のサイズの螢光ポリマーコア粒子，好ましくはポリスチ
レン粒子上に被覆する。少量の乳化剤の添加は粒子が膠
着するのを防止する助けとなろう。次いで螢光磁性粒子
を、金属酸化物の脱落を防止するために、ポリマー，好
ましくはポリスチレンの保護層で被覆する。官能基を有
する螢光磁性粒子を望む場合には、生物学的材料を共有
結合により結合させるためのカルボキシル基，アミノ基
又はヒドロキシル基のような官能基を付与するため、官
能基を有するポリマーよりなる別の層で磁性粒子を更に
被覆することができる。
【００２５】本発明に従って調製される螢光磁性粒子は
図１に示すことができる。ここにおいて１は螢光コア粒
子を表し、２は金属酸化物／ポリマー被覆を表し、３は
保護ポリマー被覆を表しそして４は官能基を有するポリ
マー被覆を表す。図２は、本発明に従って調製される磁
性粒子の０．０８乃至０．１μｍの切片の透過型電子顕
微鏡写真を示す。図３は、本発明に従って調製される
６．８μｍの磁性粒子の走査型電子顕微鏡写真を示す。
図３ａは、１０００倍，図３ｂは５０００倍の拡大であ
る。
【００２６】本発明において有用な螢光ポリマー性コア
粒子は、小さい粒子の分散系として得ることのできるも
のであってモノマーを吸収しそれによって該コア粒子表
面上への金属酸化物とモノマーとの混合物の被覆を生ず
ることのできるものであれば、いかなるポリマーよりな
るものでもよい。コア粒子はいかなるサイズ及び形状で
もよいが、好ましくは１乃至１００μｍのサイズであり
球形の形状になるものである。単分散性コア粒子を使用
するときは、得られる磁性粒子もまたサイズにおいて単
分散性となろう。コア粒子は、ジビニルベンゼン等の架
橋剤を用い又は用いない乳化重合，懸濁重合又は他の重
合手段によって得ることができる。コア粒子を調製する
のに使用することができるモノマーには例えば、スチレ
ン，メタクリル酸メチル，ビニルトルエン等がある。モ
ノマーの混合物もまた使用することができる。螢光コア
粒子は、当業者に知られている種々の技術を用いて螢光
染料をコア粒子に組み込むことによって得ることができ
る。磁性金属酸化物による被覆又は保護被覆に使用され
るモノマーは、螢光コア粒子と同じタイプのものであっ
てもなくてもよい。金属酸化物による被覆に使用するモ
ノマーの螢光コア粒子に対する重量比は、所望の金属酸
化物／ポリマー層の厚さに応じて０．１乃至１２，好ま
しくは０．２乃至６とすることができる。第１鉄塩及び
第２鉄塩の混合物から調製される金属酸化物を被覆に使
用する場合には、螢光コア粒子に対しモノマーを重量比
約０．１乃至０．５にて使用するのが好ましい。しかし
ながら、マンガン（２価）塩及び第２鉄塩の混合物から
調製される金属酸化物を被覆に使用する場合には、コア
粒子に対するモノマー重量比は０．１乃至１２とするこ
とができる。結果として、通常の有機溶媒には不活性な
架橋された螢光磁性粒子を求める場合には、マンガン
（２価）塩及び第２鉄塩の混合物から調製される金属酸
化物を、２％乃至１０％，好ましくは８％乃至１０％の
重量比で架橋剤を含有し、コア粒子に対するモノマー重
量比が３乃至１２，好ましくは４乃至６であり、螢光染
料に対するモノマー重量比が０．１乃至１０であるモノ
マーとともに使用するのが好ましい。金属酸化物／ポリ
マー被覆の際にコア粒子に対し一層低いモノマー重量比
（すなわち０．１乃至０．５）を使用する場合には、螢
光磁性粒子表面上に金属酸化物を一層固く付着させるた
めにポリマー被覆による保護層で、得られる螢光磁性粒
子を保護被覆するのが好ましい。しかしながら、コア粒
子に対し高いモノマー比（すなわち３乃至１２）を使用
する場合には、保護ポリマーによる被覆は不要である。
重合温度は５５℃乃至９０℃，好ましくは５５℃乃至６
５℃でよい。重合開始剤は、過硫酸カリウム等のような
水溶性のものでも、過酸化ベンゾイル等のような水に不
溶性のものでもよい。照射，イオン化等の他の重合開始
手段もまた使用することができる。意外なことに、被覆
にマンガン（２価）塩及び第２鉄塩の混合物より調製さ
れる金属酸化物を使用した場合には、何ら乳化剤を使用
することなく螢光磁性粒子を製造できることが見出され
た。しかしながら、被覆に第１鉄塩と第２鉄塩との混合
物より調製された金属酸化物を使用した場合には、ドデ
シル硫酸ナトリウム，Ａｅｒｏｓｏｌ ２２，Ｔｗｅｅ
ｎ ２０又はＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ ４０）
のような乳化剤の少量が金属酸化物／ポリマー被覆の間
の粒子の過剰な凝集を防止するのに有用であることが見
出された。同じ能力を有する他の乳化剤もまた使用する
ことができる。金属酸化物／ポリマー被覆の間種々の量
の金属酸化物を使用することにより、磁性金属酸化物の
含量を５％乃至５０％，好ましくは１０％乃至２５％の
範囲で変化させることができる。金属酸化物の含量を高
めるために、金属酸化物／ポリマー多重被覆を行うこと
もできる。所望の特性を有する磁性粒子が得られる限
り、重合に通常使用される他の成分を加えてもよい。金
属酸化物／ポリマー被覆のための成分は、金属酸化物／
ポリマー被覆工程の最初に全部一度に加えてもよく、又
は段階的に加えてもよい。第１鉄塩と第２鉄塩との混合
物より製した金属酸化物を使用する場合には、成分を段
階的に加えるのが好ましい。成分は真空下又はアルゴン
等の不活性ガス下において、機械的攪拌、ゆすることそ
の他の攪拌手段により混合することができる。官能基
は、金属酸化物／ポリマー被覆の間モノマーと官能基を
有するモノマーとの混合物を用いることによって又は官
能基を有するモノマーの薄層で磁性粒子を最後に再被覆
することによって螢光磁性粒子の表面上に組み込むこと
ができる。使用する官能基を有するモノマーは、次のも
のの一又は混合物から選ぶことができる： メタクリル
酸２−ヒドロキシエチル，メタクリル酸２−アミノエチ
ル，メタクリル酸トリメチルアンモニウムメチルメトサ
ルフェート，メタクリル酸ジメチルアミノエチル，メタ
クリル酸，ウンデシレン酸，メチルプロペンスルホン
酸，ウンデシレンアルコール，オレイルアミン，メタク
リル酸グリシジル，アクロレイン，グルタルアルデヒド
等。磁性螢光粒子はまた、金属酸化物／ポリマー被覆又
は保護被覆に使用したのとは異なるポリマーの層で再被
覆してそのポリマーの表面特性を帯びさせることもでき
る。
【００２７】螢光磁性粒子の利用 螢光イムノアッセイ，ラジオイムノアッセイ，エンザイ
ムイムノアッセイ，細胞分離，酵素固定化及びアフィニ
ティー精製等の種々の用途のための固相としての種々の
螢光磁性粒子の使用は、次の論文に例示するように、文
献にて検討されている： Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎ ｅｔ
ａｌ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍ
ａｒｃｈ １９８２，１７２−１７９（１９８２）；Ｐ
ｏｕｒｆａｒｚａｎｅｈ，Ｔｈｅ Ｌｉｇａｎｄ Ｑｎ
ａｒｔｅｒｌｙ，５（１）：４１−４７（１９８２）；
Ｈａｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｕｎｎｉｌｌ，Ｅｎｚｙｍ
ｅＭｉｃｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：２−１
０（１９８０）；Ｍｏｓｂａｃｈ ａｎｄ Ａｎｄｅｒ
ｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２７０：２５９−２６１（１９
７７）；Ｇｕｅｓｄｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ，Ａｌｌｅｒ
ｇｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６１
（１），２３−２７（１９７８）．いくつかの利用につ
いてはまた、酵素固定化について米国特許第４１５２２
１０号及び第４３４３９０１号に、細胞分離について米
国特許第３９７０５１８号、第４２３０６８５号及び第
４２６７２３４３号に、イムノアッセイについて米国特
許第４５５４０８８号、第４６２８０３７号及び第３９
３３９９７号に夫々開示されている。
【００２８】ある用途には有用であるが他の用途には有
用でない磁性粒子もある。例えば、米国特許第４５５４
０８８号及び第４６２８０３７号に開示されている磁性
粒子は、通常ポリマー性シランの被覆に囲まれた超常磁
性金属酸化物コアよりなるが、その大きな表面積と緩慢
な沈澱速度のためイムノアッセイとアフィニティー精製
には有用であるが、骨髄洗浄のような細胞分離への利用
には適さない。これら２つの特許に開示された磁性粒子
はサイズが小さいため、細胞懸濁液から全ての磁性粒子
を効果的に除去することは非常に困難である。更に、小
さい磁性粒子ほど正常な細胞への非特異的結合がずっと
高くなる。骨髄細胞の精製のための磁性粒子の使用にお
いては、磁性粒子はヒツジ抗マウスＩｇＧのような抗体
で被覆され、骨髄は癌細胞の表面抗原に対する数種のモ
ノクローナル抗体の混合物で処理される。磁性粒子は癌
細胞にのみ結合し、強力な磁場を通過させることにより
癌細胞を正常細胞から分離することができる。洗浄され
た細胞は次いで患者に戻される。
【００２９】本発明の方法を用いることにより、広範な
種類の生物医学的な利用のために、磁性粒子のサイズ，
表面積，金属酸化物含量及び表面特性を最適にすること
ができる。本発明により製造される磁性粒子は、エンザ
イムイムノアッセイ，螢光イムノアッセイ，ラジオイム
ノアッセイ，ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションア
ッセイその他の診断用途のための固相として使用するこ
とができる。イムノアッセイは、サンドイッチアッセイ
や競合的結合アッセイ等の当業者に明らかな種々の形態
で行うことができる。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼー
ションもまた、固相ハイブリダイゼーション又は液相ハ
イブリダイゼーション等の種々の形態で行うことができ
る。固相ハイブリダイゼーションの形態では、ＤＮＡ又
はＲＮＡプローブ（キャッチャープローブ）は磁性粒子
に最初に固定化される。固定化されたキャッチャープロ
ーブは、サンプル（サンプルＤＮＡ）からの相補的ＤＮ
Ａ鎖とハイブリッド化するのに使用される。最後に、螢
光性，放射性又は酵素トレーサーで標識されＤＮＡサン
プルの別の部分とハイブリッド化することのできる別の
プローブ（シグナルプローブ）がシグナル発生に使用さ
れる。液相ハイブリダイゼーション形態においては、キ
ャッチャープローブとシグナルプローブは最初に液相で
サンプルＤＮＡとハイブリッド化され、次いで磁性粒子
に固定化される。
【００３０】代わりに、アッセイの感度を高めるため
に、シグナルプローブを１個又は数個のビオチン基で標
識することもでき、その場合ビオチン基を螢光性，放射
性又は酵素トレーサーで標識したアビジンと結合させる
ことにより、シグナルが検出される。
【００３１】イムノアッセイ及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブ
リダイゼーションアッセイは、生物学的サンプル中の薬
物，ホルモン，抗体，ペプチド，ＤＡＮ，ＲＮＡ，核
酸，ウイルス抗原及び炭水化物等の広範な種類の物質を
測定するのに使用することができる。
【００３２】本発明によって製造される磁性粒子もま
た、アフィニティー精製，細胞分離，酵素固定その他の
生物医学的用途に使用することができる。細胞分離にお
いては、磁性粒子は、免疫反応又は非免疫反応による望
まない細胞の除去（ネガティブ選別）のため又は望む細
胞の濃縮（ポジティブ選別）のために使用される。この
原理は、骨髄から癌細胞を除去（骨髄洗浄）し、組織培
養のためにポジティブ又はネガティブ選別によって細胞
集団を精製し及び種々の細胞イムノアッセイを行うのに
使用することができる。アフィニティー精製において
は、磁性粒子は、抗体，抗原，酵素，阻害剤，コファク
ター，１本鎖ＤＮＡ，結合タンパク，ハプテン及び炭水
化物等の広範な種類の生物学的材料の精製に、ポリアク
リルアミドゲル，セファロースゲル又は他のセルロース
ビーズのような慣用の固相に代えて使用される。アフィ
ニティー精製に類似の他の用途においては、磁性粒子
は、抗血清又は臨床サンプルから望ましくないタンパク
質成分を交差吸着して除去するのに使用することができ
る。酵素固定化においては、酵素活性を保持し固定化酵
素の再使用を可能にするよう、種々の結合手段によって
磁性粒子上に酵素が固定化される。固定化酵素を担持し
た磁性粒子は、炭水化物，アミノ酸及びタンパク質等の
広範な種類の材料を製造するための固定化酵素システム
に通常使用されるガラスビーズ，制御された多孔性ガラ
ス，シリカゲル及びセルロースビーズ等の他の固相に代
えて使用することができる。
【００３３】生物学的材料を担持した又は担持しないこ
れらの螢光磁性粒子は、正しい数の粒子がウエル中に放
出されていることを確認するため及びアッセイ中の粒子
の損失をチェックするためのマーカーとして役立てるた
めに、実施例４２及び４３に述べた種々のアッセイのた
めの非磁性粒子に対し種々の比率で組み込むことができ
る。
【００３４】これらの利用はいずれも、磁性粒子の大部
分に共通な分離容易性，速い反応速度及び大きな表面積
によって効率化される。以下の実施例は本発明の多能性
と利点とを更に説明するために提供するものであり、そ
の詳細を制限的に解釈してはならない。本発明の精神と
範囲から逸脱することなく種々の均等物，変更物及び修
飾物の実施をなし得ることは明らかであり、そのような
均等の具体例は本発明に含められることが意図されてい
るからである。
【００３５】金属酸化物の調製の一般的方法 実施例 １ 機械的攪拌機、冷却器、温度計、滴下ロート及び加熱マ
ントルを備えた三つ口丸底フラスコに、４００mlの脱イ
オン水中に０．３６１ｍｏｌの硫酸第１鉄及び０．３６
９ｍｏｌの硫酸第２鉄（Ｆｅ++／Ｆｅ+++ 比＝１）の混
合物を加えた。混合物を攪拌しつつ８５乃至９０℃に加
熱し、８５０mlの６Ｎ水酸化ナトリウムを９０分かけて
滴下して加えた。混合物を８５乃至９０℃にて更に１時
間攪拌し、室温まで冷却した。金属酸化物の沈澱を２５
０×ｇにて１０分間遠心した。透明な上澄を傾斜して捨
てペレットを９００mlの脱イオン水中に機械的攪拌機を
用いて再懸濁させた。この洗浄工程を６回又は上澄のｐ
Ｈが殆ど中性となるまで繰り返した。上澄を傾斜して捨
て、２００mlの脱イオン水に再懸濁させた。２５０×ｇ
で更に遠心しても金属酸化物の沈澱の全てがペレットに
なることはない。小さいサイズの金属酸化物結晶を含む
上澄を集め、ペレットは２００mlの脱イオン水に再懸濁
