CN113711041A - 磁响应性颗粒和使用其的免疫测定方法、免疫测定试剂 - Google Patents
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Abstract
公开了敏化的磁响应性颗粒，其包括：具有核心粒子和至少一个磁性层的磁响应性颗粒，所述磁性层设置在所述核心粒子上并且包括磁性金属和/或其氧化物的微粒；以及支持在磁响应性颗粒上并与分析物特异性相互作用的物质，其中所述磁响应性颗粒的重均粒度的变异系数为15％以下。所提供的磁响应性颗粒具有优异的磁可分离性。
Description
技术领域
本发明涉及用于免疫测定试剂的磁响应性颗粒和免疫测定方法以及使用所述颗粒的免疫测定试剂。
背景技术
作为从含有生物物质的样品中测量和/或纯化目标蛋白质的程序，已知的分析包括：将与分析物特异性相互作用的物质固定在固相支持体上；使物质与生物样品中的分析物结合；洗去分析物以外的未结合物质；并测量与固相支持体结合的分析物的量。
由于未结合的物质在去除时易于分离和收集，因此使用磁响应性颗粒作为固相支持体。例如，专利文献1公开了在核心粒子的表面形成有磁性层且在其上形成有聚合物层的临床检验试剂颗粒作为这样的颗粒。然而，对于所公开的颗粒，仅获得具有宽范围粒度的颗粒。
专利文献2公开了能够进行高灵敏度免疫测定的颗粒，由于非磁性金属氧化物在磁性材料的共同存在下缩聚，所述颗粒具有显著增加的磁性材料含量。然而，所公开的生产方法仅给出具有宽粒度分布的颗粒。因此，当用作临床试剂时，存在测定重现性差的问题，并且担心缺乏准确的测量，因为过量的磁性材料含量会影响免疫反应。此外，所公开的颗粒包括在非磁性氧化物中的超顺磁性金属氧化物颗粒。因此，它的比重高和可沉淀性增加，导致当用作免疫测定试剂时所述颗粒难以处理的问题。
引用列表
专利文献
专利文献1：日本专利公开号：2004-205481
专利文献2：日本专利公开号：2013-019889
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供具有优异的磁可分离性和高灵敏度潜能的免疫测定试剂，以及用于其的磁响应性颗粒。
问题的解决方案
本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现，当使各磁响应性颗粒的磁性材料含量恒定时，可以获得具有良好的磁可分离性的磁响应性颗粒并能够实现高灵敏度免疫测定试剂。具体而言，本发明涉及以下项目。
[1]敏化的磁响应性颗粒，包括：磁响应性颗粒，所述磁响应性颗粒具有核心粒子和设置在所述核心粒子上的至少一个磁性层，所述磁性层包含磁性金属和/或其氧化物的微粒；以及与分析物特异性相互作用的物质，所述物质被支持在所述磁响应性颗粒上，其中所述磁响应性颗粒的重均粒度的变异系数为15％以下。
[2]根据[1]所述的敏化的磁响应性颗粒，其中，所述磁响应性颗粒的体积平均粒度的变异系数为20％以下。
[3]敏化的磁响应性颗粒，包括：磁响应性颗粒，所述磁响应性颗粒具有核心粒子和设置在所述核心粒子上的至少一个磁性层，所述磁性层包含磁性金属和/或其氧化物的微粒；以及与分析物特异性相互作用的物质，所述物质被支持在所述磁响应性颗粒上，其中所述敏化的磁响应性颗粒的重均粒度的变异系数为15％以下。
[4]根据[3]所述的敏化的磁响应性颗粒，其中，所述敏化的磁响应性颗粒的体积平均粒度的变异系数为20％以下。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的敏化的磁响应性颗粒，进一步包括非磁性层，所述非磁性层包含在所述磁性层和与分析物特异性相互作用的物质之间的非磁性金属氧化物和/或有机金属化合物。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的敏化的磁响应性颗粒，其中，所述与分析物特异性相互作用的物质通过一步或多步反应而化学结合在所述磁性层上。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的敏化的磁响应性颗粒，其中，所述与分析物特异性相互作用的物质通过一个或多个化学键结合在所述非磁性层上。
[8]使用根据[1]至[7]中任一项所述的敏化的磁响应性颗粒的多相免疫测定方法。
[9]免疫测定试剂，其包含根据[1]至[7]中任一项所述的敏化的磁响应性颗粒。
发明的有益效果
本发明可以提供磁响应性颗粒，其均匀地含有磁性材料、具有优异的磁可分离性、并且对表面的分析物结合抑制显著降低，以及使用所述颗粒提供高性能的免疫测定试剂。
具体实施方式
下面结合实施方式对本发明进行说明。然而，本发明不限于以下实施方式。
1.磁响应颗粒及其生产方法
以下，对各要素等进行详细说明。
1.1核心粒子
本发明的磁响应性颗粒具有至少一个磁性层，所述磁性层设置在要成为核心的粒子(核心粒子)上并且包括磁性金属和/或其氧化物的微粒。
本发明的核心粒子可以由无机或有机材料制成并且没有特别限制。但是，在用作免疫测定试剂的情况下，优选由树脂构成的树脂颗粒，因为较小的比重提供更好的分散性。树脂颗粒基本上是非磁性材料，例如可以使用有机物例如聚合物。
