CN117070650B - 广谱检测分枝杆菌的引物、探针、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种广谱检测分枝杆菌的引物、探针、试剂盒及其应用，涉及分枝杆菌广谱检测技术领域；引物探针组合包括正向引物、反向引物和探针，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4‑6所示。本发明提供的引物探针组合，能检测160多种分枝杆菌，覆盖范围广，检测时间大幅缩短；专属性强，与非分枝杆菌的细胞、病毒基因组均无交叉反应；检测灵敏度高，检测限达到100CFU/ml，基因组检测限为10‑20copies/reaction；耐用性及抗基质干扰能力强。

Description

广谱检测分枝杆菌的引物、探针、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及分枝杆菌广谱检测技术领域，特别涉及广谱检测分枝杆菌的引物、探针、试剂盒及其应用。
背景技术
分枝杆菌(Mycobacterium)是一类无鞭毛、无芽胞、细长略弯曲的杆菌，呈分枝状生长。分枝杆菌分为结核分枝杆菌复合群(MTC)、麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌(NTM)三大类。根据LPSN(https://lpsn.dsmz.de/)的公布，分枝杆菌目前已有266种，24个亚种。分枝杆菌感染所引起的疾病呈慢性，并伴有肉芽肿，如结核、麻风病等对人类健康造成重大威胁。环境水体和土壤中广泛存在的非结核分枝杆菌属于条件致病菌，可引起人体肺脏感染，淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等组织器官的病变，甚至造成全身播散性疾病。近年来，由非结核分枝杆菌引起的传染病在世界范围内的流行率有所增加。越来越多非结核分枝杆菌被报道存在致病性且具有潜在风险。目前已报道从临床和环境分离的存在致病性的分枝杆菌约有50种。
国家药监局等监管机构要求细胞库、细胞治疗类生物制品等产品均需要进行分枝杆菌污染检测。常规检测分枝杆菌的方法为培养法或豚鼠法。培养法是将待检样品接种于固体培养基37℃恒温培养56天，豚鼠法则需要豚鼠接种42天后再进行剖检。培养法和豚鼠法均存在检测周期长、生长缓慢、分离率低和容易污染等问题，无法满足对时效性要求高、样本成本较高的干细胞治疗类生物制品的快速检验放行的需求。FDA指南、《欧洲药典》、《中国药典》明确指出可用经过全面验证的核酸扩增(NAT)法检测分枝杆菌。因此，基于核酸扩增(NAT)法的技术思路，提供一种专门针对绝大多数分枝杆菌的，简单高效、重现性好、灵敏度高的广谱检测方法，是当前我国的分枝杆菌检测技术发展的迫切需求。
发明内容
NAT法中的qPCR法具有简单高效、重现性好、灵敏度高等优点，国内外生物制品的质控检测广泛使用该方法。本发明建立了一种可快速广谱检测160多种分枝杆菌的TaqMan荧光定量PCR引物探针组合、试剂盒及检测方法，可在数小时内完成分枝杆菌污染的检测，极大地满足细胞库、病毒种子库、细胞治疗产品等生物制品高时效性的检测需求。具体通过以下技术实现。
广谱检测分枝杆菌的引物探针组合，包括正向引物、反向引物和探针，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述检测探针的5’端偶联有第一荧光基团，3’端偶联有淬灭基团。
优选地，所述第一荧光基团为FAM、TET、NED、ROX、CY3、CY5、VIC、JOE或HEX荧光基团；所述淬灭基团为TAMRA、NFQ、ECLIPSE、DABCYL、BHQ1或BHQ2淬灭基团。
优选地，所述第一荧光基团为FAM荧光基团，所述淬灭基团为BHQ1淬灭基团。
更优选地，制备用于广谱检测分枝杆菌的产品。
一种广谱检测分枝杆菌的试剂盒，包括上述任一引物探针组合。
优选地，上述试剂盒还包括内控探针和内控质粒，所述内控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述内控质粒中的目标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述内控探针的5’端偶联有第二荧光基团，3’端偶联有淬灭基团，所述第二荧光基团的种类与所述第一荧光基团不同。
一种不以疾病诊断和治疗为目的的广谱检测分枝杆菌的方法，采用上述任一试剂盒进行检测。
优选地，上述广谱检测分枝杆菌的方法包括以下步骤：
根据获取待测样品类型选择是否进行预处理过程；