させた。この工程は少なくとも３回又は金属酸化物の殆
どが２５０×ｇではもはやペレットを生じなくなるまで
繰り返した。この方法で得られる金属酸化物は通常２．
０μｍ未満のサイズを有する。金属酸化物の懸濁液を合
わせ１００×ｇで１０分間遠心した。上澄を回収し、
０．８μｍ未満のサイズの磁性金属酸化物の８．６％ｗ
／ｖ懸濁液８００mlを得た。
【００３６】実施例 ２ ４００mlの脱イオン水中０．２３５ｍｏｌの硫酸第１
鉄，０．２９７ｍｏｌの硫酸第２鉄（Ｆｅ++／Ｆｅ+++
比＝０．７９）及び４８０mlの６Ｎ水酸化ナトリウムを
使用して磁性金属酸化物の２．８６％ｗ／ｖ懸濁液２０
００mlを得た以外は、実施例１の記載と同一の手順に従
った。
【００３７】実施例 ３ ４００mlの脱イオン水中０．１７８ｍｏｌの硫酸第１
鉄，０．２９８ｍｏｌの硫酸第２鉄（Ｆｅ++／Ｆｅ+++
比＝０．５９）及び５２０mlの６Ｎ水酸化ナトリウムを
使用して磁性金属酸化物の２．９８％ｗ／ｖ懸濁液１５
００mlを得た以外は、実施例１の記載と同一手順に従っ
た。
【００３８】実施例 ４ ４００mlの脱イオン水中０．１５ｍｏｌの硫酸第１鉄，
０．２７６ｍｏｌの硫酸第２鉄（Ｆｅ++／Ｆｅ+++ 比＝
０．５４）及び５２０mlの６Ｎ水酸化ナトリウムを使用
して磁性金属酸化物の６．８８％ｗ／ｖ懸濁液７００ml
を得た以外は、実施例１の記載と同一手順に従った。
【００３９】実施例 ５ ２２５mlの脱イオン水中０．１１６ｍｏｌの硫酸マンガ
ン，０．１４６ｍｏｌの硫酸第２鉄（Ｍｎ++／Ｆｅ+++
比＝０．７９）及び２４０mlの６Ｎ水酸化ナトリウムを
使用して磁性金属酸化物の１．８％ｗ／ｖ懸濁液１７０
０mlを得た以外は、実施例１の記載と同一手順に従っ
た。
【００４０】磁性粒子の調製 実施例 ６ ６００mlの脱イオン水，６mlのスチレン及び、実施例１
の記載に従って調製した８．６％ｗ／ｖの磁性金属酸化
物８０mlの混合物を密封された瓶に加えた。瓶を吸引し
て約６０ｒｐｍで５５℃のオーブン中１時間回転した。
混合物に１２ｇの過硫酸カリウム及び５％ｗ／ｖの４．
０μｍポリスチレン粒子８５０mlを加えた。瓶を再び密
封し、吸引して１時間回転し、そして２％のドデシル硫
酸ナトリウム５０mlを加えた。更に５時間経過後、混合
物に６mlのスチレン及び１０ｇの過硫酸カリウムを加え
た。混合物を更に１５時間回転し、２層にしたチーズク
ロスで濾過し、磁気的に分離して上澄が透明になるまで
脱イオン水で数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオ
ン水に再懸濁させて１．６Ｌとし、約１１％の磁性金属
酸化物含量を有し４．３μｍの平均サイズを有する２．
５％ｗ／ｖ懸濁液を得た。
【００４１】実施例 ７ 実施例６の記載に従って調製した２．５％ｗ／ｖの磁性
粒子１．６Ｌを、１ｇのドデシル硫酸ナトリウム，１０
ｇの過硫酸カリウム及び、４mlのメタノール中に０．９
８mlのウンデシレン酸と０．０２mlのジビニルベンゼン
とを含有する溶液を加えることによりカルボキシル化し
た。混合物を密封した瓶中に加え、吸引して約６０ｒｐ
ｍで５５℃のオーブン中５時間回転した。得られたカル
ボキシル磁性粒子を磁気的に分離し、上澄が透明になる
迄脱イオン水で数回洗浄した。カルボキシル磁性粒子を
脱イオン水に再懸濁させて６８０mlとし、約１１％の磁
性金属酸化物含量を有し４．３μｍの平均サイズを有す
る５．８％ｗ／ｖ懸濁液を得た。
【００４２】実施例 ８ ６００mlの脱イオン水，６mlのスチレン及び、実施例１
の記載に従って調製した８．６％ｗ／ｖの磁性金属酸化
物８０mlを密封した瓶中に加えた。瓶を吸引して約６０
ｒｐｍで５５℃のオーブン中１時間回転した。混合物に
１２ｇの過硫酸カリウム及び４．７８％ｗ／ｖの６．１
μｍポリスチレン粒子８５０mlを加えた。瓶を再び密封
し、吸引して５時間回転し、そして６mlのスチレン及び
１０ｇの過硫酸カリウムを加えた。混合物を更に１５時
間回転し、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に
分離しそして上澄が透明になるまで脱イオン水で数回洗
浄した。得られた磁性粒子を１．５Ｌの脱イオン水に再
懸濁させ、１ｇのドデシル硫酸ナトリウム，１０ｇの過
硫酸カリウム及び、４mlのメタノール中に０．９８mlの
ウンデシレン酸と０．０２mlのジビニルベンゼンとを含
有する溶液を加えることによりカルボキシル化した。混
合物を密封した瓶中に加え、吸引して約６０ｒｐｍで５
５℃のオーブン中５時間回転した。得られたカルボキシ
ル磁性粒子を磁気的に分離して上澄が透明になる迄脱イ
オン水で数回洗浄した。カルボキシル磁性粒子を脱イオ
ン水に再懸濁させて８００mlとし、約１１．６％の磁性
金属酸化物含量を有し６．８μｍの平均サイズを有する
４．３％懸濁液を得た。
【００４３】実施例 ９ ６００mlの脱イオン水，６mlのスチレン及び、実施例１
の記載に従って調製した８．６％ｗ／ｖの磁性金属酸化
物６０mlを含む混合物を三つ口丸底フラスコに加え、ア
ルゴン雰囲気下６７℃にて１時間攪拌した。混合物に１
２ｇの過硫酸カリウム及び５％ｗ／ｖの２．７μｍポリ
スチレン粒子４７０mlを加えた。混合物を６７℃にて１
時間攪拌し、２％のドデシル硫酸ナトリウム３０mlを加
えた。アルゴン雰囲気下６７℃にて更に５時間攪拌した
後、混合物に６mlのスチレン及び６ｇの過硫酸カリウム
を加えた。混合物をアルゴン雰囲気下６７℃にて更に１
５時間攪拌し、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気
的に分離しそして上澄が透明になるまで脱イオン水で数
回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水に再懸濁さ
せて９００mlとし、０．６ｇのドデシル硫酸ナトリウ
ム，１０ｇの過硫酸カリウム及び、２．４mlのメタノー
ル中に０．５９８mlのウンデシレン酸と０．０１２mlの
ジビニルベンゼンとを含有する溶液を加えることにより
カルボキシル化した。混合物を密封した瓶中に加え、吸
引して約６０ｒｐｍで５５℃のオーブン中５時間回転し
た。得られたカルボキシル磁性粒子を磁気的に分離しそ
して上澄が透明になるまで脱イオン水で数回洗浄した。
カルボキシル磁性粒子を再懸濁させて５００mlとし、約
１４％の磁性金属酸化物含量を有し４．０μｍの平均サ
イズを有する６．５％ｗ／ｖの懸濁液を得た。
【００４４】実施例 １０ ６００mlの脱イオン水，６mlのスチレン及び、実施例１
の記載に従って調製した８．６％ｗ／ｖの磁性金属酸化
物６０mlを含む混合物を密封した瓶に加えた。瓶を吸引
して約６０ｒｐｍで５５℃のオーブン中１時間回転し
た。混合物に１２ｇの過硫酸カリウム及び５％ｗ／ｖの
２．７μｍポリスチレン粒子４７０mlを加えた。瓶を再
び密封し、吸引して１時間回転しそして２％のドデシル
硫酸ナトリウム３０mlを加えた。更に５時間経過の後、
６mlのスチレン及び１０ｇの過硫酸カリウムを混合物に
加えた。混合物を更に１５時間回転し、２層にしたチー
ズクロスで濾過し、磁気的に分離し、上澄が透明になる
迄脱イオン水で数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イ
オン水に懸濁させて５００mlとし、約１４％の磁性金属
酸化物含量を有し４．０μｍの平均サイズを有する６．
８％ｗ／ｖの懸濁液を得た。