构成上述树脂颗粒的材料的实例包括但不特别限于聚烯烃，例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚偏1,2-二氯乙烯、聚四氟乙烯、聚异丁烯、聚丁二烯；丙烯酸树脂例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯；丙烯酸酯/二乙烯基苯共聚物树脂；聚对苯二甲酸亚烷基酯；聚砜；聚碳酸酯；聚酰胺；酚醛树脂；三聚氰胺甲醛树脂；苯并胍胺甲醛树脂；和脲醛树脂。这些构成树脂微粒的材料可以单独使用，也可以组合使用两种或更多种。
本发明的核心粒子的平均粒度优选为0.5～10μm，更优选为1～5μm，最优选为2.5～4μm。如果核心粒子的平均粒度小于0.5μm，磁性材料可附着到每个粒子的面积小。这可能导致磁可分离性不足。此外，如果核心粒子的平均粒度超过10μm，当核心粒子附着在磁性材料上后用作生化用途的载体时，作为反应位点的表面积可能很小。
磁可分离性是指示磁响应性颗粒对磁体的响应的指标。磁可分离性可以通过将磁体施加到磁响应性颗粒的水性分散体并使用例如分光光度计(U-3900H，由Hitachi,Ltd.制造)计算随时间测量的吸光度衰减来评价。衰减越大，对磁体的响应越好。当用作免疫测定的试剂时，可以说磁响应性颗粒在短时间内更有效地分离分析物。
另外，核心粒子的体积平均粒度的变异系数(CV值)为20％以下，优选为15％以下，更优选为10％以下。使用具有大CV值的粒子作为核心会导致每个颗粒的表面积发生变化。当形成磁性层时，这可能导致磁性材料涂覆量的变化。涂覆量的变化是不希望的，因为它导致磁可分离性的变化，因此在用作免疫测定试剂的情况下测定再现性可能变差。为了控制粒度，可以应用任何控制粒度的方法：在制造核心粒子的步骤中进行粒度控制工艺的方法；或者在制造核心粒子后通过分类进行粒度控制工艺的方法。此外，这些方法可以组合使用。
本发明中的平均粒度可以通过在例如扫描电子显微镜(“S-4800”，由HitachiHigh-Technologies Corporation制造)下观察颗粒并计算在观察到的图像中随机选择的50个颗粒各自的最大直径的平均值来确定。
本发明中的体积平均粒度是通过使用例如激光衍射和散射粒度分布分析仪(“LS13 320”，由Beckman Coulter Inc.制造)测量获得的体积平均粒度。
上述核心粒子可以在粒子表面提供反应性官能团。例如，这可以用作涂覆磁性材料时的结合位点。
使用的上述核心粒子可以是其中吸收或吸附了液体材料或固体材料细粉末的颗粒。这可以产生在内部和/或表面上包括上述液体材料或固体材料的磁性材料涂覆颗粒。注意，上述材料吸收/吸附是指通过/在颗粒表面和孔内部的吸收/吸附或附着等。该吸收和吸附可以通过常规已知的方法例如浸渍进行。
1.2磁性材料
作为本发明中用于涂覆核心粒子表面的磁性金属和/或磁性金属氧化物，可以单独使用一种，也可以组合使用两种或更多种。此外，金属和/或金属氧化物可以在颗粒表面提供反应性官能团。例如，这可以用作核心粒子被涂覆时的结合位点。
从磁可分离性的观点来看，磁性金属和/或磁性金属氧化物优选包括选自元素周期表第4至6周期的第8至10族金属或镧系元素中的任意至少一种。或者，优选的是基于氧化铁的物质。具体实例包括由MFe2O4(其中M＝Co、Ni、Mn、Zn、Mg、Cu、Li0.5Fe0.5等)表示的铁氧体、由Fe3O4或γFe2O3表示的磁铁矿。最特别优选Fe3O4或γFe2O3作为具有强饱和磁化和较小剩余磁化的磁性材料。
1.3磁性层
本发明中的磁性金属涂覆颗粒(以下，称为“磁响应性颗粒”)具有通过在核心粒子表面吸附磁性金属和/或金属氧化物而形成的磁性层。这里，金属和/或金属氧化物可以通过物理吸附或通过化学键涂覆在树脂颗粒的表面上。本发明中金属和/或金属氧化物的物理吸附是指不发生任何化学反应的吸附/结合。实例包括熔融键合或吸附、融合键合或吸附、氢键合、范德华键合、静电相互作用或多相聚集。通过化学键涂覆是指树脂颗粒表面上提供的官能团通过化学反应与金属和/或金属氧化物上的官能团结合，从而使核心粒子的表面将金属和/或金属氧化物支撑在核心粒子表面的表面上。在这些涂覆方式中，由于制备方便，更优选物理吸附涂覆。
使用磁性金属和/或金属氧化物，可以在同一核心粒子上多次重复形成复合物以产生磁响应性颗粒。在每个步骤中，用于形成复合物的金属和/或金属氧化物没有特别限制并且可以单独使用或以两种或多种组合使用。此外，添加金属和/或金属氧化物的方法没有特别限制，并且可以允许分批工艺、分开工艺或连续添加工艺中的任一种。此外，当金属和/或金属氧化物以给定比例以两种或更多种组合使用时，添加顺序没有特别限制。它们可以全部混合和添加，它们中的每一个可以单独添加，或者它们中的一些可以混合并且其他可以单独添加等。它们可以以任何给定的顺序和组合添加。添加次数也没有特别限制。
