CN115820852B - 一种用于检测tmprss2-erg融合基因的电化学传感器及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测TMPRSS2‑ERG融合基因的电化学传感器及其应用，属于传感器技术领域。本发明用于检测TMPRSS2‑ERG融合基因的电化学传感器体系包括TMPRSS2‑ERG融合基因等温扩增体系试剂、CRISPR/Cas12试剂和金工作电极。本发明的电化学传感器对TMPRSS2:ERG基因的检测能够显著提高检测的特异性，同时检测的样本可取自尿液，减少不必要的穿刺活检，降低病人痛苦；本发明的电化学传感器采用RT‑RAA恒温指数扩增，操作更简便，扩增反应时间更短，可以更快获得检测结果；本发明的电化学传感器检测成本低、简化检测平台，便于实现早期大批量筛查，具备实现即时检验环境下快速早期诊断的潜力。

Description

一种用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器及其 应用

技术领域

本发明属于传感器技术领域，具体涉及一种用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器及其应用。

背景技术

前列腺癌是全球范围内发病率排名第二，死亡率排名第五的男性肿瘤。尽管前列腺癌进展缓慢，但由于其发病隐匿、症状轻微导致死亡率还是居高不下。为了降低前列腺癌病人的死亡率，目前的主要方法就是以直肠指诊(DRE)与血清前列腺特异抗原(PSA)检测为代表的早期筛查。尽管从PSA检测应用于临床以来，大规模的血清PSA可以在早期阶段检测出更多的前列腺癌病人。但由于PSA特异性相对较低，因此在进行大规模前列腺癌筛查时会给很多非前列腺癌的病人带来不必要的活检与过度的检查。出于对前列腺癌过度诊疗的担忧，美国预防服务工作组在2012年将PSA筛查的推荐等级调整为D级别，也即是反对在成年男性人群中开展饱和PSA筛查。因此寻找灵敏性、特异性更高的前列腺癌肿瘤标志物迫在眉睫。

研究发现，有些前列腺癌病人做完DRE检查后可以在其尿液中检测到一种肿瘤特异性非常高的融合基因。这个融合基因是由TMPRSS2基因的第一个外显子与ERG基因第四个外显子融合组成，称为TMPRSS2:ERG融合基因。根据Scott A.Tomlins等人研究发现，TMPRSS2:ERG融合基因对于前列腺癌的诊断具有高特异性、相对低灵敏性的特点，可以联合其他标志物一起检测。因此，TMPRSS2:ERG融合基因是一个非常有潜力的前列腺癌诊断标志物。目前对于TMPRSS2:ERG基因的检测，主要是提取病人DRE术后尿液中的总RNA，并进行RT-qPCR定量分析。尽管RT-qPCR实验具有优秀的定量分析能力，但是其需要专业的人员对大型仪器进行长时间的专业操作。不利于在条件相对简陋的环境下进行检测，这也是TMPRSS2:ERG基因一直未能广泛应用于前列腺癌筛查的主要原因之一。为了提高基因检测的效率，使基因检测可以用于资源相对缺乏的地区，有团队研究出了可以用于即时检验(point-of-care testing,POCT)环境下的试纸条检测平台来代替大型仪器检测基因，这种试纸条的优势在于方便携带、结果展示直观、一次可以检测多个基因。但是其劣势也相对明显，比如构建试纸条的方法相对复杂、容易受到环境的干扰、难以进行定量检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器及其应用，该电化学传感器将基因检测、CRISPR技术与传感器结合，具有操作便捷、检测快速、准确的特点。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器体系，包括TMPRSS2-ERG融合基因恒温扩增体系试剂、CRISPR/Cas12试剂和金工作电极。

本申请发明人从改进TMPRSS2:ERG基因检测方法出发，采用成本更低、快速且灵敏的电化学传感器为检测平台，再通过RT-RAA技术对TMPRSS2:ERG基因进行快速扩增、CRISPR-Cas12a系统对扩增产物进行识别，通过简化检测方法，降低对大型仪器与专业平台的依赖，缩短检测的时间，以及更直观的表示检测结果。本发明的电化学传感器体系将TMPRSS2:ERG基因的检测应用于前列腺癌筛查，有着广阔的应用前景和产业化前景。

