CN111363810A - 检测egfr基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒。本发明首先提供了一种用于检测人EGFR基因18‑21外显子多个突变位点的检测剂组合物，其包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11。本发明还提供了相关检测试剂盒及检测方法。本发明可同时检测EGFR基因51种突变，每种突变的检出率基本一致，检测灵敏度可达0.1％，同时适用于cfDNA和组织DNA中的突变检测。
Description
技术领域
本发明是关于一种同时检测人EGFR基因18-21号外显子上51种突变的引物、探针、多重qPCR反应体系及试剂盒，属于生物技术领域和医学领域。
背景技术
EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。HER家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4四个分子构成，在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥重要的调节作用。
EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体激酶域激活与癌细胞增殖、转移和凋亡等多种信号传导通路有关。EGFR信号传导的异常是多种肿瘤发生的原因。
EGFR突变主要发生在胞内酪氨酸激酶(TK)区域的前四个外显子上(18～21)。缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是del E746-A750，替代突变最常见的是发生在外显子21上的L858R，复制或插入突变发生在外显子20上。其中外显子20上的T790M替代突变为一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitor，TKI)的耐药突变。此外，还有许多类型的突变临床意义尚不明确。EGFR作为癌症治疗的分子靶标受到普遍关注，并已陆续开发出了吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)和埃克替尼(Icotinib)等TKI。
目前肿瘤组织样本仍是获取肿瘤基因相关信息的主要来源，但大部分晚期肺癌患者已失去手术机会或由于种种原因不能获取肿瘤组织样本。研究结果表明，实体肿瘤患者的外周血中存在来源于凋亡、坏死的肿瘤细胞的游离DNA。对晚期肺癌患者，在不能获取肺癌组织样本时，可以选择外周血样本进行EGFR突变基因检测。因此血浆样本中EGFR突变也可以预测患者服用TKI的治疗效果。
常用的基因突变检测方法有两种：测序法和PCR法。测序法中包含直接测序法和二代测序(NGS)。直接测序法是金标准，可以检测已知突变和未知突变，缺点是灵敏度低，需要丰度达到20％，耗时长，假阴性高。NGS二代测序能同时检测多种基因突变，灵敏度达到5％，但是成本较高，耗时也长。患者一般需等待一周才能拿到检测报告。
PCR法中包括高分辨率溶解曲线法(high-resolution melting，HRM)、扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)和数字PCR法等。
高分辨率熔解曲线是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，可以检测出单个碱基的差异，但检测敏感度约5％，只能检测已知突变，不适合做多重PCR。
扩增阻滞突变系统是一种基于PCR法检测DNA点突变的新方法，其原理是：在严格反应条件下，只有引物3’端与模板配对时，PCR扩增反应才能正常进行，从而得到扩增产物。当3’端与模板不匹配时，Taq DNA聚合酶缺少3’-5’的外切酶活性，因此无法切下不匹配的碱基，导致3’末端无法正常延伸，反应终止，得不到扩增产物。通过设计3’端与突变模板互补但是与野生型模板不互补的引物进行PCR反应，根据有无特异长度的产物来判断样品模板中是否存在突变。该方法的灵敏度能达到1％，目前广泛应用于肿瘤组织中的突变检测。
数字PCR法是一种核酸分子绝对定量技术，可直接测出模板的拷贝数。利用数字PCR结合ARMS引物或MGB探针可将检测灵敏度提升至0.01％。然而目前数字PCR仪只能同时检测两通道的信号，无法实现更多重的PCR检测，通量低，检测过程繁琐，耗时长，成本高。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种针对EGFR基因多种突变的检测剂组合物及试剂盒，提高检测灵敏度，供临床医生在非小细胞肺癌患者中筛选适合服用抗EGFR的靶向治疗药物的人群。
由于血液样本中的游离DNA含量非常低，其中肿瘤DNA的含量更低，一般不超过1％，为了能在有限的血液样本量中检测更多的突变位点，一方面，本发明提高了一种用于检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物，该组合物包括：
SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11。
所述SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11是用于检测19del突变的引物，具体序列如下：
E-19-F1：5'-TAAAATTCCCGTCGCTATCAAAA-3'(SEQ ID No.1)；
E-19-F2：5'-TAAAACTCCCGTCGCTATCGC-3'(SEQ ID No.2)；
E-19-F3：5'-ATTCCCGTCGCTATCAAGTCTC-3'(SEQ ID No.3)；
E-19-F4：5'-CCGTCGCTATCAAGGCATCT-3'(SEQ ID No.4)；
E-19-F5：5'-CCCGTCGCTATCAAGGAACC-3'(SEQ ID No.5)；
E-19-F6：5'-CCCGTCGCTATCAAGGAACA-3'(SEQ ID No.6)；
