CN106939345B

CN106939345B - 用于检测ii型糖尿病易感基因creb1单核苷酸多态性的pcr-rflp方法及应用

Info

Publication number: CN106939345B
Application number: CN201710263891.3A
Authority: CN
Inventors: 徐瑶; 宋如晦; 石伟林; 代洋; 许娜; 廖兴华; 张同存
Original assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Current assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2017-04-21
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2037-04-21
Also published as: CN106939345A; CN110734969A

Abstract

本发明公开了一种用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷酸多态性的PCR‑RFLP方法及应用，首先，根据DNA池测序结果，检测到的基因多态性包括：CREB1基因启动子区距转录起始点‑1354位T或G的单核苷酸多态性和‑1343位T或A的单核苷酸多态性。以待测样本基因组DNA为模板，以引物对P为引物，在Taq DNA聚合酶、Buffer（缓冲环境）、Mg＋＋、dNTPs存在的情况下，PCR扩增包含多态位点的CREB1基因序列，然后将PCR产物一分为二，分别用Hha I和Xsp I限制性内切酶进行消化，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳分型。此外，将这两个多态位点与II型糖尿病的临床指标关联分析，结果显示不同基因型与空腹血糖和糖化血红蛋白水平显著相关。

Description

用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷酸多态性的PCR- RFLP方法及应用

技术领域

本发明涉及人类疾病分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法及其应用。

背景技术

糖尿病被认为是世界上第五大严重危害人类健康的疾病，其中90%为非胰岛素依赖型糖尿病，又称为II型糖尿病。该病属于复杂的代谢紊乱性疾病，其发病机制复杂，是遗传和环境互作的结果，其中遗传多态性可能是影响个体间疾病易感性的主要因素。由于II型糖尿病的早期临床症状不明显，往往使患者延误最佳的治疗时机。因此，寻找和鉴定出人类基因组中与II型糖尿病相关的遗传标记，将有利于该疾病的早期筛查和诊断，及时控制病程的进展。

遗传标记主要分为两类：Ⅰ类是间接反映DNA水平遗传变异的表观标记，如形态标记、细胞标记和生化标记；Ⅱ类是直接反映DNA水平遗传变异的分子标记。分子标记是遗传标记的重要组成部分，能够反映DNA水平的各种遗传变异，包括点突变、缺失、插入、易位、倒位、重排或存在长短与重排不一的重复多态性。总之，分子标记在生命科学领域中已经被广泛应用，在遗传标记中占主导地位。

基于分子标记而发展起来的诊断技术能够准确地检测出与人类复杂疾病相关的变异位点，是疾病早期筛查和诊断的有效方法。应用分子标记诊断首先是在DNA水平上检测与疾病临床检测指标密切相关的遗传标记，其次是建立该遗传多态性的快速检测方法，最终实现分子标记检测方法在疾病早期诊断和易感人群筛查中的应用。

单核苷酸多态性（SNP）是分子标记的重要组成部分，在基因组中广泛分布。限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）是一种检测SNP的有效技术，根据SNP位点附近的序列信息，如果没有自然酶切位点，通过PCR引入特定的限制性内切酶位点并进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点的不同基因型。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且对所检测的序列位点无特殊性要求。

环磷腺苷效应元件结合蛋白1（CREB1）是含有亮氨酸拉链结构域的一种重要的转录因子。细胞内的cAMP水平升高能够激活CREB1，进而调控含CREs元件的下游基因。研究表明，CREB1还可以通过募集共刺激分子（如PGC-1）调控下游基因的表达，参与血糖和胰高血糖素的代谢过程。Herzig S等研究发现，敲除CREB1基因的小鼠表现出脂肪肝表型，且降低胰岛素的敏感性（Herzig S, Hedrick S, Morantte I, Koo S-H, Galimi F, Montminy M (2003) CREB controls hepatic lipid metabolism through nuclear hormone receptor PPAR-[gamma]. Nature 426:190–193）。由此可见，CREB1基因与糖尿病的发生密切相关。

