CN112322764B - 布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法 - Google Patents

布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测布鲁氏杆菌的crRNA、试剂盒及检测方法，其中crRNA选自如下所示的序列：crRNA1：其序列如SEQ ID NO.6所示；crRNA2：其序列如SEQ ID NO.7所示；crRNA3：其序列如SEQ ID NO.8所示；crRNA4：其序列如SEQ ID NO.9所示。本发明基于布鲁氏杆菌Omp25基因设计并筛选crRNA，同时结合CRISPR‑Cas12a系统及RPA等温扩增技术，可在短时间内检测待测样本中是否存在布鲁氏杆菌，操作简单、检测速度快、成本低、可多次重复检测，同时检测灵敏度和检测特异性也显著提高，其中最低检测限可达到10拷贝/μL。

Description

布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏杆菌(Brucella)感染引起的疾病，是一种人畜共患性全身传染病，简称"布病"，又有地中海弛张热、马耳他热、波浪热等称谓。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定动物报告疾病，我国目前已经在《中华人民共和国传染病防治法》把它归类为乙类传染病，与我们更为熟悉的"非典"、"猪流感"、炭疽、艾滋病、狂犬病、乙肝等同属一类传染病。布鲁菌可通过皮肤黏膜、呼吸道、消化道等途径侵入机体，引起发热、流产、不育、虚弱、关节痛等临床症状。布鲁菌宿主广泛、传染性强，不同种布鲁菌具有宿主间交叉感染的能力，对畜牧业和人类健康均构成严重威胁。因此，在当前严峻的防控形势下研发简便、快速、精确的布鲁氏杆菌检测技术就显得非常迫切。
布鲁氏杆菌(Brucella)是一种革兰氏阴性的不运动细菌，无荚膜(光滑型有微荚膜)，触酶、氧化酶阳性，绝对嗜氧菌，可还原硝酸盐，细胞内寄生，可以在很多种家畜体内存活。目前，布鲁菌属主要有7个种，为羊种布鲁菌、牛种布鲁菌、猪种布鲁菌、犬种布鲁菌、绵羊附睾种布鲁菌、沙林鼠种布鲁菌和海洋哺乳动物种布鲁菌共21个生物型。布鲁菌广泛分布于世界各地，调查全世界有170个国家和地区有布鲁菌病报道发生，最严重的地区位于地中海沿岸和阿拉伯半岛诸国，该病在印度、墨西哥、美国的南部和中部地区也较普遍。尽管一些国家已经有效控制了布鲁菌病，但中亚地区逐渐成为人布鲁菌病的新发地区。据统计，全球每年出现约50万例人布鲁菌病。布鲁菌病在我国也广泛存在，尤其是在以畜牧业生产为主的地区。2009年全国布鲁菌病监测数据显示，全国有29个省区、市发生畜间布鲁菌病，牛、羊、猪等感染量达百万头之多，见于内蒙、东北、西北等牧区。人布鲁菌病亦呈上升趋势，人布鲁菌病疫情表现出明显的职业性、地区性、季节性，人布鲁菌病可能与接触感染动物有关。因此，必须从根本上预防和控制动物布鲁菌病。
外膜蛋白与布鲁氏菌的胞内生存有关，涉及侵袭、胞内迁移、复制等很多方面，对维持细胞结构稳定、抵御宿主细胞免疫杀伤有重要作用。外膜蛋白Omp25是布鲁氏菌入侵宿主细胞初期在酸性介质环境中释放的一种蛋白，是布鲁氏菌的重要毒力因子。该蛋白可以引发孕畜流产，缺失Omp25基因的布鲁氏菌致病力下降，且能够保护宿主免受布鲁氏菌的感染。Omp25蛋白具有良好的抗原性，能够诱导小鼠产生免疫反应，使其对布鲁氏菌具有抵抗作用。因此Omp25可以作为布鲁氏菌的特异基因来对其进行分离鉴定。
病原分离鉴定是诊断布鲁菌病的传统方法，被认为是诊断该病的“金标准”。布鲁菌生长缓慢，所需营养条件复杂，而且样本中必须有活菌存在。而且，布鲁菌分离培养需在p2级以上生物安全实验室进行。另外，细菌学方法不能鉴别与疫苗菌株同生物型的野生菌株分离株，因此，细菌学方法在布鲁菌疫苗株鉴别诊断方面具有局限性。传统的分子检测技术以基因扩增为主，包括核酸杂交技术、常规PCR、巢式PCR、多重PCR等技术。PCR技术敏感、特异、高效、快速，但假阳性高。核酸杂交技术具有灵敏度高，特异性强，实用性好的特点，是多种动物疫病诊断的常规方法，但操作复杂、成本高，普通实验室没有相应设备，易出现假阳性。基因芯片和高通量测序技术快速简便、特异性强、灵敏度高和高通量化，但成本高和对操作人员水平要求高。这就使得开发布鲁氏菌病的简便、快速、精准的现场诊断方法变得尤为重要。因此，亟需提供一种简单快速，且灵敏度、特异性高的特异性片段检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法，基于布鲁氏杆菌的Omp25基因设计并筛选相应的crRNA，并结合CRISPR-Cas12系统及RPA等温扩增技术，以检测待测样本中是否存在布鲁氏杆菌，所述试剂盒及检测方法不仅操作简单、检测速度快、成本低，同时检测灵敏度和检测特异性也显著提高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种用于检测布鲁氏杆菌的crDNA，所述crDNA选自如下所示的序列：
crDNA1：其序列如SEQ ID NO.2所示；
crDNA2：其序列如SEQ ID NO.3所示。
crDNA3：其序列如SEQ ID NO.4所示；
crDNA4：其序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了一种用于检测布鲁氏杆菌的crRNA，所述crRNA选自如下所示的序列：
crRNA1：其序列如SEQ ID NO.6所示；