此外，如果需要，可以在复合物形成时添加除磁性材料之外的功能材料作为磁性层形成材料。这种功能材料的类型没有特别限制，并且如果适当的话，可以根据形成复合物的目的选自有机物质或无机物质。其种类不限于单一类型，并且可以组合使用两种或更多种。这里的目的是指，例如，添加除赋予磁可分离性以外的功能，例如赋予电特性、着色等。
复合物的形成可以使用磁性材料和/或功能材料在相同的核心粒子上重复多次。在每个步骤中，用于形成复合物的磁性材料和/或功能材料没有特别限制。可以仅使用磁性材料，或者可以仅使用功能材料。或者，可以使用磁性材料和功能材料两者。另外，可以单独使用磁性材料或功能材料中的任一种，或者可以组合使用两种或更多种。此外，添加材料的每个工艺没有特别限制。可以允许分批工艺、分开工艺或连续添加工艺中的任一种。当以给定比例组合使用其两种或更多种时，添加顺序没有特别限制。它们可以全部混合并添加，也可以分别添加，或者也可以将一部分混合而其他单独添加等。可以以任意给定的顺序和组合添加。添加次数也没有特别限制。
当使用磁性金属和/或金属氧化物在同一核心粒子上多次重复复合物形成时，可以在磁性层上形成非磁性层，然后进一步形成磁性层。磁性层和非磁性层可以交替形成以形成多个层。
磁响应性颗粒的磁性材料含量优选为10wt％至50wt％。如果磁性材料的含量为50wt％或更多，则作为最终产品的磁响应性颗粒的比重大，并且可沉淀性增加。这引起对颗粒可分散性差的担忧。另外，磁性材料的含量越高，重均粒度的变异系数(CV值)增加，其用作免疫测定试剂的情况下，再现性有可能受到不良影响。如果含量低于10wt％，则不能获得足够的磁可分离性，因此在用作免疫测定试剂的情况下分离和收集变得困难。
磁响应性颗粒的可分散性可以通过分散率来评价。分散率可以通过磁响应性颗粒的磁性收集前的吸光度和磁性收集和分散后的吸光度的变化率来计算。分散率为85％或更多，优选为90％或更多，进一步优选为95％或更多。如果分散率低于85％，则磁性分离后的磁性颗粒再分散不充分，可能导致测定精度、测定灵敏度和测定可再现性下降。
磁响应性颗粒的重均粒度的变异系数(CV值)优选为15％以下，更优选为10％以下。重均粒度的CV值指出粒度如何变化以及密度如何变化。较低的CV值表示均匀的粒度和均匀的密度。较高的CV值表示不均匀的粒度或密度，或表示两者都不均匀。本发明中的重均粒度的CV值是通过例如圆盘离心式粒度分布分析仪(“DC24000UHR”，CPS Instruments,Inc.制造)获得的值。本发明颗粒的重均粒度的CV值低至10％以下，本发明颗粒各自具有相似的磁性材料含量(量)。因此，磁可分离性优于常规磁响应性颗粒的磁可分离性。
磁响应性颗粒的平均粒度优选为0.5～10μm，更优选为1～8μm，进一步优选为2～5μm。本发明中的平均粒度是通过例如扫描电子显微镜(“S-4800”，由Hitachi High-Technologies Corporation制造)获得的值。
磁响应性颗粒的体积平均粒度的CV值为20％以下，优选为15％以下，更优选为10％以下。体积平均粒度的CV值反映了粒度的变化。这表明如果该值低，则粒度均匀，如果该值高，则粒度不均匀。
磁响应性颗粒的磁可分离性优选为40％或更多，更优选为50％或更多，最优选为60％或更多。
注意，由金属和/或金属氧化物构成的磁性层具有约10至200nm的厚度；下述的由金属氧化物和/或有机金属化合物构成的非磁性层的厚度为约10～500nm。最终得到的磁响应性颗粒的平均粒度为约0.5～10μm。
1.4非磁性材料
本发明的磁响应性颗粒可以在磁性层表面具有非磁性金属氧化物层和/或非磁性有机金属化合物层。形成所述非磁性层以涂覆磁性层和/或赋予颗粒自身的功能性。
关于作为生化用途的载体例如免疫测定试剂的用途，可以根据目的选择非磁性层表面的特性。以下描述的程序可用于非磁性层的形成，以强烈地防止杂质从颗粒洗脱、磁性材料本身洗脱或杂质从磁性层洗脱。这可以实现更优选的状态，特别是作为免疫测定试剂的载体颗粒。
非磁性层可以通过在颗粒的存在下添加作为主要原料的非磁性金属氧化物和/或非磁性有机金属化合物和任选的其他辅助材料并使它们在液相中反应来形成。此时使用的非磁性金属氧化物和/或非磁性有机金属化合物优选具有能够与磁性材料的表面反应的官能团。使用可直接与磁性材料表面反应的金属氧化物和/或有机金属化合物，使磁性层和非磁性层牢固结合，保持高度紧密的附着，从而起到优异的防止磁性层组分泄露并固定组分的效果。同时，在使用以例如基于乙烯基的单体为代表的自由基可聚合单体的情况下，该单体不直接结合到磁性材料上。因此，磁性层和聚合物层之间的附着性差，并且磁性层组分的固定不充分。结果，可能导致组分的泄漏和形状/磁可分离性的去稳定化。
使磁性表面和非磁性层反应的程序没有特别限制。实例包括共价键合或配位键合。
下面将描述非磁性层的主要原料。为方便起见，仅举例说明单分子化合物。然而，在分子中含有一个或多个可与磁性材料表面反应的官能团的化合物是可接受的。该化合物可以是二聚体到多聚体，其中多个单分子进行缩聚。另外，可以与磁性材料反应的所含官能团的数量没有特别限制。