目前，国内外对CREB1基因的研究主要集中在其功能和调控机制方面，关于CREB1基因遗传变异及其与II型糖尿病的相关性尚未见报道。因此，开展II型糖尿病易感基因CREB1多态性的研究十分必要，在CREB1基因序列中鉴定出与II型糖尿病相关的分子标记，用于II型糖尿病的早期筛查和诊断，具有重大的实际意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，并以该多态位点作为分子标记，应用于II型糖尿病的早期筛查和诊断。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，以糖尿病患者和正常人的血液基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg^＋＋、dNTPs 存在的情况下，利用聚合酶链式反应引物对P进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定待测样本的单核苷酸多态性；

所述的聚合酶链式反应引物对P为：

上游引物P-F：5’- CCTGGAGTACCAGGAAGGACA G C-3’ 23 nt

下游引物P-R：5’- TTACACGTATGAGCCACC-3’ 18 nt

引物P-F中带有下划线的碱基为错配碱基，目的是引入Hha I的酶切位点；

PCR扩增后，将产物一分为二，一部分PCR产物用限制性内切酶Hha I进行消化，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定CREB1基因第-1354位的碱基多态性；另一部分PCR产物用限制性内切酶Xsp I进行消化，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定CREB1基因第-1343位的碱基多态性。

所述的PCR扩增条件是：20 μL反应体系，包括0.625U Taq DNA聚合酶，2×Buffer10 μL（内含Mg⁺⁺、dNTPs等），0.45 μL基因组DNA，10 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL和灭菌超纯水8.3 μL；

所述的PCR反应程序为：95 ^oC预变性5 min；94^oC变性 30 s，54.5^oC退火30 s，72^oC延伸35 s，35个循环；72^oC延伸10 min。

所述的琼脂糖凝胶的浓度都为3.0%。

检测到的人CREB1基因启动子区多态性为：基因组第-1354位T>G突变；基因组第-1343位T>A突变。

通过电泳判定CREB1基因第-1354位的碱基多态性为：TT基因型表现为161 bp条带；TG基因型表现为161、139和22 bp条带；GG基因型表现为139和22 bp条带。

通过电泳判定CREB1基因第-1343位的碱基多态性为：AA基因型表现为161 bp条带；AT基因型表现为161、125和36 bp条带；TT基因型表现为125和36 bp条带。

本发明还提供所述的CREB1基因单核苷酸多态性标记在II型糖尿病的早期筛查和诊断中的应用。

前述的应用是通过以下技术方案来实现：

（1）提取II型糖尿病患者和正常人的血液基因组DNA；

（2）根据权利要求1-6中所述的PCR-RFLP方法，检测不同群体中CREB1基因-1354位和-1343位的单核苷酸多态性；

（3）根据PCR-RFLP的检测结果，分析CREB1基因-1354位和-1343位的多态位点在II型糖尿病群体中的易感基因型，建立准确的分子诊断体系，应用于II型糖尿病的临床检测。

所述的应用包括以下步骤：

（1）采用DNA池测序技术筛查CREB1基因的单核苷酸多态性位点，检测到的多态位点包括：启动子区-1354位T>G的突变和-1343位T>A的突变；

（2）利用PCR-RFLP技术，检测CREB1基因的2个单核苷酸多态性位点在II型糖尿病患者和正常人中的分布情况，鉴定出与II型糖尿病易感性相关的基因型；

（3）利用SPSS 20.0软件将CREB1基因的2个单核苷酸多态性位点与空腹血糖、糖化血红蛋白水平II型糖尿病相关临床指标进行关联分析，如果-1354位的基因型为GG、-1343位的基因型为AA，则待测个体对糖尿病更易感，患病症状更严重，如果-1354位的基因型为TG、-1343位的基因型为TT，待测个体的糖尿病症状较轻。以此作为依据，应用于II型糖尿病的筛查和临床诊断。

与现有技术相比，本发明把DNA池测序筛查SNP与PCR-RFLP结合起来解决了SSCP的繁琐和不稳定性，提供了一种简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与II型糖尿病易感性相关的遗传标记，可用于II型糖尿病的临床检测和疾病筛查。

本发明检测到的2个CREB1基因SNP位点位于启动子区，启动子是基因序列5’端重要的顺式作用元件，能够通过与多种反式作用因子结合，进而调控基因的表达水平。当启动子序列发生突变时，可能使原有的转录因子结合位点消失，也可能产生新的转录因子的结合位点，最终影响启动子活性和CREB1蛋白的表达水平。