【００４５】実施例 １１ １８０mlの脱イオン水，２mlのスチレン及び、実施例１
の記載に従って調製した８．６％ｗ／ｖの磁性金属酸化
物２０mlを含む混合物を密封した瓶中に加えた。瓶を吸
引して約６０ｒｐｍで５５℃のオーブン中１時間回転し
た。混合物に４ｇの過硫酸カリウム及び、実施例１０の
記載に従って調製した６．８％ｗ／ｖの磁性粒子（３．
０μｍ，金属酸化物含量１４％）１６０mlを加えた。瓶
を再び密封し、吸引して１時間回転しそして２％のドデ
シル硫酸ナトリウム１０mlを加えた。更に５時間の後、
２mlのスチレン及び２ｇの過硫酸カリウムを混合物に加
えた。混合物を更に１５時間回転し、２層にしたチーズ
クロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が透明にな
る迄脱イオン水で数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱
イオン水に懸濁して１６０mlとし、約１９％の金属酸化
物含量を有し４．２μｍの平均サイズを有する７．７８
％ｗ／ｖの懸濁液を得た。
【００４６】実施例 １２ ９０mlの脱イオン水，１mlのスチレン及び、実施例１の
記載に従って調製した８．６％ｗ／ｖの磁性金属酸化物
１０mlを含有する混合物を、密封した瓶中に加えた。瓶
を吸引して約６０ｒｐｍで５５℃のオーブン中１時間回
転した。混合物に１ｇの過硫酸カリウム及び、実施例１
１の記載に従って調製した７．７８％ｗ／ｖの磁性粒子
（３．２μｍ，金属酸化物含量１９％）８０mlを加え
た。瓶を再び密封し、吸引して４時間回転し、２％のド
デシル硫酸ナトリウム５mlを加えた。更に５時間経過の
後、１mlのスチレン及び１ｇの過硫酸カリウムを混合物
に加えた。混合物を更に１５時間回転し、２層にしたチ
ーズクロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が透明
になる迄脱イオン水で数回洗浄した。得られた磁性粒子
を脱イオン水に再懸濁させて１６０mlとし、約２３％の
金属酸化物含量を有し４．５μｍの平均サイズを有する
４．５％の懸濁液を得た。
【００４７】実施例 １３ ４００mlの脱イオン水，１．９２mlのスチレン、０．０
８mlのジビニルベンゼン，４ｇの過硫酸カリウム、２０
ｇの２００〜４００メッシュの４％ジビニルベンゼン架
橋ポリスチレンビーズ及び、実施例１に従って調製した
８．６％ｗ／ｖの磁性金属酸化物１０mlを含有する混合
物を密封された瓶中に加えた。瓶を吸引して約６０ｒｐ
ｍで５５℃のオーブン中１５時間回転した。混合物を沈
澱させ上澄を傾斜して捨てた。得られた磁性ビーズを２
００mlの脱イオン水に再懸濁させ再度沈澱させた。上澄
が透明になる迄数回この工程を繰り返した。得られた磁
性ビーズを２００mlの脱イオン水に再懸濁させ、０．１
ｇのドデシル硫酸ナトリウム，２．０ｇの過硫酸カリウ
ム，０．４８mlのスチレン及び０．０２mlのジビニルベ
ンゼンを加えた。瓶を再び密封し、吸引して約６０ｒｐ
ｍで５５℃のオーブン中１時間回転しそして、０．４ml
のメタノール中に０．０９８mlのウンデシレン酸と０．
００２mlのジビニルベンゼンとを含有する溶液を加え
た。混合物を更に４時間回転し、前述のように重力によ
り沈降させることによって洗浄した。水を濾過により除
去しカルボキシル磁性ビーズを乾燥して２００〜４００
メッシュのカルボキシル磁性ビーズ２０ｇを得た。
【００４８】実施例 １４ １００mlの脱イオン水，０．５mlのスチレン、２ｇの過
硫酸カリウム、５％ｗ／ｖの４．０μｍポリスチレン粒
子７５ml及び、実施例４の記載に従って調製した６．８
８％ｗ／ｖの磁性金属酸化物１０mlを含有する混合物を
密封した瓶中に加えた。瓶を吸引して約６０ｒｐｍで５
５℃のオーブン中１５時間回転した。混合物を、２層に
したチーズクロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄
が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。得られた磁
性粒子を脱イオン水に再懸濁させて１５０mlとし、約１
４％の金属酸化物含量を有し４．３μｍの平均サイズを
有する２．５％ｗ／ｖ懸濁液を得た。
【００４９】実施例 １５ 実施例４の記載に従って調製した６．８８％ｗ／ｖの磁
性金属酸化物２０mlを使用して約１８％の金属酸化物含
量を有し４．３μｍの平均サイズを有する２．５％ｗ／
ｖの懸濁液１６０mlを得た以外は、実施例１４の記載と
同じ手順に従った。
【００５０】実施例 １６ ２０００mlの脱イオン水，１３mlのスチレン及び、実施
例３の記載に従って調製した２．９８％ｗ／ｖの磁性金
属酸化物５５０mlを含有する混合物を密封した瓶中に加
えた。瓶を吸引して約６０ｒｐｍで５５℃のオーブン中
１時間回転した。混合物に２０ｇの過硫酸カリウム及び
１０％ｗ／ｖの３．０μｍポリスチレン粒子９５０mlを
加えた。瓶を再び密封し、吸引して約６０ｒｐｍで１時
間回転しそして２％のドデシル硫酸ナトリウム６０mlを
加えた。更に５時間の経過の後、８mlのスチレン及び１
０ｇの過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合物を更に
１５時間回転し、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁
気的に分離しそして上澄が透明になるまで脱イオン水で
数回洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水に再懸濁
して３０００mlとし、約１２％の磁性金属酸化物含量を
有し３．２μｍの平均サイズを有する３．３８％ｗ／ｖ
の懸濁液を得た。
【００５１】実施例 １７ 実施例１６の記載に従って調製した磁性粒子（３．２μ
ｍ，３．３８％ｗ／ｖ，金属酸化物含量１２％）１５０
ml，２mlの１％ ＮＰ４０，０．５mlのメタクリル酸メ
チル又はスチレン、１ｇの過硫酸カリウム及び、官能基
を有するモノマーであるメチル硫酸メタクリル酸トリメ
チルアンモニウムエチル（４０％水溶液）を含有する混
合物を密封した瓶中に加えた。瓶を約６０ｒｐｍで５５
℃のオーブン中４時間回転した。混合物を、２層にした
チーズクロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が透
明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。得られた磁性粒
子を脱イオン水中に再懸濁させて２００mlとし、表面上
にトリメチルアンモニウム官能基を有する磁性粒子の
２．５％ｗ／ｖ懸濁液を得た。
【００５２】実施例 １８ 官能基を有するモノマーであるメタクリル酸２−アミノ
エチル１mlを使用して表面上にアミノ基を有する磁性粒
子の２．５％ｗ／ｖ懸濁液２００mlを得た以外は、実施
例１７に記載されたと同じ手順に従った。
【００５３】実施例 １９ 官能基を有するモノマーであるメタクリル酸２−ヒドロ
キシエチル１mlを使用して表面上にヒドロキシル基を有
する磁性粒子の２．５％ｗ／ｖ懸濁液２００mlを得た以
外は、実施例１７に記載されたと同じ手順に従った。
【００５４】実施例 ２０ モノマーとして１−ビニル−２−ピロリジノン１mlを使
用して表面上にポリビニルピロリジノンを有する磁性粒
子の２．５％ｗ／ｖ懸濁液２００mlを得た以外は、実施