E-19-F7：5'-CTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACCC-3'(SEQ ID No.7)；
E-19-F8：5'-TTCCCGTCGCTATCAAGGT-3'(SEQ ID No.8)；
E-19-F9：5'-CGTCGCTATCAAGGAAGC-3'(SEQ ID No.9)；
E-19-F10：5'-CCCGTCGCTATCAAAGC-3'(SEQ ID No.10)；
E-19-R：5'-GCCTGAGGTTCAGAGCCAT-3'(SEQ ID No.11)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物还可包括以下引物：
SEQ ID No.14和SEQ ID No.15；和/或
SEQ ID No.18和SEQ ID No.19。
引物SEQ ID No.14和SEQ ID No.15是用于检测L858R突变，具体序列如下：
E-21-F1：5'-ATGTCAAGATCACAGATTTTGGTCG-3'(SEQ ID No.14)；
E-21-R1：5'-CCTTACTTTGCCTCCTTCTGC-3'(SEQ ID No.15)。
引物SEQ ID No.18和SEQ ID No.19是用于检测T790M突变，具体序列如下：
E-20-F1：5'-CTCCACCGTGCAGCTCATCTT-3'(SEQ ID No.18)；
E-20-R1：5'-GCCAATATTGTCTTTGTGTTCCC-3'(SEQ ID No.19)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物还可进一步包括以下引物：
SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24和SEQ ID No.25；和/或
SEQ ID No.28和SEQ ID No.15；和/或
SEQ ID No.30和SEQ ID No.31。
引物SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24和SEQ ID No.25是用于检测G719X突变，具体序列如下：
E-18-F1：5'-GAATTCAAAAAGATCAAAGTGCAGA-3'(SEQ ID No.22)；
E-18-F2：5'-GAATTCAAAAAGATCAAAGTGCAGT-3'(SEQ ID No.23)；
E-18-F3：5'-TGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTAGC-3'(SEQ ID No.24)；
E-18-R：5'-CCTGTGCCAGGGACCTTACC-3'(SEQ ID No.25)。
引物SEQ ID No.28和SEQ ID No.15是用于检测L861Q突变，具体序列如下：
E-21-F2：5'-ATTTGGGCTGGCCAAACA-3'(SEQ ID No.28)；
E-21-R1：5'-CCTTACTTTGCCTCCTTCTGC-3'(SEQ ID No.15)。
引物SEQ ID No.30和SEQ ID No.31是用于检测S768I突变，具体序列如下：
E-20-F2：5'-ATGCGAAGCCACACTGACG-3'(SEQ ID No.30)；
E-20-R2：5'-ACGTGGGGGTTGTCCACGA-3'(SEQ ID No.31)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物还可进一步包括以下引物：
SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38。
引物SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38是用于检测20ins突变，具体序列如下：
E-20-F3：5'-CGAGGACAACCCCCACCA-3'(SEQ ID No.34)；
E-20-F4：5'-GATGGACAGCGTGGACAGCG-3'(SEQ ID No.35)；
E-20-F5：5'-AGCCAGCGTGGACGGTAAC-3'(SEQ ID No.36)；
E-20-F6：5'-CGAGGACAACCCCCACAA-3’(SEQ ID No.37)；
E-20-R3：5'-GAGCTGCACGGTGGAGGT-3'(SEQ ID No.38)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物还可进一步包括相应的用于检测19del、L858R、T790M、G719X、L861Q、S768I和/或20ins的探针。根据本发明的优选实施方案，所述探针的荧光基团选用FAM、VIC、ROX和/或CY5，淬灭基团选用BHQ和/或MGB。优选地，针对一个反应孔同时使用四种不同荧光基团标记的探针。进一步优选的探针的标记组合为5’FAM-3’MGB、5’VIC-3’BHQ1、5’ROX-3’MGB和5’CY5-3’BHQ3。更进一步优选地，所述探针选自：SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.26、SEQ ID No.32和SEQ ID No.39。
探针SEQ ID No.12是用于检测19del突变，其具体序列如下：
E-19-P：5'-FAM-CCACACAGCAAAGC-MGB-3'(SEQ ID No.12)。
探针SEQ ID No.16是用于检测L858R突变，其具体序列如下：
E-21-P1：5'-ROX-CTTTCTCTTCCGCACCC-MGB-3'(SEQ ID No.16)。
探针SEQ ID No.20是用于检测T790M突变，其具体序列如下：
E-20-P1：5'-CY5-AGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTC-BHQ3-3'(SEQ ID No.20)。
探针SEQ ID No.26是用于检测G719X突变，其具体序列如下：
E-18-P：5'-FAM-CTCCGGTGCGTTCG-MGB-3'(SEQ ID No.26)。
