CN110982878B - CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法与应用。该方法包括如下步骤：利用Cas13a/crRNA复合体识别Target RNA，触发Cas13a非特异性剪切RNA探针的活性，从而剪切pre‑trigger；然后将得到的产物通过T4PNK酶去磷酸化处理后得到mature‑trigger，随后进行EXPAR反应，得到dsDNA产物；再将EXPAR扩增产物与含有“光开关”分子和TPrA的溶液进行混合后进行pBPE‑ECL检测，根据获得的有效信号值，即可实现miRNAs检测的目的。

Description

CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法与 应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法与应用。
背景技术
成熟microRNAs(miRNAs)是真核生物体内一类具有调控功能的非编码小RNA，长度约为18～25nt。目前研究表明，许多癌症的发生与miRNAs异常表达有密切关系，miRNAs有望成为潜在的早期癌症诊断的标志物。因此，快速、灵敏地检测miRNAs对癌症早期诊断及治疗具有重要意义。
由于miRNA在细胞中表达量低，本身序列短，与探针杂交不稳定，因此对于miRNAs的检测具有很大的挑战。目前传统的miRNAs检测方法包括RNA印迹法、实时定量PCR法、微阵列技术和下一代测序技术等，这些方法都有各自的优势，但操作过程复杂、检测成本高、灵敏度较低或特异性差等局限使这些方法在应用上受到很大的限制。例如最常用的检测方法是实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术，该方法可以达到较高的灵敏度，但miRNAs序列短，其长度相当于引物长度，需要进行特殊的引物设计，因此为检测带来一定的困难。而微阵列芯片技术(Microarray)可以实现miRNAs高通量检测，缩短检测时间，但检测成本昂贵，并且灵敏度和特异性也较低。因此发展一种高灵敏、高特异性的miRNAs检测是非常有必要的。
CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有古细菌中的一种免疫系统，用于抵抗外源物质的入侵。CRISPR(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)是成簇的规律间隔的短回文重复序列，该系统通过对入侵的病毒核酸进行特异性的识别，利用CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)切割外源核酸从而达到防御的目的。近年来，CRISPR/Cas系统作为一种基因工程中非常重要的工具被广泛应用于基因编辑、基因表达调控及基因检测等研究中。CRISPR/Cas13a系统是一种新型的CRISPR/Cas系统。该系统中的Cas13a蛋白属于2类Ⅵ型的效应蛋白，具有RNA引导的RNA酶切割活性。在细菌CRISPR/Cas13a系统中，转录出来的前体crRNA在Cas13a的剪切作用下形成成熟的crRNA，并且与Cas13a结合形成复合物。当外源RNA存在时，该复合物特异性识别并剪切外源RNA，同时激活Cas13a的非特异性RNA剪切活性。该系统中可以人为设计crRNA中与Target RNA互补的spacer区(20nt)从而实现对不同靶标RNA的直接检测。
目前发展的利用CRISPR/Cas13a对mRNA及miRNA检测的方法中，主要通过荧光光谱法实现检测，利用Cas13a/crRNA识别靶RNA后，激活了Cas13a非特异性剪切活性，通过加入两端分别标记荧光基团和淬灭基团的RNA探针(FQ-probe)，从而激活后的Cas13a对FQ-probe进行非特异性剪切，产生荧光，通过荧光定量仪器进行实时监测。荧光检测方法中需要进行荧光探针的设计且过度依赖于荧光定量仪器进行荧光的实时监测。
电化学发光(ECL)是结合电化学和化学发光为一体的光学分析技术，因为其灵敏度高的优点，吸引了国内外很多研究者的关注。我们团队致力于电化学发光方面的研究已数十年，利用ECL实现高灵敏的核酸、蛋白、Hg2+离子等的检测，并自己开发了一种利用分子开关的纸基双极性电极电化学发光系统，且建立了纸基电化学发光检测平台。该平台不需要在纸上对电极进行修饰，成本低，灵敏度高。但是，到目前为止，尚未有结合CRISPR/Cas系统和电化学发光系统用于检测microRNA的相关报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法。
本发明的另一目的在于提供所述基于CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法，包括如下步骤：利用Cas13a/crRNA复合体识别Target RNA，触发Cas13a非特异性剪切RNA探针的活性，从而剪切pre-trigger(PT)；然后将得到的产物通过T4PNK酶去磷酸化处理后得到mature-trigger(MT)，随后进行EXPAR(exponential isothermal amplification；指数等温扩增反应)反应，得到双链DNA(dsDNA)产物；再将EXPAR扩增产物与含有“光开关”分子和TPrA的溶液进行混合后进行pBPE-ECL检测，根据获得的有效信号值，实现对microRNA的检测；具体包括如下步骤：
(1)将miRNA、pre-trigger(PT；rU修饰的DNA探针)与Cas13a/crRNA复合体混合均匀后于37℃条件下孵育30～40min，得到触发链；
(2)将T4 PNK酶加入到步骤(1)中得到的触发链中，37℃条件下反应30～50min，得到成熟的触发链(MT)；
(3)将步骤(2)中得到的成熟的触发链(MT)加入到EXPAR反应体系中进行扩增反应，得到dsDNA产物；
(4)将步骤(3)中得到的dsDNA产物与含有“光开关”分子和TPrA的溶液混合后进行pBPE-ECL检测，在pBPE的阳极获得ECL信号，根据获得的信号值，实现对microRNA的检测。
步骤(1)中所述的miRNA优选为miRNA-17(miR-17)，其核苷酸序列如下所示：5'-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3'。
步骤(1)中所述的miRNA的用量为按终浓度为10-6～10nmol/L计算；优选为按终浓度为1～10nmol/L计算。
步骤(1)中所述的pre-trigger的核苷酸序列如下所示：5'-TTGGATGGATATTGT- rUrU-CATA-3'(划横线部分为与EXPAR中模板链互补配对部分；rU(Uracilribonucleotide)表示尿嘧啶核糖核苷酸)。
步骤(1)中所述的pre-trigger的用量为按终浓度为25～100nmol/L计算；优选为按终浓度为50nmol/L计算。
步骤(1)中所述的Cas13a/crRNA复合体为由Cas13a蛋白(Leptotrichia buccalisCas13a(LbuCas13a))和crRNA复合得到的复合体；优选为由Cas13a蛋白和crRNA按摩尔比1：1复合得到的复合体。
所述的Cas13a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
编码所述LbuCas13a蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的Cas13a蛋白可通过生物公司合成的方式获得或通过原核细胞诱导表达的方式获得；优选为通过将pET-Sumo-LbuCas13a质粒转化到大肠杆菌、通过培养及诱导表达获得；更优选通过如下方法制备得到：
(A)将pET-Sumo-LbuCas13a质粒转化到大肠杆菌Rosetta2(DE3)中，在37℃条件下、含有氯霉素和卡那霉素的TB培养基进行培养，然后在16℃条件下加入IPTG进行诱导表达，收集菌体；
(B)超声裂解菌体，离心，取上清液加入到镍柱中，洗脱，得到LbuCas13a蛋白；
(C)将LbuCas13a蛋白用Ulp1蛋白酶在4℃下消化除去His6-Sumo标签，然后在肝素柱上进一步纯化，洗脱，浓缩，得到Cas13a蛋白。
步骤(A)中所述的TB培养基中氯霉素的浓度为34μg/mL，卡那霉素的浓度为50μg/mL。
步骤(A)中所述的培养为培养至大肠杆菌的细胞数OD600＝0.6。
步骤(A)中所述的诱导表达的时间优选为12小时。
步骤(B)中所述的超声裂解在含20mM Tris-HCl(pH 7.5)、1M NaCl、20mM咪唑、10％(v/v)甘油的缓冲液中进行超声裂解。
步骤(B)中所述的洗脱为采用含250mM咪唑的缓冲液进行洗脱。
步骤(C)中所述的采用、含20mM Tris-HCl(pH 7.5)、1M NaCl、10％(v/v)甘油的缓冲液进行洗脱和浓缩。
步骤(C)中所述的浓缩优选为浓缩至2mg/mL。
步骤(C)中所述的Cas13a蛋白保存于甘油中，其体积比为1:1。
所述的crRNA根据检测靶标的序列设计得到，crRNA的序列优选为如下所示：5'-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCUACCUGCACUGUAAGCACUUUG-3'(划横线部分为靶基因相关序列)。
所述的crRNA为通过互补的两条DNA单链退火得到，其序列如下所示：
