CN116463410A - 基于MassARRAY核酸质谱技术的高血压精准用药的基因检测物及应用 - Google Patents

基于MassARRAY核酸质谱技术的高血压精准用药的基因检测物及应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种基于MassARRAY核酸质谱技术的高血压精准用药的基因检测物及应用。该基因检测物针对高血压用药指导的21个SNP位点，分别为：rs1042714、rs1801253、rs28371725、rs1065852、rs2238032、rs776746、rs10494366、rs12946454、rs1801133、rs5186、rs4344、rs4359、rs1057910、rs1799853、rs16960228、rs4149601、rs7297610、rs4961、rs3892097、rs5065和rs1799752；其中包括用于扩增21个SNP位点的21对上、下游引物，所述21对上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~42所示。采用本申请的基因检测物经过核酸质谱实验分析，能够同时对多个样本的16个基因21个SNP位点同时检测，进而为高血压用药提供合理性指导。

Description

基于MassARRAY核酸质谱技术的高血压精准用药的基因检测 物及应用
技术领域
本申请涉及基因检测领域，尤其是涉及一种基于MassARRAY核酸质谱技术的高血压精准用药的基因检测物及应用。
背景技术
高血压是最常见的慢性非感染性疾病，会引起心、脑、肾等脏器的并发症，是心血管病最重要的危险因素。据《2022年全国心血管疾病报告》显示，每5例死亡中就有2例死于心血管病。推算心血管病现患人数3.3亿，其中脑卒中1300万，冠心病1139万，心衰890万，肺源性心脏病500万，房颤487万，风湿性心脏病250万，先天性心脏病200万，下肢动脉疾病4530万，高血压2.45亿。中国高血压防治指南(2018年修订版)指出2012-2015年我国18岁及以上人口的高血压患病粗率为27.90％，标化率为23.2％，高血压患者中，只有约一半人知道自己有高血压这个问题，把血压控制好的却只有16.8％。高血压是全球心血管疾病和全因死亡的主要可改变危险因素，79.8％的脑卒中与高血压有关，控制血压在正常水平可减少40-50％脑卒中的发生。因此，控制高血压可有效降低心血管疾病死亡率。
目前高血压用药种类繁多，而人群药物代谢基因也具有多态性，同一种药物用于不同人的敏感性和代谢速度各有不同。综合分析，高血压控制率低，除了患者服药依从性差，饮食及生活方式等未改善，未根据基因多态性进行个性化用药也是重要影响因素。多数患者在指南标准药物治疗方案下规律治疗，其疾病的控制率和缓解率依然很低，由于患者个体基因差异会造成药物代谢能力不同，对同一药物的反应也有很大差别。医生通常需要让患者“试药”三到六个月才能筛选出适合的药物，在此过程中，大多数人会中断甚至放弃治疗。2017年，卫计委合理用药专家委员会及中国医师协会高血压专业委员会发布《高血压合理用药指南(第2版)》，明确提出：不同个体对药物反应差异巨大，高血压用药时应考虑药物基因组学因素。通过基因检测来判断药物代谢酶和受体的基因变异情况，从而选择合适的降压药物和用药剂量，达到降低不良反应、减少无效用药、个体化精准用药的目的。
尽管现有技术中已有针对高血压个体化用药相关的检测，但不同检测方法侧重不同，难以满足临床实际需求。高通量测序技术虽通量大，但实验过程和数据分析周期长，对实验操作和数据分析人员的技术要求门槛高；荧光定量PCR技术平台实验周期短，但通量小，一个反应孔只能实现5重左右靶标的分析，如武汉友芝友医疗科技股份有限公司的“人类AGTR1、ACE、ADRB1、CYP2D6、CYP2C9基因检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”仅能检测5个基因；基因芯片平台操作简便、快速，但通量小、灵敏度低，成本相对较高；一代测序sanger技术一个反应孔只能检测1个SNP位点，虽然准确但实验成本高。MassARRAY核酸质谱分析技术一次检测实验能够得到多样本的30重乃至更多SNP位点信息，实验周期只需1天左右，拥有检测多重、准确、高通量、高灵敏度一级快速出报告等优势，适合大样本及多位点的基因检测。
