CN105154547A - 一种检测idh1和idh2基因突变的引物与方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测IDH1和IDH2基因突变的引物，其特征在于：包括针对IDH1基因外显子4的上游引物和下游引物，以及针对IDH2基因外显子4的上游引物和下游引物。本发明属于生物检测技术领域，本发明提供的引物可以实现IDH1和IDH2外显子4突变的特异性检测，引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。

Description

一种检测 IDH1 和 IDH2 基因突变的引物与方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种检测IDH1和IDH2基因突变的引物与方法。
背景技术
异柠檬酸脱氢酶1（(IDH1）和异柠檬酸脱氢酶2 (IDH2)分别位于染色体2q33.3和15q26.1，IDH1和IDH2借助NADP作为辅助因子，催化异柠檬酸的氧化脱羧反应生成α-酮戊二酸，参与细胞内氧化损伤的防御。
现有研究表明，IDH1和IDH2基因突变存在于急性髓系白血病(AML)、急性淋巴白血病(ALL)及骨髓增殖性疾病(MPD)患者中。在AML患者中，IDH1、IDH2基因突变的发生频率分别为6.6-9.6%、3.0-10.4%；在核型正常的AML(Cytogenetically normal acute myeloid leukemia, CN-AML)中，IDH1、IDH2基因突变的发生频率分别为10~16%、10~19%。IDH1和IDH2基因突变主要为外显子4上的点突变，常见的突变有IDH1 R132C/R132G/R132S/R132H/R132L/R132P，IDH2 R140G/R140W/R140L/R140Q和IDH2 R172K/R172M/R172S。IDH1和/或IDH2基因突变的CN-AML患者具有较低的完全缓解率(CR)、较高的客观有效率(RR)和较短的总生存期（OS），因此，IDH1和/或IDH2基因突变一般代表较差的预后。
中国专利申请201310365905.4公开了检测IDH1/IDH2基因突变的核苷酸序列，包括ARMS突变特异性引物、Taqman探针和核酸扩增阻滞引物。该专利申请通过核酸扩增阻滞引物和ARMS突变特异性引物相结合，通过荧光PCR实现了IDH1/IDH2基因突变的检测，但存在反应体系复杂，需要多种引物和光定量PCR仪的缺点。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测IDH1和IDH2基因突变的引物与方法，该引物具有特异性好、灵敏度高等优点，实现了检测IDH1和IDH2基因外显子4突变的准确检测。本发明检测的位点包括IDH1基因外显子4和IDH2基因外显子4。
本发明提供一种检测IDH1和IDH2基因突变的引物，其特征在于：包括针对IDH1基因外显子4的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGCCTTCGCTTTCTGCAT(SEQ ID NO.1)和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCTGCAAAATCACATTATTGCCAAC(SEQ ID NO.2)，以及针对IDH2基因外显子4的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGGCTGTGTTGTTGCTTG(SEQ ID NO.3)和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCCTGCCATCTTTTGGGGTGAAG(SEQ ID NO.4)。
优选地，所述引物中，IDH1基因外显子4的上游引物、IDH1基因外显子4的下游引物、IDH2基因外显子4的上游引物和IDH2基因外显子4的下游引物浓度比为1：1：1：1。
相应地，本发明还提供一种检测IDH1和IDH2基因突变的方法，包括如下步骤：A）提取DNA样品；B）采用权利要求1或2中所述的引物进行PCR扩增；C）对扩增产物进行凝胶电泳分析后，采用Sanger测序法检测，对检测结果进行分析。
优选地，所述步骤A）中的DNA样品为EDTA抗凝外周血或骨髓血的DNA样品。
优选地，所述步骤B）中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：63℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，34个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。
优选地，所述步骤C）中，采用Sequencher 4.1.4软件对检测结果进行分析。
此外，本发明还提供检测IDH1和IDH2基因突变的引物在制备检测IDH1和IDH2基因突变试剂中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种检测IDH1和IDH2基因外显子4突变的引物，该引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本发明还提供了一种检测IDH1和IDH2基因突变的方法，通过使用特异性的引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可以为甲磺酸伊马替尼的临床用药提供指导。
附图说明
图1 本发明提供的IDH1基因外显子4引物的扩增片段。
图2 本发明提供的IDH2基因外显子4引物的扩增片段。
图3 PCR扩增产物的凝胶电泳图。
图4 IDH1基因外显子4野生型的部分测序图。
图5 IDH1基因外显子4突变型的部分测序图。
图6 IDH2基因外显子4野生型的部分测序图。
图7 IDH2基因外显子4突变型的部分测序图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一 引物
发明人针对IDH1和IDH2基因外显子4，设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好的引物。
实施例二 引物的特异性
将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting，IDH1基因外显子4引物扩增片段位于chr2:209113061-209113491间，长度为431bp；IDH2基因外显子4引物对扩增片段位于chr15:90631664-90632063 间，长度为400bp;。无其它同源基因，结果如图1至图2所示，与IDH1和IDH2基因参考序列相符。
使用表1中的引物、表2中的PCR扩增体系和表3的PCR扩增条件对检测样品进行扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图3所示。结果显示，扩增产物的特异性高，无非特异性扩增条带产生。
实施例三 IDH1 和 IDH2 基因突变的检测
提取EDTA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit（购自Tiagen，货号：DP318）的说明书，将DNA样品稀释至100ng/μL，备用。
PCR扩增采用Q5™热启动超保真2X Master Mix（购自NEB公司，货号：M0494L），PCR扩增体系如表2所示，PCR扩增条件如表3所示。IDH1基因外显子4的上游引物、IDH1基因外显子4的下游引物、IDH2基因外显子4的上游引物和IDH2基因外显子4的下游引物浓度比为1：1：1：1，IDH1基因外显子4的上游引物浓度、IDH1基因外显子4的下游引物浓度、IDH2基因外显子4的上游引物浓度和IDH2基因外显子4的下游引物浓度都为10p/mol。
对PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图3所示。结果显示，扩增产物的特异性高，无非特异性扩增条带产生。采用BigDye® Terminator v3.1（购自Life公司，货号4336919）对检测样品的PCR扩增产物进行Sanger测序，Sanger测序的操作步骤如下：
A) DNA测序模板处理，加入ExoSAP-IT酶，在ABI 9700PCR仪中，按以下程序进行处理：37 ℃，15 min；80 ℃，15 min；4℃，infinite。
B) 参考BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit操作说明制备测序PCR体系。
C) 在ABI 9700PCR仪中，按以下程序进行处理：
96℃,1 min→(96℃,10 s→50℃,5 s→60℃,4 min) ,25个循环→4℃保温
D) 用酒精/EDTA/NaAc法对测序PCR的产物进行纯化。
E) 室温挥发净酒精，加入10μL Hi-Di Formamide溶解DNA，溶解后的样品需要在95℃变性4 min，迅速置冰中冷却4 min后，上样电泳。
测序结果（仅显示部分）如图4至图7所示，扩增产物的序列与参考序列相符。
实施例四 检测 IDH1 和 IDH2 基因突变的方法的准确性
本检测准确性定义为不同引物检测结果的一致性。
本检测方法使用表1中的检测引物对22例血液样品DNA进行检测，此外，使用表4中的验证引物对22例血液样品DNA进行检测，结果如表5所示。22例样品经两套不同引物检测，检测结果一致，表明本检测方法的准确性为100%。
注：NMD即未检测到突变。
实施例五 检测 IDH1 和 IDH2 基因突变的方法的特异性和灵敏度
本检测的检测特异性定义为阴性符合率，检测灵敏度定义为阳性符合率。
本检测方法使用表1中的检测引物对22例血液样品DNA进行检测，此外，使用表4中的验证引物对22例血液样品DNA进行检测，结果如表5所示。检测引物和验证引物检测结果为阴性(未检测到突变)的样品完全一致，本检测方法的检测特异性为100%。
检测引物和验证引物检测结果为阳性(检测到突变)的样品完全一致，突变位点及类型也完全一致，结果如表6所示，本检测方法的检测灵敏度为100%。
实施例六 检测 IDH1 和 IDH2 基因突变的方法的检测下限
本检测方法采用Sanger测序法进行检测，本检测方法的最低检测下限(LOD)为20%，当突变细胞与正常细胞的比值低于40%时，不排除假阴性的可能。
DNA输入量的检测结果如表8所示，在DNA量输入范围12.5~200ng/reaction间，可保证突变样品检测结果一致。
实施例七 检测 IDH1 和 IDH2 基因突变的方法的精密度
本检测方法的精密度定义为对样品进行重复检测得到同一结果的能力。
本检测方法对7例样品进行了IDH1和IDH2基因外显子4的三次重复检测。同一样品不同批次的扩增均成功，Sanger测序结果如表7所示。结果显示，同一样品不同批次的检测结果一致，本检测方法批间精密度为100%。
注：NMD即未检测到突变。
本检测方法对1例阳性样本(IDH1 R132H)和1例阴性样本(IDH1 NMD)进行了IDH1 基因外显子4的3复孔检测。同一样品不同孔间的扩增均成功，Sanger测序结果如表8所示。结果显示，同一样品不同孔间的检测结果一致，本检测方法的批内精密度为100%。
注：NMD即未检测到突变。
因此，本发明所提供的引物和检测方法可作为一种独立的、应用广泛的检测方法，解决了IDH1和IDH2基因外显子4突变的检测问题，可以为甲磺酸伊马替尼的临床用药提供指导，利于CN-AML患者的预后指导，减少不良反应，在帮助指导用药和个性化治疗方面具有重要意义。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州金域医学检验中心有限公司
<120> 一种检测IDH1和IDH2基因突变的引物与方法
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> IDH1-Exon4-F
tgtaaaacga cggccagtag agccttcgct ttctgcat 38
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> IDH1-Exon4-R
caggaaacag ctatgacctg caaaatcaca ttattgccaa c 41
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> IDH2-Exon4-F
tgtaaaacga cggccagttc tggctgtgtt gttgcttg 38
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> IDH2-Exon4-R
caggaaacag ctatgaccct gccatctttt ggggtgaag 39
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> IDH1-Exon4-F-validation
tgtaaaacga cggccagttg ctgcagaagc tataaagaag 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> IDH1-Exon4-R-validation
caggaaacag ctatgaccgc aaaatcacat tattgccaac 40
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> IDH2-Exon4-F-validation
tgtaaaacga cggccagtct ggttgaaaga tggcggctg 39
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> IDH2-Exon4-R-validation
caggaaacag ctatgaccct aggcgaggag ctccagtc 38