crRNA2：其序列如SEQ ID NO.7所示。
crRNA3：其序列如SEQ ID NO.8所示；
crRNA4：其序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明还提供了一种布鲁氏杆菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述crDNA或crRNA。
进一步的，所述检测试剂盒还包括Cas12a蛋白和荧光探针。
进一步的，所述Cas12a蛋白为FnCas12a蛋白。
进一步的，所述荧光探针序列的5’端标记有荧光基团，3’端标记有猝灭基团。
进一步的，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的任一种，所述猝灭基团选自TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的任一种。
进一步的，所述检测试剂盒中还包括DNA酶抑制剂。
本发明还提供了上述crDNA或crRNA或上述检测试剂盒在检测布鲁氏杆菌的非疾病诊断和治疗目的上的用途。
本发明还提供了一种布鲁氏杆菌的非疾病诊断和治疗目的的检测方法，所述方法包括如下步骤：
S1、扩增待测样本的核酸得到扩增产物；
S2、将所述的扩增产物、上述crRNA、Cas12a蛋白、荧光探针和无酶水构成的检测体系进行检测。
进一步的，将所述检测体系孵育后利用胶体金试纸进行检测或测定荧光值变化。通过胶体金试纸进行可视化检测时，将孵育后的检测体系加至胶体金试纸的检测区，通过检测线的有无确定检测结果，操作简便快速，使用范围广泛。也可将孵育后的检测体系利用荧光检测仪检测反应前后的荧光变化，进而判断待测样本中是否含有布鲁氏杆菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种用于检测布鲁氏杆菌的crDNA、crRNA及包含所述crDNA或crRNA的检测试剂盒及检测方法。本发明基于布鲁氏杆菌Omp25基因设计相应的crRNA，并对crRNA进行筛选验证，同时结合CRISPR-Cas12a系统及RPA等温扩增技术，可在短时间内通过荧光信号的变化或者胶体金试纸上检测线的有无，检测待测样本中是否存在布鲁氏杆菌。所述试剂盒及检测方法无需特殊昂贵的仪器，仅进行等温扩增反应即可实现快速检测，操作简单、检测速度快、成本低、可多次重复检测，同时检测灵敏度和检测特异性也显著提高，其中最低检测限可达到10拷贝/μL。
附图说明
图1为本发明实施例3中4个crRNA的筛选检测结果；
图2为本发明实施例3中SEQ ID NO.6所示crRNA在检测时的荧光值随时间变化的检测结果图；
图3为本发明实施例3中特异性检测时的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图4为本发明实施例3中特异性检测时的荧光值变化检测结果；
图5为本发明实施例4中灵敏性试验检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1用于检测布鲁氏菌的crRNA的设计及获得
1、根据如SEQ ID NO.1所示的布鲁氏菌病Omp25基因特异性序列，设计4条特异性的带T7启动子的crDNA序列，其序列分别如SEQ ID NO.2-5所示。
2、靶向基因突变位点crRNA的设计
(1)靶向基因突变位点crRNA设计原则
由于CRISPR-Cas12a系统是一种新型的靶向DNA基因编辑系统，其中Cas12a与crRNA结合形成监测复合物，crRNA的向导区域用互补序列识别目标DNA，并且Cas12a降解目标DNA链。其中所述crRNA设计要求：crRNA包括蛋白锚定序列和向导序列，序列格式为：5`-与Cas12a蛋白结合的锚定序列-crRNA向导序列-3`，蛋白锚定序列需要根据Cas12a蛋白来确定，使其能够与选定的Cas12a蛋白匹配并结合；向导序列则与靶向DNA中的片段匹配。crRNA向导序列不能离起始密码子(ATG)太近；长度为22-24个核苷酸。
(2)crDNA序列的选择
本发明中选用的Cas12蛋白为FnCas12a，因此选定与Cas12a蛋白结合的锚定序列为UAAUUUCUACUCUUGUAGAU(如SEQ ID NO.10所示)；所述crRNA向导序列根据SEQ ID NO.1所示的Omp25基因保守序列进行设计，即得到了如SEQ ID NO.2-5所示的4条crDNA。
(3)crRNA的获得
将上述设计得到的4条crDNA片段分别在T7 RNA聚合酶(转录反应体系如表1所示)作用下生成RNA，回收纯化得到crRNA。
表1转录反应体系
Figure BDA0002832042840000061
所得crRNA为：如SEQ ID NO.6-9所示的序列。
实施例2布鲁氏杆菌的检测试剂盒及检测方法
1、试剂盒的组成
本试剂盒包括用于检测布鲁氏杆菌的4个crRNA(SEQ ID NO.6-9所示)或者4个crDNA(SEQ ID NO.2-5所示，当试剂盒中为crDNA时，需要操作者先将crDNA片段分别在T7RNA聚合酶作用下生成RNA，回收纯化得到crRNA，具体见实施例1)、一条特异性荧光探针(选自表2)、Cas12a蛋白(本实施例采用的是FnCas12a蛋白)、无酶水、DNA酶抑制剂；
表2荧光探针序列
荧光探针 序列(5’-3’)
探针1 FAM-TTTTTTTT-BHQ1
探针2 FAM-TTTTTTTTTT-BHQ1
探针3 FAM-TTTTTTTTTTTT-BHQ1
2、布鲁氏杆菌的检测方法
