CN102732633A

CN102732633A - 人idh基因突变的检测引物和试剂盒

Info

Publication number: CN102732633A
Application number: CN2012102347366A
Authority: CN
Inventors: 吴岚晓; 曾庆; 姚飞; 谭杰锋
Original assignee: HELIXGEN (GUANGZHOU) CO Ltd
Current assignee: HELIXGEN (GUANGZHOU) CO Ltd
Priority date: 2012-07-06
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2032-07-06
Also published as: CN102732633B

Abstract

本发明公开了一种人IDH基因突变的检测引物和检测试剂盒，用于PCR与高分辨率熔解曲线分析技术联用。本发明检测试剂盒可用于检测IDH1和IDH2基因外显子4上的基因突变，检测样本为肿瘤组织、血液或骨髓细胞提取的人类基因组DNA，用于临床脑胶质瘤和血液病患者，辅助肿瘤诊断、治疗及判断预后。本发明检测试剂盒的操作简单快捷，检测效果好。

Description

人IDH基因突变的检测引物和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种生物检测试剂，更具体的说，本发明涉及一种人IDH基因突变(包括IDH1基因和IDH2基因)的检测引物和试剂盒。

背景技术

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是三羧酸循环中一种关键性限速酶，在细胞氧化损伤反应中发挥着重要的调控作用。自2008年IDH基因被发现在胶质瘤中突变以来，迅速成为研究热点。IDH基因突变可作为诊断胶质瘤的一个特异性指标，是胶质瘤分级判断和鉴别的有效分子标记，并可作为判断胶质瘤患者预后的独立因素。IDH突变还发生于少数白血病及骨髓增殖性疾病(MPD)等多种血液病中。

人类IDH有IDH1、IDH2和IDH3三个亚家族，IDH1位于胞浆和过氧化物酶体内，IDH2和IDH3酶位于线粒体内，参与三羧酸循环并提供能量。目前，仅发现IDH1和IDH2基因存在突变。IDH1基因位于染色体2q33.3，目前发现的IDH1基因突变都发生在第四外显子的R132位，共发现了六种突变类型(包括R132H，R132C，R132S，R132G，R132L，R132V)，IDH2基因位于染色体15q26.1，目前发现的IDH2基因突变发生在第四外显子的R140(包括R140W，R140L和R140Q三种)和R172(包括R172K，R172M，R172G，R172S和R172W五种)。

由于临床对IDH突变检测诊断作用的极大兴趣，当前德国已出现了商业化的对IDH1R132H高度特异的单克隆抗体，可实现在常规免疫组化中对突变基因编码的蛋白进行特异性检测。由于可以简单纳入常规组织病理学工作，该抗体在德国临床诊断中得到了广泛应用。但是，针对其他类型的IDH1突变(R132C，R132S，R132L，R132G)以及IDH2突变的单克隆抗体尚未商业化生产。用单克隆抗体检测突变为突变表型检测，通过检测突变基因的表达蛋白来检测基因突变，但由于受到肿瘤细胞基因表达调控的影响，常常不能真实反映基因突变情况。因此，现阶段，考虑到胶质瘤中IDH突变与预后密切相关，学者们推荐所有免疫组化为阴性的患者还需通过基因检测的方法来判断IDH基因是否存在突变。

目前，对基因检测突变的分析的技术方法主要包括：测序、限制性片段长度多态性方法(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、变性高效液相色谱(DHPLC)、荧光定量PCR法、基因芯片、液相芯片等方法。这些方法都有各自的优点和缺陷，尚有待改进和标准化。

1.直接测序：Sanger测序法因为可以读到DNA每个碱基的变化，目前被认为是检测基因突变的金标准方法。但是，因为灵敏度低(检测突变灵敏度约为20%)，检测异质性较高的临床肿瘤组织样本时假阴性率高。同时，测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高，检测周期长，多限于在科研单位进行，大多数医院都无法独立完成检测，不易于形成标准化操作、适合临床单位应用的体外诊断产品。