探针SEQ ID No.16也可用于检测L861Q突变，其具体序列如前所述。
探针SEQ ID No.32是用于检测S768I突变，其具体序列如下：
E-20-P2：5'-CY5-CCATCACGTAGGCTTCCTGGAGGG-BHQ3-3'(SEQ ID No.32)。
探针SEQ ID No.39是用于检测20ins突变，其具体序列如下：
E-20-P3：5'-FAM-CGCCTGCTGGGCATCTGCCT-BHQ1-3'(SEQ ID No.39)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物还可进一步包括Blocker引物。优选地，Blocker引物3'端使用MGB修饰，5'端无修饰，Blocker引物长度为13～28bp，自3'端第一个碱基起至5'端有连续13～18个碱基与野生型序列完全互补。更优选地，Blocker引物选自：SEQ ID No.13、SEQ ID No.17、SEQ ID No.21、SEQ ID No.27、SEQ ID No.33和SEQ ID No.40。
Blocker引物SEQ ID No.13是用于检测19del突变，其具体序列如下：
E-19-Block：5'-CTATCAAGGAAT/iSpC3/AAGAGAAGCAACATC-MGB-3'(SEQ IDNo.13)。
Blocker引物SEQ ID No.17是用于检测L858R突变，其具体序列如下：
E-21-Block1：5'-CAGATTTTGGGCTGG-MGB-3'(SEQ ID No.17)。
Blocker引物SEQ ID No.21是用于检测T790M突变，其具体序列如下：
E-20-Block1：5'-GCAGCTCATCACGC-MGB-3'(SEQ ID No.21)。
Blocker引物SEQ ID No.27是用于检测G719X突变，其具体序列如下：
E-18-Block：5'-GATCAAAGTGCTGGGC-MGB-3'(SEQ ID No.27)。
Blocker引物SEQ ID No.29是用于检测类型L861Q突变，其具体序列如下：
E-21-Block2：5'-GCTGGCCAAACTG-MGB-3'(SEQ ID No.29)。
Blocker引物SEQ ID No.32是用于检测S768I突变，其具体序列如下：
E-20-Block2：5'-GGTTGTCCACGCTG-MGB-3'(SEQ ID No.33)。
Blocker引物SEQ ID No.40是用于检测20ins突变，其具体序列如下：
E-20-Block3：5'-GGACAACCCCCACG-MGB-3'(SEQ ID No.40)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物还可进一步包括内控引物和内控探针，优选地，内控探针采用5’VIC-3’BHQ1修饰，内控引物和内控探针识别的区域选自EGFR其他外显子上相对保守区域。更优选地，内控引物包括：SEQ ID No.41和SEQ ID No.42；内控探针包括SEQ ID No.43：
IC-F：5'-GCTCACGCAGTTGGGCA-3'(SEQ ID No.41)；
IC-R：5'-AAGGACCACCTCACAGTTATTG-3'(SEQ ID No.42)；
IC-P：5'-VIC-TTGAAGATCATTTTCTCAGCCTCCAGAGGA-BHQ1-3'(SEQ ID No.43)。
另一方面，本发明还提供了一种用于检测EGFR基因多个突变位点的检测试剂盒，该试剂盒包括根据本发明所述的检测剂组合物。即，所述试剂盒包括用于检测19del突变的引物，可进一步包括检测L858R、T790M突变的引物；优选地更进一步还可包括检测G719X、L861Q、S768I和/或20ins突变的引物。
根据本发明的优选具体实施方案，本发明的试剂盒中，用于检测19del、L858R、T790M的引物、探针配制成第一反应预混液；用于检测G719X、L861Q、S768I的引物、探针配制成第二反应预混液；用于检测20ins的引物、探针配制成第三反应预混液。所述预混液中还可包含PCR反应缓冲液、MgCl2、dATP、dUTP、dGTP、dCTP。通常情况下，PCR反应体系总体积为50ul，样本DNA用量为3～50ng。
根据本发明的优选具体实施方案，本发明的试剂盒还可包括：包含热启动Taq酶、UNG酶和酶稀释液的混合酶液，阳性对照品和阴性对照品。
根据本发明的更优选具体实施方案，本发明的检测试剂盒包括三种预混液(混合反应液)，混合反应液中均已加有内控的引物和探针。主要组成如下表：
| 试剂盒组成 | 编号 | 主要组分 |
| 混合反应液1 | MMX-1 | 含有引物、探针、Mg<sup>2+</sup>和dUTPs的溶液 |
| 混合反应液2 | MMX-2 | 含有引物、探针、Mg<sup>2+</sup>和dUTPs的溶液 |
| 混合反应液3 | MMX-3 | 含有引物、探针、Mg<sup>2+</sup>和dUTPs的溶液 |
| Taq酶反应液 | Taq | Taq酶、UNG酶的混合液 |
| 阳性质控品 | EGFR MC | 含1％EGFR突变基因的DNA混合物 |
| 阴性对照品1 | NEG CT-1 | 不含本试剂盒检测的51种EGFR突变的人类DNA |
| 阴性对照品2 | NEG CT-2 | 超纯水 |
本发明的检测试剂盒，不同反应液检测的突变类型见下表：
另一方面，本发明还提供了所述的检测剂组合物或所述的检测试剂盒在制备用于多重荧光qPCR反应检测组织DNA和cfDNA中EGFR基因多个突变的检测系统中的应用。换而言之，本发明提供了一种用于检测EGFR基因多个突变位点的方法，该方法包括：利用本发明所述的检测剂组合物或所述的检测试剂盒，对进行多重荧光qPCR反应，以检测组织DNA和cfDNA中突变。
根据本发明的具体实施方案，利用所述的检测剂组合物或所述的检测试剂盒检测EGFR基因多个突变时，利用实时荧光定量PCR仪进行所述多重荧光qPCR反应，PCR仪的反应程序设置为：
第一步：温度37℃时间5min不采集荧光；循环数1；