例１７の記載と同じ手順に従った。
【００５５】実施例 ２１ 官能基を有するモノマーであるメチルプロペンスルホン
酸１ｇを使用して表面上にスルホン酸基を有する磁性粒
子の２．５％ｗ／ｖ懸濁液２００mlを得た以外は、実施
例１７の記載と同じ手順に従った。
【００５６】実施例 ２２ 官能基を有するモノマーであるメタクリル酸ジメチルア
ミノエチル１mlを使用して表面上にジメチルアミノ基を
有する磁性粒子の２．５％ｗ／ｖ懸濁液２００mlを得た
以外は、実施例１７の記載と同じ手順に従った。
【００５７】実施例 ２３ ７．０％ｗ／ｖの２．１１μｍポリスチレン粒子２０m
l，実施例５の記載に従って調製した１．８％ｗ／ｖの
金属酸化物１００ml，５０mlの脱イオン水及び、７．５
mlのスチレン中に０．１５ｇの過酸化ベンゾイルを含む
溶液を含有する混合物を密封した瓶に加えた。瓶を吸引
して約６０ｒｐｍで５５℃のオーブン中１５時間回転し
た。混合物を、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気
的に分離しそして上澄が透明になる迄脱イオン水で数回
洗浄した。得られた磁性粒子を脱イオン水に再懸濁させ
て２００mlとし、約１６．８％の金属酸化物含量を有し
３．６μｍの平均サイズを有する５．０％ｗ／ｖの懸濁
液を得た。
【００５８】実施例 ２４ ７．０％ｗ／ｖの２．１１μｍポリスチレン粒子２０m
l，実施例５の記載に従って調製した１．８％ｗ／ｖの
金属酸化物１００ml，５０mlの脱イオン水及び、６．７
５mlのスチレン中に０．１５ｇの過酸化ベンゾイルと
０．７５mlのジビニルベンゼンとを含む溶液を含有する
混合物を密封した瓶中に加えた。瓶を吸引して約６０ｒ
ｐｍで５５℃のオーブン中１５時間回転した。混合物
を、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離し
そして上澄が透明になる迄脱イオン水で数回洗浄した。
得られた架橋磁性粒子を脱イオン水に再懸濁させて２０
０mlとし、約１６．８％の金属酸化物含量を有し３．６
μｍの平均サイズを有する５．０％ｗ／ｖの懸濁液を得
た。こうして調製した架橋磁性粒子はサイズが均一であ
り通常の有機溶媒例えば、アセトン，アセトニトリル及
びジメチルホルムアミド等に対して不活性であることが
判明した。
【００５９】実施例 ２５ ７．０％ｗ／ｖの２．１１μｍポリスチレン粒子２０m
l，実施例５の記載に従って調製した１．８％ｗ／ｖの
金属酸化物１５０ml及び、６．７５mlのスチレン中に
０．１５ｇの過酸化ベンゾイルと０．７５mlのジビニル
ベンゼンとを含む溶液を含有する混合物を密封された瓶
中に加えた。瓶を吸引して約６０ｒｐｍで５５℃のオー
ブン中１５時間回転した。混合物を、２層にしたチーズ
クロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が透明にな
る迄脱イオン水で数回洗浄した。得られた架橋磁性粒子
を脱イオン水に再懸濁させて２００mlとし、約２３％の
金属酸化物含量を有し４．０μｍの平均サイズを有する
５．４％ｗ／ｖの懸濁液を得た。こうして調製した架橋
磁性粒子はサイズが均一で通常の有機溶媒例えば、アセ
トン，アセトニトリル及びジメチルホルムアミド等に対
して不活性であることが判明した。
【００６０】実施例 ２６ ９．１６％ｗ／ｖの３．２μｍポリスチレン粒子１５m
l，実施例５の記載に従って調製した１．８％ｗ／ｖの
金属酸化物１００ml，５５mlの脱イオン水及び、６．７
５mlのスチレン中に０．１５ｇの過酸化ベンゾイルと
０．７５mlのジビニルベンゼンとを含む溶液を含有する
混合物を密封した瓶中に加えた。瓶を吸引して約６０ｒ
ｐｍで５５℃のオーブン中１５時間回転した。混合物
を、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離し
そして上澄が透明になるまで脱イオン水で数回洗浄し
た。得られた架橋磁性粒子を脱イオン水に再懸濁して２
００mlとし、約１６．８％の金属酸化物含量を有し５．
５μｍの平均サイズを有する４．７％ｗ／ｖの懸濁液を
得た。こうして調製した架橋磁性粒子はサイズが均一で
通常の有機溶媒例えばアセトン，アセトニトリル及びジ
メチルホルムアミド等に対し不活性であることが判明し
た。
【００６１】実施例 ２７ ４．５％ｗ／ｖの４．１μｍポリスチレン粒子３０ml，
実施例５の記載に従って調製した１．８％ｗ／ｖの金属
酸化物１００ml，４０mlの脱イオン水及び、６．７５ml
のスチレン中に０．１５ｇの過酸化ベンゾイルと０．７
５mlのジビニルベンゼンとを含む溶液を含有する混合物
を密封した瓶中に加えた。瓶を吸引して約６０ｒｐｍで
５５℃のオーブン中１５時間回転した。混合物を、２層
にしたチーズクロスで濾過し、磁気的に分離しそして上
澄が透明になるまで脱イオン水で数回洗浄した。得られ
た架橋磁性粒子を脱イオン水に再懸濁して２００mlと
し、約１６．９％の金属酸化物含量を有し６．７μｍの
平均サイズを有する４．５％ｗ／ｖの懸濁液を得た。こ
うして調製された架橋磁性粒子はサイズが均一で通常の
溶媒例えば、アセトン，アセトニトリル及びジメチルホ
ルムアミド等に対して不活性であることが判明した。
【００６２】実施例 ２８ ７．０％ｗ／ｖの２．１１μｍポリスチレン粒子２０m
l，実施例５の記載に従って調製した１．８％ｗ／ｖの
金属酸化物１００ml，５０mlの脱イオン水及び、６mlの
スチレン中に０．１５ｇの過酸化ベンゾイルと０．７５
mlのウンデシレニルアルコールと０．７５mlのジビニル
ベンゼンとを含む溶液を含有する混合物を密封した瓶中
に加えた。瓶を吸引して約６０ｒｐｍで５５℃のオーブ
ン中１５時間回転した。混合物を、２層にしたチーズク
ロスで濾過し、磁気的に分離しそして上澄が透明になる
迄脱イオン水で数回洗浄した。得られた架橋ヒドロキシ
ル磁性粒子を濾過し乾燥して約１６．８％の金属酸化物
含量を有し３．９μｍの平均サイズを有する９ｇの粉末
を得た。こうして調製された架橋ヒドロキシル磁性粒子
はサイズが均一で通常の溶媒例えば、アセトン，アセト
ニトリル及びジメチルホルムアミド等に対し不活性であ
ることが判明した。
【００６３】磁性粒子への生物学的材料の結合 実施例 ２９ ８０mlの瓶中に、実施例１７の記載に従って調製した
４．３μｍの５．０％ｗ／ｖカルボキシル磁性粒子３０
mlを加えた。粒子を磁気的に分離し５０mlのリン酸緩衝
液（０．１Ｍ，ｐＨ５．５）に再懸濁させた。粒子懸濁
液に２０mgのウシ血清アルブミン及び１００mgの１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド（ＥＤＣ）を加えた。混合物を室温にて２時間回転
しそして磁気的に分離した。粒子を８０mlのリン酸緩衝
液で１回洗い、そしてリン酸緩衝食塩水（０．１Ｍ，ｐ
Ｈ７．０）に再懸濁させて７５mlとし、２．０％ｗ／ｖ
の懸濁液を得た。
【００６４】ウシ血清アルブミンを受動的吸着により磁
性粒子に結合させるためにはＥＤＣを使用しないこと以
外は同じ手順に従った。
【００６５】実施例 ３０ ４mlのバイアル中に、実施例７の記載に従って調製した
４．３μｍの５．０％ｗ／ｖカルボキシル磁性粒子１ml
を加えた。粒子を磁気的に分離し２mlのリン酸緩衝液
（０．１Ｍ，ｐＨ５．５）で１回洗いそして２mlの同緩
衝液で再懸濁させた。粒子懸濁液に、１．４mg／mlのヤ