因此，建立一种基于MassARRAY核酸质谱技术平台的高血压精准用药的基因检测方法，具有重要的医疗价值。另外，由于MassARRAY核酸质谱技术一次检测可得到多个样本的多个位点检测结果，因此检测结束后，需要从冗长的下机结果文件中，手工筛选实验号、SNP位点的RS号和基因分型结果，然后与PharmGKB药物基因组学数据库、SNP数据库、Clinvar数据库、文献等比对，对个体药物动力学、药物代谢和药物疗效提供详细的注释，最终人工编辑发放报告得出合理的用药建议，人工分析步骤繁琐、耗时长、消耗大量的人力和时间，人工还容易出错和不全面，因此还需要对检测结束后的结果分析过程进行改进。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供一种基于MassARRAY核酸质谱技术的高血压精准用药的基因检测物，利用含有所述基因检测物的试剂盒能够同时对多个样本的21个SNP位点同时检测，且针对每个样本的21个SNP位点的检测可在单管中一次性进行，实验周期短、成本低、通量高、准确率高、重复性好，同时检测结果不需要复杂的数据分析，检测报告可自动生成，进而为高血压用药提供合理性指导，具有极大的临床应用价值。
为此，本申请第一方面提供了一种基于MassARRAY核酸质谱技术的高血压精准用药的基因检测物，所述基因检测物针对高血压用药指导的21个SNP位点，分别为：rs1042714、rs1801253、rs28371725、rs1065852、rs2238032、rs776746、rs10494366、rs12946454、rs1801133、rs5186、rs4344、rs4359、rs1057910、rs1799853、rs16960228、rs4149601、rs7297610、rs4961、rs3892097、rs5065和rs1799752。
本申请的发明人通过市场调研、文献查询及大夫推荐，确定了高血压常用药物，包含5大类14种。现在市场上已经公开多种高血压药物检测的相关位点，但是选择或组合真正具有临床意义且有效性的位点并不容易。本发明选择的21个SNP位点具备：1)选择了PharmGKB数据库中用药等级3级以上的位点；2)在人群数据库中具有基因多态性，删掉了中国人100％有和没有人群频率的位点；3)包含了药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)的高血压检测位点。最终本申请的发明人通过参考PharmGKB数据库、dbSNP数据库、ClinVar、ExAC、1000Genomes等数据库，筛选出了高血压精准用药的16个基因21个SNP位点，上述21个SNP位点具有实际的临床意义和有效性。
在一些实施方式中，所述基因检测物包括用于扩增21个SNP位点的21对上、下游引物，所述21对上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～42所示。
在一些实施方式中，所述基因检测物还包括针对所述21个SNP位点的21条延伸引物，所述21条延伸引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:43～63所示。
本申请的发明人首先通过MassARRAY网址的引物设计软件Assay Designer，调整相关参数，完成PCR扩增所需的21对上、下游引物和单碱基延伸的21条延伸引物的初步设计。导出设计好的引物及各参数文件，合成引物，然后通过不断的优化和大样本测试，最终确认了21对上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～42所示，21条延伸引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:43～63所示。利用上述核苷酸序列所示的上、下游引物和延伸引物能够实现对该21个SNP的准确分型，同时达到核酸质谱的检测技术的要求。
在一些实施方式中，所述21个SNP位点所检测的16个高血压用药指导相关的基因分别为：ADRB1、ADRB2、CYP2D6、CYP3A5、CACNA1C、NOS1AP、PLCD3、ACE、MTHFR、AGTR1、CYP2C9、PRKCA、NEDD4L、YEATS4、ADD1和NPPA。