第二步：温度95℃时间5min不采集荧光；循环数1；
第三步：温度95℃时间15s不采集荧光，温度60℃时间35s不采集荧光，温度72℃时间20s不采集荧光；循环数10；
第四步：温度95℃时间15s不采集荧光，温度60℃时间35s采集荧光，温度72℃时间20s不采集荧光；循环数35。
具体检测时，可根据仪器说明书进行参数设置及基线调整。
本发明的检测试剂、试剂盒及检测方法，可同时检测人EGFR基因18～21号外显子51个突变位点，详细信息如下：
在本发明的一些具体实施方案中，利用本发明的技术，同时检测EGFR基因51种突变，每种突变的检出率基本一致，检测灵敏度可达0.1％，同时适用于cfDNA和组织DNA中的突变检测。
综上所述，本发明提供了一种基于多通道实时荧光定量PCR仪的更高灵敏度、更省样本的多重qPCR检测剂组合物和试剂盒。本发明中的引物、探针序列经过优选和大量的重复测试，解决了多重PCR中常见的引物相互干扰的问题，保证了本发明中涵盖的各位点的检出率基本一致。进一步，本发明中的Blocker结构采用MGB基团修饰，极大地提高了Blocker与模板的结合效率；Blocker的序列长度以及结合区域经过优选，解决了Blocker对阳性模板扩增有抑制的问题。更进一步，本发明中对荧光探针的两端组合做了最大的优化，筛选出最适合四重qPCR的探针修饰组合，解决了多重荧光qPCR中荧光背景高的问题，提高了多重qPCR中阳性信号的信噪比。此外，本发明还优化了靶序列长度，提高了引物与短片段模板的结合的成功率，特别适用于cfDNA中突变检测。本发明的技术可实现利用3管反应对EGFR基因51个突变位点同时进行监测分析。只需一台具备四通道的实时荧光定量PCR仪(比如ABI7500)，经过100分钟的反应，即可测出样本中低至0.1％的EGFR基因突变。本发明所提供的方法快速、灵敏、准确、稳定，非常适合液体活检；可供临床医生在非小细胞肺癌患者中筛选适合服用抗EGFR的靶向治疗药物的人群；并且，检测成本相对低，对样品的用量少、所需的仪器设备市场普及率高，非常适合临床推广。
附图说明
图1为MMX-1管FAM信号(19-del)灵敏度分析PCR扩增曲线。
图2为MMX-1管ROX信号(L858R)灵敏度分析PCR扩增曲线。
图3为MMX-1管CY5信号(T790M)灵敏度分析PCR扩增曲线。
图4为MMX-2管FAM信号(G719X)灵敏度分析PCR扩增曲线。
图5为MMX-2管ROX信号(L861Q)灵敏度分析PCR扩增曲线。
图6为MMX-2管CY5信号(S768I)灵敏度分析PCR扩增曲线。
图7为MMX-3管FAM信号(20ins)灵敏度分析PCR扩增曲线。
图8为MMX-1管检测阴性对照品1的PCR扩增曲线。
图9为MMX-1管检测阳性质控品的PCR扩增曲线。
图10为MMX-2管检测阴性对照品1的PCR扩增曲线。
图11为MMX-2管检测阳性质控品的PCR扩增曲线。
图12为MMX-3管检测阴性对照品1的PCR扩增曲线。
图13为MMX-3管检测阳性质控品的PCR扩增曲线。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。下列实施例中未注明具体条件的方法，通常按照所属领域的常规操作进行。
实施例1
本实施例提供了一种用于检测人EGFR基因51种突变的试剂盒，其中包括的引物、探针以及Blocker序列如下：
内控选自EGFR基因相对保守区域，内控探针5’端采用荧光基团VIC标记，3’端采用淬灭基团BHQ1标记。内控的引物探针序列如下：
| IC-F | 5'-GCTCACGCAGTTGGGCA-3' | SEQ ID No.41 |
| IC-R | 5'-AAGGACCACCTCACAGTTATTG-3' | SEQ ID No.42 |
| IC-P | 5'-VIC-TTGAAGATCATTTTCTCAGCCTCCAGAGGA-BHQ1-3' | SEQ ID No.43 |
试剂盒组成如下：
试剂盒包括三种混合反应液，混合反应液中均已加有内控的引物和探针。
不同反应液检测的突变类型见下表：
反应程序设置如下：
ABI7500：设置Reporter Dye(荧光)：FAM、VIC、ROX、CY5；Quencher Dye(淬灭)：NONE；Passive Reference(阳性参照)：NONE。
基线调整：选取3-15个循环的荧光信号。阈值调整：在扩增曲线指数区调整阈值，调整阳性质控品VIC通道阈值，使得阳性质控品VIC通道Ct值在15～16之间，再调整其他通道阈值与VIC通道一致。记录荧光定量PCR仪显示的Ct值。计算样本的FAM/ROX/CY5通道Ct值与VIC通道Ct值的差值，ΔCt值＝CtFAM/ROX/CY5-Ct VIC。
结果判定：各通道的Cut-offΔCt值均为11。若样品某通道的ΔCt＞11则该通道对应的EGFR突变为阴性或低于最低检测限，若样品ΔCt≤11则该通道对应的EGFR突变为阳性。
利用本实施例中的试剂盒检测本发明中51种突变模拟样本，以51种阳性质粒或突变细胞系基因组DNA按比例混合于野生型基因组DNA中形成1％、0.5％、0.2％、0.1％突变比例的模拟样本。
取96孔PCR板或八联排管，每孔中加混合反应液(MMX-1或MMX-2或MMX-3)15μl，混合酶液5μl，再加入待测样本30μl。同一样本(包括待测样本、阳性质控品、阴性对照品1、阴性对照品2)需要分别做3个反应。每次PCR测试都必须同时检测阳性质控品、阴性对照品1和阴性对照品2。
封上高透膜或盖上管盖，轻轻混匀，短暂离心后上机运行PCR检测程序。
图1为MMX-1管FAM信号(19-del)灵敏度分析PCR扩增曲线。图2为MMX-1管ROX信号(L858R)灵敏度分析PCR扩增曲线。图3为MMX-1管CY5信号(T790M)灵敏度分析PCR扩增曲线。图4为MMX-2管FAM信号(G719X)灵敏度分析PCR扩增曲线。图5为MMX-2管ROX信号(L861Q)灵敏度分析PCR扩增曲线。图6为MMX-2管CY5信号(S768I)灵敏度分析PCR扩增曲线。图7为MMX-3管FAM信号(20ins)灵敏度分析PCR扩增曲线。图8为MMX-1管检测阴性对照品1的PCR扩增曲线。图9为MMX-1管检测阳性质控品的PCR扩增曲线。图10为MMX-2管检测阴性对照品1的PCR扩增曲线。图11为MMX-2管检测阳性质控品的PCR扩增曲线。图12为MMX-3管检测阴性对照品1的PCR扩增曲线。图13为MMX-3管检测阳性质控品的PCR扩增曲线。