2.荧光定量PCR法：通过序列特异性探针实现基因突变检测，该方法灵敏度高、特异性好，是目前基因检测体外诊断试剂最常用的技术平台。但是，该方法需荧光标记的特异性探针，一种探针只能进行一种基因突变类型的检测，因此检测试剂成本高，检出突变种类少，操作相对复杂。对突变类型较多的IDH基因，该方法并不十分合适。目前，尚未开发成功基于该方法的检测IDH基因突变的试剂盒。

3.限制性片段长度多态性方法(RFLP)：该方法成本低，对检测设备要求低，突变基因的检出限在5~10%。但是，劳动强度稍大、需专业的技术人员、不适于高通量检测和大规模临床应用。

4.SSCP、DHPLC、基因芯片、液相芯片等方法操作复杂、对设备要求高，仅在科研单位实验室应用，不适合大范围推广使用。

发明内容

本发明的目的在于：解决现有技术的不足，提供一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的人IDH基因突变的检测引物。

本发明的另一目的在于：解决现有技术的不足，提供一种操作简单快捷、检测效果更全面、特异性高、漏检率低的人IDH基因突变的检测试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种人IDH基因突变检测引物对，用于PCR与高分辨率熔解曲线分析技术联用，所述引物对为

IDH1f：ACCAAATGGCACCATACGA(SEQ ID NO：1)，

IDH1r：TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT(SEQ ID NO：2)；

或

IDH2f：AGTCCCAATGGAACTATCCG(SEQ ID NO：3),

IDH2r:AAGCCAGCCTCACCTCGTC(SEQ ID NO：4)。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种人IDH基因突变检测的试剂盒，用于PCR与高分辨率熔解曲线分析技术联用，所述试剂盒包括引物对

IDH1f：ACCAAATGGCACCATACGA(SEQ ID NO：1)，

IDH1r：TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT(SEQ ID NO：2)；

或

IDH2f：AGTCCCAATGGAACTATCCG(SEQ ID NO：3),

IDH2r:AAGCCAGCCTCACCTCGTC(SEQ ID NO：4)。

优选的，所述试剂盒还包括突变对照标准品和野生对照标准品。

优选的，所述试剂盒包括反应液，反应液含有PCR缓冲液、dNTP混合液、MgCl₂、引物对、DNA聚合酶、荧光染料和去DNA酶蒸馏水。

更优选的，所述反应液各组分的反应浓度为PCR缓冲液2×、dNTP混合液各0.4-0.8mM、MgCl₂1.0-5.0mM、引物对各0.5-0.8μM、DNA聚合酶0.2-0.6U/μL、荧光染料2×，去DNA酶蒸馏水加至配制2×检测反应液总体积。

本发明采用的核心技术--高分辨率熔解曲线(HRM)分析技术是近年来兴起的一种用于鉴别基因序列差异的分析方法。检测原理是运用PCR方法特异性扩增IDH基因片段，继之用HRM法分析扩增片段的差异，在HRM分析步骤中，由于反应体系中使用了一种小分子荧光饱和染料，使突变导致的DNA分子熔解温度的微小差异都能突显出来。这种DNA分析技术以野生型基因组DNA为参照，能分辨出待检测样本中是否含有突变型基因，具有极高的灵敏度和准确性。该技术不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，特别适用于突变位点较集中且临床上无需区分具体突变类型的突变检测，检测突变灵敏度高于传统测序。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)特异性引物的设计：针对IDH1和IDH2基因突变位点，设计所扩增序列包含突变位点、扩增特异性和扩增效率高的PCR引物，且扩增目的片段不包含影响HRM分析的其他突变位点或SNP位点，以保证扩增出的PCR产物在进行HRM分析时的分辨率和准确度。

(2)对PCR反应及HRM分析的各个条件进行优化，PCR扩增的非特异性产物的比例要求控制的尽可能低，以保证HRM分析的准确度，同时，野生型与突变型分子的熔解曲线差异达到最大化，从而最大限度地提高分析灵敏度。

本发明的检测引物和相应的检测试剂盒不受突变类型局限，无需序列特异性探针，可以检测IDH1和IDH2基因外显子4上发生的所有突变类型。在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变的分析。操作简便快速，成本低，灵敏度、特异性好，结果准确，为临床IDH基因突变检测提供一种便利有效的新手段，辅助肿瘤诊断、治疗及判断预后。