本申请通过对上述16个高血压用药指导相关的基因中所含有的21个SNP位点的基因检测和分型，进而能够有效对5大类14种高血压常用药物的用药进行指导，具有极大的临床应用价值及更好的市场推广前景。具体地，上述用药基因所对应的高血压药物、SNP位点、SNP位点基因型和用药指导如表1所示。
表1
本申请第二方面提供了一种基于MassARRAY核酸质谱技术的用于高血压精准用药的基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括如本申请第一方面所述的基因检测物。
在一些实施方式中，所述试剂盒中包括用于对待测样本中的21个SNP位点进行多重PCR扩增的PCR扩增试剂，对多重PCR扩增后的扩增产物进行去磷酸化的去磷酸化试剂，以及对去磷酸后的扩增产物进行单碱基延伸的延伸试剂；其中，所述PCR扩增试剂中含有所述基因检测物中的21对上、下游引物，所述延伸试剂中含有所述基因检测物中的21条延伸引物。
在一些具体实施方式中，所述PCR扩增试剂中还含有DNA聚合酶(如，Taq酶)、dNTP和PCR缓冲液等；所述去磷酸化试剂含有虾碱式磷酸酶(SAP)和虾碱式磷酸酶缓冲液等；所述延伸试剂中还含有iPLEX酶、iPLEX缓冲液和iPLEX Termination mix(iPLEX终止混合物)等。
通过采用上述试剂盒，能够实现对待测样本中的21个SNP位点的精准检测，根据检测结果即可对患者的高血压用药进行精准指导，具有极大的临床应用价值。
在一些实施方式中，利用所述试剂盒对待测样本进行高血压精准用药检测的方法包括如下步骤：
S1，将待测样本的基因组DNA溶液与所述PCR扩增试剂混合形成PCR反应体系，对所述PCR反应体系进行多重PCR扩增，获得扩增产物；
S2，采用所述去磷酸化试剂对所述扩增产物进行去磷酸化，获得去磷酸后的扩增产物；
S3，将所述去磷酸后的扩增产物与所述延伸试剂混合形成延伸反应体系，对所述延伸反应体系进行单碱基延伸，获得延伸产物；
S4，采用脱盐树脂对所述延伸产物进行脱盐纯化，获得纯化后的延伸产物；
S5，将所述纯化后的延伸产物进行芯片点样，然后利用MassARRAY核酸质谱平台对所述纯化后的延伸产物中的21个SNP位点进行检测，获得基因分型结果；
S6，根据获得的基因分型结果生成高血压精准用药报告结果。
本申请中，上述试剂盒的使用方法能够同时对多个样本的21个SNP位点同时检测并准确分型，且针对每个样本的21个SNP位点的检测可在一个反应中一次性进行，进一步节省了实验操作和成本，具有实验周期短、成本低、通量高、准确率高、重复性好等优势，同时检测结果不需要复杂的数据分析，检测报告可自动生成。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述基因组DNA溶液的纯度OD260/OD280为1.8～2.0。在一些优选的实施方式中，所述基因组DNA溶液的纯度OD260/OD280为1.9～2.0；本申请中，待测样本基因组DNA溶液的纯度影响基因分型的结果，若基因组DNA溶液的纯度多低，最终利用MassARRAY核酸质谱平台检测后的质谱峰图不明显，质谱峰图无法判读，影响结果的判定。本申请通过将基因组DNA溶液的纯度OD260/OD280控制在1.8～2.0，尤其是1.9～2.0时，能使最终检测后的结果质谱峰图出峰清晰，检测结果准确。
本申请中，所述基因组DNA溶液的浓度需控制在5ng/μL以上，以保证检测结果的准确性。
本申请中，待测样本中基因组DNA的提纯方法和纯化方式为本领域的常规手段，本领域的技术人员可以根据实际需要进行常规选择。
在一些实施方式中，所述PCR反应体系中每条引物的浓度均为0.4～0.6μM。在一些优选的实施方式中，所述PCR反应体系中每条引物的浓度均为0.5μM。
本申请通过将PCR反应体系中每条引物的浓度控制在上述范围内，能够明显降低多重PCR扩增体系的竞争干扰和引物二聚体的作用，提升扩增效果，有效对待测样本基因组DNA上的21个SNP位点进行扩增。
步骤S3中，所述延伸反应体系中每条延伸引物的浓度各自独立地为0.56～1.08μM。