结果显示：样本上样量为30ng时，所有模拟阳性样本ΔCt值均小于Cut-offΔCt值，说明本发明能检出低至0.1％突变比例的51种EGFR突变。
备注：6254、12369和23571三种突变类型虽然是19外显子上不同区域缺失，但是形成的突变体相同；12384和133194这两种突变形式形成的突变体也相同。
19del阳性样本检测结果：
L858R和T790M阳性模拟样本检测结果：
G719X、L861Q、S768I阳性模拟样本检测结果
20ins阳性模拟样本检测结果：
实施例2
运用本发明检测已知突变的临床组织样本37例，外周血24例，阳性样本符合率100％，另外还测出某些样本中存在的低频突变，共多检测出2例19del、1例G719X、1例L861Q(已排除污染或假阳性)。
序列表
<110> 河南爱微迪生物技术有限公司
<120> 检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒
<130> GAI18CN3849
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 2
taaaactccc gtcgctatcg c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 3
attcccgtcg ctatcaagtc tc 22
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 4
ccgtcgctat caaggcatct 20
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<220>
<223> 引物
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cccgtcgcta tcaaggaacc 20
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<220>
<223> 引物
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<220>
<223> 引物
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ctatcaagga attaagagaa gcaaccc 27
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<220>
<223> 引物
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ttcccgtcgc tatcaaggt 19
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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cgtcgctatc aaggaagc 18
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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cccgtcgcta tcaaagc 17
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<211> 19
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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gcctgaggtt cagagccat 19
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<220>
<223> 探针
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ccacacagca aagc 14
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<212> DNA
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<223> Blocker
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<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
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ctatcaagga atnaagagaa gcaacatc 28
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atgtcaagat cacagatttt ggtcg 25
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<220>
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ccttactttg cctccttctg c 21
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<212> DNA
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<220>
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ctttctcttc cgcaccc 17