非磁性金属氧化物和/或非磁性有机金属化合物优选含有选自Si、Ge、Ti或Zr中的至少一种。如上所述，它优选具有能够与磁性层的表面反应的官能团。具体实例包括：以烷氧基硅烷为代表的硅烷化合物，如原硅酸四乙酯及其水解产物；以烷氧基锗为代表的锗化合物，如四乙氧基锗及其水解产物；以烷氧基钛为代表的钛化合物，如四乙氧基钛及其水解产物；或以烷氧基锆为代表的锆化合物，如四丁氧基锆及其水解产物。这里，考虑到保持颗粒分散性，非磁性层的比重应尽可能小。在上述实例中，最优选硅烷化合物。
此外，在用作非磁性层的主要原料的金属氧化物和/或有机金属化合物中，可以使用除了与磁性层的表面反应的官能团之外还具有另一官能部分的金属氧化物和/或有机金属化合物。在这种情况下，磁响应性颗粒还可以提供源自金属氧化物和/或有机金属化合物的另一功能。
具有另一官能部分的金属氧化物和/或有机金属化合物将参考硅烷化合物具体举例说明。然而，所使用的金属氧化物和/或有机金属化合物不限于它们。
实例包括含乙烯基化合物，例如乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、7-辛烯基三甲氧基硅烷；含环氧基化合物例如2-(3,4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷、8-环氧丙氧基辛基三甲氧基硅烷；含苯乙烯基化合物例如对苯乙烯基三甲氧基硅烷；含甲基丙烯酰基的化合物例如3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷、8-甲基丙烯酰氧基辛基三甲氧基硅烷；含丙烯酰基化合物例如3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷；含氨基的化合物，例如N-2-(氨乙基)-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷、N-2-(氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-三乙氧基甲硅烷基-N-(1,3-二甲基亚丁基))丙胺、N-苯基-3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-(乙烯基苄基)-2-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷盐酸盐、N-2-(氨乙基)-8-氨基辛基三甲氧基硅烷；含异氰脲酸酯的化合物例如三-(三甲氧基甲硅烷基丙基)异氰脲酸酯；含脲基化合物例如3-脲基丙基三烷氧基硅烷；含巯基化合物例如3-巯基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷；含异氰酸酯的化合物例如3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷；含羧酸酐的化合物例如3-三甲氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐；和含羧酸的化合物，例如水解的3-三甲氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐)。
当用作生化用途的载体时，其中优选含环氧基的化合物、含氨基的化合物、含巯基的化合物、含羧酸酐的化合物或含羧酸的化合物。同样，优选的实例包括：其中含乙烯基化合物/含苯乙烯基化合物的双键部分被氧化以环氧化的那些；或将含乙烯基化合物/含苯乙烯基化合物引入颗粒上，然后将其双键部分氧化成环氧基团，通过在引入颗粒之前或之后转换官能团，增加与生物相关材料的反应性。
如上所述用作非磁性层的主要原料的金属氧化物和/或有机金属化合物可以是单一类型，或者可以以给定比例组合使用两种或更多种。在使用两种或更多种金属氧化物和/或有机金属化合物的情况下，两种或更多种金属氧化物和/或有机金属化合物的组合是两种或更多种具有另一官能部分的金属氧化物和/或有机金属化合物的组合，两种或更多种没有另一官能部分的金属氧化物和/或有机金属化合物的组合，或具有一个或多个其他官能部分的金属氧化物和/或有机金属化合物和没有一个或多个其他功能的金属氧化物和/或有机金属化合物的组合。
在形成非磁性层的过程中添加金属氧化物和/或有机金属化合物的程序没有特别限制，并且可以允许分批工艺、分开工艺或连续添加工艺中的任一种。此外，在以给定的比例将两种或更多种以给定的比例组合使用的情况下，添加顺序没有特别限制。它们可以全部混合并添加，也可以分别添加，或可以将一部分混合而其他单独添加等。他们可以以任意给定的顺序和组合添加。添加次数也没有特别限制。
非磁性层的涂覆和磁性层的涂覆可以在其表面已经涂覆有磁性层的核心粒子上重复进行。例如，表面涂覆磁性层的核心粒子涂覆有非磁性层。该表面层可以进一步依次涂覆有磁性层和非磁性层。此时，只要包括至少一个磁性层，且最外层为非磁性层，核心粒子上在整个涂覆层中涂层的数量(层数)以及磁性层/非磁性层(内层)的数量和类型没有限制。注意，在包括两个或更多个磁性层的情况下，与仅包括一个磁性层的颗粒相比，更高的最终颗粒的磁性材料含量提高，从而可以使磁响应性更高。