本申请中所述延伸反应体系中，每条延伸引物的浓度是不一样的，浓度的确定需要根据最终检测结果的出峰高度进行调整，最低峰不低于最高峰高度的60％。本申请根据线性调整方法(linear adjustment method)配制延伸引物混合物，延伸反应体系中每条延伸引物的浓度根据其分子量不同而不同。在本申请的一些具体实施方式中，针对21个SNP位点：rs1042714、rs1801253、rs28371725、rs1065852、rs2238032、rs776746、rs10494366、rs12946454、rs1801133、rs5186、rs4344、rs4359、rs1057910、rs1799853、rs16960228、rs4149601、rs7297610、rs4961、rs3892097、rs5065和rs1799752的延伸引物的浓度分别为0.72μM、0.68μM、0.64μM、0.61μM、0.99μM、0.81μM、1.08μM、0.58μM、0.81μM、0.94μM、1.02μM、0.92μM、0.74μM、0.75μM、0.87μM、0.84μM、0.91μM、0.71μM、0.56μM、0.95μM和0.83μM。通过采用上述浓度的各延伸引物，进一步保证了检测结果的准确性。
在一些实施方式中，步骤S4中，脱盐纯化过程中，将所述脱盐树脂与所述延伸产物中形成的混合物放置于旋转混匀仪上，在转速为10～15rmp下摇匀30～40min。在一些优选的实施方式中，所述混合物在转速为12rmp下摇匀40min。
本申请所述方法延伸反应结束后的延伸反应产物在应用MassARRAY检测之前，需要采用树脂盐脱的方式对延伸反应产物进行纯化；纯化过程中，每反应孔中加入脱盐树脂的量可以为15mg，树脂加入后将反应板于旋转混匀仪上混合均匀以对每孔中的延伸反应产物进行脱盐纯化。本申请的发明人通过研究发现，当将旋转混匀仪的转速控制在10～15rmp，与尤其是10～11rmp，摇匀时间控制在30～40min，尤其是40min，能够提升脱盐纯化效果，使最终检测后的质谱峰图效果好，进而提升检测结果和判读的准确性。
在一些实施方式中，步骤S5中，所述点样的速度为140～160。
本申请，当将点样的速度控制在140～160，能够有助于提升检测后各样本中每个SNP位点的质谱峰图效果出峰效果，进而提升检测结果和判读的准确性。
在一些实施方式中，所述高血压精准用药报告结果采用基于python代码编写的自动化报告生成程序自动生成。
本申请中，高血压精准用药报告结果采用高血压用药自动化报告程序生成，其是一个基于python代码编写的自动化报告生成程序。该程序主要通过执行python代码程序，对受检者待测样本的检测结果、靶向用药数据库、受检者的个人信息等进行复杂处理，最终生成一个可修改的word版的受检者高血压用药指导检测报告。
该程序执行过程如下：
步骤一、在程序目录下执行python程序；
步骤二、程序获取受检者样本信息：程序将受检者样本信息表中的受检者样本信息读入，获取受检者的样本编号、患者姓名、性别、年龄、送检单位、采样日期、收样日期、样本类型、报告版本等信息；
步骤三、选择报告模板：程序根据受检者样本信息表中的样本信息和报告版本，自动载入对应的报告模板；
步骤四、读取高血压药物数据库：程序读取高血压数据库，将用药位点及其位点对应的药物、等级、药物疗效等信息读入；
步骤五、读取受检者的检测结果：程序读取受检者的检测结果，根据读入的高血压药物数据库的信息，识别到受检者高血压药物相关的位点信息，则自动记录该突变位点的检测信息，进而自动形成高血压用药指导检测报告的word版本。
本申请中，所述试剂盒的检测流程包括特异性引物扩增、去磷酸化反应、单碱基延伸、质谱检测等环节，检测过程中先通过PCR扩增目标序列，然后对PCR产物进行去磷酸化，最后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上进行单个碱基的延伸。MassARRAY基因分析技术基于MALDT-TOF飞行时间质谱技术，该技术应用质谱分析对质量的灵敏度特别高的特点，能够有效将含不同碱基的基因序列区别开，进而进行SNP分型。
本申请的有益技术效果如下：本申请所述基于MassARRAY核酸质谱技术的高血压精准用药的基因检测物，能够对具有实际的临床意义的高血压精准用药的21个SNP位点进行有效扩增，因此利用含有所述基因检测物的试剂盒能够同时对多个样本的21个SNP位点同时检测，且针对每个样本的21个SNP位点的检测可在同一个反应中一次性进行，实验周期短、成本低、通量高、准确率高、重复性好，同时检测结果不需要复杂的数据分析，检测报告可自动生成，进而为高血压用药提供合理性指导，具有极大的临床应用价值和及更好的市场推广前景。
附图说明
图1采用本申请检测方法对位点rs1799752检测后的质谱峰图。
图2采用一代测序方法对位点rs1799752检测后的结果图。