附图说明

图1(a)为本发明实施例1中样本中不含IDH1基因第4外显子突变的HRM分析图；

图1(b)为本发明实施例1中样本中有含IDH1基因第4外显子R132H突变的HRM分析图；

图1(c)为本发明实施例1中样本中有含IDH1基因第4外显子R132C突变的HRM分析图；

图1(d)为本发明实施例1中样本中有含IDH1基因第4外显子R132S突变的HRM分析图；

图2(a)为本发明实施例2中样本中不含IDH2基因第4外显子突变的HRM分析图；

图2(b)为本发明实施例2中样本中有含IDH2基因第4外显子R140W突变的HRM分析图；

图2(c)为本发明实施例2中样本中有含IDH2基因第4外显子R140L突变的HRM分析图；

图2(d)为本发明实施例2中样本中有含IDH2基因第4外显子R172K突变的HRM分析图；

图3(a)为本发明实施例4中样本IDH1基因第4外显子的扩增曲线图；

图3(b)为本发明实施例4中PCR产物熔解峰分析图。

具体实施方式

检测人IDH基因突变的检测方法，包括以下步骤：

1.提取石蜡包埋肿瘤组织或外周血、骨髓基因组DNA，将DNA浓度调整到2-10ng/μL。

2.样本DNA IDH1和IDH2基因外显子4的特异性扩增：

①反应体系的配制：

注：在样本检测时，同步设置野生对照和突变对照。

②PCR条件：在95℃预变性3-5分钟，然后以95℃10-15秒、62℃30-45秒进行50次循环。

③2×检测反应液组成：

2×检测反应液组成成分	浓度
		PCR缓冲液(10×)	2×
dNTP混合液(100mM)	各0.4-0.8mM
		MgCl₂(25mM)	1.0-5.0mM
IDH1或IDH2上下游引物(100μM)	各0.5-0.8μM
		DNA聚合酶(5U/μL)	0.2-0.6U/μL
荧光染料(10×)	2×
		去DNA酶蒸馏水	加至配制2×检测反应液总体积

④PCR反应引物：特异性扩增样品中的IDH基因第4外显子基因。IDH1突变检测引物序列为IDH1f：5’-ACCAAATGGCACCATACGA-3’(SEQ ID NO：1)，IDH1r：5’-TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT-3’(SEQ ID NO：2)。IDH2突变检测引物序列为IDH2f：5’-AGTCCCAATGGAACTATCCG-3’(SEQ IDNO：3)，IDH2r:5’–AAGCCAGCCTCACCTCGTC-3’(SEQ ID NO：4)。以上引物由上海生工生物工程有限公司合成。

⑤突变对照标准品和野生对照标准品：IDH1序列信息来源为NCBI ReferenceSequence:NG023319.1，IDH2序列信息来源为NCBI Reference Sequence:NG023302.1。突变型标准品分别包含人类IDH1基因第4外显子R132H突变序列和IDH2基因第4外显子的R140W突变型序列，野生型标准品分别包含IDH1和IDH2基因外显子4野生型序列。由上海生工生物工程有限公司合成。

3.步骤2扩增的样本进行HRM分析：PCR产物经95℃30秒变性和40℃30秒复性后，在75℃到90℃收集荧光。运行HRM自动分析程序，分别与相对应的野生对照参比，分析样本DNA中是否存在IDH1和IDH2基因突变。

为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。实施例1检测试剂盒用于检测脑胶质瘤肿瘤组织是否发生IDH1基因突变