作为本发明所述的用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器体系的优选实施方式，所述TMPRSS2-ERG融合基因恒温扩增体系试剂包括TMPRSS2-ERG融合基因恒温扩增引物；所述恒温扩增体系试剂的恒温扩增方法选自重组酶介导恒温核酸扩增、环介导恒温扩增和超分支滚环扩增恒温扩增方法中任一种；所述TMPRSS2-ERG融合基因恒温扩增引物选择以下任意一对：

TE-1-F：CGCGAGCTAAGCAGGAG(SEQ ID NO:1)

TE-1-R：CCAGTCGTTGTTTGAGTGTGCCTAC(SEQ ID NO:2)

TE-2-F：CGCGAGCTAAGCAGGAG(SEQ ID NO:3)

TE-2-R：CTCCTCCAGCGACTATGGAC(SEQ ID NO:4)

TE-3-F：CGCGAGCTAAGCAGGAG(SEQ ID NO:5)

TE-3-R：GGAGTGGGCGGTGAAAGAATATGG(SEQ ID NO:6)

TE-4-F：CGCGAGCTAAGCAGGAG(SEQ ID NO:7)

TE-4-R：CTCACCCCCAGCTACAACGAA(SEQ ID NO:8)。

作为本发明所述的用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器体系的优选实施方式，所述CRISPR/Cas12试剂包括TMPRSS2:ERG基因的特异性crRNA引物和Cas12蛋白。所述CRISPR/Cas12a试剂合成的crRNA含有与所述恒温扩增产物结合的TTTN序列。

作为本发明所述的用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器体系的优选实施方式，所述TMPRSS2:ERG基因的特异性crRNA引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示；所述下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示。本申请发明人经过大量的实验设计crRNA体外转录所需DNA模板的PCR扩增引物，其中上游引物包含有T7启动子区和21-nt的固定序列，下游引物包含有19-nt目的基因的互补序列以及21-nt的固定序列。

作为本发明所述的用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器体系的优选实施方式，所述金工作电极为印刷电极，包括工作电极、参比电极和对电极；所述金电极含有SH-ssDNA-MB(5’端巯基修饰，3’端亚甲蓝MB修饰)；所述ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

作为本发明所述的用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器体系的优选实施方式，所述的金工作电极的SH-ssDNA-MB探针的修饰缓冲液为含有0.5M NaCl、5mMMgCl₂、50mM TCEP的100mM Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液的pH为7.4。

本发明还提供一种采用所述的电化学传感器体系检测TMPRSS2-ERG融合基因的方法，包括以下步骤：

S1.提取待测样本的总RNA；

S2.以步骤S1的RNA为模板，利用所述的TMPRSS2-ERG融合基因恒温扩增引物进行RT-RAA扩增反应，得到RAA扩增产物；

S3.采用所述的crRNA引物通过桥式PCR扩增得到crRNA，并与Cas12a蛋白孵育，得Cas12a-crRNA复合体；

S4.将Cas12a-crRNA复合体与RAA扩增产物孵育得Cas12a-crRNA-amplicon复合物；

S5.将Cas12a-crRNA-amplicon复合物滴加至传感器的金工作电极上，孵育剪切后采用方波伏安法检测电极电信号。

优选地，所述步骤S2和步骤S3中的桥式PCR扩增体系为：上游引物1.4μL，下游引物1.4μL，2xTaq DNA聚合酶混合液25μL，三蒸水22.2μL；所述步骤S3中的桥式PCR扩增条件为：95℃下变性5分钟，95℃变性20秒，63℃退火10秒，72℃延伸45秒，循环35次，最后72℃延伸15分钟。

作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述步骤S3中的Cas12a蛋白与crRNA的浓度比为1：1。

作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述待测样本包括尿液或组织样本。

作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述方波伏安法的电化学检测工作液为含有10mM Tris和100mM NaCl的缓冲液。

本发明还提供所述的电化学传感器在制备用于前列腺癌诊断的产品中的应用。

本发明的有益效果：提供一种用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器，本发明的电化学传感器具有以下优势：(1)相对血清PSA筛查，本发明的电化学传感器对TMPRSS2:ERG基因的检测能够显著提高检测的特异性，同时检测的样本可取自尿液，减少不必要的穿刺活检，降低病人痛苦；(2)相对RT-PCR繁琐的操作与长时间的扩增反应，本发明的电化学传感器采用RT-RAA恒温指数扩增，操作更简便，扩增反应时间更短，可以更快获得检测结果；(3)本发明的电化学传感器利用CRISPR-Cas12a系统的反式剪切酶活性，结合金电极的DNA修饰技术能够进一步简化TMPRSS2:ERG基因的检测过程，提高检测特异度；(4)本发明的电化学传感器检测成本低、简化检测平台，便于实现早期大批量筛查，具备实现即时检验环境下快速早期诊断的潜力。