图3为实施例3中位点rs1042714检测后的质谱图。
图4为实施例4中位点rs1042714检测后的质谱图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：基于MassARRAY核酸质谱技术的高血压精准用药的基因检测物中引物核苷酸序列的设计本申请的发明人通过市场调研、文献查询及大夫推荐，确定了包含5大类14种高血压常用药物，并通过参考PharmGKB数据库、dbSNP数据库、ClinVar、ExAC、1000Genomes等数据库，筛选出了具有实际的临床意义和有效性的高血压精准用药的21个SNP位点，分别为：rs1042714、rs1801253、rs28371725、rs1065852、rs2238032、rs776746、rs10494366、rs12946454、rs1801133、rs5186、rs4344、rs4359、rs1057910、rs1799853、rs16960228、rs4149601、rs7297610、rs4961、rs3892097、rs5065和rs1799752。
通过MassARRAY网址的引物设计软件Assay Designer，调整相关参数，完成多重PCR扩增所需的21对上、下游引物和单碱基延伸的21条延伸引物的初步设计。值得注意的是，在设计插入/缺失位点(ACE的位点rs1799752)的单碱基延伸引物时，需要特殊技巧。插入/缺失引物设计的过程中，引物设计第二步“Find Proximal SNPs”中经常报错，为此本申请的发明人在设计位点rs1799752的延伸引物时，将位点rs1799752的序列信息由：CGCCCCTCACAGGACTGCTGAGGCCCTGCAGGTGTCTGCAGCATGTGGCCCCAGGCCG GGGACTCTGTAAGCCACTGCTGGAGAGCCACTCCCATCCTTTCTCCCATTTCTCTAGACC TGCTGCCTATACAGTCACTTTT[-/TTTTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTCTGTCGCCCA TACAGTCACTTTT]ATGTGGTTTCGCCAATTTTATTCCAGCTCTGAAATTCTCTGAGCTCC CCTTACAAGCAGAGGTGAGCTAAGGGCTGGAGCTCAAGGCATTCAAACCCCTACCAG转换成SNP序列：CGCCCCTCACAGGACTGCTGAGGCCCTGCAGGTGTCTGCAGCATGTGGCCCCAGGCCG GGGACTCTGTAAGCCACTGCTGGAGAGCCACTCCCATCCTTTCTCCCATTTCTCTAGACC TGCTGCCTATACAGTCACTTTT[A/T>]TGTGGTTTCGCCAATTTTATTCCAGCTCTGAAATT CTCTGAGCTCCCCTTACAAGCAGAGGTGAGCTAAGGGCTGGAGCTCAAGGCATTCAAA CCCCTACCAG(>或者<代表延伸引物的方向)成功设计了位点rs1799752的延伸引物。
导出设计好的引物及各参数文件，合成引物，然后通过不断的优化和大样本测试，最终确认了21对上、下游引物和21条延伸引物的核苷酸序列，具体如表2所示。
表2
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实施例2：基于MassARRAY核酸质谱技术的高血压精准用药的基因检测试剂盒
基因检测试剂盒包括如下组分：
PCR扩增试剂包含：Taq酶、dNTP Mix、10x PCR缓冲液(含20mM MgCl2)、MgCl2和实施例1中基因检测物中的21对上、下游引物的引物混合物；
去磷酸化试剂包含：虾碱式磷酸酶(SAP)和虾碱式磷酸酶缓冲液；
延伸试剂包含：iPLEX酶、10x iPLEX缓冲液、iPLEX Termination mix(iPLEX终止混合物)和实施例1中基因检测物中的21条延伸引物的引物混合物。
实施例3：利用实施例2中的试剂盒对受检者样本进行高血压精准用药检测利用实施例2中的试剂盒对受检者样本的基因组DNA中的21个SNP位点进行检测和基因分型，同时将检测结果与一代测序结果进行比对，检测实施例2中的试剂盒检测结果的准确性。具体检测过程如下：