若无需进行样本预处理，则直接配制成供试品溶液进行核酸提取；
若需要进行样本预处理，则预处理过程是加入细胞裂解液处理(可选地，一般裂解30min左右即可)，离心后收集沉淀作为供试品；
将所述内控质粒加至供试品或qPCR反应液中，提取供试品中的核酸；将阳性对照质粒加入内控质粒和无核酸酶水并稀释配制成阳性对照；
取无菌生理盐水为阴性对照(NCS)，加入内控质粒(IC)与所述供试品同步提取，或者提取完核酸后于qPCR反应中加入内控质粒(IC)；无模板对照(NTC)为无核酸酶水，或者用无核酸酶水配制的内控质粒；
在荧光定量PCR仪上创建第一荧光基团检测通道和第二荧光基团检测通道，对供试品、无模板对照(NTC)、阴性对照(NCS)、阳性对照(PC)分别进行qPCR反应，分别读取双通道的Ct值；
针对Ct值进行结果判定；
分别在对应的通道查看扩增情况，供试品检测扩增曲线的阈值线为所述阳性对照中目标通道Ct值的10％，内控质粒扩增曲线的阈值线为无模板对照或阴性对照中内控通道Ct值的10％；
质控结果的要求如下表1所示。
表1质控结果的要求
样品检测结果的判定标准如下表2所示。
表2样品检测结果判定标准
需要说明的是，本发明的阳性对照中，阳性对照质粒的种类和基因序列不限，可根据实际情况而定。一般而言，只要是含有分枝杆菌检测靶序列的质粒，都可以用作本发明的阳性对照质粒。
可选地，阳性对照质粒可以选用pUC57-M.tuberculosis、pUC57-M.terrae、pUC57-M.xenopi这三种重组质粒的混合液。
需要说明的是，若内控质粒在样本核酸提取过程加入，检测后判定为阴性的供试品的第二荧光基团通道Ct值，与提取阴性对照(NCS)中第二荧光基团通道Ct值间隔应在+/-3cycles范围之内。若内控质粒在qPCR反应时加入，检测后判定为阴性的供试品的第二荧光基团通道Ct值与提取阴性对照中第二荧光基团通道Ct值间隔应在+/-2cycles范围之内。第二荧光基团通道信号如果有抑制，需重测或对样品进行合适处理消除抑制因子。
与现有技术相比，本发明提供的引物探针组合和相应的qPCR检测方法的有益之处在于：
1、利用本发明提供的引物探针组合进行双重荧光定量PCR，根据Ct值和扩增曲线能够快速判断出样本中是否存在分枝杆菌污染，可以检测160多种分枝杆菌，覆盖范围广；
2、本发明提供的检测方法可在数小时内完成分枝杆菌污染的检测，与传统检测方法相比，检测时间大幅缩短；
3、专属性强，与人和动物细胞、真菌，除分枝杆菌外的其他细菌、支原体，以及常见基因治疗相关病毒基因组均无交叉反应；
4、检测灵敏度高，检测限达到100CFU/ml，基因组检测限为10-20copies/reaction，灵敏度不低于《中国药典》标准。
5、耐用性及抗基质干扰能力强，引入107个293T/CHO/Vero细胞及1ml培养上清，并提取100CFU/ml分枝杆菌基因组后亦能检出。
6、本发明设置了HEX通道内部控制系统(内控质粒和内控探针)，在检测分枝杆菌时能够监测待测样品提取及qPCR反应是否存在抑制现象，可以有效避免假阴性的出现，结果判断更加准确可靠。
附图说明
图1为实施例3中分枝杆菌qPCR检测体系的检测能力验证结果；
图2为实施例3中标准质粒灵敏度验证结果；
图3为实施例4中本发明引物探针组合与非分枝杆菌的交叉反应验证结果；
图4为实施例5中分枝杆菌检测方法的耐用性验证结果；
图5为实施例5中分枝杆菌检测方法的耐用性验证结果；
图6为实施例6中内控探针特异性验证结果；
图7为实施例6中分枝杆菌检测与内控质粒有无交叉反应验证结果；
图8为实施例7中应用本发明的引物探针组合和检测方法的检测结果。
具体实施方式
TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种，与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光标记和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光标记发出的荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，则探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所使用的引物探针组合中，检测探针的5’端偶联有第一荧光基团，3’端偶联有淬灭基团；内控探针的5’端偶联有第二荧光基团，3’端偶联有淬灭基团。
可选地，第一荧光基团可以从FAM、TET、NED、ROX、CY3、CY5、VIC、JOE、HEX荧光基团，或者其他荧光基团中任选一种。