附图说明

图1：A为TMPRSS2:ERG基因的qPCR扩增产物电泳图；B为TMPRSS2:ERG基因的RT-RAA扩增产物电泳图；

图2：A为TMPRSS2:ERG对应的crDNA产物电泳图；B为TMPRSS2:ERG对应的crRAN产物电泳图；

图3为用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器的原理示意图；

图4为Cas12a-crRNA-TE-2基因剪切产物电泳图；

图5为Cas12a-crRNA-TE-2基因剪切产物前后电化学检测结果；

图6为Cas12a-crRNA-TE-2基因剪切不同浓度产物前后电化学检测结果；

图7为Cas12a-crRNA-TE-2基因剪切FAM-Q荧光探针的荧光结果图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器，包括金电极、Cas12a蛋白、TMPRSS2-ERG融合基因引物和crRNA引物。

1、所述TMPRSS2-ERG融合基因引物的设计方法如下：

1)首先以TMPRSS2基因和ERG基因最常见的融合类型(TMPRSS2EXON-1：ERGEXON-4)为扩增模板。以TMPRSS2EXON-1序列为模板设计TMPRSS2:ERG融合基因的前引物，以ERGEXON-4序列为模板设计TMPRSS2:ERG融合基因的后引物。根据TMPRSS2基因与ERG基因序列在Primer Premier 6软件上分别设计四对不同的上游与下游引物，引物序列如表1所示。

表1

2)分别采用qPCR法和RT-RAA法扩增TMPRSS2:ERG基因：a.qPCR法：提取正常前列腺细胞(RWPE-1)与前列腺癌细胞(VCAP)总RNA，使用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行逆转录，随后将逆转录产物与步骤1)设计的四对引物进行qPCR，实验结果如图1A所示；b.RT-RAA法：采用上述的RNA直接与TMPRSS2:ERG基因引物，在奇天公司的RT-RAA basic试剂盒中进行扩增反应，反应条件为37℃，30min，并对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，结果如图1B所示。

图1A是TMPRSS2:ERG四种基因的qPCR扩增产物电泳图，其中泳道1是TE-1基因，产物大小为120bp；泳道2为TE-2基因，产物大小为180bp；泳道3为TE-3基因，产物大小为505bp；泳道4为TE-4基因，产物大小为597bp。由图1A可以看出，TE-2扩增效率与特异性高，TE-1与TE-4扩增特异性较低，TE-3扩增效率较低。图1B中，泳道1是TE-1基因，产物大小为120bp；泳道2为TE-2基因，产物大小为180bp；泳道3为TE-3基因，产物大小为505bp；泳道4为TE-4基因，产物大小为597bp。由图1B可见，RT-RAA扩增方法对TE-2基因具有非常高的特异性与灵敏度。因此选择TE-2基因进行后续实验。TE-2基因在RT-RAA以及RT-qPCR两种方法中得到的扩增产物一致，电泳条带单一明亮，均可以用于下一步实验，同时证明RT-RAA可以在本实验中代替RT-qPCR，以达到节约时间、减少大型仪器依赖的目的。

2、所述crRNA引物的设计和验证方法如下：

1)设计crRNA体外转录所需DNA模板的PCR扩增引物，其中上游引物包含有T7启动子区和21-nt的固定序列，下游引物包含有19-nt目的基因的互补序列以及21-nt的固定序列，然后通过桥式PCR扩增得到crRNA转录模板DNA。其中引物序列如表2所示，所述桥式PCR扩增的体系如表3所示，桥式PCR扩增条件为：首先95℃下变性5分钟；接着95℃变性20秒，63℃退火10秒，72℃延伸45秒，循环35次；最后72℃延伸15分钟。

表2

表3桥式PCR扩增体系

2)扩增产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后用于T7RNA聚合酶介导的转录反应，从而体外转录出crRNA，并将产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，余下crRNA置于-80℃冰箱冻存。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图2所示。图2A是TMPRSS2:ERG基因对应的crDNA电泳图；图2B是TMPRSS2:ERG基因对应的crRNA。由图2可知，TMPRSS2:ERG基因所对应的crDNA及crRNA均合成成功，电泳条带单一明亮，可用于下一步实验。