ギ（Ｇｔ）抗マウス（Ｍｓ）ＩｇＧ １４０ml及び１０
mgの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミドを加えた。バイアルを室温にて２時間回
転した。粒子を磁気的に分離し、２mlのリン酸緩衝液で
１回洗いそして２mlのリン酸緩衝食塩水（０．１Ｍ，ｐ
Ｈ７．０）で再懸濁させて２mlとし２．５％ｗ／ｖのヤ
ギ抗マウスＩｇＧ被覆磁性粒子を得た。モノクローナル
な又はポリクローナルな他の種類の抗体もまた同じ手順
によってカルボキシル磁性粒子に結合させることができ
る。
【００６６】ヤギ抗マウスＩｇＧその他の種類の抗体を
受動的吸着によって磁性粒子に結合させるためには、Ｅ
ＤＣを使用しないこと以外は同じ手順に従った。
【００６７】実施例 ３１ ４mlのバイアル中に、実施例２９の記載に従って調製し
たウシ血清アルブミン被覆磁性粒子（４．３μｍ，２％
ｗ／ｖ）２．５mlを加えた。粒子を磁気的に分離し、２
mlのリン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ５．５）に再懸濁さ
せて２mlとした。混合物に１０μＬのマウス抗Ｂ赤血球
表面抗原（２０mg／ml）及び１mgの１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを加え
た。混合物を室温にて２時間回転した。粒子を磁気的に
分離し、リン酸緩衝液で１回洗いそして２mlのリン酸緩
衝食塩水（０．１Ｍ，ｐＨ７．０）に再懸濁させ、２．
５％ｗ／ｖの懸濁液を得た。
【００６８】実施例 ３２ ４０μＬのマウス抗Ａ赤血球表面抗原（５mg／ml）を使
用して２．５％ｗ／ｖの懸濁液２mlを得た以外は、実施
例３１の記載と同じ手順に従った。
【００６９】磁性粒子を用いた血液型判定 実施例 ３３ Ａとラベルした５ｍｍ×６５ｍｍの試験管中に、実施例
３２の記載に従って調製した２．５％ｗ／ｖのマウス抗
Ａ被覆磁性粒子２５μＬを加えた。Ｂとラベルした別の
試験管中には、実施例３１の記載に従って調製した２．
５％ｗ／ｖのマウス抗Ｂ被覆磁性粒子２５μＬを加え
た。双方の試験管に、パック赤血球を等張緩衝食塩水で
１対１００に希釈して調製した１％パック赤血球５０μ
Ｌを加えた。指で数回軽くたたいて試験管を振り磁石の
上に置いた。結果は以下に要約した通りであった。
【００７０】
【００７１】ここに＋は陽性反応を示す。すなわち、赤
血球は対応する抗体を被覆した磁性粒子によって凝集
し、その結果磁気分離後は試験管の上澄は透明であっ
た。他方、陰性反応の上澄は、赤血球と抗体被覆磁性粒
子との間での凝集がないため、磁気分離後も濁ったまま
である。
【００７２】磁性粒子を用いたイムノアッセイ 実施例 ３４ ２mlの微量遠心管中に、６％ｗ／ｖの３μｍカルボキシ
ル磁性粒子１mlを加えた。粒子を１０００ｒｐｍで３分
間遠心した。上澄を吸引し、粒子を酢酸緩衝液中で５乃
至１００μｇ／mlの組み換えＨＢｃＡｇ １mlとともに
振り混ぜることによって再懸濁させた。管を室温にて２
時間回転させそして前記のように遠心した。上澄を吸引
し、粒子を、酢酸緩衝液と２乃至１０％の正常動物血清
とを含む再被覆溶液１mlに再懸濁させた。管を室温にて
２乃至１６時間回転させそして前記のように遠心した。
上澄を吸引し、遠心と再懸濁とにより１mlの等張緩衝食
塩水（ＩＢＳ）で３回洗浄した。最後に、粒子を１mlの
ＩＢＳで再懸濁させ２乃至８℃にて貯蔵した。
【００７３】実施例 ３５ ９６ウエルのミクロ滴定板の最初の２列に、実施例３４
の記載に従って調製した０．２５％ｗ／ｖのＢ型肝炎コ
ア抗原（ＨＢｃＡｇ）被覆磁性粒子２０μＬを加えた。
サンプルの調製は、ＨＢｃＡｇ陽性血清を陰性血漿で種
々に希釈し、更に各サンプルを標本希釈緩衝液（ＳＤ
Ｂ）で１：１００に希釈することにより行った。ＳＤＢ
は、リン酸緩衝液，タンパク質安定化剤，界面活性剤，
及び抗菌剤を含有するものであった。粒子を含有するウ
エルに、各最終のサンプル希釈液５０μＬを加えた。３
７℃で３０分間インキュベーションの後、粒子を磁気分
離機で２分間分離し、塩類と界面活性剤とを含有する洗
浄用緩衝液２００μＬで３回洗浄した。粒子を含む各ウ
エルに、塩類，タンパク質安定化剤，グリセロール，界
面活性剤及び抗菌剤を含有する希釈液中のヤギ抗ヒトＩ
ｇＧ−Ｂ−Ｄガラクトシダーゼ結合体（０．５μｇ／m
l）５０μＬを加えた。３７℃で１５分間のインキュベ
ーションの後、粒子を分離し上記のようにして３回洗浄
し、３０μＬのＩＢＳに再懸濁させた。粒子を黒いミク
ロ滴定板（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）の最初の２列に移した。
粒子を含む各ウエルに、４−メチルウンベリフェリル−
Ｂ−ガラクトピラノシド（ＭＵＧ，Ｓｉｇｍａ）を含有
する溶液１００μＬを加えた。板を３７℃にてインキュ
ベートし、螢光強度を、励起側３６５ｎｍ及び螢光側４
５０ｎｍのフィルターを備えた螢光濃度分析機（ＦＣ
Ａ，Ｐａｎｄｅｘ）を用い５分間隔で１０倍利得にセッ
トして測定した。５分間隔での螢光強度の増大を任意に
定めた螢光単位（ＡＦＵ）にて記録し表Ｉに示した。
【００７４】 表 Ｉ 陽性標本の ＡＦＵ（５分） 希釈率 ２個のウエルの平均値 ─────────────────────────── １：１００ ２２６８７ １：１０００ ５９３３ １：５０００ １５１６ １：８０００ ８３５ １：１００００ ６３９ １：１５０００ ４９５ １：２００００ ４２７ １：２５０００ ３０７
【００７５】実施例 ３６ マウス抗ＨＢｓＡｇのカルボキシル磁性粒子への結合は
実施例３０と同様であった。
【００７６】黒の９６ウエルのミクロ滴定板（Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈ）のウエルに、０．２５％ｗ／ｖの３．２μｍ
マウス抗ＨＢｓＡｇ被覆カルボキシル磁性粒子２０μＬ
を２列に加えた。磁性粒子を含むウエルに、種々の量の
ＨＢｓＡｇを含有する無処理血漿又はＨＢｓＡｇ陰性血
漿１００μＬを加えた。３７℃にて３０分間インキュベ
ーションした後、磁気分離機により粒子を２分間分離
し、塩類と界面活性剤とを含有する洗浄用緩衝液１００
μＬで１回洗った。粒子を含む各ウエルに、塩類，タン
パク質安定化剤，グリセロール，界面活性剤及び抗菌剤
を含有する希釈液中のマウス抗ＨＢｓＡｇ−Ｂ−ガラタ
トシダーゼ結合体２０μＬを加えた。３７℃にて１５分
間インキュベーションの後、粒子を分離し上記のように
して５回洗浄した。粒子を含む各ウエルに、４−メチル
ウンベリフェリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ
Ｇ，Ｓｉｇｍａ）を含有する溶液５０μＬを加えた。板
を３７℃でインキュベートし、螢光強度を、励起側３６
５ｎｍ及び螢光側４５０ｎｍのフィルターを備えた螢光
濃度分析機（ＦＣＡ，Ｐａｎｄｅｘ）により５分間隔で
１０倍利得に設定して測定した。５分間隔での螢光強度
の増大を任意に定めた螢光単位（ＡＦＵ）にて記録し、
表IIに示した。
【００７７】 表 II ＨＢｓＡｇ濃度 ＡＦＵ（５分） （ｎｇ） ２個のウエルの平均値 ───────────────────────────── １．０ １１４９ ０．５ ４５５ ０．２５ ２１８ ０．１２５ １１８ 陰 性 １４
【００７８】実施例 ３７ ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ／Ｈ−９ 細胞（Ｇａｌｌｏ株）か
