JP7194548B2 - シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅するプライマーおよびこれを利用したシュードモナス・エルギノーサの検出方法 - Google Patents
シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅するプライマーおよびこれを利用したシュードモナス・エルギノーサの検出方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、院内感染の原因菌であるシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅するプライマーおよびこれを利用したシュードモナス・エルギノーサの検出方法に関する。
シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）は、健常人であれば感染症を引き起こすリスクは極めて低い菌であるが、外科手術・がん治療・移植手術などによって抵抗力が低下した患者においては、術後感染症、人工呼吸器関連肺炎や重篤な菌血症の起因菌となる。また近年では、シュードモナス・エルギノーサ感染症の予防治療に有効であったフルオロキノロン系 （シプロフロキサシン、レボフロキサシンなど）、カルバペネム系（イミペネム、メロペネムなど）、アミノグリコシド系（アミカシンなど）の抗菌薬に対して耐性を持つ多剤耐性シュードモナス・エルギノーサが出現し、大きな社会問題となっている。
現在、易感染患者（immunocompromised host）における感染症起因菌の院内検査方法として、選択培地や専用の培養ボトルを用いた培養法が用いられているが（非特許文献１）、菌の検出から同定までに３～７日程度の日数が必要とされ、迅速性や正確性に欠ける点が問題であった。さらにシュードモナス・エルギノーサによる感染症は、重症病態の経過を辿るため、臨床検体からの本菌の迅速高感度な検出法の確立が、(i)起因菌の早期同定による適切な抗菌薬の選択と早期治療に繋がり、より高い治癒率、合併症予防をもたらすこと、(ii)不必要な多剤併用療法を回避し、新たな薬剤耐性菌の出現を予防しうること、などから臨床において重要な課題であった。また、院内において、多剤耐性P. aeruginosaのアウトブレイクが発生した場合には、不顕性感染患者の検出や病原菌の媒介因子の同定が重要である。さらに、多剤耐性P. aeruginosaに対する適切な抗菌薬の使用は重要な課題であり、常に適切な抗菌薬を選択すべく、抗菌薬使用時における病態と起因菌の定期的なモニタリングが望まれている。
一方、我々は、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法による血液中細菌の迅速（所要時間約６時間）かつ高感度（１ｃｅｌｌ／ｍｌより検出可）な定量法を構築し（非特許文献２）、様々な病態の患者の血液中細菌の検出に有効であることを明らかにしてきた（非特許文献３～６）。しかしながらシュードモナス・エルギノーサを血液、糞便等から高感度に分別定量可能な技術の報告は認められない。
Sigurdardottir K, Digranes A, Harthug S, Nesthus I, Tangen JM, Dybdahl B, Meyer P, Hopen G, Lokeland T, Grottum K, Vie W, Langeland N. (2005) A multi-centre prospective study of febrile neutropenia in Norway: microbiological findings and antimicrobial susceptibility. Scand J Infect Dis 37: 455-64.
Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. (2007) Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol 73: 32-9.
Sakaguchi S, Saito M, Tsuji H, Asahara T, Takata O, Fujimura J, Nagata S, Nomoto K, Shimizu T. (2010) Bacterial rRNA-targeted reverse transcription-PCR used to identify pathogens responsible for fever with neutropenia. J Clin Microbiol 48: 1624-8.
Nishigaki E, Abe T, Yokoyama Y, Fukaya M, Asahara T, Nomoto K, Nagino M. (2014) The detection of intraoperative bacterial translocation in the mesenteric lymph nodes is useful in predicting patients at high risk for postoperative infectious complications after esophagectomy. Ann Surg 259: 477-84.
Okazaki T, Asahara T, Yamataka A, Ogasawara Y, Lane GJ, Nomoto K, Nagata S, Yamashiro Y. (2016) Intestinal microbiota in pediatric surgical cases administered Bifidobacterium breve: a randomized controlled trial. J Pediatr Gastroenterol Nutr 63: 46-50.
Sato J, Kanazawa A, Azuma K, Ikeda F, Goto H, Komiya K, Kanno R, Tamura Y, Asahara T, Takahashi T, Nomoto K, Yamashiro Y, Watada H. (2017) Probiotic reduces bacterial translocation in type 2 diabetes mellitus: A randomised controlled study. Sci Rep 21;7: 12115.