(1)取50-100ng待测样本DNA，加入等温扩增体系(RPA等温扩增体系)中，RPA等温扩增体系如表3所示，其中所述引物选自SEQ ID NO.11-12或SEQ ID NO.13-14或SEQ IDNO.15-16或SEQ ID NO.17-18所示的等温扩增引物对(四对引物任选其一)。
表3RPA等温扩增体系
Figure BDA0002832042840000071
(2)将所述得到的扩增产物、与所述检测试剂：对应的crRNA、Cas12a蛋白、荧光探针和无酶水按照表4所示进行混合，得到检测体系。
表4检测体系
Figure BDA0002832042840000072
将上述检测体系混匀，并在检测缓冲液(NEBuffer 3)中37℃孵育1～3小时。同时设立阴性对照组(将扩增产物替换为无酶水)。将所述检测体系孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区进行检测，观察检测线的有无；或者将所述检测体系孵育后利用荧光检测仪测定荧光值，统计分析反应前后荧光值的变化情况，以判断待测待测样本DNA中是否存在布鲁氏杆菌。
实施例3特异性检测
1、crRNA的筛选检测
合成布鲁氏杆菌Omp25基因的靶序列，分别利用实施例1设计的4个crRNA构建CRISPR-Cas12a体系，并进行检测筛选，使用荧光定量PCR仪检测各体系的荧光信号变化，检测结果如图1所示。结果显示，针对同一靶基因设计不同的crRNA，其检测效果存在差异，选取相较于阴性对照在含靶基因的体系中荧光值变化更显著，即灵敏度更高，效果更优异的crRNA，即如SEQ ID NO.6所示的crRNA。其中SEQ ID NO.6所示的crRNA在检测时的荧光值随时间变化的结果如图2所示，结果显示，含靶基因的体系(布鲁氏菌病)和阴性对照随时间增加均出现了荧光信号的升高，随着时间的延长，在反应进行到20-30分钟时，含靶基因体系的荧光信号为阴性对照组的2到3倍以上，即显著高于阴性对照。因此利用该方法可以判定待测样本中是否含有布鲁氏杆菌。
2.特异性检测
选取SEQ ID NO.6所示的crRNA，按照实施例2所述的检测方法进行检测，并以布鲁氏杆菌Omp25基因、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和双歧杆菌分别作为待测样本DNA，以验证特异性。琼脂糖凝胶电泳检测结果和荧光检测结果分别如图3和图4所示。根据图3，其中除了布鲁氏杆菌外，其他的菌体均没有条带，即均没有出现扩增，即本发明的检测方法具有很高的特异性；而根据图4荧光值的变化，随着时间的延长，含有布鲁氏杆菌Omp25基因的样本的荧光强度显著增强，而其他菌体与阴性对照类似，其荧光强度基本无变化，从而进一步证明了本发明检测方法的特异性。
实施例4灵敏性试验
为了确定本发明的检测方法的最小检出量，合成含有布鲁氏杆菌Omp25基因的质粒标准品，并将其分别稀释为107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL等7个浓度梯度分别作为模板，选取SEQ ID NO.6所示的crRNA，按照实施例2所述的检测方法进行检测，结果如图5所示。结果显示，本发明的检测方法具有较广的检测范围，在浓度为101拷贝/μL时，在第40-45min的荧光信号值与阴性对照存在显著差异，即本发明检测方法的最低检测限至少为101拷贝/μL。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉博杰生物医学科技有限公司
<120> 布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)
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gcttttgctg ccgacgccat ccaggaacag cctccggttc cggctccggt tgaagtagct 120
ccccagtata gctgggctgg tggctatacc ggtctttacc ttggctacgg ctggaacaag 180
gccaagacca gcaccgttgg cagcatcaag cctgacgatt ggaaggctgg cgcctttgct 240
ggctggaact tccagcagga ccagatcgta tacggtgttg aaggtgatgc aggttattcc 300
tgggccaaga agtccaagga cggcctggaa gtcaagcagg gctttgaagg ctcgctgcgt 360
gcccgcgttg gctacgacct gaacccggtt atgccgtacc tcacggctgg tattgccggt 420
tcgcagatca agcttaacaa cggcttggac gacgaaagca agttccgcgt gggttggacg 480
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tacacccagt acggcaacaa gaactatgat ctggccggta cgactgttcg caacaagctg 600
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<400> 18
ccagatcata gttcttgttg ccgtact 27

Claims (10)