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<212> DNA
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<220>
<223> Blocker
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cagattttgg gctgg 15
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<220>
<223> 引物
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ctccaccgtg cagctcatct t 21
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 19
gccaatattg tctttgtgtt ccc 23
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<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> 探针
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agctcatgcc cttcggctgc ctc 23
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<211> 14
<212> DNA
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<220>
<223> Blocker
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gcagctcatc acgc 14
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 22
gaattcaaaa agatcaaagt gcaga 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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gaattcaaaa agatcaaagt gcagt 25
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 24
tgaattcaaa aagatcaaag tgctagc 27
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<220>
<223> 引物
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cctgtgccag ggaccttacc 20
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<212> DNA
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ctccggtgcg ttcg 14
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gatcaaagtg ctgggc 16
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
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atttgggctg gccaaaca 18
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<212> DNA
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<220>
<223> Blocker
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gctggccaaa ctg 13
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atgcgaagcc acactgacg 19
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acgtgggggt tgtccacga 19
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<212> DNA
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<220>
<223> 探针
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ccatcacgta ggcttcctgg aggg 24
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ggttgtccac gctg 14
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cgaggacaac ccccacca 18
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<212> DNA
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gatggacagc gtggacagcg 20
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agccagcgtg gacggtaac 19
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<223> 引物
<400> 37
cgaggacaac ccccacaa 18