有义链：5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGACCACCCCAAAAATGAAGGGGACTAAAACCTACCTGCACTGTAAGCACTTTG-3'(划横线部分为T7启动子区)；
反义链：5'-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGGTTTTAGTCCCCTTCATTTTTGGGGTGGTCCCTAT AGTGAGTCGTATTAATTTC-3'(划横线部分为T7启动子区)。
步骤(1)中所述的Cas13a/crRNA复合体的用量为按终浓度为5～20nmol/L计算；优选为按终浓度为10nmol/L计算(即体系中Cas13a蛋白和crRNA的浓度均为10nmol/L)。
步骤(1)中所述的孵育的时间优选为30min。
步骤(2)中所述的T4PNK酶的用量为按终浓度为0.2U/μL计算。
步骤(3)中所述的扩增反应优选为通过如下步骤实现：
(I)配制EXPAR反应溶液：EXPAR反应溶液包括A溶液和B溶液，其中，A溶液包括0.1μM的扩增模板，250μM的dNTP mix和10％(v/v)成熟的触发链(即Cas13a/crRNA与PT的反应产物)；B溶液包括0.4U/μL的Nt.BstNBI切刻内切酶，0.05U/μL的vent DNA聚合酶，1×Thermopol buffer和1×NEBuf fer 3.1；其中，A溶液中的扩增模板的序列如下所示：5'-AACTATCAACAATATCCATCCAAACAGACTCAAACTATCAACAATATCCATCCAA-3'；
(II)EXPAR扩增反应：将A溶液与B溶液等体积混合后在55℃下反应30min，得到dsDNA产物。
步骤(I)中所述的B溶液为采用DEPC处理水进行配制。
步骤(I)中所述的1×Thermopol buffer的配方如下：20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％(v/v)Triton X-10，pH 8.8。
步骤(I)中所述的1×NEBuffer 3.1的配方如下：25mM Tris-HCl，50mM NaCl，5mMMgCl2和0.5mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，pH 7.9。
步骤(4)中所述的双链DNA产物与含有“光开关”分子和TPrA的混合液的体积比为3:2。
步骤(4)中所述的“光开关”分子为[Ru(bpy)2dppz]2+或[Ru(phen)2dppz]2+。
步骤(4)中所述的含有“光开关”分子和TPrA的溶液中“光开关”分子的浓度为30μmol/L～0.5mmol/L(优选为0.5mmol/L)；TPrA的浓度为10mmol/L～100mmol/L(优选为70mmol/L)。
步骤(4)中所述的pBPE-ECL检测优选为通过如下步骤实现：
将双链DNA产物与含有“光开关”分子和TPrA的溶液进行混合，得到混合液，然后将混合液滴到pBPE上，再将pBPE正面朝向PMT并将其放置到暗盒里，最后，将pBPE的一对驱动电极连接到直流电源上，施加驱动电压；在pBPE的阳极获得一个ECL信号，将在10s内观察到的最大的可再现的发光信号作为有效的信号值，实现对microRNA的检测。
所述的驱动电压设定为14V。
所述的CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法在检测microRNA中的应用(非疾病诊断治疗目的)。
本发明的基本原理如图1所示：
在这项研究中，我们首次将CRISPR/Cas13a信号放大系统与纸质双极性电极电化学发光(pBPE-ECL)技术结合用于核酸分子诊断，开发了一种高灵敏度、低成本且无需标记的miRNA分析方法。该方案主要利用CRISPR系统中的Cas13a蛋白能够特异性识别并靶向Target RNA，由此激活Cas13a蛋白的反式切割活性的特性。其中，一个Target RNA可以触发Cas13a非特异性切割约103个含rU的探针，具有信号放大的作用。利用这种特性，我们在EXPAR扩增的触发链与模板链互补的末端设计了含rU碱基的序列，通过Cas13a非特异性剪切得到EXPAR扩增反应的触发链，随后进行EXPAR反应。通过将分子开关[Ru(phen)2dppz]2+插入到反应得到的dsDNA产物的大沟中，从而产生ECL信号。其中分子开关[Ru(phen)2dppz]2+工作原理为：当[Ru(phen)2dppz]2+在溶液状态下，水分子通过氢键与嵌入配位体的吩嗪氮原子连接，使得吩嗪氮原子质子化，导致三联体金属配体电荷转换(triplet metal-to-ligand charge transfer，MLCT)激发态失活，从而使得[Ru(phen)2dppz]2+不发生电化学发光反应；将DNA加入到该复合物的溶液中以后，平面的配位体嵌入双螺旋DNA分子“大沟”部位的碱基对之间，使吩嗪氮原子受到了保护，三联体金属配体处于激发态，可以和三丙胺(TPrA)发生氧化还原反应，并释放出光子，从而可以观察到显著的电化学发光。
在该项研究中，miRNA作为检测靶标用于触发Cas13a/crRNA反式切割活性，从而剪切PT，最后用于触发EXPAR扩增反应，以产生dsDNA产物。“光开关”分子[Ru(phen)2dppz]2+被用来插入EXPAR扩增产物dsDNA的碱基对中，然后将其直接滴加到pBPE-ECL上进行ECL检测。在优化条件下，1fM的miRNA可以被检测出来。该装置也被用来从miR-10b、miR-155及miR-21中特异性区分miR-17。因为该设备具有构造简单、一次性的、快速、低成本、无标记并具有灵敏度高的优势，如果将来以电池作为电源和智能手机作为信号读出，这种pBPE-ECL分子开关系统具有在发展中国家或者在资源有限的偏远地区用于疾病biomarker检测的巨大潜力。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)本发明利用Cas13a/crRNA复合体识别Target RNA，触发Cas13a非特异性剪切RNA探针的活性从而剪切PT，即rU修饰的DNA探针，通过T4PNK酶去磷酸化处理后得到MT，从而触发后续EXPAR反应，随后将EXPAR扩增产物与含有“光开关”分子[Ru(phen)2dppz]2+和TPrA的溶液进行混合；然后将混合液滴加到纸基双极性电极(pBPE)上；将pBPE正面朝向光电倍增管(PMT)放置到暗盒里；最后，将pBPE的一对驱动电极连接到一个直流电源上，施加驱动电压；在pBPE的阳极获得一个ECL信号，将在10s内观察到的最大的发光信号作为有效的信号值，即可实现快速灵敏miRNAs检测的目的。
(2)本发明首次将CRISPR技术与纸基电化学发光相结合。
(3)本发明中首次使用T4PNK酶对Cas13a剪切后的rU碱基进行去磷酸化处理，将Cas13a与EXPAR反应结合从而实现miRNA高灵敏度检测。
(4)本发明的方法利用分子开关的性质，可以达到非标记检测的目的。
(5)本发明的方法利用Cas13a信号放大的功能结合纸基双极性电极电化学发光系统实现了快速、高灵敏度检测。
(6)本发明中的纸基双极性电极为一次性可抛弃芯片，成本低。
(7)本发明中的双极性电极和外加电源之间无需导线相连，故该检测装置的构建更简便。
附图说明
图1是Cas/EXPAR-ECL检测系统用于miRNA检测的原理图。
图2是Cas13a蛋白电泳图及蛋白活性验证图；其中，A为SDS-PAGE凝胶电泳分析图(M：蛋白Marker；泳道1～2：LbuCas13a蛋白；泳道3～7：BSA蛋白)；B为Cas13a蛋白活性验证图。
图3是Cas/EXPAR-ECL检测系统用于miRNA检测的可行性分析图。
图4是Cas/EXPAR-ECL检测系统用于miRNA系统的灵敏度分析图。
图5是Cas/EXPAR-ECL检测系统用于miRNA系统的特异性分析图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1
1.Cas13a蛋白的表达及纯化
Cas13a蛋白(即LbuCas13a蛋白)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码Cas13a蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所使用的质粒为pET-Sumo-LbuCas13a(Liu,L.；Li,X.Y.；Ma,J.；Li,Z.Q.；You,L.L.；Wang,J.Y.；Wang,M.；Zhang,X.Z.；Wang,Y.L.TheMolecular Architecture for RNA-Guided RNA Cleavage by Cas13a.Cell 2017,170,714-726.)。首先将该质粒转化到大肠杆菌Rosetta2(DE3)(Novagen)中，在TB培养基(OXOID)(包含34μg/mL氯霉素(Sangon)和50μg/mL卡那霉素(Sangon))培养基中37℃培养。当大肠杆菌的细胞数OD600＝0.6时，由0.1mM异丙基-1-硫代-b-d-半乳糖苷(IPTG，sigma)在16℃下诱导12小时进行蛋白表达。随后收集大肠杆菌Rosetta(DE3)(Novagen)细胞，在含,20mM Tris-HCl(pH 7.5)、1M NaCl、20mM咪唑、10％(v/v)甘油的缓冲液中超声裂解。将超声后的溶液离心，取上清液加入到镍柱中Ni Sepharose(GE Healthcare)，用含250mM咪唑的缓冲液洗脱结合蛋白。随后，将洗脱的LbuCas13a蛋白用Ulp1蛋白酶(赛默飞)在4℃下消化，除去His6-Sumo标签，然后在肝素柱(GE Healthcare)上进一步纯化，用含有20mM Tris-HCl(pH 7.5)、1M NaCl、10％(v/v)甘油的缓冲液洗脱，然后将洗脱液浓缩至2mg/mL，最后加入甘油50％(v/v)将Cas13a蛋白置于-20℃保存。其中，LbuCas13a蛋白及其编码基因如下所示：
