CN113136429A - Idh1或idh2基因突变的检测试剂盒与检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种IDH1或IDH2基因突变的检测试剂盒与检测方法，包括用于检测的crRNA，其中IDH1基因R132H突变位点的crRNA：其序列如SEQID NO.5‑6任一所示；IDH2基因R172K突变位点的crRNA：其序列如SEQ IDNO.7‑8任一所示。本发明基于胶质瘤相关分子标志物IDH1基因R132H突变位点和IDH2基因R172K突变位点，分别设计了相应的crRNA，并进行筛选验证，同时结合CRISPR‑Cas12a系统，可在短时间内检测待测样本中是否存在相应的IDH1/2基因突变，进而实现对胶质瘤的辅助诊断治疗，操作简单、检测速度快、成本低，且灵敏度和特异性也显著提高。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种胶质瘤相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法。
背景技术
脑胶质瘤是源自神经上皮的肿瘤的统称，占颅脑肿瘤的40％～50％，是最常见的原发性颅内肿瘤，其占所有脑肿瘤的81％，其中高级别胶质瘤预后很差。胶质母细胞瘤(GBM)是最具侵袭性的胶质瘤，其5年生存率仅为5.5％。2018年美国有新发胶质瘤约12760例。
IDH(异柠檬酸脱氢酶)是一类在三羧酸循环中起重要作用的酶家族，这些酶参与三羧酸循环，通过氧化脱羧作用催化异柠檬酸盐产生α-酮戊二酸(α-KG)。在需氧有机体中，三羧酸循环是代谢途径的一部分，通过碳水化合物、蛋白质、脂肪的化学转化形成二氧化碳、水及机体所需能量。人类基因共有5种IDH基因(IDH1和IDH2为同源基因)编码3种不同的IDH酶，根据其辅酶的不同可分为NADP依赖性(IDH1和IDH2)和NAD依赖性(IDH3)。其中IDH1和IDH2在许多细胞功能中起重要作用，并且还被证明可通过减少细胞培养物中的DNA氧化损伤和脂质过氧化来防止复制性衰老。野生型IDH1和IDH2在应对各种细胞损伤而应对氧化应激的程度方面起着重要作用。而在大多数WHOⅡ、Ⅲ级胶质瘤中，都发现了存在IDH1/2突变，其中IDH1最常见的突变位点是R132H，其他突变发生的频率较低，IDH2最常见的突变则是R172K错义替换。研究表明，IDH1和IDH2突变被认为是胶质瘤发生的早期事件，较低级别胶质瘤中更常见，并且其中IDH突变型患者比IDH野生型患者预后好。临床研究表明，积极有效的放化疗可使IDH突变型胶质瘤患者获得较好的疗效。据报道，IDH1突变型恶性星形细胞瘤在最大范围手术切除也可改善预后。因此，对于IDH1或IDH2基因突变状态的检测已成为辅助肿瘤诊断和治疗的重要手段之一，并且在术中快速判定IDH突变也是十分必要的。由于荧光检测具有灵敏度高，选择性好等优点，因此现阶段临床一般都是通过荧光定量PCR检测的方法进行IDH突变的检测，如专利CN111705131 A公开了一种检测人IDH1或IDH2基因突变的PCR试剂盒，其中包括核酸扩增试剂IDH1R132H反应液和IDH2R172K反应液以及对照品，反应液中分别含有用于检测IDH1R132H和IDH2R172K突变的特异性引物和TaqMan荧光探针，以实现IDH突变的荧光定量PCR检测。然而现有的荧光检测设备存在体积大、不方便携带、成本高、需要专业人员操作等问题，因此不能满足室外复杂现场样品及中低端市场的快速实时检测需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种胶质瘤相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法，通过对试剂盒中使用的crRNA进行筛选并结合CRISPR-Cas12a系统，以检测待测样本中是否存在IDH1和/或IDH2基因突变，所述试剂盒及检测方法不仅操作简单、检测速度快、成本低，同时检测灵敏度和检测特异性也显著提高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种用于检测IDH1或IDH2基因突变的crDNA，所述crDNA包括：
IDH1基因R132H突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.1-2任一所示；
IDH2基因R172K突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.3-4任一所示。
本发明还提供了一种用于检测IDH1或IDH2基因突变的crRNA，所述crRNA包括：
IDH1基因R132H突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.5-6任一所示；
IDH2基因R172K突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.7-8任一所示。
本发明还提供了一种IDH1和/或IDH2基因突变的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述crDNA或crRNA。
进一步的，所述检测试剂盒还包括Cas12a蛋白和荧光探针。
进一步的，所述Cas12a蛋白为FnCas12a蛋白。
进一步的，所述荧光探针序列的5’端标记有荧光基团，3’端标记有猝灭基团。
进一步的，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的任一种，所述猝灭基团选自TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的任一种。
本发明还提供了上述crDNA或crRNA或检测试剂盒在检测IDH1或IDH2基因突变的非疾病诊断和治疗目的上的用途。