CREB1基因在血糖代谢和胰岛素合成、分泌过程中具有重要的调控作用，将CREB1基因的SNP位点与II型糖尿病的临床指标进行关联分析表明，空腹血糖、糖化血红蛋白受到显著影响，因此，CREB1基因的-1354位和-1343位的SNP位点可以作为II型糖尿病早期筛查和诊断的分子标记。

本发明提供的检测方法为CREB1基因多态性与II型糖尿病关系的建立奠定了基础，CREB1基因的两个位点可以作为分子诊断标记，用于II型糖尿病的临床检测。

附图说明

图1为本发明中通过DNA池测序筛选到的CREB1基因-1354位T>G突变的SNP多态性测序结果图。

图2为本发明中通过DNA池测序筛选到的CREB1基因-1343位T>A突变的SNP多态性测序结果图。

图3为CREB1基因-1354和-1343的多态位点在II型糖尿病患者和正常人中的分布情况。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。若未特别指明，均按照常规的实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。

用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于：以糖尿病患者和正常人的血液基因组DNA为模板，以引物对P（F、R）为引物，PCR扩增CREB1基因，然后利用限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定待测样本的单核苷酸多态性；即在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg^＋＋、dNTPs 存在的情况下，利用聚合酶链式反应引物对P进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定待测样本的单核苷酸多态性；

所述的聚合酶链式反应引物对P为：

上游引物P-F：5’- CCTGGAGTACCAGGAAGGACA G C-3’ 23 nt

下游引物P-R：5’- TTACACGTATGAGCCACC-3’ 18 nt

其中，所述的PCR扩增条件是：20 μL反应体系，包括0.625U Taq DNA聚合酶，2×Buffer 10 μL（内含Mg⁺⁺、dNTPs等），0.45 μL基因组DNA，10 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL和灭菌超纯水8.3 μL；

其中，所述的琼脂糖凝胶的浓度都为3.0%。

进一步，检测到的人CREB1基因启动子区多态性为：基因组第-1354位T>G突变；基因组第-1343位T>A突变。通过电泳判定CREB1基因第-1354位的碱基多态性为：TT基因型表现为161 bp条带；TG基因型表现为161、139和22 bp条带；GG基因型表现为139和22 bp条带。通过电泳判定CREB1基因第-1343位的碱基多态性为：AA基因型表现为161 bp条带；AT基因型表现为161、125和36 bp条带；TT基因型表现为125和36 bp条带。

前述的应用是通过以下技术方案来实现：

（1）提取II型糖尿病患者和正常人的血液基因组DNA；

进一步，所述的应用包括以下步骤：

（3）利用SPSS 20.0软件将CREB1基因的2个单核苷酸多态性位点与空腹血糖、糖化血红蛋白水平II型糖尿病相关临床指标进行关联分析，如果-1354位的基因型为GG、-1343位的基因型为AA，则待测个体对糖尿病更易感，患病症状更严重，如果-1354位的基因型为TG、-1343位的基因型为TT，待测个体的糖尿病症状较轻；

以此作为依据，应用于II型糖尿病的筛查和临床诊断。

本发明利用PCR-RFLP方法对II型糖尿病易感基因CREB1的单核苷酸多态性位点进行检测。

1、血液样本采集

本发明具体以II型糖尿病患者和正常个体作为检测对象，126个II型糖尿病患者的血液样本采自武汉科技大学附属天佑医院内分泌科，100个正常人血液样本采自武汉大学校医院体检科。本实验内容已通过武汉科技大学附属天佑医院医学伦理委员会的批准。

2、基因组DNA的分离、提取、纯化

参考文献Sambrock et al (2002)方法。

3、DNA池的构建

用紫外分光光度计测定DNA样品在260 nm、280 nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA。

DNA浓度（ng）= 50×OD₂₆₀值×稀释倍数

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50 ng/μL，然后分别从II型糖尿病患者和正常人中随机选择30个个体，取每个个体的DNA样品10 μL混合构建成DNA池。