可选地，第二荧光基团同样可以从FAM、TET、NED、ROX、CY3、CY5、VIC、JOE、HEX荧光基团，或者其他荧光基团中任选一种，但第二荧光基团不能与第一荧光基团相同。
可选地，淬灭基团可以从TAMRA、NFQ、ECLIPSE、DABCYL、BHQ1、BHQ2淬灭基团，或者其他淬灭基团中任选一种。
检测探针和内控探针上的淬灭基团选择不作要求，既可以相同，也可以不同。
以下实施例中，第一荧光基团选用FAM荧光基团为例，第二荧光基团选用HEX荧光基团为例，淬灭基团均选用BHQ1荧光基团为例。
以下实施例中所使用的检测引物均由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，检测探针、内控探针和内控质粒均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
以下实施例中所使用的RNase-free water(无RNA酶水)，也是Nuclease-freewater(无核酸酶水)，即不含RNA酶，也不含DNA酶。
以下实施例中所采用的技术方案若无特别说明，则均采用常规分子生物学技术。所使用的人源细胞(例如人胚肾细胞293及293T、人脐带间充质干细胞MSC)、猴源细胞系(例如非洲绿猴肾细胞Vero)、仓鼠源细胞系(例如仓鼠肾细胞BHK-21、仓鼠卵巢细胞CHO-K1)、牛源细胞系(例如牛肾细胞MDBK)、猪源细胞系(例如猪肾细胞PK-15)均为公司自主保藏。所使用的腺病毒HAd-5、腺相关病毒AAV-2、大肠杆菌(Escherichia coli)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、口腔支原体(Mycoplasma oral)均为公司自主保藏。
可选地，当将内控质粒加至供试品中时，内控质粒为700copies/样本。当将内控质粒加至qPCR反应液中时，内控质粒为200copies/孔。
可选地，每个反应孔中，阳性对照中阳性对照质粒和内控质粒分别为1000copies/孔和200copies/孔。
若无特别说明，下列实施例中所采用的各试剂(例如qPCR反应液、核酸提取体系的各试剂、各缓冲液等)、各试剂盒和技术方案，均采用市售的试剂、试剂盒，以及行业内常规的分子生物学技术操作完成。
实施例1：引物探针的合成
1、分枝杆菌引物探针设计：
查阅《欧洲药典》、《中国药典》、《非结核分枝杆菌病诊断与治疗指南(2020版)》、相关文献等资料，确定常见致病性分枝杆菌种类，于NCBI下载其16SrRNA核酸序列。将分枝杆菌16S rRNA与其他细菌16S rRNA、支原体16S rRNA、真菌18S rRNA核酸序列比对，设计能特异检测分枝杆菌的引物探针，含2条正向引物、1条反向引物和3条检测探针，其中引物由天一辉远合成，检测探针由生工合成，序列如下表3所示。
表3引物探针组合的核苷酸序列
2、内控质粒及探针序列
人工合成内控质粒目标片段并构建重组质粒pUC57-IC，以此质粒为模板添加到分枝杆菌qPCR检测体系，目标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：
taggcggcttgtcgcgttgtctatgcatgcgagactgacctgagctaggagctgaacttgcctaggtgctagcggtg gaatgcgcagatatc。
相应的内控探针ProbeIC的核苷酸序列，如SEQ ID NO.7所示，具体为：
HEX-catgcgagactgacctgagctaggagctg-BHQ1
实施例2：分枝杆菌qPCR检测体系的建立及内控质粒添加
合成pUC57-IC重组质粒并测定浓度，根据公式计算pUC57-IC质粒拷贝数，梯度稀释至1×103copies/μl备用。
合成qPCR检测体系中与内控共用引物的pUC57-M.xenopi重组质粒，并测定浓度，根据公式计算其质粒拷贝数并梯度稀释至10copies/μl。采用TaKaRa公司的Probe qPCRMix，按下表4配置qPCR检测反应体系，使反应孔中pUC57-M.xenopi为100copies/reaction；并按下表5的反应程序进行双通道qPCR。
表4qPCR检测反应体系
表5qPCR程序
经确认，IC添加量为200copies/reaction时，不会影响pUC57-M.xenopi检测灵敏度Ct值，且内控通道能稳定检出。
实施例3：分枝杆菌qPCR检测体系的检测能力验证
1、分枝杆菌检测范围预测