らのＨＴＶ−１抗原を、実施例３４の記載と同様の手順
により３．６μｍのカルボキシル磁性粒子に結合させ
た。
【００７９】９６ウエルのミクロ滴定板のウエルに、
０．２５％ｗ／ｖのＨＩＶ被覆磁性粒子２０μＬを２列
に加えた。粒子を含むウエルに、リン酸緩衝液，タンパ
ク質安定化剤，界面活性剤及び抗菌剤を含有する標本希
釈緩衝液（ＳＤＢ）に１：１００に希釈した陽性，境界
及び陰性の各標本５０μＬを加えた。３７℃にて３０分
間のインキュベーションの後、磁気分離機により２分間
粒子を分離しそして塩類と界面活性剤とを含有する洗浄
用緩衝液１００μＬで３回洗浄した。粒子を含む各ウエ
ルに、塩類，タンパク質安定化剤，グリセロール，界面
活性剤および抗菌剤を含有する希釈液中のヤギ抗ヒト−
Ｂ−ガラクトシダーゼ（約０．５μｇ／ml）結合体５０
μＬを加えた。３７℃にて１５分間インキュベーション
した後、上記のようにして粒子を４回洗浄した。粒子を
黒のミクロ滴定板（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）に移した。粒子
を含む各ウエルに、４−メチルウンベリフェリル−Ｂ−
Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵＧ，Ｓｉｇｍａ）を含有
する溶液１００μＬを加えた。板を３７℃にてインキュ
ベートし、螢光強度を、励起側３６５ｎｍ及び螢光側４
５０ｎｍのフィルターを備えた螢光濃度分析機（ＦＣ
Ａ，Ｐａｎｄｅｘ）を用いて５分間隔で２５倍利得に設
定して測定した。５分間隔での螢光強度の増大を任意に
定めた螢光単位（ＡＦＵ）にて記録し表III に示した。
【００８０】 表 III 抗ＨＩＶ ＡＦＵ（５分） 標本 ２個のウエルの平均値 ─────────────────────────── 陽性対照 ９４６２ 境界標本 ５２７ 陰性対照 ８６
【００８１】磁性粒子を用いた細胞分離 実施例 ３８ 実施例７の記載に従って調製した４．３μｍのカルボキ
シル磁性粒子を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．
７）で洗浄し超音波処理し、７０％エタノールで１０分
間滅菌し、ＰＢＳで３回洗浄し、０．５mg／mlのアフィ
ニティ精製ヒツジ抗マウスイムノグロブリン抗体（ＳＡ
Ｍ）とともに３．３mg抗体／１００mg粒子の比率で４℃
にて４８時間インキュベートした。使用前に、抗体被覆
磁性粒子をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に所望の濃度に再
懸濁させた。
【００８２】ヒト組織培養ｃＡＬＬａ陽性ＮＡＬＭ−１
６白血病細胞をＰＢＳで洗い懸濁させた。一部は抗体に
よる処理をしなかった（−ＭｏＡｂ）。他の部分を２つ
の抗ＣＤ１０モノクローナル抗体及び１つの抗ＣＤ９モ
ノクローナル抗体で４℃にて３０分間処理し（＋ＭｏＡ
ｂ），ＰＢＳで洗い、ＰＢＳにて３．５×１０6 個／ml
に調整した。一方には抗体処理細胞（＋ＭｏＡｂ）を含
み他方には無処理細胞（−ＭｏＡｂ）を含む２本の試験
管に、ＳＡＭ被覆磁性粒子を開始時の細胞に対する粒子
の比率が４５となるように加えた。管を４℃にて３０分
間回転した。粒子を磁気分離機で分離した。上澄を回収
し遠心して残存細胞を回収した。ペレットを１００μＬ
のトリパンブルーに再懸濁させて全細胞数を数えた。結
果を表IVに示した。
【００８３】 表 IV 粒子／細胞比 ＋／−MoAb細胞 回収細胞 消耗％ ────────────────────────────── ０ ＋ 7.62×105 ０（対照） ４５ ＋ 2.89×104 96.2 ４５ − 7.33×105 4.6
【００８４】実施例 ３９ ５７６mlの脱イオン水，９mlのスチレン及び、実施例１
の記載に従って調製した３．０％ｗ／ｖの磁性金属酸化
物２８８mlを含有する混合物を密封した瓶に加えた。瓶
を吸引して約６０ｒｐｍで６５±４℃のオーブン中１時
間回転した。混合物に、１８ｇの過硫酸カリウム及び５
％ｗ／ｖの４．０μｍ螢光ナイル赤ポリスチレン粒子７
１２mlを加えた。瓶を再び密封し、吸引して１時間回転
し、そして２．０％のドデシル硫酸ナトリウム４５mlを
加えた。更に５時間経過の後、９mlのスチレン及び９ｇ
の過硫酸カリウムを混合物に加えた。混合物を更に１５
時間回転し、２層にしたチーズクロスで濾過し、磁気的
に分離し、そして上澄が透明になるまで脱イオン水で数
回洗浄した。得られた螢光磁性粒子を脱イオン水に懸濁
して１５８０mlとし、約１１．０％の磁性金属酸化物含
量を有し４．４μｍの平均サイズを有する３．０％ｗ／
ｖ懸濁液を得た。
【００８５】実施例 ４０ 実施例３９の記載に従って調製した３．０％ｗ／ｖの螢
光ナイル赤磁性粒子１．５８０Ｌを、１．２３ｇのドデ
シル硫酸ナトリウム，１７．５０ｇの過硫酸カリウム及
び、４．８mlのメタノール中に１．２mlのウンデシレン
酸と０．０２４mlのジビニルベンゼンとを含有する溶液
の添加によりカルボキシル化した。混合物を密封した瓶
に加え、吸引して約６０ｒｐｍで５５〜６５℃のオーブ
ン中５時間回転した。得られた螢光ナイル赤カルボキシ
ル磁性粒子を磁気的に分離し、そして上澄が透明になる
まで脱イオン水で数回洗浄した。螢光ナイル赤カルボキ
シル磁性粒子を脱イオン水に懸濁させて８５０mlとし約
１１．０％の磁性金属酸化物含量を有し４．４μｍの平
均サイズを有する５．０％ｗ／ｖ懸濁液を得た。
【００８６】実施例 ４１ １１．２８％ｗ／ｖの２．２４μｍポリスチレン粒子１
２．４ml，実施例５の記載に従って調製した２．７８％
ｗ／ｖの金属酸化物６５ml，７５mlの脱イオン水及び、
６．７５mlのスチレン中に０．１８ｇの過酸化ベンゾイ
ルと７mgのナイル赤と０．７５mlのジビニルベンゼンと
を含む溶液を含有する混合物を密封した瓶に加えた。瓶
を吸引して約６０ｒｐｍで６０〜７０℃のオーブン中約
１５時間回転した。混合物を、２層にしたチーズクロス
で濾過し、磁気的に分離し、そして上澄が透明になるま
で脱イオン水で数回洗浄した。得られた螢光架橋磁性粒
子を脱イオン水に懸濁させて１７０mlとし、約１６．５
％ｗ／ｖの金属酸化物含量を有し４．０μｍの平均サイ
ズを有する５．４％ｗ／ｖの懸濁液を得た。
【００８７】実施例 ４２ 螢光及び無螢光カルボキシル磁性粒子（ほぼ同じ金属酸
化物含量を有する）へのヤギ抗ＨＢｓＡｇの結合は実施
例３０と同様であった。
【００８８】黒の９６ウエルのミクロ滴定板〔Ｐａｎｄ
ｅｘ（登録商標）〕のウエルに、４．０μｍの，ヤギ抗
ＨＢｓＡｇを被覆した螢光及び無螢光カルボキシル磁性
粒子の完全な混合物（比率１：１），濃度０．１２５％
ｗ／ｖ，の２０μＬを加えた。磁性粒子を含むウエル
に、種々の量のＨＢｓＡｇを含む無処理血漿又はＨＢｓ
Ａｇ陰性血漿の１００μＬを加えた。３７℃にて３０分
間インキュベーションした後、粒子を磁気分離機により
分離し１００μＬの洗浄用緩衝液で２回洗浄した。粒子
を含む各ウエルに希釈緩衝液中のマウス抗ＨＢｓＡｇと
Ｂ−ガラクトシダーゼとの結合体２０μＬを加えた。３
７℃で１５分間のインキュベーションの後、粒子を分離
し上記のようにして６回洗浄した。粒子を含むウエル
に、４−メチルウンベリフェリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド（ＭＵＧ，Ｓｉｇｍａ）を含有する溶液５０μ