在形成非磁性层时，除了作为主要原料的金属氧化物和/或有机金属化合物之外，还可以任选地使用辅助材料。辅助材料没有特别限制。例如，在本发明中使磁性材料表面与金属氧化物和/或有机金属化合物反应的情况下，在许多情况下通常可以加入酸或碱进行反应。
在磁性层的表面形成的有非磁性层的磁响应性颗粒的重均粒度的变异系数(CV值)优选为15％以下，更优选为10％以下。另外，平均粒度优选为0.5～10μm，更优选为1～8μm，进一步优选为2～5μm。体积平均粒度的CV值为20％以下，优选为15％以下，更优选为10％以下。
1.5支持物质和如何支持生物相关材料
<分析物>
本发明中的分析物是指待测量/捕获的物质。例如，这种物质存在于体内或生物样品中，例如血液(全血)、红细胞、血清、血浆、尿液、唾液或痰液。实例包括：炎症相关标志物，例如病变组织、病变细胞、CRP(C反应蛋白)、IgA、IgG、IgM；凝血和纤维蛋白溶解标志物，例如纤维蛋白降解产物如D-二聚体、可溶性纤维蛋白、TAT(凝血酶-抗凝血酶复合物)、PIC(纤溶酶-纤溶酶抑制剂复合物)；循环相关标志物，如氧化型低密度脂蛋白、BNP(脑钠肽)、H-FABP(心脏脂肪酸结合蛋白)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)；代谢相关标志物，如脂联素；肿瘤标志物，如CEA(癌胚抗原)、AFP(甲胎蛋白)、PIVKA-II、CA19-9、CA125、PSA(前列腺特异性抗原)；感染相关标志物例如HBV(乙型肝炎病毒)、HCV(丙型肝炎病毒)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)；呼吸相关标志物，如KL-6；变应原特异性IgE(免疫球蛋白E)；激素和药物。
<相互作用物质>
本发明中与分析物特异性相互作用的物质的实例包括蛋白质、肽、氨基酸、脂质、碳水化合物、DNA、RNA、受体、半抗原、生物素和抗生物素蛋白。分子量有多高或多低或相互作用的物质是否来自天然存在或合成的物质没有特别限制。实例包括可用于利用免疫反应的免疫测定的抗体或抗原。同时，术语“相互作用”是指反应或结合。
上述磁响应性颗粒的主要用途是生化用途的载体，如免疫测定试剂。作为生化用途的载体的磁响应性颗粒(以下，称为“敏化的磁响应性颗粒”)可以通过使用该颗粒作为载体并固定分析物、分析物类似物或与分析物特异性相互作用的物质(在下文中，有时通常简称为“支持物质”)来生产。
将支持物质固定在磁响应性颗粒上以制备本发明的敏化的磁响应性颗粒的方法没有特别限制。常规已知的物理和/或化学键合可用于固定。当通过化学键固定时，通过使用具有如段落0042中示例的生物相关材料结合官能团的金属氧化物和/或有机金属化合物形成非磁性层，存在于磁响应性颗粒的表面上的官能团可以固定为支架，用于结合支持物质。
上述技术优选用于为磁响应性颗粒的表面提供环氧基、氨基、巯基、羧酸基或羧酸酐结构，并通过每个结构将支持物质支持在颗粒的表面上。
此外，可以将能够与上述支持物质特异性结合的生物相关材料支持在磁响应性颗粒上，并且支持物质可以通过生物相关材料与反应体系中的磁响应性颗粒结合。可用于该目的的生物相关材料的实例包括抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白。其上支持生物相关材料以介导与支持物质的结合的磁响应性颗粒也可以被认为是敏化的磁响应性颗粒。
所得的敏化的磁响应性颗粒可以任选地用每种聚合物化合物或蛋白质(例如牛血清白蛋白)包被(封闭)，并且可以分散在合适的缓冲液中，然后用作敏化磁性颗粒分散体。敏化颗粒分散体可用作免疫测定的试剂。此外，用于测定的稀释剂(缓冲液)和/或标准物质等可以组合使用以提供测定试剂盒。
敏化磁性响应性颗粒的重均粒度的变异系数(CV值)优选为15％以下，更优选为10％以下。此外，平均粒度优选为0.5～10μm，更优选为1～8μm，最优选为2～5μm。体积平均粒度的CV值为20％以下，优选为15％以下，更优选为10％以下。
用于免疫测定的试剂和稀释剂可包含各种敏化剂，以提高测定灵敏度并促进分析物与支持物质之间的特异性反应。此外，用于免疫测定的试剂和稀释剂可包含例如各种聚合物化合物/蛋白质及其降解产物、氨基酸和/或表面活性剂以抑制由除了存在于测定样品中的测定靶标物质之外的物质引起的非特异性反应，和提高测定试剂的稳定性。
使用本发明的免疫测定试剂测定测定靶标物质的方法没有特别限制，只要使用本发明中的磁响应性颗粒即可。例如，本领域通常进行的夹心测定、竞争测定等可以根据文献的描述进行(例如，“Enzymatic Immunoassay,2nd edition”，Eiji Ishikawa等编辑，Igaku-Shoin Ltd.,1982)。
分析物测定包括以下步骤：使样品、敏化的磁响应性颗粒、标记的分析物结合物质、标记的测定靶标物质或其类似物等接触；并实施B/F分离(将结合的标记抗体与游离的标记抗体分离)。在前一步骤中，可以通过常规处理例如搅拌或混合来分散磁性颗粒。后一步骤例如如下进行：通过使用从反应容器等外部施加的磁体等，利用磁性颗粒的磁性收集磁性颗粒；排出反应溶液；加入洗涤溶液；取出磁体；将磁性颗粒混合、分散和然后洗涤。上述操作可以重复一到三次。洗涤溶液没有特别限制，只要该溶液是本领域常规使用的即可。