LbuCas13a氨基酸序列(SEQ ID NO.1)
MKVTKVGGISHKKYTSEGRLVKSESEENRTDERLSALLNMRLDMYIKNPSSTETKENQKRIGKLKKFFSNKMVYLKDNTLSLKNGKKENIDREYSETDILESDVRDKKNFAVLKKIYLNENVNSEELEVFRNDIKKKLNKINSLKYSFEKNKANYQKINENNIEKVEGKSKRNIIYDYYRESAKRDAYVSNVKEAFDKLYKEEDIAKLVLEIENLTKLEKYKIREFYHEIIGRKNDKENFAKIIYEEIQNVNNMKELIEKVPDMSELKKSQVFYKYYLDKEELNDKNIKYAFCHFVEIEMSQLLKNYVYKRLSNISNDKIKRIFEYQNLKKLIENKLLNKLDTYVRNCGKYNYYLQDGEIATSDFIARNRQNEAFLRNIIGVSSVAYFSLRNILETENENDITGRMRGKTVKNNKGEEKYVSGEVDKIYNENKKNEVKENLKMFYSYDFNMDNKNEIEDFFANIDEAISSIRHGIVHFNLELEGKDIFAFKNIAPSEISKKMFQNEINEKKLKLKIFRQLNSANVFRYLEKYKILNYLKRTRFEFVNKNIPFVPSFTKLYSRIDDLKNSLGIYWKTPKTNDDNKTKEIIDAQIYLLKNIYYGEFLNYFMSNNGNFFEISKEIIELNKNDKRNLKTGFYKLQKFEDIQEKIPKEYLANIQSLYMINAGNQDEEEKDTYIDFIQKIFLKGFMTYLANNGRLSLIYIGSDEETNTSLAEKKQEFDKFLKKYEQNNNIKIPYEINEFLREIKLGNILKYTERLNMFYLILKLLNHKELTNLKGSLEKYQSANKEEAFSDQLELINLLNLDNNRVTEDFELEADEIGKFLDFNGNKVKDNKELKKFDTNKIYFDGENIIKHRAFYNIKKYGMLNLLEKIADKAGYKISIEELKKYSNKKNEIEKNHKMQENLHRKYARPRKDEKFTDEDYESYKQAIENIEEYTHLKNKVEFNELNLLQGLLLRILHRLVGYTSIWERDLRFRLKGEFPENQYIEEIFNFENKKNVKYKGGQIVEKYIKFYKELHQNDEVKINKYSSANIKVLKQEKKDLYIRNYIAHFNYIPHAEISLLEVLENLRKLLSYDRKLKNAVMKSVVDILKEYGFVATFKIGADKKIGIQTLESEKIVHLKNLKKKKLMTDRNSEELCKLVKIMFEYKMEEKKSEN。
LbuCas13a核酸序列(SEQ ID NO.2)
ATGAAAGTGACTAAAGTAGGTGGCATTAGCCATAAAAAATACACCTCTGAAGGTCGCCTGGTTAAGTCCGAATCCGAAGAAAACCGCACTGACGAGCGTCTGAGCGCGCTGCTGAACATGCGTCTGGACATGTACATCAAAAACCCGTCCTCTACCGAAACCAAAGAAAACCAGAAACGCATCGGCAAACTGAAAAAATTTTTCTCAAATAAGATGGTTTACCTGAAAGACAACACCCTGAGCCTGAAAAACGGCAAAAAAGAAAACATCGACCGCGAGTATAGCGAAACCGACATCCTGGAATCCGACGTGCGTGATAAAAAGAACTTCGCAGTGCTGAAAAAGATCTACCTTAACGAAAACGTTAACTCCGAAGAACTTGAAGTGTTCCGTAATGACATTAAGAAAAAACTGAACAAAATTAACTCACTGAAATATAGCTTCGAGAAAAACAAAGCGAACTACCAGAAAATTAACGAAAACAACATCGAAAAAGTTGAAGGTAAATCTAAACGTAATATTATTTACGACTACTACCGCGAGTCTGCCAAACGTGACGCGTACGTTAGCAACGTAAAAGAAGCGTTTGATAAACTGTACAAAGAAGAAGATATCGCTAAGCTGGTTCTGGAAATCGAAAACCTGACTAAGCTGGAAAAATATAAAATCCGTGAGTTTTATCACGAAATTATCGGCCGTAAAAACGACAAAGAAAACTTCGCTAAAATTATCTATGAAGAAATTCAGAACGTGAACAACATGAAAGAGCTGATCGAAAAGGTTCCGGATATGAGTGAACTGAAAAAATCTCAGGTCTTCTATAAATACTATCTTGACAAGGAAGAGCTGAACGATAAAAATATCAAATACGCGTTCTGTCACTTCGTCGAAATTGAAATGTCACAATTGCTGAAAAACTACGTTTATAAACGTCTGTCCAACATCTCTAACGACAAGATCAAACGCATTTTCGAGTATCAAAACCTGAAAAAATTGATCGAAAACAAACTCCTGAACAAACTGGACACCTATGTGCGTAACTGCGGAAAATACAACTACTATCTGCAAGATGGCGAAATCGCAACCTCGGATTTTATCGCGCGTAACCGTCAGAACGAAGCATTTCTGCGTAACATCATCGGTGTCTCCTCCGTTGCTTACTTTAGCCTGCGCAACATCCTGGAAACTGAAAATGAGAATGACATCACGGGCCGTATGCGCGGCAAAACCGTGAAAAATAACAAAGGTGAGGAAAAATACGTTTCTGGCGAAGTTGACAAAATCTATAACGAAAACAAGAAAAACGAAGTGAAAGAAAACCTGAAGATGTTCTACTCCTACGACTTCAACATGGACAACAAAAATGAAATCGAGGATTTCTTTGCTAACATCGATGAAGCTATTTCGTCTATCCGCCACGGTATTGTGCACTTCAACTTGGAACTGGAAGGCAAGGACATCTTCGCTTTTAAAAACATTGCCCCGAGCGAGATCTCTAAGAAAATGTTCCAGAACGAAATCAACGAGAAAAAATTAAAACTGAAAATCTTCCGTCAACTGAATAGCGCAAACGTTTTTCGCTACCTGGAAAAATACAAAATCCTGAACTACCTTAAACGCACGCGTTTCGAATTCGTGAACAAGAACATCCCGTTCGTTCCGTCTTTCACTAAACTGTACAGTCGTATTGATGATCTGAAAAACAGCCTGGGCATCTATTGGAAGACCCCGAAGACCAACGATGACAACAAAACCAAAGAAATCATCGACGCGCAGATCTACCTGCTTAAAAACATTTACTACGGTGAATTTCTGAACTACTTTATGAGCAACAACGGCAATTTCTTTGAAATCTCCAAGGAAATCATTGAGTTAAATAAAAACGATAAACGCAACTTGAAAACCGGGTTCTATAAACTGCAAAAATTTGAAGATATTCAGGAGAAAATCCCGAAGGAATACCTTGCGAACATCCAATCCCTGTACATGATCAACGCGGGCAACCAGGATGAAGAGGAGAAGGATACTTACATTGACTTTATCCAGAAAATCTTCCTGAAAGGTTTTATGACCTACCTGGCTAATAACGGCCGCCTGAGCCTGATCTATATTGGCTCAGACGAAGAAACCAATACCTCGCTGGCTGAAAAGAAACAGGAATTCGACAAATTCCTGAAAAAATACGAACAGAACAATAACATTAAAATCCCATACGAGATTAACGAATTCCTGCGCGAGATCAAACTGGGTAACATTCTGAAATATACGGAGCGCCTGAACATGTTCTACCTGATTTTAAAACTGCTGAACCATAAAGAACTGACCAACCTGAAAGGTTCCCTGGAGAAATACCAGTCTGCTAACAAAGAAGAGGCTTTCAGCGACCAGCTGGAACTGATCAACCTCCTGAACCTGGATAACAATAGAGTGACTGAAGACTTCGAATTGGAAGCTGATGAAATCGGTAAGTTCCTGGACTTCAACGGTAATAAGGTGAAAGATAATAAAGAACTGAAGAAGTTCGATACCAACAAAATCTACTTCGACGGCGAAAACATCATCAAACACCGCGCGTTTTATAACATCAAAAAATACGGGATGCTGAACCTGCTGGAAAAAATCGCTGATAAAGCGGGCTATAAAATCTCTATTGAAGAGCTTAAAAAATACAGCAACAAAAAGAACGAAATCGAGAAGAATCACAAAATGCAGGAAAACCTGCATCGCAAATACGCCCGTCCGCGCAAAGACGAAAAATTCACCGACGAAGACTACGAATCCTATAAACAGGCCATCGAAAACATCGAAGAATATACCCACCTGAAAAACAAAGTGGAATTCAACGAACTGAACCTGCTGCAGGGCCTGCTGCTCCGTATCCTGCATCGTCTGGTCGGCTACACTTCCATCTGGGAACGTGACCTGCGTTTCCGTCTGAAAGGCGAATTTCCGGAAAACCAGTATATTGAAGAAATTTTCAATTTCGAAAACAAGAAAAACGTGAAATACAAAGGCGGTCAGATTGTTGAAAAATATATTAAATTCTATAAAGAACTGCACCAGAACGATGAAGTTAAAATCAATAAATACAGCAGCGCAAATATTAAAGTGCTGAAACAGGAGAAAAAAGATCTGTATATTCGTAACTATATCGCCCATTTCAACTATATCCCACACGCTGAAATTAGCCTGCTGGAAGTCCTGGAAAACCTGCGCAAACTGCTGAGCTATGATCGCAAACTGAAAAACGCGGTGATGAAATCCGTGGTTGATATTTTGAAAGAATACGGTTTCGTGGCAACTTTCAAAATCGGTGCAGATAAGAAAATTGGTATCCAGACCCTGGAAAGCGAAAAAATCGTCCACCTGAAAAACCTGAAGAAAAAGAAACTGATGACCGATCGTAACTCTGAGGAACTGTGTAAACTGGTTAAAATCATGTTCGAATATAAAATGGAAGAGAAAAAATCTGAAAACTAA。
2.crRNA体外转录及纯化
(1)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司(上海，中国)合成，三磷酸核苷酸的(NTP)混合物从生工生物工程(上海)股份有限公司购买。SYBR Green I染料从赛百盛基因有限责任公司(北京，中国)购买。退火所使用的PCR buffer(Mg2+)，RNA酶抑制剂，DL2000DNA Marker(包含2000-，1000-，750-，500-，250-和100-bp)的DNA片段从宝生物工程有限公司(大连，中国)购买。T7 RNA聚合酶及10×RNA聚合酶反应缓冲液从NEB(北京，中国)购买。RNA纯化试剂盒从天根生化科技(北京)有限公司(北京，中国)购买。
(2)通过互补的两条单链退火得到用于crRNA转录的双链DNA模板，两条互补的单链长度均为77nt，其中包含T7启动子区(GAAATTAATACGACTCACTATAGG)，退火体系含有：1×PCR buffer，10μM有义链和10μM无义链(均为终浓度，用DEPC处理水配制)，进行梯度退火，两条互补引物序列如下：
有义链：5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGACCACCCCAAAAATGAAGGGGACTAAAACCTACCTGCACTGTAAGCACTTTG-3'(划横线部分为T7启动子区)；
反义链：5'-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGGTTTTAGTCCCCTTCATTTTTGGGGTGGTCCCTAT AGTGAGTCGTATTAATTTC-3'(划横线部分为T7启动子区)。
转录反应是在转录缓冲液中，37℃条件下反应6～12h，转录体系(终浓度)为：5U/μL T7 RNA polymerase，1U/μL RNase抑制剂，2mM NTPmix和40ng/μL DNA模板。转录完成后，利用DNase I对DNA模板进行降解，然后用RNA纯化试剂盒对转录产物进行纯化，并通过Nanodrop 2000测定所得crRNA的浓度，随后置于-80℃保存。转录得到的crRNA的序列为：
5'-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCUACCUGCACUGUAAGCACUUUG-3'(划横线部分为靶基因相关序列)。
3.LbuCas13a蛋白纯化电泳分析与蛋白活性验证：
(1)蛋白Marker、BSA蛋白、RNase A(核糖核酸酶A)、考马斯亮蓝从生工生物工程(上海)股份有限公司购买，FQ5U探针从宝生物工程有限公司(大连，中国)合成，实时荧光检测使用CFX Connect Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad,CA,USA)，miR-10b以及miR-17从宝生物工程有限公司(大连，中国)购买。其中：
FQ5U序列为：FAM-rUrUrUrUrU-BHQ1(FAM表示5-羧基荧光素；rU(Uracilribonucleotide)表示尿嘧啶核糖核苷酸；BHQ1表示黑洞猝灭基团)；
miRNA-17序列为：5'-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3'；
miR-10b：5'-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3'。
(2)①将纯化后的蛋白进行8％SDS-PAGE凝胶电泳分析，泳道1、2分别加入1μL、2μL纯化后的蛋白，泳道3～7分别加入1、2、4、6、8μg BSA蛋白便于对LbuCas13a进行定量。上样完成后，80V电压25min，110V电压2h进行电泳，随后使用0.1％考马斯亮蓝进行染色1h，紧接着使用脱色液(50mL甲醇、50mL冰醋酸、400mL H2O)进行脱色，最终可看到蛋白条带。
②LbuCas13a蛋白活性验证：
以RNaseA+FQ5U作为阳性对照组(第1组)，以Cas13a/crRNA+miR-17+FQ5U为实验组(第2组)，在相同条件下，以Cas13a/crRNA+miR-10b+FQ5U，Cas13a/crRNA+FQ5U，Cas13a+miR-17+FQ5U，crRNA+miRNA-17+FQ5U，Cas13a+FQ5U以及H2O为对照组(第3～8组)，在荧光定量PCR仪上进行荧光信号采集，结果如图2所示，可看出阳性对照组和实验组可看到明显的荧光信号，证明纯化后的LbuCas13a蛋白具有较高的活性。
4.Cas/EXPAR-ECL检测miRNA分析系统可行性分析：
(1)本发明选择miR-17(miRNA-17)作为检测靶标，miR-17从宝生物工程有限公司(大连，中国)购买，Pre-trigger(PT)、EXPAR反应中模板链由上海生物工程有限公司合成，dNTPmix从生工生物工程(上海)股份有限公司购买，T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)酶，Nt.BstNBI切刻内切酶，vent DNA聚合酶及其反应buffer均从NEB(北京，中国)购买。其中：
miRNA-17序列为：5'-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3'；
pre-trigger(PT)序列为：5'-TTGGATGGATATTGT-rUrU-CATA-3'(划横线部分为与EXPAR中模板链互补配对部分；rU(Uracil ribonucleotide)表示尿嘧啶核糖核苷酸)。
(2)①miRNA触发Cas13a/crRNA复合体的反式切割活性
将miRNA-17，pre-trigger(PT)与Cas13a/crRNA复合体(Cas13a/crRNA复合体是由上述Cas13a蛋白和crRNA按摩尔比1：1混合得到)在37℃条件下孵育30min(体系中miRNA-17的浓度为1nM，pre-trigger(PT)的浓度为50nM，Cas13a/crRNA复合体的浓度为10nM)，激活后的Cas13a剪切与Cas13a/crRNA/miRNA复合体临近的PT，从而得到剪切后产物。
②T4 PNK酶处理剪切后产物
向上述溶液中加入2U T4PNK酶(终浓度0.2U/μL)，37℃条件下反应30min，得到成熟的触发链MT(由于上述剪切得到rU-probe后，其3′端为环磷酸化的U碱基，无法直接通过聚合酶进行扩增，必须首先使用T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)酶进行去磷酸化处理后才能够通过聚合酶延伸)。
③EXPAR扩增反应
准备EXPAR反应溶液：分为A溶液和B溶液；其中，A溶液包含扩增模板(0.1μM)，dNTPmix(250μM)和1.5μL上述剪切产物；B溶液包含Nt.BstNBI切刻内切酶(0.4U/μL)，vent DNA聚合酶(0.05U/μL)，1×Thermopol buffer(20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％(v/v)Triton X-10，pH 8.8)，1×NEBuffer 3.1(25mM Tris-HCl，50mM NaCl，5mM MgCl2和0.5mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，pH 7.9)(用DEPC处理水配制)；随后将A溶液与B溶液等体积混合，混合后体积为15μL，在55℃下反应30min得到dsDNA产物；其中，A溶液中的扩增模板的序列如下：
5'-AACTATCAACAATATCCATCCAAACAGACTCAAACTATCAACAATATCCATCCAA-3'。
④pBPE的制作
