CN111690752A - 一种检测人类egfr基因突变的试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，包括用于人类表皮生长因子受体EGFR基因29种突变的引物、探针，内控基因引物和探针、外控基因引物和探针，还包括荧光定量PCR反应缓冲液，dNTPs，热启动DNA Polymerase，阴性对照品和阳性对照品。本发明还提供了一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒的使用方法。解决了人类EGFR基因突变检测时在灵敏度、成本、操作方便性等问题。

Description

一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法
技术领域
本发明应用于基因检测技术领域，具体涉及一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法。
背景技术
人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)存在于所有正常上皮和部分间叶来源的细胞，对细胞的生长、分化调节有着十分重要的作用，该受体基因位于人类7号染色体的短臂上，由大约19K个碱基组成，包含28个外显子。其酪氨酸激酶功能区由外显子18～24编码，其表达产物可激活酪氨酸激酶，从而打开下游信号通路。EGFR主要通过两条途径将信号传递至细胞核，一条是Ras→Raf→MAPK途径；另一条是PI3K→PKC→IKK途径。当信号传导至细胞核后，引起核内基因转录水平的增加，使细胞增殖、转化。
所以EGFR信号传导的异常是导致多种肿瘤发生的原因。EGFR成为肿瘤特别是非小细胞肺癌靶向治疗研究的一个重要靶点，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)是针对该靶点的小分子抑制剂，多项临床研究证实，EGFR基因突变的晚期NSCLC患者能从酪氨酸激酶抑制剂显著获益。近年来的大量研究发现EGFR基因的编码区主要是在外显子18～21上会发生突变，突变种类至少30种与EGFR-TKIs的药物反应性有关，其中主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R点突变，其中缺失突变最常见的是del E746-A750，和21外显子替代突变(L858R)被称作经典突变或者热点突变，约占突变的90％。所以EGFR突变是患者是否对此TKI敏感的强预测因子，TKI药物的治疗应当依据EGFR基因检测结果选择治疗对象，筛选最合适的患者进行有针对性的靶向治疗，以提高药物疗效，有效抵制癌症的进展。
目前常用的基因突变检测方法有测序法和ARMS-PCR方法；DNA测序法是进行EGFR突变检测的可靠方法，也是使用最多的方法。测序法需要对测序样品扩增、纯化、序列分析，过程比较繁琐、耗时长，且对取材和技术要求比较高，更重要的是由于测序方法本身的限制灵敏度不高，只能对含量大于30％的突变基因进行检测，对环境和操作者有危害。虽然有专门的测序公司，可以避免操作的限制，缩短成果时间，但是费用昂贵。因此，此方法在临床应用中还存在一定的限制，不适于大量临床样品分析。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的人类EGFR基因突变检测时在灵敏度、成本、操作方便性等问题，提供一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法。本试剂盒具有高灵敏度、低成本、操作简便等特点，可以快速精准的对人类EGFR基因突变进行检测，检测灵敏度达到0.5％。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：
一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，包括用于人类表皮生长因子受体EGFR基因G719A、G719S、G719C、E746_A750>I、E746_A750del(1)、E746_A750del(2)、L747_T751del1、L747_T751del 2、E746_A750>A、E746_S752>A、E746-S752>V、E746-S752>D、E746_A750del、L747_P753>S、L747_S752del、L747_T751>S、L747_T751>P、L747_A750>P1、L747-A750>P2、L747_P753>Q、L747-T751>Q、L747_E749del、T790M、S768I、V769_D770insASV、H773_V774insH、D770_N771insG、L858R、L861Q等29种突变的引物、探针，内控基因引物和探针、外控基因引物和探针。
进一步的，所述人类EGFR基因29中突变的引物和探针分为7个引物体系。
进一步的，引物体系1包括用于检测G719A、G719S、G719C位点的引物和探针，引物体系2包括用于检测E746_A750>I/E746_A750del(1)、E746_A750del(2)/L747_T751del1、L747_T751del 2/E746_A750>A、E746_S752>A/E746-S752>V、E746-S752>D/E746_A750del、L747_P753>S/L747_S752del、L747_T751>S/L747_T751>P、L747_A750>P1/L747-A750>P2、L747_P753>Q/L747-T751>Q、L747_E749del位点的引物和探针，引物体系3包括用于检测T790M位点的引物和探针，引物体系4包括用于检测S768I位点的引物和探针，引物体系5包括用于检测V769_D770insASV、H773_V774insH、D770_N771insG位点的引物和探针，引物体系6包括用于检测L858R位点的引物和探针，引物体系7包括用于检测L861Q位点的引物和探针。
进一步的，所述人类EGFR基因29中突变的引物和探针序列如SEQ IQ NO.1-SEQ IQNO.34所示。