分析物的测量结果可以通过将分析物或其类似物等用标记物质标记并测定其量或活性而得到的值算出。常规方案可以用作测量标记物质或其活性的程序，其没有特别限制。具体实例包括放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、电化学发光免疫测定(ECLIA)、化学发光免疫测定(CLIA和CLEIA)、吸光度测量或表面等离振子共振。测量时使用的光学仪器没有特别限制。可以使用作为代表性例子广泛用于临床试验的任何生化自动分析仪。
在磁响应性颗粒被用作生物化学用途的载体，例如免疫测定试剂的情况下，如上所述，具有增加的磁可分离性是关键的。使用具有优异磁可分离性的颗粒可实现优异的洗涤/纯化效率和减少的颗粒损失。这可以引起特别是免疫测定试剂的高性能。本发明的上述磁响应性颗粒可实现高磁可分离性，因此适合作为生化用途的载体，如免疫测定试剂。
实施例
2.实施例
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于它们。
以下方案用于测量每个实施例或比较例中获得的颗粒的平均粒度及其CV值、平均密度的CV值、磁可分离性和磁性材料含量。
2.1测量物理特性的方案
2.1.1平均粒度
通过在扫描电子显微镜(“S-4800”，由Hitachi High-Technologies Corporation制造)下观察颗粒并计算在观察到的图像中随机选择的各50个颗粒的最大直径的平均值来确定平均粒度。
2.1.2体积平均粒度CV值的测量
体积平均粒度的CV值通过使用激光衍射和散射粒度分布分析仪(“LS13 320”，由Beckman Coulter Inc.制造)测量体积平均粒度分布来计算。
2.1.3重均粒度CV值的测量
重均粒度的CV值通过使用圆盘离心式粒度分布分析仪(“DC24000UHR”，由CPSInstruments，Inc.制造)测量重均粒度分布来计算。具体地，将具有通过混合8％和24％蔗糖溶液获得的密度梯度的溶液以5000rpm离心，同时将其吸光度调整为1.0的颗粒水性分散体(0.1mL)置于其上进行测量。
2.1.4磁可分离性评价
使用分光光度计(U-3900H，由Hitachi,Ltd.制造)测量550nm处的吸光度以进行评价。将磁体(2800G，W10 mm×D10 mm×H1 mm)附接在设置在分光光度计的石英池底部，同时将吸光度调整为1.0的颗粒水性分散体(1.3mL)放入其中。在样品放置5秒或125秒后，读取吸光度。计算这120秒内的吸光度衰减以给出磁可分离性的指标。
2.1.5磁性材料含量的测量
磁响应性颗粒的磁性材料的含量可以由在空气中加热颗粒至1000℃使树脂部分分解而得到的残渣算出。具体地，精确称量磁响应性颗粒的干重(A)；使用同步热重分析仪(TG-DTA6300，Hitachi High-Tech Science Corporation制造)，以5℃/min的程序速度从35℃升温至1000℃；将温度保持在1000℃5分钟；然后测量所得残留物的重量(B)；并以百分比形式计算B与A的比例以给出磁性材料含量。
2.1.6可分散性评价
使用的样品溶液是将550nm波长的吸光度调整为1.0的磁性颗粒水性分散液。在此，将1.3mL的各样品溶液分配到分光光度计(“U-3900H”，由Hitachi,Ltd.制造)中设置的石英池中，并读取550nm波长处的吸光度。接下来，使用磁体(28000G，W40 mm×D40 mm×H10mm)磁性收集溶液中的颗粒，直到上清液的吸光度变为0。然后，将溶液在2000rpm下涡旋5秒以分散磁性颗粒，并测量550nm波长处的吸光度。使用磁性收集前的吸光度和磁性收集和分散后的吸光度，使用下式计算吸光度的变化以给出分散率。
分散率(％)＝[(磁性收集和分散后的吸光度)/(磁性收集前的吸光度)]×100。
2.2.1实施例1-1
首先，将作为树脂颗粒的2.0g Micropearl EX-003(粒度为3.01μm，CV为3.1％，由SEKISUI CHEMICAL CO.,LTD.制造)超声分散到40.0g离子交换水中以获得核心粒子分散体。
随后，在超声照射下搅拌的同时加入4.0mL磁性流体EMG707(由FerrotecCorporation制造)以进行另外30分钟的超声分散处理。将所得分散液过滤并用离子交换水洗涤，然后去除过量的磁性流体以产生磁响应性颗粒[1]。
2.2.2实施例1-2
首先，将实施例1-1中得到的磁响应性颗粒[1]1.0g超声分散到400g乙醇中。接着，向其中加入10mL 28％氨水溶液(由NACALAI TESQUE,INC.制造)、1.0g原硅酸四乙酯和3.0g8-环氧丙氧基辛基三甲氧基硅烷并超声分散3小时。过滤所得分散液后，将分散液分散到离子交换水中并重复3次离心，得到表面具有环氧基的磁响应性颗粒EP[1]。