1.一种用于检测布鲁氏杆菌的crDNA，其特征在于，所述crDNA选自如下所示的序列：
crDNA1：其序列如SEQ ID NO.2所示；
crDNA2：其序列如SEQ ID NO.3所示；
crDNA3：其序列如SEQ ID NO.4所示；
crDNA4：其序列如SEQ ID NO.5所示。
2.一种用于检测布鲁氏杆菌的crRNA，其特征在于，所述crRNA选自如下所示的序列：
crRNA1：其序列如SEQ ID NO.6所示；
crRNA2：其序列如SEQ ID NO.7所示；
crRNA3：其序列如SEQ ID NO.8所示；
crRNA4：其序列如SEQ ID NO.9所示。
3.一种布鲁氏杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的crDNA或权利要求2所述的crRNA。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括Cas12a蛋白和荧光探针。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述Cas12a蛋白为FnCas12a蛋白。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针序列的5’端标记有荧光基团，3’端标记有猝灭基团。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的任一种，所述猝灭基团选自TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的任一种。
8.如权利要求1所述的crDNA或权利要求2所述的crRNA或权利要求3-7任一项所述的检测试剂盒在检测布鲁氏杆菌的非疾病诊断和治疗目的上的用途。
9.一种布鲁氏杆菌的非疾病诊断和治疗目的的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、扩增待测样本的核酸得到扩增产物；
S2、将所述的扩增产物、权利要求2所述的crRNA、Cas12a蛋白、荧光探针和无酶水构成的检测体系进行检测。
10.如权利要求9所述的的检测方法，其特征在于，将所述检测体系孵育后利用胶体金试纸进行检测或测定荧光值变化。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112941212A (zh) * 2021-03-23 2021-06-11 大连海关技术中心 用于现场检测布鲁氏杆菌的通用型引物组、试剂盒及方法
CN114164214B (zh) * 2021-06-11 2022-11-22 山东舜丰生物科技有限公司 一种基于crispr技术检测病原微生物的方法
CN113637778B (zh) * 2021-07-15 2022-07-19 内蒙古大学 一种用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法
CN113528686B (zh) * 2021-08-20 2022-05-03 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 用于布氏杆菌的detectr核酸检测的试剂和试剂盒
CN114015792B (zh) * 2021-11-10 2023-07-07 内蒙古大学 一种用于检测布鲁氏杆菌的荧光试剂盒与检测方法
CN116042878B (zh) * 2023-01-30 2024-07-23 内蒙古大学 一种用于检测和区分布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法
CN116004870B (zh) * 2023-01-30 2024-07-19 内蒙古大学 一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法
CN118240979A (zh) * 2024-04-22 2024-06-25 武汉科技大学 一种可视化检测HIV的CRISPR-Cas12a系统以及检测方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103243095A (zh) * 2013-01-30 2013-08-14 天津市动物疫病预防控制中心 用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物及检测反应体系
WO2020106630A1 (en) * 2018-11-19 2020-05-28 The Regents Of The University Of California Methods for detecting and sequencing a target nucleic acid
CN109486974A (zh) * 2018-12-13 2019-03-19 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种布鲁氏杆菌重组酶聚合酶扩增检测试剂盒及其应用
CN111394490B (zh) * 2020-05-15 2020-12-29 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 用于土拉杆菌的CRISPR-Cas12a检测引物组及其应用

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