pBPE可参考中国专利(201610772576.9，纸基双极性电极电化学发光分子开关系统用于快速灵敏基因检测致病菌的方法)的实施例1制作，具体为：丝网印刷的网板的图案形状用Adobe Illustrator CS6设计，然后制作成网板(铝框200目尼龙网板)；网板的开口产生纸的疏水区域，而具有交联光敏材料的部分，则得到亲水性的区域；用蜡印的方法产生亲水的通道，然后用丝网印刷的方法将导电碳油墨(徐州博汇新材料科技有限公司，型号CNB-7，<60Ω/cm2)在纸通道上制作双极性电极和驱动电极；纸基双极性电极的制作过程如下：首先，将滤纸(纤维素滤纸，购于杭州沃华滤纸有限公司)裁剪成合适的尺寸(100毫米×80毫米)，并在纸张上通过网板丝网印刷上碳电极，然后置于100℃的烘箱8分钟，并将其冷却到室温；然后，将纸基电极置于纸张通道丝网膜的下方，将固体蜡通过丝网膜擦到纸张上；为了让更多的固体蜡印到纸上，用光滑的勺状的金属器具进一步按压丝网膜；纸被蜡印之后，和网板一起置于加热板上，并加热至80℃，约10秒，以将蜡熔化进纸，以形成疏水屏障，得到纸基双极性电极。
⑤pBPE-ECL检测
纸基双极性电极制作完成后，将上述双链DNA(dsDNA)产物进行pBPE-ECL检测：首先，将所制备的pBPE裁剪成单个，置于一个3D打印的一对塑料衬底中组装成芯片；然后，将上述dsDNA产物的溶液与含有0.5mM[Ru(phen)2dppz]2+(深圳金赛途生物)和70mM TPrA(≥98％，编号：102-69-2；Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州，美国))的混合液(用PBS缓冲液配制)定容至25μL，将混合液滴到pBPE的中心。将滴加溶液后的pBPE翻转，确保pBPE正面朝向PMT放置到暗盒里。最后，将芯片的一对驱动电极连接到一个直流电源上通电之前，需要等待30～60s，以确保整个纸基芯片的通道被溶液浸润。接着，施加适当的驱动电压(本实验的驱动电压设定为14V)。之后约10s，在pBPE的阳极可以获得一个ECL信号。
⑥数据采集和分析
由光电倍增管(电压设定为850V)收集的pBPE阳极的ECL信号被PMT放大，模拟信号被晶体管-晶体管逻辑(TTL)识别，并使用由LabView软件程序控制的多功能采集卡(PCI-1751，研华，台湾)进行采集，最终用基于Labview的光子计数的计算机程序记录，并用于进一步的分析；在实验中观察到的ECL信号不是一个稳定的数值，实际上随着时间衰减，这种现象可能是由于发光体的不可逆的分解造成的；实验中，我们将在10s内观察到的最大的发光信号作为有效的信号值。
(3)可行性验证
以上述Cas13a/crRNA+miRNA-17+PT为实验组(第1组)，在相同条件下，以Cas13a/crRNA+PT，Cas13a+miRNA-17+PT，crRNA+miRNA-17+PT，PT，以及Cas13a/crRNA+miRNA-17为对照组(第2～6组)，通过上述纸基双极性电极电化学发光系统进行可行性验证实验，结果如图3所示，可看出仅实验组可看到明显的ECL信号，证明该方案可行。
4.Cas/EXPAR-ECL检测系统用于miRNA系统的灵敏度分析:
为了验证我们新开发的Cas/EXPAR-ECL检测系统的灵敏度，将不同浓度的miR-17(100pM，10pM，1pM，100fM，10fM和1fM)分别加入到上述反应体系中进行扩增。扩增后的dsDNA产物分别与[Ru(phen)2dppz]2+和TPrA混合溶液孵育，来评估pBPE-ECL检测系统的灵敏度。
结果如图4所示，ECL强度随着miRNA浓度从100pM到1fM的降低而呈线性下降的趋势，不同浓度靶miRNA和阴性对照(不加入miR-17)的最大ECL发光信号如图所示，这表明该系统能够高灵敏度地检测miRNA。
5.Cas/EXPAR-ECL检测系统用于miRNA系统的特异性分析:
为了进一步验证pBPE-ECL检测系统的特异性，分别加入100pM miR-10b、miR-155、miR-21(检测靶标miRNA均从宝生物工程有限公司(大连，中国)购买)及miR-17至上述Cas13a/crRNA反应体系中进行特异性实验，分别加入到EXPAR体系中进行扩增反应。扩增后的dsDNA产物与含有[Ru(phen)2dppz]2+和TPrA的混合液(用PBS缓冲液配制)定容至25μL，来评估该检测系统的特异性。其中miR-10b、miR-155、miR-21的序列分别为：
miR-10b：5'-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3'；
miR-21：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'；
miR-155：5'-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3'；
结果如图5所示，只有加入miR-17的实验组加入[Ru(phen)2dppz]2+以后表现出显著的ECL信号。加入miR-10b，miR-155，miR-21和对照组(不加入靶标miRNA)没有dsDNA产物产生，所以ECL信号较低。这些结果证实，所设计的Cas/EXPAR-ECL检测系统用于miRNA检测具有很好的特异性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南师范大学
<120> CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法与应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1159
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LbuCas13a氨基酸序列
<400> 1
Met Lys Val Thr Lys Val Gly Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Thr Ser
1 5 10 15
Glu Gly Arg Leu Val Lys Ser Glu Ser Glu Glu Asn Arg Thr Asp Glu
20 25 30
Arg Leu Ser Ala Leu Leu Asn Met Arg Leu Asp Met Tyr Ile Lys Asn
35 40 45
Pro Ser Ser Thr Glu Thr Lys Glu Asn Gln Lys Arg Ile Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Met Val Tyr Leu Lys Asp Asn Thr Leu
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asn Gly Lys Lys Glu Asn Ile Asp Arg Glu Tyr Ser Glu
85 90 95
Thr Asp Ile Leu Glu Ser Asp Val Arg Asp Lys Lys Asn Phe Ala Val
100 105 110
Leu Lys Lys Ile Tyr Leu Asn Glu Asn Val Asn Ser Glu Glu Leu Glu
115 120 125
Val Phe Arg Asn Asp Ile Lys Lys Lys Leu Asn Lys Ile Asn Ser Leu
130 135 140
Lys Tyr Ser Phe Glu Lys Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile Asn Glu
145 150 155 160
Asn Asn Ile Glu Lys Val Glu Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile Ile Tyr
165 170 175
Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asp Ala Tyr Val Ser Asn Val
180 185 190
Lys Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Glu Glu Asp Ile Ala Lys Leu
195 200 205
Val Leu Glu Ile Glu Asn Leu Thr Lys Leu Glu Lys Tyr Lys Ile Arg
210 215 220
Glu Phe Tyr His Glu Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu Asn Phe
225 230 235 240
Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Met Lys Glu
245 250 255
Leu Ile Glu Lys Val Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser Gln Val
260 265 270
Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys Asn Ile
275 280 285
Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln Leu Leu
290 295 300
Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp Lys Ile
305 310 315 320
Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu Asn Lys
325 330 335
Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys Tyr Asn
340 345 350
Tyr Tyr Leu Gln Asp Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile Ala Arg
355 360 365
Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val Ser Ser
370 375 380
Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn Glu Asn
385 390 395 400
Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn Lys Gly
405 410 415
Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn Glu Asn
420 425 430
Lys Lys Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser Tyr Asp
435 440 445
Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala Asn Ile
450 455 460
Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe Asn Leu
465 470 475 480
Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala Pro Ser
485 490 495
Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys Lys Leu
500 505 510
Lys Leu Lys Ile Phe Arg Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe Arg Tyr
515 520 525
Leu Glu Lys Tyr Lys Ile Leu Asn Tyr Leu Lys Arg Thr Arg Phe Glu
530 535 540
Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys Leu Tyr
545 550 555 560
Ser Arg Ile Asp Asp Leu Lys Asn Ser Leu Gly Ile Tyr Trp Lys Thr
565 570 575
Pro Lys Thr Asn Asp Asp Asn Lys Thr Lys Glu Ile Ile Asp Ala Gln
580 585 590
Ile Tyr Leu Leu Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Phe
595 600 605
Met Ser Asn Asn Gly Asn Phe Phe Glu Ile Ser Lys Glu Ile Ile Glu
610 615 620
Leu Asn Lys Asn Asp Lys Arg Asn Leu Lys Thr Gly Phe Tyr Lys Leu
625 630 635 640
Gln Lys Phe Glu Asp Ile Gln Glu Lys Ile Pro Lys Glu Tyr Leu Ala
645 650 655
Asn Ile Gln Ser Leu Tyr Met Ile Asn Ala Gly Asn Gln Asp Glu Glu
660 665 670
Glu Lys Asp Thr Tyr Ile Asp Phe Ile Gln Lys Ile Phe Leu Lys Gly
675 680 685
Phe Met Thr Tyr Leu Ala Asn Asn Gly Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Ile
690 695 700
Gly Ser Asp Glu Glu Thr Asn Thr Ser Leu Ala Glu Lys Lys Gln Glu
705 710 715 720
Phe Asp Lys Phe Leu Lys Lys Tyr Glu Gln Asn Asn Asn Ile Lys Ile
725 730 735
Pro Tyr Glu Ile Asn Glu Phe Leu Arg Glu Ile Lys Leu Gly Asn Ile
740 745 750
Leu Lys Tyr Thr Glu Arg Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu
755 760 765
Leu Asn His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr
770 775 780
Gln Ser Ala Asn Lys Glu Glu Ala Phe Ser Asp Gln Leu Glu Leu Ile
785 790 795 800
Asn Leu Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu
805 810 815
Glu Ala Asp Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn Gly Asn Lys Val
820 825 830
Lys Asp Asn Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe
835 840 845
Asp Gly Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys
850 855 860
Tyr Gly Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Gly Tyr
865 870 875 880
Lys Ile Ser Ile Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu
885 890 895
Ile Glu Lys Asn His Lys Met Gln Glu Asn Leu His Arg Lys Tyr Ala
900 905 910
Arg Pro Arg Lys Asp Glu Lys Phe Thr Asp Glu Asp Tyr Glu Ser Tyr
915 920 925
Lys Gln Ala Ile Glu Asn Ile Glu Glu Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys
930 935 940
Val Glu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ile
945 950 955 960
Leu His Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg
965 970 975
Phe Arg Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn Gln Tyr Ile Glu Glu Ile
980 985 990
Phe Asn Phe Glu Asn Lys Lys Asn Val Lys Tyr Lys Gly Gly Gln Ile
995 1000 1005
Val Glu Lys Tyr Ile Lys Phe Tyr Lys Glu Leu His Gln Asn Asp Glu
1010 1015 1020
Val Lys Ile Asn Lys Tyr Ser Ser Ala Asn Ile Lys Val Leu Lys Gln
1025 1030 1035 1040
Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr
1045 1050 1055
Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu Glu Asn Leu Arg
1060 1065 1070
Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala Val Met Lys Ser
1075 1080 1085
Val Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala Thr Phe Lys Ile
1090 1095 1100
Gly Ala Asp Lys Lys Ile Gly Ile Gln Thr Leu Glu Ser Glu Lys Ile
1105 1110 1115 1120
Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys Leu Met Thr Asp Arg Asn
1125 1130 1135
