CN105506099A - 一种检测itpa基因多态性的引物及其方法 - Google Patents

一种检测itpa基因多态性的引物及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测ITPA基因多态性的引物及其方法。本发明提供的ITPA基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot？PCR引物。本发明提供的ITPA基因多态性的引物具有特异性强，检测灵敏度好，准确性高的优点，实现了ITPA基因多态性的检测，可用于指导利巴韦林的用量调整，以提高抗病毒治疗的反应，同时也可以为临床预测丙型肝炎抗病毒个体化治疗效果提供依据，具有重大的社会意义。

Description

一种检测ITPA基因多态性的引物及其方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测ITPA基因多态性的引物及其方法。
背景技术
丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎，是一种由丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus,HCV）感染引起的病毒性肝炎，主要通过血液传播。由于大部分感染丙肝病毒的患者在感染的急性期无明显症状，因此常常被人们忽视，一般待丙型肝炎转化为慢性丙型肝炎或肝硬化等顽固疾病时才有所察觉，这样往往会错过丙型肝炎的最佳治疗期。据世界卫生组织统计，全球约有1.4-1.7亿HCV感染者，我国HCV感染率约为3.2%，约有3800万HCV感染者，而且每年呈上升的趋势，严重危害人类的健康。
2009年，杜克大学的Ge等在《自然》上发表了一篇与HCV感染相关的全基因组相关性（genomewide association study,GWAS）研究论著，报道了IL28B基因位于第19号染色体短臂（19q13），其编码干扰素λ3（IL28B）上游约3kb附近的单核苷酸多态性rs12979860与聚已二醇干扰素、利巴韦林联合治疗的效果显著相关。杜克大学的同一研究组在发现IL28B基因型具有预测抗病毒治疗应答的基础上，通过GWAS研究发现，肌苷腺苷三磷酸酶（in0sineadenosine triphatase,ITPA）基因变异可缓解RBV引起的溶血性贫血，如rs1127354AA和rs7270101CC基因型均为贫血的保护性因子。因此，通过检测ITPA基因多态性有利于预测HCV患者的疗效。
中国专利申请201210353290.9公开了检测IL28B(rs8099917) 和ITPA(rs1127354)的突变的方法，其多态性检测用探针包含P1或P1’的寡核苷酸、P2或P2’的寡核苷酸以及P3或 P3’的寡核苷酸，其是通过将探针进行PCR扩增后进行Tm分析，对IL28B基因多态性的 rs8099917和ITPA 基因多态性的 rs1127354 进行分型。
虽然目前的检测方法可以对ITPA进行分型，但是上述方法存在检测结果误差较大，重复性较低，而且结果判断较复杂的缺陷。因此，研究和开发出一种操作简单，检测结果误差小，结果重复性高的ITPA基因的检测方法仍是目前研究的热点。
发明内容
为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种检测ITPA基因多态性的引物及其方法，该引物主要用于检测ITPA_rs7270101和ITPA_rs1127354两个位点，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，为ITPA基因多态性提供了一种简单有效的检测方法。
本发明提供了一种检测ITPA基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物；所述PCR扩增引物为：针对ITPA的上游引物5’- GGAGATGGGCAGCAGAGTTA-3’（SEQID NO.1）和下游引物5’- CAGGTCACAGGAAGACAGAGA-3’（SEQ ID NO.2）；所述SNaPshot PCR引物包括：针对ITPA0101的SNaPshot PCR引物5’-AAAAAAAAAAAAGATCGATCGAGAAATCCAACCATCTTTTAAAAA-3’（SEQ ID NO.3），针对ITPA7354的SNaPshot PCR引物5’- AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATTTTCTGTGCCACCAAAGTGCATG-3’（SEQ ID NO.4）。
进一步地，所述SNaPshot PCR引物中ITPA0101和ITPA7354的引物浓度比为1:1。
另外，本发明提供了一种检测ITPA基因多态性的方法，包括如下步骤：
S1提取DNA样品；
S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；
S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化；
S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
进一步地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃5min；阶段7：25℃ 保温。
进一步地，所述步骤S3中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃ 10s；阶段2：55℃ 5s；阶段3：60℃ 30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃ 保温。
进一步地，所述步骤S4中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
除此之外，本发明提供的检测ITPA基因多态性的引物在制备检测ITPA基因多态性试剂中的用途。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：本发明提供的检测ITPA基因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了检测ITPA基因多态性的检测，可用于指导利巴韦林的用量调整，以提高抗病毒治疗的反应，同时也可以为临床预测丙型肝炎抗病毒个体化治疗效果提供依据，具有重大的社会意义。
附图说明
图1为本发明提供的ITPA基因引物的扩增片段；
图2为本发明提供的ITPA基因SNaPshot PCR引物的检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一、引物
本发明提供的ITPA基因引物如表1所示，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物，所述PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。
表1 本发明提供的引物
实施例二、引物的特异性
将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting，结果如下：
1)ITPA基因特异引物于UCSC中进行Blast，所有引物的扩增片段均覆盖了相应的检测位点，无其它同源基因，ITPA扩增片段位于chr20:3193710+3193935，长度为226bp，扩增序列图如图1。
2）使用表1中SNaPshot PCR引物，SNaPshot法进行检测，结果如图2所示，各产物峰的相对位置及测序反应掺入的碱基与预期相符。
实施例三、ITPA基因多态性的检测
1）提取EDTA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit（购自Tiagen，货号DP318）的说明书，将DNA样品稀释至100ng/μL，备用。
2）配制PCR引物，震荡混匀；短暂离心后备用；PCR扩增采用Q5™热启动超保真2XMaster Mix（购自NEB公司，货号M0494L），反应体系如表2所示，震荡混匀，短暂离心后，分装18.0μL至标记好的PCR反应管；往标记好的PCR反应管加入引物混合物5.0μL，按照以下程序进行PCR扩增：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，2:9个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。
表2、PCR试剂配制表格
3）按SNaPshot PCR引物中ITPA0101和ITPA7354的引物浓度比为1:1混合，SNaPshotPCR产物中加入1.0μL SAP酶，按照以下程序进行反应：37℃，15min；80℃，15min；4℃，保温。反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检测结果采用GENEMAPPERID V4.1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图2所示。
实施例四、检测ITPA基因多态性的方法的特异性
本发明的检测特异性定义为阴性符合率。本发明共对21例样本进行优化SNaPshot测序法检测，检测结果采用ARMS-PCR法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阴性结果与ARMS-PCR法显示的结果相符，无突变的样本(阴性)共7例，如表3所示。本发明的检测特异性为100%。
表3、ITPA基因检测特异性的试验数据
实施例五、检测ITPA基因多态性的方法的灵敏度
本发明的检测灵敏度定义为阳性符合率。本发明共对21例样本进行优化SNaPshot测序法检测，检测结果采用ARMS-PCR法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阳性结果与ARMS-PCR法显示的结果相符，突变的样本(阳性)共14例，如表4所示。本发明的检测灵敏度为100%。
表4、ITPA基因检测灵敏度的试验数据
实施例六、检测ITPA基因多态性的方法的准确度
本发明准确度定义为不同方法检测结果的一致性。本发明共对21例样本进行SNaPshot测序法检测，检测结果均采用ARMS-PCR法进行验证。不同方法检测结果一致，如表5所示。本发明的准确度为100%。
表5、ITPA基因2SNPs位点检测准确度的试验数据
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州金域检测科技股份有限公司
<120> 一种检测ITPA基因多态性的引物及其方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggagatgggc agcagagtta 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caggtcacag gaagacagag a 21
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaaaaaaaaa aagatcgatc gagaaatcca accatctttt aaaaa 45
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatattttct gtgccaccaa agtgcatg 58