Claims (7)

1.一种检测IDH1和IDH2基因突变的引物，其特征在于：包括针对IDH1基因外显子4的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGCCTTCGCTTTCTGCAT和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCTGCAAAATCACATTATTGCCAAC，以及针对IDH2基因外显子4的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGGCTGTGTTGTTGCTTG和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCCTGCCATCTTTTGGGGTGAAG。
2.根据权利要求1所述的检测IDH1和IDH2基因突变的引物，其特征在于：所述引物中，IDH1基因外显子4的上游引物、IDH1基因外显子4的下游引物、IDH2基因外显子4的上游引物和IDH2基因外显子4的下游引物浓度比为1：1：1：1。
3.一种检测IDH1和IDH2基因突变的方法，其特征在于：包括如下步骤：A）提取DNA样品；B）采用权利要求1或2中所述的引物进行PCR扩增；C）对扩增产物进行凝胶电泳分析后，采用Sanger测序法检测，对检测结果进行分析。
4.根据权利要求3所述的检测IDH1和IDH2基因突变的方法，其特征在于：所述步骤A）中的DNA样品为EDTA抗凝外周血或骨髓血的DNA样品。
5.根据权利要求3所述的检测IDH1和IDH2基因突变的方法，其特征在于：所述步骤B）中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：63℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，34个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。
6.根据权利要求3所述的检测IDH1和IDH2基因突变的方法，其特征在于：所述步骤C）中，采用Sequencher 4.1.4软件对检测结果进行分析。
7.根据权利要求1或2所述的检测IDH1和IDH2基因突变的引物在制备检测IDH1和IDH2基因突变试剂中的用途。
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Application publication date: 20151216

Assignee: THE FIRST PEOPLE'S HOSPITAL OF QINZHOU

Assignor: GUANGZHOU KINGMED CENTER FOR CLINICAL LABORATORY

Contract record no.: 2019440000087

Denomination of invention: Primers and method for detecting IDH1 and IDH2 gene mutation

Granted publication date: 20170613

License type: Common License

Record date: 20190528

CP02 Change in the address of a patent holder
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Address after: 510700 No. 10, helix 3 Road, International Biological Island, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province

Patentee after: GUANGZHOU KINGMED CENTER FOR CLINICAL LABORATORY

Address before: 510330 Guangdong Guangzhou Haizhuqu District Xingang East Road 2429, 3rd floor.

Patentee before: GUANGZHOU KINGMED CENTER FOR CLINICAL LABORATORY