将设计完毕的引物探针在NCBI中的Primer-BLAST进行特异性序列搜索比对，结果显示本发明中的引物探针可覆盖167种分枝杆菌(含致病性分枝杆菌39种)，统计结果见表6。
表6特异性序列搜索比对统计结果
Mycobacterium(分枝杆菌) NO.of Species(种类)
Mycobacterium tuberculosis complex(MTC) 5
Mycobacterium leprae 1
non-tuberculous Mycobacteria(NTM) 161
Total(总计) 167
2、分枝杆菌检测范围验证
以中国食品药品检定研究院的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒中国家参考品中的11种分枝杆菌(鸟分枝杆菌M.avium、土地分枝杆菌M.terrae、施氏分枝杆菌M.shimoidei、堪萨斯分枝杆菌M.kansasii、亚洲分枝杆菌M.asiaticum、瘰疬分枝杆菌M.scrofulaceum、戈登分枝杆菌M.gordonae、龟脓分枝杆菌M.abscessus、偶然分枝杆菌M.fortuitum、草分枝杆菌M.phlei、结核分枝杆菌M.tuberculosis)为材料，提取11种分枝杆菌参考品的基因组，并采用上表4和表5所示的qPCR检测反应体系和qPCR程序进行检测。
如图1所示，11种分枝杆菌均能100％检出，扩增情况汇总结果如下表7所示。
表7扩增情况汇总
分枝杆菌(1×103个菌/ml) 检出率(检出数/总反应数) 平均Ct值
M.avium 100％(3/3) 30.61
M.terrae 100％(3/3) 31.28
M.shimoidei 100％(3/3) 30.63
M.kansasii 100％(3/3) 30.47
M.asiaticum 100％(3/3) 30.98
M.scrofulaceum 100％(3/3) 30.30
M.gordonae 100％(3/3) 31.05
M.abscessus 100％(3/3) 29.74
M.fortuitum 100％(3/3) 30.50
M.phlei 100％(3/3) 28.83
M.tuberculosis 100％(3/3) 30.59
3、标准质粒灵敏度验证，标准曲线的建立
选取6种分枝杆菌(M.tuberculosis、M.lepare、M.scrofulaceum、M.xenopi、M.terrae、M.phlei)人工构建分枝杆菌16S rRNA标准质粒，使用Plasmid Mini Kit I(OMEGA)试剂盒进行分枝杆菌16S rRNA标准质粒的提取，并测量质粒浓度，计算质粒拷贝数，稀释至2×106-2×102copies/μl质粒标准品溶液作标准曲线各点。以2×101copies/μl质粒标准品溶液作为质粒灵敏度对照。
采用上表4和表5的扩增体系及反应程序进行qPCR，在不同3天进行3次独立重复实验，每次实验质粒灵敏度对照重复8孔。
检测结果显示：6种分枝杆菌的扩增效率均＞90％，且相关系数R2≥0.99，质粒灵敏度均达到100copies/reaction。实验结果见表8及图2。
表8标准质粒灵敏度验证结果
4、分枝杆菌基因组检测限
以三种分枝杆菌M.bovis BCG(上海瑞楚生物科技有限公司，卡介苗冻干粉)、M.phlei(本公司培养法得到的平板菌)和M.gordonae(ATCC购买)为例，使用TaKaRaMiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(TaKaRa，9763)提取基因组DNA，并根据基因组大小及所测浓度计算拷贝数并进行梯度稀释；分别以100、50、20、10copies/reaction作为反应样本，在不同3天做3次独立重复实验，每次实验每个稀释度重复8孔，反应体系及反应程序同表4和表5。
结果如下表9所示，M.bovis BCG基因组核酸检测限为20copies/reaction；M.phlei基因组检测限为10copies/reaction；M.gordonae基因组检测限为20copies/reaction。
表9检测限验证结果
5、分枝杆菌标准品检测限的验证
以中国食品药品检定研究院结核分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品中的精密性参考品(结核分枝杆菌CMCC 93009，1×102个菌/ml)及北京三药科技开发公司的耻垢分枝杆菌M.smegmatis标准品(0.5-1×103CFU/ml，稀释10倍后使用)为材料，用本公司研发的分枝杆菌基因组提取方法，于4天提取4次样品，每次2个复样。每天提取后进行qPCR检测，每个样品3复孔，4次实验共24孔，反应体系及反应程序同表4和表5所示。