3、所述金电极的制备方法，具体步骤如下：

(1)在丝网印刷电极上，滴加10μL以下溶液：1μM SH-ssDNA-MB和0.1μM 6-巯基己醇在缓冲液(0.1M NaClO₄，2.5mM Na₂HPO₄，pH 7.0)中，室温3小时；

(2)用0.1MNaClO₄和2.5mM Na₂HPO₄，pH 7.0的溶液冲洗电极；

(3)将金电极浸入0.1NaClO₄和2.5mM Na₂HPO₄中的1mM 6-巯基己醇中1小时；

(4)在用相同的缓冲液冲洗后，将电极在冰箱中放置24小时并储存在4℃的缓冲溶液(0.1M NaClO4，2.5mM Na2HPO4，pH 7.0)中。

其中，ssDNA的核苷酸序列如表4所示。

表4

实施例2

本实施例采用实施例1的电化学传感器对TMPRSS2:ERG融合基因进行检测，检测原理如图3所示，具体方法如下：

(1)制备Cas12a-crRNA-目的基因复合物：先将Cas蛋白和实施例1得到的crRNA以1：1的浓度比在反应缓冲液中于室温下混合静止孵育10min，形成Cas12a-crRNA复合体；然后将Cas12a-crRNA复合体与实施例1扩增得到的TMPRSS2:ERG基因扩增产物相互作用，反应条件为37℃孵育25min；由此得到Cas12a-crRNA-amplicon复合体；最终体系中Cas12a和crRNA的终浓度为100nM。为了验证cas12a-crRNA复合体与目的基因结合，将不同碱基顺序的crRNA与cas12a组成复合体再与目的基因结合，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，结果如图4所示。crRNAnc是crRNA的镜像序列，由图4可知，TMPRSS2:ERG基因扩增产物只会和正确序列的crRNA与Cas12a发生剪切反应，说明本发明的Cas12a-crRNA具有非常高的特异性。

(2)金电极与Cas12a-crRNA-目的基因复合物结合进行检测：首先用10mM Trisbuffer清洗工作电极，通过方波伏安法检测Cas12a-crRNA-amplicon剪切前的工作电极电信号；其次将crRNA和cas12a在室温下混合孵育5min，随后将TMPRSS2:ERG基因扩增产物与crRNA-cas12a复合体在37℃条件下反应10min。将上述反应液缓慢滴加至金电极上，37℃反应30min；最后将工作液(10mM Tris buffer，100mM NaCl)滴在电极上，通过方波伏安法检测Cas12a-crRNA-amplicon剪切后的电极电信号，待电流信号变化稳定后读取结果。结果如图5所示。由图5可知，金电极修饰后(MB-DNA)的电信号要远高于裸金电极(Control)的电信号，而当cas12a-crRNA-TMPRSS2:ERG复合体与修饰后的电极反应后(MB-DNA-cas12a-crRNA-TE2)，电信号明显降低。因此，本发明的电化学传感器可以对TMPRSS2:ERG融合基因进行快速检测。

实施例3

本实施例对实施例1的电化学传感器的功能进行验证，采用实施例2的检测方法对以下4个样品进行检测：

样品一：在EP管中加入ddH2O、r3.1、crRNA，室温反应5min后加入TMPRSS2:ERG基因扩增产物；

样品二：在EP管中加入ddH2O、r3.1、cas12a，室温反应5min后加入TMPRSS2:ERG基因扩增产物；

样品三：在EP管中加入ddH2O、r3.1、cas12a、crRNA-nc室温反应5min后加入TMPRSS2:ERG基因扩增产物；

样品四：在EP管中加入ddH2O、r3.1、cas12a、crRNA，室温反应5min后加入TMPRSS2:ERG基因扩增产物。

实验结果：样品一的电化学传感器的电流信号未明显变化，证明TMPRSS2:ERG基因扩增产物与crRNA结合依赖cas12a蛋白的剪切能力；样品二的电化学传感器的电流信号未明显变化，证明TMPRSS2:ERG基因扩增产物与cas12a蛋白结合依赖crRNA的靶向能力；样品三的电化学传感器的电流信号未明显变化，证明TMPRSS2:ERG基因扩增产物与cas12a蛋白结合依赖特异性crRNA的靶向能力；样品四的电化学传感器的电流信号减小，证明当反应体系中同时含有TMPRSS2:ERG基因扩增产物及对应的crRNA，cas12a蛋白时，电化学传感器的电流信号才会发生明显变化。由上述实验结果可知，cas12a蛋白、crRNA与目的基因在组成三元复合物中均起到不可缺少的作用，并且TMPRSS2:ERG基因只能与正确的crRNA。证明构建的电化学传感器检测平台可以达到预期目的。