Ser Glu Glu Leu Cys Lys Leu Val Lys Ile Met Phe Glu Tyr Lys Met
1140 1145 1150
Glu Glu Lys Lys Ser Glu Asn
1155
<210> 2
<211> 3480
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LbuCas13a核酸序列
<400> 2
atgaaagtga ctaaagtagg tggcattagc cataaaaaat acacctctga aggtcgcctg 60
gttaagtccg aatccgaaga aaaccgcact gacgagcgtc tgagcgcgct gctgaacatg 120
cgtctggaca tgtacatcaa aaacccgtcc tctaccgaaa ccaaagaaaa ccagaaacgc 180
atcggcaaac tgaaaaaatt tttctcaaat aagatggttt acctgaaaga caacaccctg 240
agcctgaaaa acggcaaaaa agaaaacatc gaccgcgagt atagcgaaac cgacatcctg 300
gaatccgacg tgcgtgataa aaagaacttc gcagtgctga aaaagatcta ccttaacgaa 360
aacgttaact ccgaagaact tgaagtgttc cgtaatgaca ttaagaaaaa actgaacaaa 420
attaactcac tgaaatatag cttcgagaaa aacaaagcga actaccagaa aattaacgaa 480
aacaacatcg aaaaagttga aggtaaatct aaacgtaata ttatttacga ctactaccgc 540
gagtctgcca aacgtgacgc gtacgttagc aacgtaaaag aagcgtttga taaactgtac 600
aaagaagaag atatcgctaa gctggttctg gaaatcgaaa acctgactaa gctggaaaaa 660
tataaaatcc gtgagtttta tcacgaaatt atcggccgta aaaacgacaa agaaaacttc 720
gctaaaatta tctatgaaga aattcagaac gtgaacaaca tgaaagagct gatcgaaaag 780
gttccggata tgagtgaact gaaaaaatct caggtcttct ataaatacta tcttgacaag 840
gaagagctga acgataaaaa tatcaaatac gcgttctgtc acttcgtcga aattgaaatg 900
tcacaattgc tgaaaaacta cgtttataaa cgtctgtcca acatctctaa cgacaagatc 960
aaacgcattt tcgagtatca aaacctgaaa aaattgatcg aaaacaaact cctgaacaaa 1020
ctggacacct atgtgcgtaa ctgcggaaaa tacaactact atctgcaaga tggcgaaatc 1080
gcaacctcgg attttatcgc gcgtaaccgt cagaacgaag catttctgcg taacatcatc 1140
ggtgtctcct ccgttgctta ctttagcctg cgcaacatcc tggaaactga aaatgagaat 1200
gacatcacgg gccgtatgcg cggcaaaacc gtgaaaaata acaaaggtga ggaaaaatac 1260
gtttctggcg aagttgacaa aatctataac gaaaacaaga aaaacgaagt gaaagaaaac 1320
ctgaagatgt tctactccta cgacttcaac atggacaaca aaaatgaaat cgaggatttc 1380
tttgctaaca tcgatgaagc tatttcgtct atccgccacg gtattgtgca cttcaacttg 1440
gaactggaag gcaaggacat cttcgctttt aaaaacattg ccccgagcga gatctctaag 1500
aaaatgttcc agaacgaaat caacgagaaa aaattaaaac tgaaaatctt ccgtcaactg 1560
aatagcgcaa acgtttttcg ctacctggaa aaatacaaaa tcctgaacta ccttaaacgc 1620
acgcgtttcg aattcgtgaa caagaacatc ccgttcgttc cgtctttcac taaactgtac 1680
agtcgtattg atgatctgaa aaacagcctg ggcatctatt ggaagacccc gaagaccaac 1740
gatgacaaca aaaccaaaga aatcatcgac gcgcagatct acctgcttaa aaacatttac 1800
tacggtgaat ttctgaacta ctttatgagc aacaacggca atttctttga aatctccaag 1860
gaaatcattg agttaaataa aaacgataaa cgcaacttga aaaccgggtt ctataaactg 1920
caaaaatttg aagatattca ggagaaaatc ccgaaggaat accttgcgaa catccaatcc 1980
ctgtacatga tcaacgcggg caaccaggat gaagaggaga aggatactta cattgacttt 2040
atccagaaaa tcttcctgaa aggttttatg acctacctgg ctaataacgg ccgcctgagc 2100
ctgatctata ttggctcaga cgaagaaacc aatacctcgc tggctgaaaa gaaacaggaa 2160
ttcgacaaat tcctgaaaaa atacgaacag aacaataaca ttaaaatccc atacgagatt 2220
aacgaattcc tgcgcgagat caaactgggt aacattctga aatatacgga gcgcctgaac 2280
atgttctacc tgattttaaa actgctgaac cataaagaac tgaccaacct gaaaggttcc 2340
ctggagaaat accagtctgc taacaaagaa gaggctttca gcgaccagct ggaactgatc 2400
aacctcctga acctggataa caatagagtg actgaagact tcgaattgga agctgatgaa 2460
atcggtaagt tcctggactt caacggtaat aaggtgaaag ataataaaga actgaagaag 2520
ttcgatacca acaaaatcta cttcgacggc gaaaacatca tcaaacaccg cgcgttttat 2580
aacatcaaaa aatacgggat gctgaacctg ctggaaaaaa tcgctgataa agcgggctat 2640
aaaatctcta ttgaagagct taaaaaatac agcaacaaaa agaacgaaat cgagaagaat 2700
cacaaaatgc aggaaaacct gcatcgcaaa tacgcccgtc cgcgcaaaga cgaaaaattc 2760
accgacgaag actacgaatc ctataaacag gccatcgaaa acatcgaaga atatacccac 2820
ctgaaaaaca aagtggaatt caacgaactg aacctgctgc agggcctgct gctccgtatc 2880
ctgcatcgtc tggtcggcta cacttccatc tgggaacgtg acctgcgttt ccgtctgaaa 2940
ggcgaatttc cggaaaacca gtatattgaa gaaattttca atttcgaaaa caagaaaaac 3000
gtgaaataca aaggcggtca gattgttgaa aaatatatta aattctataa agaactgcac 3060
cagaacgatg aagttaaaat caataaatac agcagcgcaa atattaaagt gctgaaacag 3120
gagaaaaaag atctgtatat tcgtaactat atcgcccatt tcaactatat cccacacgct 3180
gaaattagcc tgctggaagt cctggaaaac ctgcgcaaac tgctgagcta tgatcgcaaa 3240
ctgaaaaacg cggtgatgaa atccgtggtt gatattttga aagaatacgg tttcgtggca 3300
actttcaaaa tcggtgcaga taagaaaatt ggtatccaga ccctggaaag cgaaaaaatc 3360