检测试剂盒包括反应液，反应液含有PCR缓冲液、dNTP混合液、MgCl₂、引物对、DNA聚合酶、荧光染料和去DNA酶蒸馏水。引物对为：

IDH1f：ACCAAATGGCACCATACGA(SEQ ID NO：1)，

IDH1r：TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT(SEQ ID NO：2)。

试剂盒还包括突变对照标准品和野生对照标准品。

检测临床采集的脑胶质瘤肿瘤组织样本IDH1基因第4外显子的突变情况。

包括以下步骤：

1.样品处理和基因组DNA提取：接受来自临床手术切除的脑胶质瘤肿瘤组织样品，将肿瘤组织剪碎，按照

DNA Mini试剂盒(凯杰生物技术(上海)有限公司)说明书操作进行基因组DNA提取。将DNA浓度调整到4ng/μL，置于-20℃保存备用。

2.样本DNA IDH1基因的特异性扩增(爱德华科技(Idaho Technology，USA)公司的LightScaner32实时荧光定量PCR仪)：

①反应体系的配制：

注：在样本检测时，同步设置野生对照和突变对照。

②PCR条件：在95℃预变性5分钟，然后以95℃15秒、62℃30秒进行50次循环。

③2×检测反应液组成：

④PCR反应引物：特异性扩增样品中的IDH1因第4外显子基因。IDH1突变检测引物序列为IDH1f：5’-ACCAAATGGCACCATACGA-3’(SEQ ID No：1)，IDH1r：5’-TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT-3’(SEQ ID No：2)。以上引物由上海生工生物工程有限公司合成。

⑤突变对照标准品和野生对照标准品：突变型标准品包含人类IDH1基因第4外显子R132H突变序列突变型序列，野生型标准品包含IDH1基因外显子4野生型序列。由上海生工生物工程有限公司合成。

3.步骤2扩增的样本进行HRM分析(爱德华科技(Idaho Technology，USA)公司的LightScaner32实时荧光定量PCR仪)：PCR产物经95℃30秒变性和40℃30秒复性后，在75℃到90℃收集荧光。运行HRM自动分析程序，与IDH1野生对照参比，分析样本DNA中是否存在IDH1基因突变。

图1(a)为样本中不含IDH1基因第4外显子突变的HRM分析图；图1(b)为样本中有含IDH1基因第4外显子R132H突变的HRM分析图；图1(c)为样本中有含IDH1基因第4外显子R132C突变的HRM分析图；图1(d)为样本中有含IDH1基因第4外显子R132S突变的HRM分析图。用前述的方法共检测100例临床样本，同时采用金标准测序法进行验证。PCR-HRM方法检测与金标准测序方法结果的符合率为100%。

实施例2检测试剂盒用于检测急性粒细胞白血病(AML)骨髓细胞是否发生IDH2基因突变

IDH2f：AGTCCCAATGGAACTATCCG(SEQ ID NO：3),

IDH2r:AAGCCAGCCTCACCTCGTC(SEQ ID NO：4)。

试剂盒还包括突变对照标准品和野生对照标准品。

检测临床AML患者骨髓样本IDH2基因第4外显子的突变情况。

包括以下步骤：

1.样品处理和基因组DNA提取：接受来自临床AML患者抽取的骨髓样品，按照

Blood Mini试剂盒(凯杰生物技术(上海)有限公司)说明书操作进行基因组DNA提取。将DNA浓度调整到2ng/μL，置于-20℃保存备用。

2.样本DNA IDH2基因的特异性扩增(爱德华科技(Idaho Technology，USA)公司的LightScaner32实时荧光定量PCR仪)：

①反应体系的配制：

注：在样本检测时，同步设置野生对照和突变对照。

②PCR条件：在95℃预变性3分钟，然后以95℃10秒、62℃35秒进行50次循环。

③2×检测反应液组成：

④PCR反应引物：特异性扩增样品中的IDH2基因第4外显子基因。IDH2突变检测引物序列为IDH2f：5’-AGTCCCAATGGAACTATCCG-3’(SEQ ID No：3)，IDH2r:5’-AAGCCAGCCTCACCTCGTC-3’(SEQ ID No：4)。以上引物由上海生工生物工程有限公司合成。

⑤突变对照标准品和野生对照标准品：突变型标准品包含人类IDH2基因第4外显子的R140W突变型序列，野生型标准品包含IDH2基因外显子4野生型序列。由上海生工生物工程有限公司合成。

3.步骤2扩增的样本进行HRM分析(爱德华科技(Idaho Technology，USA)公司的LightScaner32实时荧光定量PCR)：PCR产物经95℃30秒变性和40℃30秒复性后，在75℃到90℃收集荧光。运行HRM自动分析程序，与IDH2野生对照参比，分析样本DNA中是否存在IDH2基因突变。