4、CREB1基因多态位点筛查

PCR扩增CREB1基因启动子区

从NCBI数据库中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得CREB1基因（NC_000002.12）的序列信息，利用Primer 5.0设计扩增CREB1基因启动子区的引物，其引物信息如下：

上游引物1-F：5’- TGGGAGGTGGGACATGAAAG -3’ 20nt

下游引物1-R：5’- TCAGAGGTCTCTCAGGACGG -3’ 20nt

以构建好的DNA池为模版，用上述设计的引物进行PCR扩增，PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5 mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。

PCR反应体系为：20 μL反应体系，包括0.625U Taq DNA聚合酶，2×Buffer 10 μL（内含Mg⁺⁺、dNTPs等），0.45 μL基因组DNA，10 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL和灭菌超纯水8.3 μL。

PCR反应程序为：95 ^oC预变性5 min；94^oC变性 30 s，61.0 ^oC退火30 s，72^oC延伸1min 30s，35个循环；72^oC延伸10 min。

DNA池测序分析

将上述PCR扩增产物送武汉擎科生物技术有限公司进行切胶纯化并测序，对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；如图1左起第3个位点出现了T、G两种检测结果、图2所左起第3个位点出现了T、A两种检测结果，即本发明筛查到了CREB1基因的2个SNP位点，分别为：在CREB1基因第-1354位为T或G的碱基多态性，可以表示为-1354T>G；在第-1343位为T或A的碱基多态性，可以表示为-1343 T >A。

5、CREB1基因多态位点的PCR-RFLP检测

多态位点分析

当CREB1基因第-1354位点发生T>G突变时，原本的T碱基附近的其他序列不能形成内切酶识别序列，这时需要通过引物引入错配，使得引物3’端和此处的突变型“G”在PCR扩增后形成一个Hha I限制性内切酶识别序列GCGC，这样当第-1354位点发生T>G突变时，即T突变为G，GCTG序列相应的变成内切酶识别序列GCGC，从而形成了Hha I限制性内切酶识别位点，该处突变可以用Hha I-PCR-RFLP方法检测；当CREB1基因第-1343位点发生T>A突变时，原来的Xsp I限制性内切酶识别序列CTAG相应的变成了GAAG，该位点属于自然酶切位点，可直接用Xsp I-PCR-RFLP方法检测。

PCR-RFLP引物设计

针对CREB1基因第-1354位的T>G突变，利用引入酶切位点技术设计错配引物对P，其中上游引物序列为：

P-F: 5’- CCTGGAGTACCAGGAAGGACA G C-3’ 23 nt

G 为引入错配碱基，它与突变型“G”形成Hha I限制性内切酶识别序列；

另外，由于CREB1基因第-1343位T>A的突变能够使原本的Xsp I限制性内切酶识别位点消失，属于自然酶切位点，且该位点与-1354位T>G的突变位点在基因组上距离仅相差12 bp，因此，本发明创新性地用一对引物（P）同时检测2个突变位点，与传统方法相比，具有简单、快速、节约成本等优点。

引物对P的PCR反应体系为：20 μL反应体系，包括0.625U Taq DNA聚合酶，2×Buffer 10 μL（内含Mg⁺⁺、dNTPs等），0.45 μL基因组DNA，10 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL和灭菌超纯水8.3 μL。

引物对P的PCR反应程序为：95 ^oC预变性5 min；94^oC变性 30 s，54.5^oC退火30 s，72^oC延伸35 s，35个循环；72^oC延伸10 min。

PCR产物酶切及RFLP检测

将20 μL的PCR产物一分为二，分别用Hha I和Xsp I进行酶切，然后根据电泳结果判定其SNP多态性。

1）酶切体系为20 μL，包括：10 μL PCR产物，1 μL（10 U/ μL）限制性内切酶， 2 μL酶切Buffer，7 μL灭菌蒸馏水。

2）酶切消化条件：37^oC恒温培养箱中消化5~10 h。

3）酶切消化后将样品置于65 ^oC水浴5 min终止酶切反应，120 V电压进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色检测酶切结果，用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型。

CREB1基因第-1354位的碱基多态性为：TT基因型表现为161 bp条带；TG基因型表现为161、139和22 bp条带；GG基因型表现为139和22 bp条带。