Ｌを加えた。板を３７℃でインキュベートし、螢光強度
を、励起側５２５ｎｍ及び螢光側５８０ｎｍのフィルタ
ー（チャンネルＣ，対照チャンネル）を備えた螢光濃度
分析機〔ＦＣＡ，Ｐａｎｄｅｘ（登録商標）〕を用い、
８分間隔で２５倍利得に設定して測定した。チャンネル
Ｃの螢光強度を任意に定めた螢光単位（ＡＦＵ）で記録
し表（１）に示した。結果は、螢光磁性粒子が空のウエ
ルを検出し、また平均螢光強度に満たないウエルをも表
示していることを示している。これはピペット操作の誤
りかアッセイ中の粒子の損失によるものである。
【００８９】 表 （１） チャンネルＣ（対照チャンネル） ──────────────────── ウエルの数 ΔＡＦＵ範囲 ΔＡＦＵ範囲 １２空 ４８３２−４９００ ４８６７ １７ ２９８２６−３３２００ ３１４８０ １ −−− １９４５８＊ １ −−− ２７９５２
【００９０】＊１７ウエルの平均ＡＦＵ ３１４８０に
対し１個のウエルのＡＦＵが１９４５８であることは、
当該ウエルの粒子の損失又はアッセイ当初に少ない数の
粒子しか放出されなかったことを示す。
【００９１】実施例 ４３ アッセイ能力の比較のためヤギ抗ＨＢｓＡｇで被覆した
螢光及び無螢光カルボキシル磁性粒子を同時にアッセイ
において使用した以外は、実施例４２の記載と同じ手順
に従った。螢光強度はチャンネルＤ（定量チャンネル，
励起側３６５ｎｍ及び螢光側４５０ｎｍフィルター）を
用いて測定し、表（２）に示した。結果は、螢光及び無
螢光の粒子のいずれもアッセイにおいて同等の成績をあ
げたことを示している。
【００９２】 表 （２） ＡＦＵ ──────────────────── ＨＢｓＡｇ濃度 螢光粒子 無螢光粒子 高 ２７２３８ ３００５９ 中等度 ５８２０ ５９７６ 低 １６８８ １８１６ 陰 性 ３２６ ４０３
【図面の簡単な説明】
【図１】 螢光磁性粒子の断面モデル図である。
【図２】 螢光磁性粒子の断面透過型電子顕微鏡写真で
ある。
【図３】 螢光磁性粒子の走査型電子顕微鏡写真（１０
００倍）である。
【図４】 螢光磁性粒子の走査型電子顕微鏡写真（５０
００倍）である。
【符号の説明】
１：螢光コア粒子 ２：金属酸化物／ポリマー被覆層 ３：保護ポリマー被覆 ４：官能基含有ポリマー被覆
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ０８Ｆ 257/00 Ｃ０８Ｆ 257/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (31)優先権主張番号 ４５２，０９９ (32)優先日 1989年12月14日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 C08F 2/44 C08F 291/00 C08F 257/00

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】分析物の存在又は濃度を測定するための方
    法であって、（ａ） 螢光磁性粒子であって、該螢光磁
    性粒子に担持された前記分析物に特異的なリガンドを有
    するものを、液体標本と接触させて懸濁液を形成し、
    （ｂ） 十分な量の分析物が前記特異的リガンドと反応
    するまで前記懸濁液をインキュベートし、（ｃ） 前記
    磁性粒子を前記懸濁液から分離し、（ｄ） 前記分析物
    に特異的な第２の標識されたリガンドを前記の分離した
    磁性粒子に加え、（ｅ） 十分な量の分析物が、前記分
    析物に特異的な前記第２の標識されたリガンドと反応す
    るまで該懸濁液をインキュベートし、（ｆ） 前記磁性
    粒子を前記懸濁液から分離し、（ｇ） 前記磁性粒子上
    の複合体形成を前記標識により検出又は測定し、そし
    て、（ｈ） 標識されたリガンドの測定量と対照サンプ
    ルの分析物の測定量とを関係づけることよりなり、前記
    螢光磁性粒子が前記工程の間存在する粒子の数をモニタ
    ーするために用いられるものである方法。
  2. 【請求項２】前記螢光材料が、ナイル赤，クマリン６，
    クマリン４，ローダミンＢ，ナイル青，オキサジン７２
    ５，オキサジン７５０又はこれらの螢光材料の１又は２
    以上の混合物よりなる群より選ばれるものである、請求
    項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記粒子の数が、前記粒子を前記液体標本
    に接触させるに先立ち螢光粒子の螢光強度を測定するこ
    とにより、及び前記螢光磁性粒子に結合した標識された
    リガンドの量を測定した後に螢光粒子の螢光強度を測定
    することにより、モニターされるものである、請求項１
    に記載の方法。
  4. 【請求項４】核酸標的分子中の特定の核酸配列の存在又
    は濃度を測定するための方法であって、（ａ） 螢光磁
    性粒子であって該螢光磁性粒子に担持された前記標的分
    子の前記核酸配列に相補的な核酸を有するものを、液体
    標本と接触させて懸濁液を形成し、（ｂ） ハイブリッ
    ド化条件下にハイブリッド化を起こさせるに十分な時間
    前記懸濁液をインキュベートし、（ｃ） 前記螢光磁性
    粒子を前記懸濁液から分離し、（ｄ） 前記標的分子の
    前記核酸配列に相補的な第２の標識された核酸配列を加
    え、（ｅ） ハイブリッド化条件下にハイブリッド化を
    起こさせるに十分な時間前記懸濁液をインキュベート
    し、（ｆ） 前記螢光磁性粒子を前記懸濁液から分離
    し、そして、（ｇ） 前記磁性粒子上の複合体の形成を
    前記標識により測定することよりなり、前記螢光磁性粒
    子が前記工程の間存在する粒子の数をモニターするため
    に用いられるものである方法。
  5. 【請求項５】前記粒子の数が、前記粒子を前記液体標本
    に接触させるに先立ち螢光粒子の螢光強度を測定するこ
    とにより、及び前記螢光磁性粒子に結合した標識された
    リガンドの量を測定した後に螢光粒子の螢光強度を測定
    することにより、モニターされるものである、請求項４
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】核酸標的分子中の特定の核酸配列の存在又
    は濃度を測定するための方法であって、 （ａ） 均一なサイズ分布と磁性含量とを有する単分散
    性の螢光磁性粒子であって、（ｉ） モノマーを吸着し
    得る内側コアポリマー粒子と磁気応答性金属酸化物及び
    ポリマーの組合せとからなり、該ポリマーが前記内側コ
    アポリマー粒子に吸着され得るモノマーよりなり且つ１
    の螢光染料又は螢光染料の組合せを含有するものである
    粒子であり、 （ｂ） 前記金属酸化物及びポリマーの組合せは前記内
    側コア粒子を均一に被覆するものであり、 （ｃ） 前記磁性粒子は、均一なサイズ分布と均一な磁
    性含量を有し溶液中で単分散性のものであり、そして、 （ｄ） 前記螢光磁性粒子に担持された前記標的分子の
    前記核酸配列に相補的な核酸を有するものを、液体標本
    と接触させて懸濁液を形成することよりなる方法。
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