Claims (8)

1.一种检测ITPA基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物为：针对ITPA的上游引物5’- GGAGATGGGCAGCAGAGTTA-3’和下游引物5’- CAGGTCACAGGAAGACAGAGA-3’；所述SNaPshot PCR引物包括：针对ITPA0101的SNaPshotPCR引物5’- AAAAAAAAAAAAGATCGATCGAGAAATCCAACCATCTTTTAAAAA-3’，针对ITPA7354的SNaPshot PCR引物5’- AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATTTTCTGTGCCACCAAAGTGCATG-3’。
2.根据权利要求1所述的检测ITPA基因多态性的引物，其特征在于：所述SNaPshot PCR引物中ITPA0101和ITPA7354的引物浓度比为1:1。
3.一种检测ITPA基因多态性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1提取DNA样品；
S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；
S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化；
S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
4.根据权利要求3所述的同时检测IL28B和ITPA基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
5.根据权利要求3所述的检测ITPA基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。
6.根据权利要求3所述的检测ITPA基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S3中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃ 10s；阶段2：55℃ 5s；阶段3：60℃ 30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃ 保温。
7.根据权利要求3所述的检测ITPA基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S4中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
8.根据权利要求1所述的检测ITPA基因多态性的引物在制备检测ITPA基因多态性试剂中的用途。
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