进一步的，所述人类EGFR基因外控基因引物和探针序列如SEQ IQ NO.35-SEQ IQNO.37所示。
进一步的，所述人类EGFR基因内控基因引物和探针序列如SEQ IQ NO.38-SEQ IQNO.40所示。
进一步的，所述试剂盒还包括荧光定量PCR反应缓冲液，dNTPs，热启动DNAPolymerase，阴性对照品和阳性对照品。
一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)核酸提取：根据样本类型(外周血/石蜡包埋组织)选择不同的商业化试剂盒进行DNA提取，本发明中外周血DNA提取采用美基生物生产的HiPure Blood DNAMini Kit试剂盒，石蜡包埋组织DNA提取采用HiPure FFPE DNA Kit试剂盒；
2)PCR反应体系的配置：预混分装荧光定量PCR反应缓冲液，dNTPs，热启动DNAPolymerase形成PCR反应液，然后将步骤1)得到的DNA及引物体系1-7、外控基因引物探针体系分别加入PCR反应液中分别形成PCR反应体系1-PCR反应体系8，共同组成PCR反应体系；混匀后瞬离5s，进行PCR扩增；
3)反应结束后进行基因分型判读。
进一步的，步骤2)中所述PCR扩增的条件为：
预变性的条件为：95℃，2min；
第一阶段由5个扩增循环构成，其条件为：95℃，15s；58℃，1min；
第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：95℃，15s；60℃，1min，并于60℃分别采集FAM(靶点)、VIC(内参)荧光通道的信号。
基因分型判读的方式：PCR程序运行完成后自动保存结果，对检测靶点以及内参的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值。
阴性对照孔中，FAM/VIC信号均应无Ct值或无典型的S型扩增曲线升起；若阴性对照管有典型的S型扩增曲线升起，可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测；
阳性对照孔中，FAM/VIC信号均应有典型的S型扩增曲线升起，且Ct值在12～25间，但有可能因不同仪器阈值设置而发生波动；若对照品有至少一个通道无典型的S型扩增曲线升起或Ct值≤12或Ct值≥25，该批次样本需重新检测，确认所使用的试剂是否仍在有效期内，确定操作是否严格按照说明书进行；
若满足上述要求，表明此次实验成功，对样品管进行分析。
检测样本Ct值的确认：外控基因反应孔的FAM信号应有明显的扩增曲线，且Ct值应在15-25之间；
内控基因(VIC通道)应有典型的S型扩增曲线升起，且Ct值15-25之间，表明所加样本DNA质量正常，若Ct值≤15，表明所加样本过量，请将样本稀释后再次检测；若Ct≥25或无扩增(无Ct)，表明所加样本DNA含有PCR抑制剂或DNA量不够，可能影响低突变率样本的检测结果，请重新提取DNA后检测。
突变结果的确定：
确认未选择校正荧光参照，同时选择样本单一检测反应孔、阳性对照反应孔、阴性对照反应孔进行分析，确认各位点检测Ct值。由于样本中突变百分含量各不相同，所得到的突变Ct值也各不相同。根据不同的突变Ct值区分检测结果的阴/阳性。
具体结果判定见表1：
表1结果判定
Figure BDA0002587496680000041
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明ARMS-PCR技术的基础上，结合荧光定量和多重PCR技术，通过对反应体系、扩增引物和探针的优化，设计开发出一种高灵敏、低成本、操作简单的EGFR基因突变检测试剂盒；
(2)本发明可同时检测EGFR基因29种突变，以快速精准的对人类EGFR基因进行检测，检测灵敏度达到0.5％。
附图说明
图1为本发明一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法中EGFR(G719A/G719S/G719C)位点含1％突变体和野生型模板检测结果。
图2为本发明一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法中EGFR(exon 19del)位点含1％突变体和野生型模板检测结果。
图3为本发明一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法中EGFR(T790M)位点含1％突变体和野生型模板检测结果。
图4为本发明一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法中EGFR(S768I)位点含1％突变体和野生型模板检测结果。
图5为本发明一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法中EGFR(exon 20ins)位点含1％突变体和野生型模板检测结果。
图6为本发明一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法中EGFR(L858R)位点含1％突变体和野生型模板检测结果。
图7为本发明一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法中EGFR(L861Q)位点含1％突变体和野生型模板检测结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
另外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买获得或现有方法制备得到。
实施例1：引物和探针组合设计及使用
本发明提供一种人类表皮生长因子受体EGFR基因29种突变的荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法。上述人类表皮生长因子受体EGFR基因检测试剂盒包括用于人类表皮生长因子受体EGFR基因G719A、G719S、G719C、E746_A750>I、E746_A750del(1)、E746_A750del(2)、L747_T751del1、L747_T751del 2、E746_A750>A、E746_S752>A、E746-S752>V、E746-S752>D、E746_A750del、L747_P753>S、L747_S752del、L747_T751>S、L747_T751>P、L747_A750>P1、L747-A750>P2、L747_P753>Q、L747-T751>Q、L747_E749del、T790M、S768I、V769_D770insASV、H773_V774insH、D770_N771insG、L858R、L861Q等29种突变的引物、探针，内控基因引物和探针、外控基因引物和探针。