CREB1基因第-1343位的碱基多态性为：AA基因型表现为161 bp条带；AT基因型表现为161、125和36 bp条带；TT基因型表现为125和36 bp条带。

6、CREB1基因多态位点在群体中的分布差异

CREB1基因多态位点在II型糖尿病患者（T2D， n=126）和正常个体（Control， n=100）中的基因型分布如图3所示，对于-1354位突变位点，GG基因型在糖尿病患者中属于优势基因型，而在正常人中频率最低；对于-1343位突变位点，AA基因型在糖尿病患者中属于优势基因型，而在正常人中的优势基因型为TA。由此可见，-1354位点的GG基因型和-1343位的AA基因型可能与II型糖尿病易感性相关。

7、CREB1基因多态位点与II型糖尿病临床指标的关联分析

临床数据：空腹血糖和糖化血红蛋白水平。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 20.0软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y _ij = μ + Genotype _i + e _ij，

其中：Y _ij为性状观察值，μ为总体均值，Genotype _i为第i个基因型的固定效应，e _ij为随机误差。各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean ± SE形式表示。

关联分析结果表明（见表1），在Hha I检测的-1354T>G位点，GG型个体的空腹血糖和糖化血红蛋白水平都明显高于TG型和TT型，且表现显著或极显著水平（P<0.05或P<0.01）；在Xsp I检测的-1343T>A位点，AA基因型个体的空腹血糖显著高于TA和TT基因型个体（P<0.05），AA和TA基因型个体的糖化血红蛋白水平极显著高于TT基因型个体（P<0.01）。因此，本发明首次成功利用Hha I-PCR-RFLP和Xsp I-PCR-RFLP方法检测了CREB1基因-1354T>G和-1343T>A的2个多态位点。并通过关联分析验证，CREB1基因的2个位点均可作为II型糖尿病临床检测的分子标记。

表1 CREB1基因两个多态位点与II型糖尿病临床检测指标的关联分析

注：具有相同字母表示差异不显著（P>0.05），具有不同小写字母的表示差异显著（P<0.05），不同大写字母的表示差异极显著（P<0.01）。

8、上述SNP标记在II型糖尿病临床筛查和诊断中的应用

鉴定的CREB1基因-1354和-1343位的SNP可作为重要的分子遗传标记，其中，-1354位的GG基因型和-1343位的AA基因型，可作为II型糖尿病早期筛查和诊断的重要指征。

SEQUENCE LISTING

<110>武汉科技大学

<120>用于检测II型糖尿病易感基因CREB1单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法及应用

<160> 4

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400> 1

CCTGGAGTACCAGGAAGGACAGC 23

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400> 2

TTACACGTATGAGCCACC 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400> 3

TGGGAGGTGGGACATGAAAG 19

<210> 4

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

400> 4

TCAGAGGTCTCTCAGGACGG 20

Claims

1.聚合酶链式反应引物对P在制备糖尿病检测产品中的应用，其特征在于，所述的聚合酶链式反应引物对P为：

上游引物P-F：5’-CCTGGAGTACCAGGAAGGACAGC-3’23nt；

下游引物P-R：5’-TTACACGTATGAGCCACC-3’18nt；

引物对P进行PCR扩增后，将产物一分为二，一部分PCR产物用限制性内切酶Hha I进行消化，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定CREB1基因第-1354位的碱基多态性；另一部分PCR产物用限制性内切酶Xsp I进行消化，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定CREB1基因第-1343位的碱基多态性。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的PCR扩增条件是：20μL反应体系，包括0.625U Taq DNA聚合酶，2×Buffer 10μL，0.45μL基因组DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL和灭菌超纯水8.3μL；

所述的PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸35s，35个循环；72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的浓度都为3.0％。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测到的人CREB1基因启动子区多态性为：基因组第-1354位T>G突变；基因组第-1343位T>A突变。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过电泳判定CREB1基因第-1354位的碱基多态性为：TT基因型表现为161bp条带；TG基因型表现为161、139和22bp条带；GG基因型表现为139和22bp条带。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过电泳判定CREB1基因第-1343位的碱基多态性为：AA基因型表现为161bp条带；AT基因型表现为161、125和36bp条带；TT基因型表现为125和36bp条带。