本发明还提供了一种胶质瘤相关分子标志物基因突变的非疾病诊断和治疗目的的检测方法，所述方法包括如下步骤：
S1、扩增待测样本的核酸得到扩增产物；
S2、将所述的扩增产物、权利要求2所述的crRNA、Cas12a蛋白、荧光探针和无酶水构成的检测体系进行检测。
进一步的，将所述检测体系孵育后利用胶体金试纸进行检测或测定荧光值变化。通过胶体金试纸进行可视化检测时，将孵育后的检测体系加至胶体金试纸的检测区，通过检测线的有无确定检测结果，操作简便快速，使用范围广泛。也可将孵育后的检测体系利用荧光检测仪检测反应前后的荧光变化，进而判断待测样本中是否含有本发明所述的叶酸代谢相关分子标志物基因突变的基因。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种用于检测IDH1或IDH2基因突变的crDNA、crRNA及包含所述crDNA或crRNA的检测试剂盒及检测方法。本发明基于胶质瘤相关分子标志物IDH1基因R132H突变位点和IDH2基因R172K突变位点，分别设计了相应的crRNA，并对crRNA进行筛选验证，同时结合CRISPR-Cas12a系统，可在短时间内通过荧光信号的变化或者胶体金试纸上检测线的有无，检测待测样本中是否存在相应的IDH1/2基因突变，进而实现对胶质瘤的辅助诊断治疗。所述试剂盒及检测方法操作简单、检测速度快、成本低、可多次重复检测，可满足室外复杂现场样品及中低端市场的快速实时检测需求，同时检测灵敏度和检测特异性也显著提高：
其中在对IDH1基因R132H突变位点的检测中，反应进行到1h时，突变型基因的荧光信号显著高于野生型基因，该方法可以区分10拷贝突变株与104拷贝野生株，灵敏度高于普通PCR；
在对IDH2基因R172K突变位点的检测中，反应进行到1h时，突变型基因的荧光信号显著高于野生型基因，该方法可以区分10拷贝突变株与104拷贝野生株，灵敏度高于普通荧光PCR。
附图说明
图1为本发明实施例3中IDH1基因R132H突变位点的2个crRNA的筛选检测结果；
图2为本发明实施例3中IDH2基因R172K突变位点的2个crRNA的筛选检测结果；
图3为本发明实施例3中IDH1 R132H突变位点的特异性检测结果；
图4为本发明实施例3中IDH2 R172K突变位点的特异性检测结果；
图5为本发明实施例4中IDH1 R132H突变位点的灵敏度试验检测结果；
图6为本发明实施例4中IDH2 R172K突变位点的灵敏度试验检测结果；
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1靶向基因突变位点crRNA的设计及获得
(1)靶向基因突变位点crRNA设计原则
由于CRISPR-Cas12a系统是一种新型的靶向DNA基因编辑系统，其中Cas12a与crRNA结合形成监测复合物，crRNA的向导区域用互补序列识别目标DNA，并且Cas12a降解目标DNA链。其中所述crRNA设计要求：crRNA包括蛋白锚定序列和向导序列，序列格式为：5`-与Cas12a蛋白结合的锚定序列-crRNA向导序列-3`，蛋白锚定序列需要根据Cas12a蛋白来确定，使其能够与选定的Cas12a蛋白匹配并结合；向导序列则与靶向DNA中的片段匹配。
(2)crDNA序列的选择
本发明中选用的Cas12a蛋白为FnCas12a，因此选定与Cas12a蛋白结合的锚定序列为AAUUUCUACUGUUGUAGAU(如SEQ ID NO.9所示)；所述crRNA向导序列根据现有技术已知的IDH1基因R132H突变位点以及IDH2基因R172K突变位点区域设计，每个突变位点设计了两个相应的crDNA，其序列具体为：
IDH1基因R132H突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.1-2任一所示；
IDH2基因R172K突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.3-4任一所示。
(3)crRNA的获得
将所得的3个突变位点的crDNA片段分别在T7 RNA聚合酶(转录反应体系如表1所示)作用下生成RNA，回收纯化得到crRNA。
表1转录反应体系
所得crRNA为：
IDH1基因R132H突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.5-6任一所示；
IDH2基因R172K突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.7-8任一所示。
实施例2IDH1和IDH2基因突变的检测试剂盒及检测方法
1、试剂盒的组成
本试剂盒包括如实施例1所示获得的IDH1基因R132H突变位点和/或IDH2基因R172K突变位点的各2个crRNA或crDNA(当试剂盒中为crDNA时，需要操作者先将crDNA片段分别在T7 RNA聚合酶作用下生成RNA，回收纯化得到crRNA，具体见实施例1)、一条特异性荧光探针(如表2所示)、Cas12a蛋白(本实施例采用的是FnCas12a)、无酶水、DNA酶抑制剂；
表2荧光探针序列
| 荧光探针 | 序列(5’-3’) |
| 探针1 | FAM-TTTTTTTT-BHQ1 |
| 探针2 | FAM-TTTTTTTTTT-BHQ1 |
| 探针3 | FAM-TTTTTTTTTTTT-BHQ1 |
进一步的，所述试剂盒中还可包括扩增体系，所述扩增体系包括等温扩增引物对，各突变位点的引物对具体为：
IDH1 R132H突变位点的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.10-11所示；
IDH2 R172K突变位点的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.12-13所示。
2、IDH1和IDH2基因突变的检测方法
(1)取50-100ng待测样本DNA，加至等温扩增体系(RPA扩增体系)中，RPA扩增体系如表3所示，其中所述引物为如上所示的对应的等温扩增引物对。