步骤1：提取受检者样本中基因组DNA，提取的基因组DNA溶液的纯度OD260/OD280为1.9，浓度稀释至5ng/μL；将基因组DNA溶液与试剂盒内的PCR扩增试剂混合，形成PCR反应体系。5μL PCR反应体系的组成如表3所示。
表3
将配制好的PCR反应体系加入到96孔板的一个反应孔中，把板用膜封好，4000rpm离心5s后放于PCR仪中进行多重PCR扩增，扩增程序为：95℃2min，(95℃30s，56℃30s，72℃60s)45个循环，72℃5min，4℃forever。
步骤2：在含有扩增产物的反应孔中加入2μL去磷酸化试剂的混液(SAP混液)，2μLSAP混液的组成及在7μL反应体系中的浓度如表4所示。
表4
把板用膜封好(或8联管)，4000rpm离心5s，然后放于PCR仪进行以下去磷酸化，去磷酸化程序为：37℃40min，85℃5min，4℃forever。
步骤3：在含有去磷酸后的扩增产物的反应孔中加入2μL延伸试剂(iPLEX延伸混合液)，2μL iPLEX延伸混合液的组成及在9μL反应体系中的浓度如表5所示。
表5
其中，针对21个SNP位点：rs1042714、rs1801253、rs28371725、rs1065852、rs2238032、rs776746、rs10494366、rs12946454、rs1801133、rs5186、rs4344、rs4359、rs1057910、rs1799853、rs16960228、rs4149601、rs7297610、rs4961、rs3892097、rs5065和rs1799752的延伸引物的浓度分别为：0.72μM、0.68μM、0.64μM、0.61μM、0.99μM、0.81μM、1.08μM、0.58μM、0.81μM、0.94μM、1.02μM、0.92μM、0.74μM、0.75μM、0.87μM、0.84μM、0.91μM、0.71μM、0.56μM、0.95μM和0.83μM。
把板用膜封好，4000rpm离心5s，然后放于PCR仪进行单碱基延伸，单碱基延伸的程序为：94℃30s，(94℃5s，<52℃5s，80℃5s>5个循环)40个循环，72℃3min，4℃forever。
步骤4：样本脱盐纯化
把洁净树脂(Resin)铺平在96/15mg dimple plate上，风干最少10min(操作时在dimple plate下垫张洁净的白纸)；在含有延伸产物的样本孔里加入41μL水，瞬时离心；轻轻将样本板凌空反转，放在盛有树脂的dimple plate上，然后将dimple plate连样本板一起反转(过程中两板不可水平移动)，使树脂掉到孔里；用膜把板封好，然后放在旋转混匀仪上，转速12rmp，摇匀40min；将板以2000rpm离心5min。
步骤5：点样、上机检测
利用MassArrayTM RS1000点样仪对纯化后的延伸产物进行点样，点样速度为150，点样结束后MassArrayTM核酸质谱分析仪对受试者基因组DNA中的21个SNP位点进行检测，获得基因分型结果。
由于本实施例仅是为了验证实施例2试剂盒检测结果的准确性，因此获得基因分型结果以后直接与一代测序的结果进行对比，没有进行后续的根据基因分型结果输出高血压精准用药报告的步骤。采用实施例2中的试剂盒对受检者样本中的21个SNP位点检测后的基因型结果与一代测序结果如表5所示。
表5
SNP位点 本申请检测结果 一代测序结果
rs1042714 CC CC
rs1801253 CC CC
rs28371725 GG GG
rs1065852 AG AG
rs2238032 TT TT
rs776746 CT CT
rs10494366 GT GT
rs12946454 AA AA
rs1801133 AA AA
rs5186 AA AA
rs4344 AA AA
rs4359 CT CT
rs1057910 AA AA
rs1799853 CC CC
rs16960228 AG AG
rs4149601 AG AG
rs7297610 CC CC
rs4961 GG GG
rs3892097 CC CC
rs5065 AA AA
rs1799752 ID ID
本申请中，位点rs1799752为插入/缺失性突变位点，其II型(插入/插入)、ID型(插入/野生型)和DD型(野生型/野生型)的基因型分别如下：
ATACAGTCACTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTCTGTCGCCC/ATACAGTCACTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTCTGTCGCCC II型
ATACAGTCACTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTCTGTCGCCC/del ID型del/del DD型
采用本申请所述方法对该位点进行检测时，如果样本质谱峰图为T，表示为插入型；如果样本质谱峰图为A，表示为野生型。
从表5可知，利用本申请检测方法对受试者样本基因组DNA中的21个SNP位点进行检测后的基因分型结果与一代测序结果完全一致，本申请试剂盒的检测结果精准，利用获得的精准的SNP基因分型结果可对受试者高血压用药进行个体化指导。另外，图1和2示例性地给出了分别采用本申请检测方法和一代测序方法对受检者样本位点rs1799752进行检测后的结果图。从图1和图2可知，本申请检测方法对位点rs1799752检测后的质谱峰结果与一代测序结果一致，本申请检测方法检测结果可靠。图3示例性地给出了位点rs1042714检测后的质谱图。从图3可知，本申请检测方法获得的位点rs1042714质谱图的出峰明显，根据该质谱图可清楚地判定该位点的基因型结果，保证了检测结果的准确性。
实施例4：利用实施例2中的试剂盒对受检者样本进行高血压精准用药检测检测过程基本同实施例3，不同之处在于，检测过程中提取受检者样本中基因组DNA，提取的基因组DNA溶液的纯度OD260/OD280为1.7。检测结果发现，位点rs1042714、位点rs1065852和位点rs1799853质谱图的出峰效果不明显，根据质谱峰图无法进行基因型判读。图4示例性地给出了位点rs1042714检测后的质谱图。从图4可知，位点rs1042714检测后的质谱图没有明显的出峰，因此无法利用该质谱图对该位点的基因型结果进行判定。
说明当基因组DNA溶液的纯度过低时，会影响质谱图的出峰效果，进而降低检测结果的准确性。
实施例5：利用实施例2中的试剂盒对受检者样本进行高血压精准用药检测检测过程基本同实施例3，不同之处在于，检测过程中PCR扩增体系中每条引物的终浓度均为1μM。检测结果发现，位点rs12946454的基因分型结果为AT，位点rs7297610的基因分型结果为CT，这两个位点的基因分型结果发生错误判读；其余位点的检测结果与实施例3相同。表明，当PCR扩增体系中每条引物的终浓度过高时，会导致多重PCR的扩增效果较差，进而导致检测结果的准确性下降。
实施例6：利用实施例2中的试剂盒对受检者样本进行高血压精准用药检测检测过程基本同实施例3，不同之处在于，检测过程中PCR扩增体系中每条引物的终浓度均为0.2μM。检测结果发现，位点rs1799853的基因分型结果为CT，该位点的基因分型结果发生错误判读；其余位点的检测结果与实施例3相同。表明，当PCR扩增体系中每条引物的终浓度过低时，同样会导致多重PCR的扩增效果较差，进而导致检测结果的准确性下降。
实施例7：利用实施例2中的试剂盒对受检者样本进行高血压精准用药检测检测过程基本同实施例3，不同之处在于，在检测的样本脱盐纯化过程中，用膜把板封好，然后放在旋转混匀仪上，转速12rmp，摇匀20min。检测后发现，检测后的质谱峰图效果较差，且位点rs4344的基因分型结果为AG，检测结果发生错误判读。表明，样本脱盐纯化过程中，洁净树脂与延伸产物的混合时间过短，会影响延伸产物的纯化效果，产物中的杂质较多，影响后续的结果判读。
实施例8：利用实施例2中的试剂盒对受检者样本进行高血压精准用药检测检测过程基本同实施例3，不同之处在于，在点样过程中，点样速度为130。检测后发现，位点rs28371725的基因分型结果为TT，该位点的基因分型结果发生错误判读；其余位点的检测结果与实施例3相同。表明，若点样的速度过慢，同时会影响检测结果的准确性。
应用例1：高血压患者的高血压精准用药指导
利用本申请实施例2中的试剂盒对患者(年龄43岁，男)基因组DNA中的21个SNP位点进行检测，并根据检测后的基因分型结果输出高血压精准用药报告。
具体检测过程如下：
步骤1-步骤5同实施例3。
步骤6：采用基于python代码编写的自动化报告生成程序，根据步骤5获得的基因分型结果生成高血压精准用药报告结果。患者的高血压精准用药报告结果如表6所示。
表6