图2(a)为样本中不含IDH2基因第4外显子突变的HRM分析图；图2(b)为样本中有含IDH2基因第4外显子R140W突变的HRM分析图；图2(c)为样本中有含IDH2基因第4外显子R140L突变的HRM分析图；图2(d)为样本中有含IDH2基因第4外显子R172K突变的HRM分析图。用前述的方法共检测100例临床样本，同时采用金标准测序法进行验证。PCR-HRM方法检测与金标准测序方法结果的符合率为100%。

实施例3检测试剂盒的临床试验

以南方医科大学南方医院神经外科为临床试验单位，采用目前基因突变金标准检测方法--Sanger法基因测序作为对照，对本发明试剂盒(即实施例1或实施例2的试剂盒)进行了临床试验研究。

临床试验共检测临床脑胶质瘤石蜡病理切片标本218例，本发明试剂盒与金标准Sanger法基因测序检测结果均阳性者81例，均阴性者135例，其中结果不一致的标本2例。本发明试剂盒的灵敏度(阳性符合率)为100%，特异度(阴性符合率)为98.54%，正确率(总一致率)为99.08%。经一致性检验，Kappa值为0.937，配对设计卡方检验精确p值为1，两种检测方法一致性为优。综上分析,本发明IDH基因突变检测试剂盒在检测临床石蜡包埋脑胶质瘤组织是否存在IDH基因突变上与金标准Sanger基因测序法检测具有很高的一致性,本发明试剂盒可满足临床检测需要。

实施例4本发明引物与文献报道引物的PCR扩增效率和产物特异性比较

本发明特异性扩增IDH1基因第4外显子的引物对为

IDH1f：ACCAAATGGCACCATACGA(SEQ ID NO：1)，

IDH1r：TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT(SEQ ID NO：2)。

包括以下步骤：

1.样品：实施例1步骤1的样本提取的DNA。

2.样本DNA分别采用本发明所述IDH1基因引物和文献报道引物(Journal ofMolecular Diagnostics2010,12(4):487-492.前导链引物为

5’-ACGGTCTTCAGAGAAGC-3’，反义链引物为

5’-GGTGTAGATACCAAAGATAAGAAT-3’)进行IDH1外显子4基因的特异性扩增(爱德华科技(Idaho Technology，USA)公司的LightScaner32实时荧光定量PCR仪)：

①反应体系的配制：

②PCR条件：在95℃预变性5分钟，然后以95℃15秒、62℃30秒进行50

次循环。

图3(a)为样本IDH1基因第4外显子的扩增曲线图，采用本发明引物的PCR扩增CP值小，扩增曲线陡峭，平台期荧光值高，说明本发明引物的扩增效率比文献报道引物扩增效率高。图3(b)为PCR产物熔解峰分析，采用本发明引物扩增产物均为单一熔解峰，说明产物单一，无非特异性扩增，而文献报道的引物扩增产物熔解峰除了主峰外，还出现其他杂峰，说明存在非特异性扩增产物。

应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种人IDH基因突变检测引物对，用于PCR与高分辨率熔解曲线分析技术联用，其特征在于，所述引物对为

IDH1f：ACCAAATGGCACCATACGA，

IDH1r：TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT；

或

IDH2f：AGTCCCAATGGAACTATCCG,

IDH2r:AAGCCAGCCTCACCTCGTC。

2.一种人IDH基因突变检测的试剂盒，用于PCR与高分辨率熔解曲线分析技术联用，其特征在于，所述试剂盒包括引物对

IDH1f：ACCAAATGGCACCATACGA，

IDH1r：TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT；

或

IDH2f：AGTCCCAATGGAACTATCCG,

IDH2r:AAGCCAGCCTCACCTCGTC。

3.根据权利要求2所述的人IDH基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括突变对照标准品和野生对照标准品。

4.根据权利要求2或3所述的人IDH基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反应液，反应液含有PCR缓冲液、dNTP混合液、MgCl₂、引物对、DNA聚合酶、荧光染料和去DNA酶蒸馏水。

5.根据权利要求4所述的人IDH基因突变检测的试剂盒，其特征在于，所述反应液各组分的反应浓度为：PCR缓冲液2×、dNTP混合液各0.4-0.8mM、MgCl₂1.0-5.0mM、引物对各0.5-0.8μM、DNA聚合酶0.2-0.6U/μL、荧光染料2×,去DNA酶蒸馏水加至配制2×检测反应液总体积。