表3 RPA扩增体系
(2)将所述得到的扩增产物、与所述检测试剂：对应的crRNA、Cas12a蛋白、荧光探针和无酶水按照表4所示的进行混合，得到检测体系。
表4检测体系
用100-250nM纯化的Cas12a，50-100nM crRNA，1-5μL合成的荧光探针，2μL DNA酶抑制剂，5-10μL目的DNA的扩增产物，在检测缓冲液(NEBuffer 3)中37℃孵育1～3小时。同时设立阴性对照组(将扩增产物替换为无酶水)。将所述检测体系孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区进行检测，观察检测线的有无；或者将所述检测体系孵育后利用荧光检测仪测定荧光值，统计分析反应前后荧光值的变化情况，以判断待测待测样本DNA中是否存在相应的IDH1和IDH2基因突变。采用该试剂盒进行检测，操作简单、检测设备小巧便携，无需使用特殊的大型仪器，并且检测时间全程仅1-2h，检测速度快，成本低，可用于床旁检测。
实施例3crRNA对野生型和突变型序列的特异性检测
合成野生株(WT)和突变株(MUT)的靶序列，分别利用实施例1设计的共4个crRNA构建检测体系进行检测筛选。IDH1 R132H突变位点的检测结果如图1所示，其中crRNA1-IDH1为SEQ ID NO.5所示序列，crRNA2-IDH1为SEQ ID NO.6所示序列。IDH2 R172K突变位点的的检测结果如图2所示，其中crRNA1-IDH2为SEQ ID NO.7所示序列，crRNA2-IDH2为SEQ IDNO.8所示序列。根据检测结果，选取相较于野生株在突变株中荧光值变化更显著，即灵敏度更高，效果更优异的crRNA，分别为SEQ ID NO.6所示的crRNA2-IDH1以及SEQ ID NO.7所示的crRNA1-IDH2。通过上述筛选得到效果相对较优的crRNA，用于构建CRISPR-Cas12a系统，并在体外进行切割有效性验证，具体为：
用100-250nM纯化的FnCas12a，250-500nM crRNA，1-5μL合成的荧光探针，2μL DNA酶抑制剂，不同稀释浓度的目的DNA，在检测缓冲液(NEBuffer3)中37℃孵育1～3小时。几组反应混合物同时在便携式检测仪中反应(温度设置为37℃，动力学检测每10min检测一次共1个小时)。使用荧光定量PCR仪检测体系的荧光信号变化。
1、IDH1 R132H突变位点的特异性检测
检测了SEQ ID NO.6所示的crRNA2-IDH1对野生型和突变型序列的检测效果，检测结果如图3所示。图3为IDH1 R132H突变位点的体系荧光值结果。结果显示，加入野生IDH1、不同浓度的IDH1 R132H突变型模板后均出现了荧光信号的升高，其中与crRNA2-IDH1完全匹配的IDH1 R132H突变型模板的信号随着时间的延长，为野生型对照组信号的2到5倍，普遍高于野生型，利用该方法可以区分至少10拷贝突变株与104拷贝的野生株，灵敏度高于普通PCR。
2、IDH2 R172K突变位点的特异性检测
检测了SEQ ID NO.7所示的crRNA1-IDH2对野生型和突变型序列的检测效果，检测结果如图4所示。图4为IDH2 R172K突变位点的体系荧光值结果。结果显示，加入野生IDH2、不同浓度的IDH2 R172K突变型模板后均出现了荧光信号的升高，其中与crRNA1-IDH2完全匹配的IDH2 R172K突变型模板的信号随着时间的延长，为野生型对照组信号的2到5倍，普遍高于野生型，利用该方法可以区分至少10拷贝突变株与104拷贝的野生株，灵敏度高于普通PCR。
综上，结果显示本发明设计的crRNA检测靶标DNA的体系荧光值变化趋势均显著高于阴性对照，即本发明所述的用于检测胶质瘤相关分子标志物IDH1和IDH2基因突变的2个crRNA可以分别特异性地检测出对应的突变序列。
实施例4crRNA对野生型和突变型序列的电泳检测灵敏性试验
检测实施例3筛选得到的效果相对较优的2个crRNA在进行琼脂糖凝胶电泳时的灵敏度，具体为：
1、IDH1 R132H突变位点的crRNA的灵敏度检测
将IDH1 R132H突变质粒梯度稀释后作为模板进行PCR扩增并构建检测体系，随后用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图5所示。阴性对照(即0copies/μL)无条带，说明扩增过程中无污染；模板浓度在102copies/μL至105copies/μL时，均可观察到位于250-500bp之间的单一电泳条带，条带清晰且与目的条带大小(318bp左右)一致，说明利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物时，其灵敏度可达到103copies/μL左右。
2、IDH2 R172K突变位点的crRNA的灵敏度检测
将IDH2 R172K突变质粒梯度稀释后作为模板进行PCR扩增并构建检测体系，随后用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图6所示。阴性对照(即0copies/μL)无条带，说明扩增过程中无污染；模板浓度在103copies/μL至105copies/μL时，均可观察到位于250-500bp之间的单一电泳条带，条带清晰且与目的条带大小(342bp左右)一致；而当模板浓度为102copies/μL时则观察不到扩增条带，说明利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物时，其灵敏度可达到102copies/μL左右。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏博嘉生物医学科技有限公司