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 38
gagctgcacg gtggaggt 18
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<212> DNA
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<220>
<223> 探针
<400> 39
cgcctgctgg gcatctgcct 20
<210> 40
<211> 14
<212> DNA
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<220>
<223> Blocker
<400> 40
ggacaacccc cacg 14
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 41
gctcacgcag ttgggca 17
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
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aaggaccacc tcacagttat tg 22
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 探针
<400> 43
ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga 30
Claims (10)
1.一种用于检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物，该组合物包括：
用于检测19del突变的引物：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQID No.11。
2.根据权利要求1所述的检测剂组合物，该组合物还包括以下引物：
用于检测L858R突变的引物：SEQ ID No.14和SEQ ID No.15；和/或
用于检测T790M突变的引物：SEQ ID No.18和SEQ ID No.19。
3.根据权利要求1或2所述的检测剂组合物，该组合物还包括以下引物：
用于检测G719X突变的引物：SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24和SEQ IDNo.25；和/或
用于检测L861Q突变的引物：SEQ ID No.28和SEQ ID No.15；和/或
用于检测S768I突变的引物：SEQ ID No.30和SEQ ID No.31。
4.根据权利要求1或2或3所述的检测剂组合物，该组合物还包括以下引物：
用于检测20ins突变的引物：SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ IDNo.38和SEQ ID No.39。
5.根据权利要求1～4任一项所述的检测剂组合物，该组合物还包括用于检测19del、L858R、T790M、G719X、L861Q、S768I和/或20ins的探针，所述探针的荧光基团选用FAM、VIC、ROX和/或CY5，淬灭基团选用BHQ和/或MGB；
优选地，针对一个反应孔同时使用四种不同荧光基团标记的探针；进一步优选的探针的标记组合为5’FAM-3’MGB、5’VIC-3’BHQ1、5’ROX-3’MGB和5’CY5-3’BHQ3；
更进一步优选地，所述探针选自：SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No.20、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.32和SEQ ID No.39。
6.根据权利要求1～5任一项所述的检测剂组合物，该组合物还包括Blocker引物；优选地，Blocker引物3'端使用MGB修饰，5'端无修饰，Blocker引物长度为13～28bp，自3'端第一个碱基起至5'端有连续13～18个碱基与野生型序列完全互补；
更优选地，Blocker引物选自：SEQ ID No.13、SEQ ID No.17、SEQ ID No.21、SEQ IDNo.29、SEQ ID No.33和SEQ ID No.40。
7.根据权利要求1所述的检测剂组合物，该组合物还包括内控引物和内控探针，内控探针采用5’VIC-3’BHQ1修饰，内控引物和内控探针识别的区域选自EGFR其他外显子上相对保守区域；
优选地，内控引物包括：SEQ ID No.41和SEQ ID No.42；内控探针包括SEQ ID No.43。
8.一种用于检测EGFR基因多个突变位点的检测试剂盒，该试剂盒包括根据权利要求1～7任一项所述的检测剂组合物；
优选地，所述试剂盒还包括：包含热启动Taq酶、UNG酶和酶稀释液的混合酶液，阳性质控品和阴性对照品。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其中，
用于检测19del、L858R、T790M的引物、探针配制成第一反应预混液；
用于检测G719X、L861Q、S768I的引物、探针配制成第二反应预混液；
用于检测20ins的引物、探针配制成第三反应预混液。
10.一种用于检测EGFR基因多个突变位点的方法，该方法包括：利用权利要求1～7任一项所述的检测剂组合物或权利要求8～9任一项所述的检测试剂盒，对进行多重荧光qPCR反应，以检测组织DNA和cfDNA中突变；
优选地，所述反应利用实时荧光定量PCR仪进行，PCR仪的反应程序设置为：
第一步：温度37℃时间5min不采集荧光；循环数1；
第二步：温度95℃时间5min不采集荧光；循环数1；
第三步：温度95℃时间15s不采集荧光，温度60℃时间35s不采集荧光，温度72℃时间20s不采集荧光；循环数10；
第四步：温度95℃时间15s不采集荧光，温度60℃时间35s采集荧光，温度72℃时间20s不采集荧光；循环数35。
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