医生根据上述用药报告，可选择性地舍去针对该患者疗效差且有用药风险的药物，同时选择针对该患者疗效好的药物进行要药。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (10)

1.一种基于MassARRAY核酸质谱技术的高血压精准用药的基因检测物，其特征在于，所述基因检测物针对高血压用药指导的21个SNP位点，分别为：rs1042714、rs1801253、rs28371725、rs1065852、rs2238032、rs776746、rs10494366、rs12946454、rs1801133、rs5186、rs4344、rs4359、rs1057910、rs1799853、rs16960228、rs4149601、rs7297610、rs4961、rs3892097、rs5065和rs1799752。
2. 根据权利要求1所述的基因检测物，其特征在于，所述基因检测物包括用于扩增21个SNP位点的21对上、下游引物，所述21对上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~42所示。
3.根据权利要求1或2所述的基因检测物，其特征在于，所述基因检测物还包括针对所述21个SNP位点的21条延伸引物，所述21条延伸引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:43~63所示。
4.根据权利要求1所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述21个SNP位点所检测的16个高血压用药指导相关的基因分别为：ADRB1、ADRB2、CYP2D6、CYP3A5、CACNA1C、NOS1AP、PLCD3、ACE、MTHFR、AGTR1、CYP2C9、PRKCA、NEDD4L、YEATS4、ADD1和NPPA。
5.一种基于MassARRAY核酸质谱技术的用于高血压精准用药的基因检测试剂盒，其特征在于，所述基因检测试剂盒包括如权利要求1-4中任意一项所述的基因检测物。
6.根据权利要求5所述的基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括用于对待测样本中的21个SNP位点进行多重PCR扩增的PCR扩增试剂，对多重PCR扩增后的扩增产物进行去磷酸化的去磷酸化试剂，以及对去磷酸后的扩增产物进行单碱基延伸的延伸试剂；其中，所述PCR扩增试剂中含有所述基因检测物中的21对上、下游引物，所述延伸试剂中含有所述基因检测物中的21条延伸引物。
7.根据权利要求6所述的基因检测试剂盒，其特征在于，利用所述试剂盒对待测样本进行高血压精准用药检测的方法包括如下步骤：
S1，将待测样本的基因组DNA溶液与所述PCR扩增试剂混合形成PCR反应体系，对所述PCR反应体系进行多重PCR扩增，获得扩增产物；
S2，采用所述去磷酸化试剂对所述扩增产物进行去磷酸化，获得去磷酸后的扩增产物；
S3，将所述去磷酸后的扩增产物与所述延伸试剂混合形成延伸反应体系，对所述延伸反应体系进行单碱基延伸，获得延伸产物；
S4，采用脱盐树脂对所述延伸产物进行脱盐纯化，获得纯化后的延伸产物；
S5，将所述纯化后的延伸产物进行芯片点样，然后利用MassARRAY核酸质谱平台对所述纯化后的延伸产物中的21个SNP位点进行检测，获得基因分型结果；
S6，根据获得的基因分型结果生成高血压精准用药报告结果。
8.根据权利要求7所述的基因检测试剂盒，其特征在于，步骤S1中，所述基因组DNA溶液的纯度OD260/OD280为1.8~2.0，优选为1.9~2.0；所述PCR反应体系中每条引物的浓度均为0.4~0.6µM，优选为0.5µM；
步骤S3中，所述延伸反应体系中每条延伸引物的浓度各自独立地为0.56~1.08µM。
9. 根据权利要求7或8所述的基因检测试剂盒，其特征在于，步骤S4中，脱盐纯化过程中，将所述脱盐树脂与所述延伸产物中形成的混合物放置于旋转混匀仪上，在转速为10~15rmp下摇匀30~40min；优选在转速为12 rmp下摇匀40min；
步骤S5中，所述点样的速度为140~160。
10.根据权利要求7或8所述的基因检测试剂盒，其特征在于，步骤S6中，所述高血压精准用药报告结果采用基于python代码编写的自动化报告生成程序自动生成。
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