<120> IDH1或IDH2基因突变的检测试剂盒与检测方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catcataggt catatctaca acagtagaaa ttaccctata gtgagtcgta ttaatttc 58
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctatcatca taggtcatat ctacaacagt agaaattacc ctatagtgag tcgtattaat 60
ttc 63
<210> 3
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accaagccca tcaccattgg caagatctac aacagtagaa attaccctat agtgagtcgt 60
attaatttc 69
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagcccatca ccattggcaa gatctacaac agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60
aatttc 66
<210> 5
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggguaauuuc uacuguugua gauaugaccu augaug 36
<210> 6
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggguaauuuc uacuguugua gauaugaccu augaugauag g 41
<210> 7
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggguaauuuc uacuguugua gaucuugcca auggugaugg gcuuggu 47
<210> 8
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggguaauuuc uacuguugua gaucuugcca auggugaugg gcuu 44
<210> 9
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aauuucuacu guuguagau 19
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgcagaagc tataaagaag cataatgttg 30
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaataaaaca catacaagtt ggaaatttct gg 32
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agtgggacca ctattatctc tgtcctc 27
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atcttttggg gtgaagacca ttttg 25
Claims (10)
1.一种用于检测IDH1或IDH2基因突变的crDNA，其特征在于，所述crDNA包括：
IDH1基因R132H突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.1-2任一所示；
IDH2基因R172K突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.3-4任一所示。
2.一种用于检测IDH1或IDH2基因突变的crRNA，其特征在于，所述crRNA包括：
IDH1基因R132H突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.5-6任一所示；
IDH2基因R172K突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.7-8任一所示。
3.一种IDH1和/或IDH2基因突变的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的crDNA和/或权利要求2所述的crRNA。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括Cas12a蛋白和荧光探针。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述Cas12a蛋白为FnCas12a蛋白。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针序列的5’端标记有荧光基团，3’端标记有猝灭基团。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的任一种，所述猝灭基团选自TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的任一种。
8.如权利要求1所述的crDNA或权利要求2所述的crRNA或权利要求3所述的检测试剂盒在检测IDH1或IDH2基因突变的非疾病诊断和治疗目的上的用途。
9.一种胶质瘤相关分子标志物基因突变的非疾病诊断和治疗目的的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、扩增待测样本的核酸得到扩增产物；
S2、将所述的扩增产物、权利要求2所述的crRNA、Cas12a蛋白、荧光探针和无酶水构成的检测体系进行检测。
10.如权利要求9所述的的检测方法，其特征在于，将所述检测体系孵育后利用胶体金试纸进行检测或测定荧光值变化。
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