将上述磁响应性颗粒EP[1]以3.0wt％超声分散在PBS中，将0.5mL转移到试管中。使用磁体将磁响应性颗粒EP[1]收集到试管壁表面后，除去分散介质。然后，加入0.5mL含有抗KL-6抗体(0.75mg/mL)的PBS溶液。将该混合物在25℃下搅拌过夜以敏化以制备抗KL-6抗体敏化的磁响应性颗粒[1]。之后，加入1.5mL 1.0wt％BSA溶液，并将混合物在25℃下搅拌4小时。使用磁体将敏化的磁响应性颗粒收集到试管的壁表面上。此后，除去分散介质，新加入1.5mL 1.0wt％BSA溶液并分散。重复该操作3次以制备抗KL-6抗体敏化的磁响应性颗粒[1]分散体。
2.2.3实施例1-3
将链霉亲和素溶解于0.1M硼酸水溶液中，以制备0.1μg/mL的链霉亲和素溶液。
将实施例1-2中得到的磁响应性颗粒EP[1]以3.0wt％超声分散于0.1M硼酸水溶液中，将其0.5mL转移至试管中。使用磁体将磁响应性颗粒EP[1]收集到试管的壁表面后，除去分散介质。接着，加入上述链霉亲和素溶液0.5mL，在37℃下搅拌混合物18小时，得到链霉亲和素敏化的磁响应性颗粒[1]。然后加入0.5mL 1.0wt％BSA溶液，并将混合物在37℃的反应温度下搅拌4小时。使用磁体将敏化的磁响应性颗粒收集到试管的壁表面上。此后，除去分散介质，新加入1.5mL 1.0wt％BSA溶液并分散。重复该操作3次以制备链霉亲和素敏化的磁响应性颗粒[1]分散体。
2.2.4实施例2-1
首先，将作为树脂颗粒的2.0g Micropearl SP-203(粒度为3.02μm，CV为4.9％，由SEKISUI CHEMICAL CO.,LTD.制造)超声分散到40.0g离子交换水中以制备核心粒子分散体。
随后，在超声照射下搅拌的同时加入4.0mL磁性流体EMG707(由FerrotecCorporation制造)以进行另外30分钟的超声分散处理。过滤所得分散体并用离子交换水洗涤。然后，去除过量的磁性流体以产生磁响应性颗粒[2]。
2.2.5实施例2-2
除了使用实施例2-1中制备的磁响应性颗粒[2]之外，进行与实施例1-2基本相同的操作，以制备抗KL-6抗体敏化的磁响应性颗粒[2]和抗KL-6抗体敏化的磁响应性颗粒[2]分散体。
2.2.6实施例3-1
首先，将作为树脂颗粒的2.0g Micropearl SP-203(粒度为3.02μm，CV为4.9％，由SEKISUI CHEMICAL CO.,LTD.制造)超声分散到40.0g离子交换水中以制备核心粒子分散体。
随后，在超声照射下搅拌的同时加入5.0mL磁性流体EMG707(由FerrotecCorporation制造)以进行另外30分钟的超声分散处理。过滤所得分散体并用离子交换水洗涤。然后，去除过量的磁性流体以产生磁响应性颗粒[3]。
2.2.7实施例3-2
除了使用实施例3-1中制备的磁响应性颗粒[3]之外，进行与实施例1-2基本相同的操作，以制备抗KL-6抗体敏化的磁响应性颗粒[3]和抗KL-6抗体敏化的磁响应性颗粒[3]分散体。
2.3.1比较例1-1
作为磁响应性颗粒，将Magnosphere MS300 Tosyl(由JSR Life SciencesCorporation制造)用作磁响应性颗粒[4]。
2.3.2比较例1-2
将上述磁响应性颗粒[4]以3.0wt％超声分散在PBS中，将其0.5mL转移到试管中。使用磁体将磁响应性颗粒[4]收集到试管壁表面后，除去分散介质。然后，加入0.5mL含有抗KL-6抗体(0.75mg/mL)的PBS溶液。将该混合物在25℃下搅拌过夜以敏化以制备抗KL-6抗体敏化的磁响应性颗粒[4]。之后，加入1.5mL 1.0wt％BSA溶液，并将混合物在25℃下搅拌4小时。使用磁体将敏化的磁响应性颗粒收集到试管的壁表面上。此后，除去分散介质，新加入1.5mL 1.0wt％BSA溶液并分散。重复该操作3次以制备抗KL-6抗体敏化的磁响应性颗粒[4]分散体。
2.3.3比较例2
首先，将作为树脂颗粒的2.0g Micropearl SP-203(粒度为3.02μm，CV为4.9％，由SEKISUI CHEMICAL CO.,LTD.制造)超声分散到40.0g 10mM NaCl溶液中以制备核心粒子分散体。
随后，在超声照射下搅拌的同时加入8.0mL磁性流体EMG707(由FerrotecCorporation制造)以进行另外30分钟的超声分散处理。将所得分散液静置3min，除去上清液，然后将颗粒重新分散在离子交换水中，过滤，用离子交换水洗涤，得到磁响应性颗粒[5]。
2.3.4参考例
除了磁性流体EMG707(Ferrotec Corporation制造)的体积变为2.0mL之外，进行与实施例2-1基本相同的操作，以制造磁响应性颗粒[6]。
表1示出了对实施例1-1至3-2、比较例1-1至2或参考例中得到的颗粒的体积平均粒度的CV值、重均粒度的CV值、磁性材料含量、磁可分离性和分散率的测量结果。
[表1]
无论敏化之前或之后，实施例1至3中的磁响应性颗粒具有15％或更小的重均粒度的CV值和20％或更小的体积平均粒度的CV，并且具有比比较例1中的磁响应性颗粒的更好的磁可分离性，比较例1具有相当的粒度但具有大于15％的重均粒度的CV值和大于20％的体积平均粒度的CV值。由此表明，本发明的磁响应性颗粒的重均粒度的CV值为15％以下，各个磁响应性颗粒中含有均匀的磁性材料，表明优异的磁可分离性。