人类EGFR基因29中突变的引物和探针分为7个引物体系。其中，引物体系1包括用于检测G719A、G719S、G719C位点的引物和探针，引物体系2包括用于检测E746_A750>I/E746_A750del(1)、E746_A750del(2)/L747_T751del1、L747_T751del 2/E746_A750>A、E746_S752>A/E746-S752>V、E746-S752>D/E746_A750del、L747_P753>S/L747_S752del、L747_T751>S/L747_T751>P、L747_A750>P1/L747-A750>P2、L747_P753>Q/L747-T751>Q、L747_E749del位点的引物和探针，引物体系3包括用于检测T790M位点的引物和探针，引物体系4包括用于检测S768I位点的引物和探针，引物体系5包括用于检测V769_D770insASV、H773_V774insH、D770_N771insG位点的引物和探针，引物体系6包括用于检测L858R位点的引物和探针，引物体系7包括用于检测L861Q位点的引物和探针。
用于检测以上29种突变基因型的引物对、探针序列如表2所示：
表2
Figure BDA0002587496680000051
Figure BDA0002587496680000061
Figure BDA0002587496680000071
上述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，优选FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX，3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，优选TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1。在一优选实施例中，29种基因检测探针及外控基因探针的5’端荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为MGB；内控基因探针的5’端荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为TAMRA。
实施例2：PCR反应体系的配置
本发明试剂盒采用8联PCR反应条设计，1-7号管由基因检测试剂组成，分别指示引物体系1-引物体系7不同基因检测位点，8号管指示外控基因引物体系。1-8号管预混分装热启动taq酶、缓冲液、镁离子、dNTP物质基因检测试剂得到PCR反应液；将实施例1中得到的引物、探针及DNA加入PCR反应液中，分别得到PCR反应体系1、PCR反应体系2、PCR反应体系3、PCR反应体系4、PCR反应体系5、PCR反应体系6、PCR反应体系7、PCR反应体系8，共同组成PCR反应体系。PCR反应体系1-8的组成如表3。
表3PCR反应体系
Figure BDA0002587496680000072
Figure BDA0002587496680000081
Figure BDA0002587496680000091
Figure BDA0002587496680000101
仪器通道及反应体积选择：
①选择FAM通道(Reporter：FAM，Quencher：TAMRA)和VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：TAMRA)检测扩增情况；
②反应体积(Sample Volume)为20μL。
③参考荧光(Reference Dye)：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passivereference选择“none”；具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。
实施例3：基因检测试剂盒的使用
1、样本收集
本实施例从重庆市第九人民医院采集肺癌患者外周血1例，使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集血液标本5ml，室温静置30分钟，1500～2000rpm离心10分钟，分别收集血浆和血液中细胞于无菌螺口塑料管中。参照所购买的Magen基因组小量提取试剂盒进行基因组DNA的提取，并用Qubit 3调整其浓度到10ng/uL备用，上述样本经艾德生物EGFR基因检测试剂盒检测确定相应的位点无突变，然后将含有各位点突变的阳性质粒(M)溶解在没有突变的野生型(WT)人类基因组DNA水溶液中，混合成M:WT为1:99的10ng/uL含有1％突变体的阳性模拟样本备用。
2、阳性对照品的制备
通过绝对定量的方法，将含有各位点突变的阳性质粒(M)溶解在没有对应点位突变的野生型(WT)人类基因组DNA水溶液中，混合成M:WT为5:95的10ng/uL阳性对照品备用。
3、反应体系配制
反应体系配制按照实施例3中的PCR反应体系1-8配制反应体系，其中1-7号管由各基因位点检测试剂和内控检测试剂组成，8号管由外控检测试剂组成。反应体系配置后将步骤1中提取的DNA加入配制好的反应体系中，加入的模板量于8连管各管中分别加入2uL。
4、PCR反应
反应体系配制混匀后瞬离5s，待上机。在进行PCR反应时需要将待测样本、阴性对照和阳性对照一起平行上机检测，每个样本需要同时加入1-8号管进行反应。本发明中使用ABI7500进行检测。
5、仪器通道及反应体积选择
①选择FAM通道(Reporter：FAM，Quencher：TAMRA)和VIC通道(Reporter：VIC，Quencher：TAMRA)检测扩增情况；