实施例4

本实施例对实施例1的电化学传感器的检测下限进行验证，采用实施例2的检测方法对不同浓度的TMPRSS2:ERG基因

a.提取VCaP细胞total RNA，利用酶标仪测出浓度并梯度稀释，逆转成cDNA备用；b.对上一步得到的cDNA进行恒温扩增；c.取12μL ddH2O、2μLr3.1 buffer、2μL cas12a蛋白、2μL crRNA置于EP管中，振荡混匀室温静置5分钟；d.取2μL扩增产物加入EP管中振荡混匀；e.将上述溶液滴加至电化学传感器并读取结果。

实验结果如图6所示，对不同浓度TMPRSS2:ERG基因的RT-RAA扩增产物进行cas12a-crRNA识别，实验结果可以通过电化学传感器检测直观的观察，本实验应根据浓度设置从高到低的3个实验组与一个对照组，验证TMPRSS2:ERG基因检测的下限以及线性响应范围。

由上述可知，本发明的电化学传感器具有二级生物信号放大系统，a.RT-RAA可以在短时间内对TMPRSS2:ERG基因进行快速的指数扩增。b.cas12a-crRNA-amplicons复合体可以对单链DNA进行非特异性剪切。因此在检测TMPRSS2:ERG基因时，电化学传感器检测应呈现良好的线性响应范围。

实施例5

本实施例采用检测荧光信号的方法对Cas12a-crRNA-TMPRSS2:ERG的结合进行验证，具体方法如下：

(1)设计并配置FQ探针溶液：在ssDNA的5'端和3'端分别修饰FAM基团和BHQ1基团，得到序列为5'-TTATTTTATTTTATT-3'的探针。并配置成300nM的荧光探针溶液。

(2)检测荧光信号：在200μL的EP管中，加入10μL DEPC水、2μLr2.1 buffer、2μLcrRNA、2μL Cas12a以及2μL FQ探针，充分混匀后在EP管盖上加入2μLTMPRSS2:ERG融合基因扩增产物，离心并置于PCR仪中。PCR程序为：45度恒温，每分钟采集一次荧光信号，设置30个循环。

实验结果如图7所示：在本实验中，当反应体系中缺少了Cas12a、crRNA时，PCR仪无法检测到荧光信号；当Cas12a、crRNA、以及TMPRSS2:ERG扩增产物均存在于反应体系中时，PCR仪才可检测到荧光信号。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1. 一种用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器体系，其特征在于，包括TMPRSS2-ERG融合基因恒温扩增体系试剂、CRISPR/Cas12a试剂和金工作电极；所述TMPRSS2-ERG融合基因恒温扩增体系试剂包括TMPRSS2-ERG融合基因恒温扩增引物；所述恒温扩增体系试剂的恒温扩增方法选自重组酶介导恒温核酸扩增、环介导恒温扩增和超分支滚环扩增恒温扩增方法中任一种；所述TMPRSS2-ERG融合基因恒温扩增引物为：

TE-2-F：CGCGAGCTAAGCAGGAG（SEQ ID NO:3）

TE-2-R：CTCCTCCAGCGACTATGGAC（SEQ ID NO:4）；

所述CRISPR/Cas12a试剂包括TMPRSS2:ERG基因的特异性crRNA引物和Cas12a蛋白；所述CRISPR/Cas12a试剂合成的crRNA含有与所述恒温扩增产物结合的TTTN序列；所述TMPRSS2:ERG基因的特异性crRNA引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示；所述下游引物的序列如SEQ ID NO:10所示；

所述金工作电极为印刷电极，包括工作电极、参比电极和对电极；所述金工作电极含有SH-ssDNA-MB；所述ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

2. 根据权利要求1所述的用于检测TMPRSS2-ERG融合基因的电化学传感器体系，其特征在于，所述的金工作电极的SH-ssDNA-MB探针的修饰缓冲液为含有0.5M NaCl、5mMMgCl2、50mM TCEP的100mM Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液的pH为7.4。

3.权利要求1~2任一项所述的电化学传感器体系在制备用于前列腺癌诊断的产品中的应用。