同时，制备比较例2的磁响应性颗粒使得通过磁纯化使重均粒度的CV设置为15％或以上。尽管由于增加磁性材料含量而表现出高磁可分离性，但由于高颗粒比重引起低的可分散性。
实施例3的磁响应性颗粒和敏化的磁响应性颗粒的体积平均粒度的CV值为15％或以上，确实具有实用的磁可分离性；然而，它们的磁可分离性低于实施例1或2中的磁响应性颗粒和敏化的磁响应性颗粒的磁可分离性。这表明体积平均粒度的变化越大，磁分离变得越不均匀。
以下程序用于评估在上述实施例或比较例中获得的一些颗粒的实用性。
2.4.1试剂评价
使用在实施例1-2中获得的敏化的磁响应性颗粒或比较例1-2中颗粒表面固定有抗KL-6抗体的敏化的磁响应性颗粒，进行以下免疫测定。在使用KL-6浓度为0U/mL的免疫测定的情况与使用5000U/mL的标准溶液或其中抗原已稀释至10、50、100、500、1000或2500U/mL每种标准溶液的免疫测定的情况之间确定发光水平的差异。
钌复合物标记的抗KL-6抗体的制备
首先，将0.5mL含有抗KL-6抗体的PBS溶液(2.0mg/mL)添加到聚丙烯管中。接下来，添加13μL Ru-NHS(1mg/mL)。将混合物在25℃下振荡搅拌，通过Sephadex G25柱纯化，然后进行评价。
KL-6免疫测定：
发光水平使用自动分析仪(“Picolumi III”，由SEKISUI MEDICAL CO.,LTD.制造)测量，其中电化学发光测定用作测量原理。在向200μL反应溶液中加入20μL样品后，加入25μL抗KL-6抗体共轭磁性颗粒。混合物在30℃反应9分钟；添加350μL 10mM Tris缓冲液；并在被磁体捕获的同时洗涤颗粒3次。接着，添加200μL含有1.0μg/mL钌复合物标记的抗KL-6抗体的钌标记的抗体溶液。30℃反应9分钟后，加入350μL 10mM Tris缓冲液。颗粒在被磁体捕获的同时洗涤3次。然后，加入300μL的0.1M含三丙胺的发光电解溶液，并将该溶液供给电极表面上。最后，测量结合到颗粒上的钌复合物的发光水平。
以下示出了根据上述程序评价的实施例1-2或比较例1-2中的敏化的磁响应性颗粒的实用性评价结果。
[表2]
发光水平[计数]
与比较例1-2中的颗粒相比，实施例1-2中的颗粒与相同浓度的抗原反应时，发光水平与0U/mL时的差异较大，表明灵敏度更高，即试剂性能优越。实施例1-2的颗粒与比较例1-2的颗粒相比，重均粒度的CV值和体积平均粒度的CV值较低，表明优异的磁可分离性。试剂评价中表现出优异的试剂性能可能是因为被抗体敏化后液体中颗粒的运动是均匀的，大部分颗粒不会飞散，并且当颗粒被磁体捕获时可以被有效地捕获。
工业适用性
本发明通过使用重均粒径为15％以下的CV值的磁响应性颗粒，能够提供易于支持生物相关材料且由于优异的磁可分离性而提高分离/纯化效率的高灵敏度免疫测定试剂。
Claims (9)
1.敏化的磁响应性颗粒，其包含：
磁响应性颗粒，其具有核心粒子和设置在核心粒子上的至少一个磁性层，所述磁性层包含磁性金属和/或其氧化物的微粒；和
与分析物特异性相互作用的物质，所述物质被支持在磁响应颗粒上，
其中，磁响应性颗粒的重均粒度的变异系数为15％以下。
2.根据权利要求1所述的敏化的磁响应性颗粒，其中，所述磁响应性颗粒的体积平均粒度的变异系数为20％以下。
3.敏化的磁响应性颗粒，其包含：
磁响应性颗粒，其具有核心粒子和设置在核心粒子上的至少一个磁性层，所述磁性层包含磁性金属和/或其氧化物的微粒；和
与分析物特异性相互作用的物质，所述物质被支持在磁响应颗粒上，
其中，敏化的磁响应性颗粒的重均粒度的变异系数为15％以下。
4.根据权利要求3所述的敏化的磁响应性颗粒，其中，所述敏化的磁响应性颗粒的体积平均粒度的变异系数为20％以下。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的敏化的磁响应性颗粒，其进一步包括非磁性层，所述非磁性层包含在所述磁性层和与分析物特异性相互作用的物质之间的非磁性金属氧化物和/或有机金属化合物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的敏化的磁响应性颗粒，其中，所述与分析物特异性相互作用的物质通过一步或多步反应而化学结合在所述磁性层上。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的敏化的磁响应性颗粒，其中，所述与分析物特异性相互作用的物质通过一个或多个化学键结合在所述非磁性层上。
8.使用根据权利要求1至7中任一项所述的敏化的磁响应性颗粒的多相免疫测定方法。
9.免疫测定试剂，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的敏化的磁响应性颗粒。
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