②反应体积(Sample Volume)为20μL。
③参考荧光(Reference Dye)：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passivereference选择“none”；具体检测通道设置可参照各仪器使用说明。
6、PCR反应程序
预变性的条件为：95℃，2min；
第一阶段由5个扩增循环构成，其条件为：95℃，15s；58℃，1min；
第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：95℃，15s；60℃，1min，并于60℃分别采集FAM(靶点)、VIC(内参)荧光通道的信号。
7、实验结果
反应程序结束后保存结果并对检测靶点以及内参的扩增曲线进行分析判读。参见附图1-7，对29种基因突变位点进行检测，阴性对照孔中，FAM/VIC信号无典型的S型扩增曲线升起，1-7号管中待测样本FAM和VIC荧光检测信号形成对数扩增“S”型曲线。
结果表明，采用本发明的试剂盒可以快速准确的检测出人类EGFR基因29种基因突变点，为患者的靶向治疗药物的选择提供参考。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司
<120> 一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
attcccgtcg ctatcaagac agct 24
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccgtcgcta tcaaggactc tc 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccgtcgcta tcaaggttcc g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttcccgtcgc tatcaagtcg c 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgtcgctatc aaggaatcga aa 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgtcgctatc aaggaaccat c 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aattcccgtc gctatcaagt agca 24
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cccgtcgcta tcaaggatgc ca 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctgaggttc agagccatgg ac 22
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caaggaaatc ctcgat 16
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tccaccgtgc agctcgttat 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcaggtactg ggagccaata 20
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atgcccttcg gctgc 15
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgcagctcat cacgcagctc atgc 24
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaagcctacg tgatggccgt 20
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgagctgcgt gatgagctgc acggtg 26
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccgcctgctg ggcatc 16
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cctacgtgat ggccagcgtg gacaac 26
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgatggccag cgtggatggt 20
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtggacaacc cccatcac 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gccagcgtgg caagagtg 18
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
caagatcaca gatattaggc g 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agccacctcc ttactttgcc 20
<210> 31
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctgggtgcgg aagag 15
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
attttgggct ggccaagca 19
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gaaaatgctg gctgacctaa ag 22