结果如表10所示：本方案中的qPCR检测方法可以稳定检出结核分枝杆菌(100个菌/ml)、耻垢分枝杆菌(100CFU/ml)，符合现行版《中国药典》对分枝杆菌检测灵敏度要求。
表10分枝杆菌标准品检测限验证结果
实施例4：分枝杆菌检测方法的特异性验证
1、各生物细胞基因组DNA的提取
(1)人类及动物细胞基因组DNA
猪肾细胞PK-15、牛肾细胞MDBK、非洲绿猴肾细胞Vero、中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1、人胚肾细胞293及293T、仓鼠肾细胞BHK-21、人脐带间充质干细胞MSC，均由本公司保存，采用QIAamp○R Mini kit(50)(QIAGEN，51304)提取基因组DNA。
(2)病毒基因组DNA
腺病毒HAd-5、腺相关病毒AAV-2由本公司保存，采用Viral Nucleic Acidpurification kit(simgen，4002050)提取基因组DNA。
(3)细菌基因组DNA
大肠杆菌(Escherichia coli)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)，均由本公司保存，采用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNAExtraction Kit Ver.3.0(TaKaRa，9763)提取基因组DNA。
(4)常见支原体基因组DNA
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、口腔支原体(Mycoplasma oral)由本公司保存，采用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(TaKaRa，9763)提取基因组DNA。
2、工作浓度基因组DNA的制备
采用微量分光光度计测量以上所提细胞、细菌、支原体基因组DNA的浓度。根据所测浓度，将细菌、支原体基因组用RNase-free Water稀释至0.2ng/μl，将人类及动物细胞基因组稀释至20ng/μl，腺病毒HAd-5、腺相关病毒AAV-2取1ml物理滴度为108copies/ml病毒液提取DNA后取5μl为模板参与qPCR。取pUC57-M.tuberculosis重组质粒作为阳性对照质粒。
qPCR反应体系、扩增程序同上表4和表5一致。
结果如图3所示，可以看到，本发明的引物探针组合与非分枝杆菌均无交叉反应；非分枝杆菌基因组DNA扩增情况汇总如表11所示。
表11常见非分枝杆菌细胞
实施例5：分枝杆菌检测方法的耐用性验证
分枝杆菌为胞内菌，检测污染分枝杆菌的细胞样品时，需将培养上清及细胞裂解共提取检测，提取过程引入的细胞DNA可能会抑制分枝杆菌靶标扩增，从而影响检测，因此需要进行耐用性验证。
提取293T/CHO/Vero细胞基因组，测量浓度并稀释至80ng/μl备用。分别以100copies/reaction的土分枝杆菌M.terrae、蟾分枝杆菌M.xenopi、结核分枝杆菌M.tuberculosis质粒标准品为对照；分别在100copies/reaction的土分枝杆菌M.terrae、蟾分枝杆菌M.xenopi、结核分枝杆菌M.tuberculosis质粒标准品中引入400ng/reaction的293T/CHO/Vero细胞基因组，将上述所有样品进行分枝杆菌qPCR检测，qPCR反应体系、反应程序同表4和表5。
验证结果如图4和表12所示，与无293T/CHO/Vero细胞基因组的对照相比，293T/CHO/Vero细胞基因组的引入均不会导致分枝杆菌检测假阴性。
表12分枝杆菌检测方法的耐用性验证结果
以中国食品药品检定研究院结核分枝杆菌PCR检测试剂盒中的结核分枝杆菌M.tuberculosis精密性参考品(100个菌)，以及北京三药科技开发公司的M.smegmatis(耻垢分枝杆菌)标准品(100CFU)为材料，人为污染含1ml培养上清的107个293T/CHO/Vero细胞样品。利用本公司研发的分枝杆菌基因组提取方法提取分枝杆菌基因组核酸，进行分枝杆菌qPCR检测，qPCR反应体系、反应程序同表4和表5所示。
验证结果如图5及表13，不添加分枝杆菌的细胞样品均未出现扩增信号，人为污染结核和耻垢分枝杆菌的样本检出阳性。
表13分枝杆菌检测方法的耐用性验证结果