gtccacctga aaaacctgaa gaaaaagaaa ctgatgaccg atcgtaactc tgaggaactg 3420
tgtaaactgg ttaaaatcat gttcgaatat aaaatggaag agaaaaaatc tgaaaactaa 3480
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T7启动子区
<400> 3
gaaattaata cgactcacta tagg 24
<210> 4
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 有义链
<400> 4
gaaattaata cgactcacta tagggaccac cccaaaaatg aaggggacta aaacctacct 60
gcactgtaag cactttg 77
<210> 5
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义链
<400> 5
caaagtgctt acagtgcagg taggttttag tccccttcat ttttggggtg gtccctatag 60
tgagtcgtat taatttc 77
<210> 6
<211> 53
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> crRNA
<400> 6
gaccacccca aaaaugaagg ggacuaaaac cuaccugcac uguaagcacu uug 53
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> miRNA-17
<400> 7
caaagugcuu acagugcagg uag 23
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> miR-10b
<400> 8
uacccuguag aaccgaauuu gug 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttggatggat attgtruruc ata 23
<210> 10
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 扩增模板
<400> 10
aactatcaac aatatccatc caaacagact caaactatca acaatatcca tccaa 55
<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> miR-21
<400> 11
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 12
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> miR-155
<400> 12
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23

Claims (8)

1.一种CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）将miRNA、pre-trigger与Cas13a/crRNA复合体混合均匀后于37℃条件下孵育30~40min，得到触发链；
（2）将T4 PNK酶加入到步骤（1）中得到的触发链中，37℃条件下反应30~50min，得到成熟的触发链；
（3）将步骤（2）中得到的成熟的触发链加入到EXPAR反应体系中进行扩增反应，得到dsDNA产物；
（4）将步骤（3）中得到的dsDNA产物与含有“光开关”分子和TPrA的溶液混合后进行pBPE-ECL检测，在pBPE的阳极获得ECL信号，根据获得的信号值，实现对microRNA的检测；
步骤（1）中所述的miRNA为miRNA-17，其核苷酸序列如下所示：
5'-CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG-3'；
步骤（1）中所述的pre-trigger的核苷酸序列如下所示：
5'-TTGGATGGATATTGT-rUrU-CATA-3'；
步骤（1）中所述的Cas13a/crRNA复合体为由Cas13a蛋白和crRNA复合得到的复合体；
所述的Cas13a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的crRNA的序列如下所示：
5'-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCUACCUGCACUGUAAGCACUUUG-3'；
步骤（3）中所述的扩增反应通过如下步骤实现：
（I）配制EXPAR反应溶液：EXPAR反应溶液包括A溶液和B溶液，其中，A溶液包括0.1 μM的扩增模板，250 μM的 dNTP mix和10%（v/v）成熟的触发链；B溶液包括0.4 U/μL的Nt.BstNBI切刻内切酶，0.05U/μL 的vent DNA聚合酶，1×Thermopol buffer和1×NEBuffer 3.1；其中，A溶液中的扩增模板的序列如下所示：
5'-AACTATCAACAATATCCATCCAAACAGACTCAAACTATCAACAATATCCATCCAA-3'；
（II）EXPAR扩增反应：将A溶液与B溶液等体积混合后在55℃下反应30 min，得到dsDNA产物；
步骤（4）中所述的“光开关”分子为 [Ru(phen)2dppz]2+；
所述的方法为非疾病诊断治疗目的。
2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法，其特征在于：
所述的crRNA为通过互补的两条DNA单链退火得到，其序列如下所示：
有义链：5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGACCACCCCAAAAAT GAAGGGGACTAAAACCTACCTGCACTGTAAGCACTTTG-3'；
反义链：5'-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGGTTTTAGTCCCCTTCA TTTTTGGGGTGGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC-3'；
编码所述LbuCas13a蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法，其特征在于：
步骤（I）中所述的1×Thermopol buffer的配方如下：20 mM Tris-HCl，10 mM KCl，10mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1 %（v/v）Triton X-10，pH 8.8；
步骤（I）中所述的1×NEBuffer 3.1的配方如下： 25 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，5 mMMgCl2 和 0.5 mM二硫苏糖醇，pH 7.9。
4.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的miRNA的用量为按终浓度为10-6~10nmol/L计算；
步骤（1）中所述的pre-trigger的用量为按终浓度为25~100nmol/L计算；
步骤（1）中所述的Cas13a/crRNA复合体的用量为按终浓度为5~20nmol/L计算；
步骤（2）中所述的T4PNK酶的用量为按终浓度为0.2 U/μL计算；
步骤（4）中所述的含有“光开关”分子和TPrA的溶液中“光开关”分子的浓度为30 μmol/L～0.5 mmol/L；TPrA的浓度为10 mmol/L～100 mmol/L；
步骤（4）中所述的双链DNA产物与含有“光开关”分子和TPrA的混合液的体积比为3:2。
5.根据权利要求4所述的CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的miRNA的用量为按终浓度为1~10nmol/L计算；
步骤（1）中所述的pre-trigger的用量为按终浓度为50nmol/L计算；
步骤（1）中所述的Cas13a/crRNA复合体的用量为按终浓度为10nmol/L计算。
6.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法，其特征在于：
步骤（4）中所述的pBPE-ECL检测通过如下步骤实现：
将双链DNA产物与含有“光开关”分子和TPrA的溶液进行混合，得到混合液，然后将混合液滴到pBPE上，再将pBPE正面朝向PMT并将其放置到暗盒里，最后，将pBPE的一对驱动电极连接到直流电源上，施加驱动电压；在pBPE的阳极获得一个ECL信号，将在10s内观察到的最大的可再现的发光信号作为有效的信号值，实现对microRNA的检测；
所述的驱动电压设定为14 V。
7.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的孵育的时间为30min。
8.权利要求1～7任一项所述的CRISPR/Cas13a结合电化学发光系统检测microRNA的方法在非疾病诊断治疗目的的检测microRNA中的应用。
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