CN103205485A - 一种检测蜡样芽孢杆菌核苷酸的方法及检测用引物和探针 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测蜡样芽孢杆菌核苷酸的方法及检测用引物和探针，属于生物检测技术领域。本发明根据蜡样芽孢杆菌基因组序列设计的引物特异性好，用于荧光PCR检测的灵敏度高。本发明检测方法准确性高，灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有蜡样芽孢杆菌，为各种乳制品中蜡样芽孢杆菌的病原学诊断及鉴别诊断提供了科学依据。

Description

一种检测蜡样芽孢杆菌核苷酸的方法及检测用引物和探针

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种检测蜡样芽孢杆菌核苷酸的方法及检测用引物和探针。 

背景技术

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种好氧、中温、产芽孢的革蓝氏阳性杆菌，广泛存在于土壤、水和空气尘埃中。菌株种类繁多，有益生菌株、低毒菌株和少数高毒力菌株，高毒力株常导致食物中毒事件暴发，是常见的食品污染菌。菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，1.0～1.2×3.0～5.0微米。产芽孢，芽孢圆型或柱形，中生或近中生，孢囊无明显膨大。无荚膜，运动。菌落大，表面粗糙，扁平，不规则。蜡状芽孢杆菌同苏芸金芽孢杆菌，炭疽孢杆菌组成蜡状芽孢杆菌群，它们的形态特征，生理生化特征相似度高，并有极高的DNA同源性。蜡状芽孢杆菌细菌对上界有害因子抵抗力强，分布广，是典型的菌体细胞，有部份菌株能产生肠毒素，可引起呕吐型和腹泻型两种不同类型的食物中毒，主要的食物有米饭、乳类、禽畜肉类、水果汁、发酵食品等。资料表明，B.cereus是北欧最常见的食物中毒致病菌之一，在我国B.cereus引起的食物中毒也很常见。腹泻型食物中则为多种肠毒素的作用结果，因此，除了要监测食物中蜡芽孢杆菌的数量外，了解其致病性也为极其重要。 

目前对该类蜡样芽孢杆菌的检测主要采用传统的细菌分离及生化鉴定方法，该方法费力，需要长时间进行选择性增菌过程，是一项费时费力的工作。另外，以蜡状芽孢杆菌营养体、芽孢表面抗原是免疫检测法可进行特异性检测。芽孢表面抗原是免疫快速检测的基础，但是血清试验很大程度上受到多克隆和单克隆抗体与其他抗原发生交叉反应的影响。 

发明内容

为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种检测蜡样芽孢杆菌核苷酸所用的检测引物和探针。 

本发明的另一目的在于提供所述检测蜡样芽孢杆菌核苷酸的方法。本发明所用的方法用于蜡样芽孢杆菌实时荧光RT-PCR检测，使得能够快速简单地判断样品是否有蜡样芽孢杆菌，为各种乳制品中致病菌检测提供了技术模式。 

一种检测蜡样芽孢杆菌核苷酸所用的检测引物和探针： 

分析已报道蜡样芽孢杆菌基因组序列，分别设计检测引物及荧光探针； 

所述的检测引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如下： 

检测正向引物BcF：5’-CATTCGTTCGCTGTGTGAACA-3’ 

检测反向引物BcR：5’-CCAACTTCAACCACAGGACAAA-3’ 

所述的荧光探针序列为： 

荧光探针BcY序列：5’-AGCCACCTAGCACACACGCCCAGA-3’ 

该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。 

所述的报告荧光染料优选为Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5中的一种； 

所述的淬灭荧光染料优选为Tamra、Rox、Dabcy1、BHQ1或BHQ2中的一种； 

所述的检测蜡样芽孢杆菌核苷酸的方法，通过下述技术方案实现： 

（1）制备蜡样芽孢杆菌DNA模板 

将待检的含蜡样芽孢杆菌液用酚-氯仿法抽提基因组DNA，制备蜡样芽孢杆菌DNA模板。 

（2）进行实时荧光RT-PCR反应 

以步骤（1）中制备获得的蜡样芽孢杆菌DNA模板，进行实时荧光RT-PCR反应，即在25μL反应体系加入2.5μL10×PCR Buffer,2μL dNTP（各2.5mM），正向引物BcF和反向引物BcR（10μM）各1.5μL，0.5μL探针BcY（10μM），0.5μL Taq酶，5μL DNA，11.5μL RNase Free dH₂O。 

反应条件为95℃变性3min；以95℃反应5s，60℃反应40s扩增45个循环；在实时荧光PCR仪中反应，反应结束即可根据扩增曲线判定是否有蜡样芽孢杆菌。 

本发明的原理： 

根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记的探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增 强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对蜡样芽孢杆菌的检测。 

相对于现有技术，本发明具有如下优点： 

本发明根据蜡样芽孢杆菌基因组序列设计的引物特异性好，用于荧光PCR检测的灵敏度高。本发明检测方法准确性高，灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有蜡样芽孢杆菌，为各种乳制品中蜡样芽孢杆菌的病原学诊断及鉴别诊断提供了科学依据。 

附图说明

图1是实时荧光RT-PCR技术检测蜡样芽孢杆菌核酸的特异性实验的检测结果图； 

图2是本发明检测方法的灵敏度实验的检测结果图。 

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。 

实施例1 

一种检测蜡状芽孢杆菌的方法，按照以下步骤进行： 

1.引物与探针的设计及合成 

从NCBI数据库下载所有的蜡样芽孢杆菌基因组序列，通过对序列的比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段SEQ ID NO.4，利用生物软件Primer Express3.0针对该区段设计引物和Taqman探针。并通过NCBI数据库进行了Blast同源性比对验证，确保序列与其他物种无交叉。设计的引物序列为： 