实施例6：内控探针特异性、分枝杆菌qPCR检测与内控质粒有无交叉反应验证
1、内控探针的特异性验证
分别将11种分枝杆菌、8种人类及动物细胞、2种病毒、9种细菌、2种支原体提取基因组备用，使用本方案的分枝杆菌qPCR检测方法进行验证，qPCR反应体系、反应程序同上表4和表5所示。
实验结果如表14及图6所示，表明内控探针与人类及动物细胞、病毒、分枝杆菌、细菌、支原体基因组均无交叉反应。
表14交叉反应验证结果
2、分枝杆菌qPCR检测与内控质粒有无交叉反应验证
在提取分枝杆菌基因组的过程中，取1ml无菌生理盐水作为阴性对照NCS，引入700copies/样本的内控质粒，提取完毕后进行分枝杆菌qPCR检测，反应体系及反应程序同上表4和表5。
如图7所示，阴性对照样品NCS的HEX通道产生正常的扩增曲线而FAM通道未产生荧光信号，证明引入的内控质粒与分枝杆菌检测无交叉反应，样本检测过程中不会因为内控质粒的引入导致假阳性。
实施例7：分枝杆菌检测方法的应用实例
利用本方案中的qPCR法对CHO细胞种子库及工作库样品进行分枝杆菌检查，以确定是否有分枝杆菌污染，并选择在提取过程中加入内控质粒，检测样本和阴性对照的DNA提取选用MinElute Virus Spin Kit(QIAGEN 57704)试剂盒，按产品说明书操作即可。具体方法为：
阴性对照：取1ml无菌生理盐水，预处理后加入700copies的内控质粒，提取DNA；
检测样本：分别取107个种子库或工作库中的CHO细胞及1ml培养上清，预处理后加入700copies的内控质粒，提取DNA；
阳性对照：取试剂盒中的阳性对照质粒(pUC57-M.tuberculosis、pUC57-M.terrae、pUC57-M.xenopi重组质粒混合液)稀释至100copies/μl后取10μl加入qPCR反应管，取试剂盒中的内控质粒稀释至1000copies/μl后取0.2μl加入qPCR反应管；
具体地，pUC57-M.tuberculosis、pUC57-M.terrae、pUC57-M.xenopi重组质粒是分别将能监测分枝杆菌qPCR反应的结核分枝杆菌、土分枝杆菌、蟾分枝杆菌的16S rRNA核酸序列转入pUC57质粒中，并使用Plasmid Mini Kit I(OMEGA)试剂盒进行提取后获得。经过测定浓度并计算质粒拷贝数，并稀释至1×108copies/μl，将三者等体积混合后作为备用。
无模板对照：无RNA酶水加入qPCR反应管。
qPCR反应体系、反应程序同上表4和表5一致。
检测结果如图8及表15所示，依据表1的质控结果要求和表2的样品检测结果判定标准，判定CHO细胞种子库及工作库均无分枝杆菌污染。
表15检测结果
以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.广谱检测分枝杆菌的引物探针组合，其特征在于，由正向引物、反向引物、检测探针、内控探针和内控质粒组成，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述检测探针的5’端偶联有第一荧光基团，3’端偶联有淬灭基团；
所述内控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述内控质粒中的目标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述内控探针的5’端偶联有第二荧光基团，3’端偶联有淬灭基团，所述第二荧光基团的种类与所述第一荧光基团不同。
2.根据权利要求1所述的广谱检测分枝杆菌的引物探针组合，其特征在于，所述第一荧光基团为FAM、TET、NED、ROX、CY3、CY5、VIC、JOE或HEX荧光基团；所述淬灭基团为TAMRA、NFQ、ECLIPSE、DABCYL、BHQ1或BHQ2淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的广谱检测分枝杆菌的引物探针组合，其特征在于，所述第一荧光基团为FAM荧光基团，所述淬灭基团为BHQ1淬灭基团。
4.权利要求1-3任一项所述的引物探针组合在制备用于广谱检测分枝杆菌的产品中的应用。
5.一种广谱检测分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的引物探针组合。
6.一种不以疾病诊断和治疗为目的的广谱检测分枝杆菌的方法，其特征在于，采用权利要求5所述的试剂盒进行检测。
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