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ctgggtgcgg aagagaaaga 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gctcacgcag ttgggcactt 20
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cacctcacag ttattgaaca tcct 24
<210> 37
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aagatcattt tctcag 16
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
agtgtctttg aagtcttcgt tc 22
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ccactccagc atcactcact t 21
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tctcgggaga accaaaccgg aatg 24

Claims (9)

1.一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：包括用于人类表皮生长因子受体EGFR基因G719A、G719S、G719C、E746_A750>I、E746_A750del(1)、E746_A750del(2)、L747_T751del1、L747_T751del2、E746_A750>A、E746_S752>A、E746-S752>V、E746-S752>D、E746_A750del、L747_P753>S、L747_S752del、L747_T751>S、L747_T751>P、L747_A750>P1、L747-A750>P2、L747_P753>Q、L747-T751>Q、L747_E749del、T790M、S768I、V769_D770insASV、H773_V774insH、D770_N771insG、L858R、L861Q等29种突变的引物、探针，内控基因引物和探针、外控基因引物和探针。
2.如权利要求1所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述人类EGFR基因29中突变的引物和探针分为7个引物体系。
3.如权利要求2所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：引物体系1包括用于检测G719A、G719S、G719C位点的引物和探针，引物体系2包括用于检测E746_A750>I/E746_A750del(1)、E746_A750del(2)/L747_T751del1、L747_T751del2/E746_A750>A、E746_S752>A/E746-S752>V、E746-S752>D/E746_A750del、L747_P753>S/L747_S752del、L747_T751>S/L747_T751>P、L747_A750>P1/L747-A750>P2、L747_P753>Q/L747-T751>Q、L747_E749del位点的引物和探针，引物体系3包括用于检测T790M位点的引物和探针，引物体系4包括用于检测S768I位点的引物和探针，引物体系5包括用于检测V769_D770insASV、H773_V774insH、D770_N771insG位点的引物和探针，引物体系6包括用于检测L858R位点的引物和探针，引物体系7包括用于检测L861Q位点的引物和探针。
4.如权利要求1-3中任一项所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述人类EGFR基因29中突变的引物和探针序列如SEQ IQ NO.1-SEQ IQ NO.34所示。
5.如权利要求1所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述人类EGFR基因外控基因引物和探针序列如SEQ IQ NO.35-SEQ IQ NO.37所示。
6.如权利要求1所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述人类EGFR基因内控基因引物和探针序列如SEQ IQ NO.38-SEQ IQ NO.40所示。
7.如权利要求1所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括荧光定量PCR反应缓冲液，dNTPs，热启动DNA Polymerase，阴性对照品和阳性对照品。
8.一种根据权利要求1-7中任一项所述检测人类EGFR基因突变的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)核酸提取：根据样本类型(外周血/石蜡包埋组织)选择不同的商业化试剂盒进行DNA提取，本发明中外周血DNA提取采用美基生物生产的HiPure Blood DNA Mini Kit试剂盒，石蜡包埋组织DNA提取采用HiPure FFPE DNA Kit试剂盒；
2)PCR反应体系的配置：预混分装荧光定量PCR反应缓冲液，dNTPs，热启动DNAPolymerase形成PCR反应液，然后将步骤1)得到的DNA及引物体系1-7、外控基因引物探针体系分别加入PCR反应液中分别形成PCR反应体系1-PCR反应体系8，共同组成PCR反应体系；混匀后瞬离5s，进行PCR扩增；
3)反应结束后进行基因分型判读。
9.如权利要求8所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增的条件为：
预变性的条件为：95℃，2min；
第一阶段由5个扩增循环构成，其条件为：95℃，15s；58℃，1min；
第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：95℃，15s；60℃，1min，并于60℃分别采集FAM(靶点)、VIC(内参)荧光通道的信号。
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