正向引物：5’-CATTCGTTCGCTGTGTGAACA-3’ 

反向引物：5’-CCAACTTCAACCACAGGACAAA-3’ 

探针的序列为：5’-AGCCACCTAGCACACACGCCCAGA-3’ 

该探针的5’端用报告荧光染料VIC标记，3’端用淬灭荧光染料BHQ2标记。 

2.DNA的提取 

将待检的蜡样芽孢杆菌培养液用酚-氯仿法抽提基因组DNA。具体步骤如 下： 

将待检的蜡样芽孢杆菌液（约1ml）加入1.5ml的离心管中,12000rpm离心5分钟.去上清；加入DNA裂解液700ul，充分混匀重悬，水浴煮沸5分钟；加入等体积的酚-氯仿（V/V=1：1）溶液，充分混匀后离心，13000rpm离心5分钟；将上清液入另一个1.5ml的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，13000rpm离心5min;将上清移入另一个1.5ml的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心5分钟；弃上清后用70%乙醇冲洗，13000rpm离心5分钟，小心吸弃上清，倒置晾干；在干燥后的离心管中加入50ul无RNase水充分混匀，制备获得DNA模板，待用。 

3.Real-time PCR体系的建立和优化 

引物浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将蜡样芽孢杆菌的引物浓度分别从0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比连续稀释，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.4μmol/L。 

镁离子浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将MgCl₂的浓度从1mmol/L至10mmol/L以1mmol/L递增，经过多次重复实验选定5mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。 

Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化：通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果，选定5U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。 

dNTPs浓度的优化：通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选1mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。 

探针浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将蜡样芽孢杆菌的探针浓度分别从0.1μmol/L至0.5μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.2μmol/L。 

利用上述步骤1中设计合成的引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的蜡样芽孢杆菌实时荧光RT-PCR反应体系为25μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。 

表1蜡样芽孢杆菌实时荧光RT-PCR反应中的各组分情况 

组分	25μL体积	终浓度
			10×PCR Buffer	2.5	1×
dNTPs（各2.5mM）	2	0.4mM
			正、反向引物（各10μM）	各1.5	0.6μM
探针（10μM）	0.5	0.2μM

[0049] 

Taq酶	0.5	2.5U
			DNA	5
RNase Free dH2O	11.5

实验中使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。根据检测样本来源不同，应适当调整模板加量。 

4.实时荧光RT-PCR反应条件 

将样品管放入ABI公司7500荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：95℃变性3min；以95℃反应5s，60℃反应40s扩增45个循环（收集荧光）。反应结束后根据曲线判定结果。 

蜡样芽孢杆菌核酸Real-time PCR方法的特异性确定： 

利用建立起的荧光RT-PCR反应系对10株不同的菌进行检测（4株蜡状芽孢杆菌，3株苏芸金芽孢杆菌和3株炭疽孢杆菌），检测结果如图1所示，4株蜡状芽孢杆菌均出现相应的特异性荧光扩增曲线（参见图1中所指），呈阳性反应。而其它3株苏芸金芽孢杆菌和3株炭疽孢杆菌则均没有荧光信号产生（参见图中1所指），判为阴性。结果表明，所设计的引物探针只对蜡状芽孢杆菌特异，与其它检测对象无交叉反应。 

试验结果： 

以蜡状芽孢杆菌的DNA为模板，通过实时荧光RT-PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，而其它病菌的荧光强度没有变化。 

灵敏度实验： 

将步骤2中提取的DNA用DEPC处理的水梯度稀释成5.0×10⁷、5.0×10⁶、5.0×10⁵、5.0×10⁴、5.0×10³、5.0×10²、5.0×10¹拷贝数/mL，进行相对灵敏度检测，检测结果如图2所示，结果证实蜡状芽孢杆菌检测的最低检测限均达到500个模板拷贝。 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (4)

1.一种检测蜡样芽孢杆菌核苷酸所用的检测引物和探针，其特征在于： 

所述的引物的核苷酸序列为： 

检测正向引物BcF：5’-CATTCGTTCGCTGTGTGAACA-3’ 

检测反向引物BcR：5’-CCAACTTCAACCACAGGACAAA-3’； 

所述的荧光探针序列为： 

荧光探针BcY序列：5’-AGCCACCTAGCACACACGCCCAGA-3’； 

所述荧光探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。 

2.根据权利要求1所述的检测蜡样芽孢杆菌核苷酸所用的检测引物和探针，其特征在于：所述的报告荧光染料为Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3或Cy5中的一种。 

3.根据权利要求1所述的检测蜡样芽孢杆菌核苷酸所用的检测引物和探针，其特征在于：所述的淬灭荧光染料为Tamra、Rox、Dabcy1、BHQ1或BHQ2中的一种。 

4.权利要求1所述的检测引物和探针所应用的蜡样芽孢杆菌核苷酸的检测方法，其特征在于：通过下述技术方案实现： 

（1）制备蜡样芽孢杆菌DNA模板 

将待检的含蜡样芽孢杆菌液用酚-氯仿法抽提基因组DNA，制备蜡样芽孢杆菌DNA模板； 

（2）进行实时荧光RT-PCR反应 

以步骤（1）中制备获得的蜡样芽孢杆菌DNA模板，进行实时荧光RT-PCR反应，25μL反应体系为：2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP（各2.5mM），正向引物BcF（10μM）1.5μL，反向引物BcR（10μM）1.5μL，0.5μL荧光探针BcY（10μM），0.5μL Taq酶，5μL DNA，11.5μL RNase Free dH₂O； 

反应条件为95℃变性3min；以95℃反应5s，60℃反应40s扩增45个循环；在实时荧光PCR仪中反应，反应结束即可根据扩增曲线判定是否有蜡样芽孢杆菌。 

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