本発明の課題は、シュードモナス・エルギノーサ感染の早期診断へ利用できる技術を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、これまでほとんど公知になっていなかったシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡを利用することにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーである。
また、本発明は、 以下の工程（１）～（４）
（１）試料からＲＮＡを抽出する工程
（２）（１）で抽出したＲＮＡに相補的な塩基配列を作製する工程
（３）シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーと、（２）で作製した塩基配列を用いて増幅反応を行う工程
（４）増幅の有無を確認する工程
を含むことを特徴とするシュードモナス・エルギノーサの検出方法
である。
（１）試料からＲＮＡを抽出する工程
（２）（１）で抽出したＲＮＡに相補的な塩基配列を作製する工程
（３）シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーと、（２）で作製した塩基配列を用いて増幅反応を行う工程
（４）増幅の有無を確認する工程
を含むことを特徴とするシュードモナス・エルギノーサの検出方法
である。
更に、本発明は、配列番号４～７に記載の塩基配列で示されるシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列および当該配列に相補的なシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡである。
本発明のプライマーは、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することができる。
そのため、このプライマーを利用すれば、シュードモナス・エルギノーサを血液、糞便等から高感度に、かつ、迅速に分別定量可能となり、シュードモナス・エルギノーサによる院内感染を制御することができる。
本発明のプライマーは、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部、好ましくはプライマーで挟まれた配列を特異的に増幅するものである。ここで特異的に増幅とは、シュードモナス・エルギノーサ以外の微生物の２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列を増幅しないことを言い、例えば、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）、シュードモナス・ステュゼリ（P. stutzeri）、シュードモナス・ルテオラ（P. luteola）、シュードモナス・オリジハビタンス（P. oryzihabitans）、シュードモナス・プチーダ（P. putida）、シュードモナス・トラッシー（P. tolaasii）、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）、シュードモナス・フルオレッセンス（P. fluorescens）等のシュードモナス・エルギノーサの近縁種の２３Ｓ ｒＲＮＡを増幅しないことを言う。なお、本発明のプライマーによれば、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡを、例えば、血液中であれば１ｃｅｌｌ／ｍｌ以上で、糞便であれば１００ｃｅｌｌｓ／ｇ以上で特異的に増幅することができる。
本発明のプライマーとしては、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列を基に作製することができる、例えば、複数のシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列、より具体的には配列番号３～８の何れかに記載の塩基配列で示されるシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列、好ましくはこれらの全てに記載の塩基配列で示されるシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列と、上記したシュードモナス・エルギノーサの近縁種の２３Ｓ ｒＲＮＡについて、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ソフトウェア（Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22: 4673-80）を用いて整列を行った後、シュードモナス・エルギノーサに特異的な配列をもとにプライマーの設計を行えばよい。このプライマーについて、その他の細菌の ｒＲＮＡ遺伝子配列に相補的な塩基配列と交差しないことを、例えば、NCBI BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）により確認すればよい。
本発明のプライマーとして好ましいものとしては以下のものが挙げられる。
s-Pa-F（配列番号１）
GTCGTCTTTTAGATGACGAAGTGG
s-Pa-R（配列番号２）
TGGTATCTTCGACCAGCCAGA
s-Pa-F（配列番号１）
GTCGTCTTTTAGATGACGAAGTGG
s-Pa-R（配列番号２）
TGGTATCTTCGACCAGCCAGA
なお、上記プライマーは、当業者によく知られた通常のＤＮＡの合成法、例えば、ＤＮＡ合成機を用いて得ることもできるし、シグマアルドリッチジャパン社やライフテクノロジーズジャパン社などのＤＮＡ合成業者等に合成を依頼して得ることができる。
また、上記プライマーの設計で利用したシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列（配列番号３～８）は以下の菌株由来である。なお、シュードモナス・エルギノーサ ＡＴＣＣ１０１４５ Type strainとシュードモナス・エルギノーサ ＤＳＭ６１９５の２３Ｓ ｒＲＮＡは同一の配列であり、シュードモナス・エルギノーサ ＡＴＣＣ１５４４２とシュードモナス・エルギノーサ ＪＣＭ５９６１の２３Ｓ ｒＲＮＡは同一の配列であった。
シュードモナス・エルギノーサ ＡＴＣＣ１０１４５ 基準株（Type strain）
（配列番号３）
シュードモナス・エルギノーサ ＡＴＣＣ９０２７
（配列番号４）
シュードモナス・エルギノーサ ＡＴＣＣ１５４４２
（配列番号５）
シュードモナス・エルギノーサ ＪＣＭ２７７６
（配列番号６）
シュードモナス・エルギノーサ ＪＣＭ５９６１
（配列番号７）
シュードモナス・エルギノーサ ＤＳＭ６１９５
（配列番号８）
ＡＴＣＣ：10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 USA
ＪＣＭ：〒３０５－００７４ 日本国茨城県つくば市高野台３－１－１ 理化学研究所 バイオリソース研究センター 微生物材料開発室（ＪＣＭ）
ＤＳＭ：DSM's Head Office Het Overloon 16411 TE Heerlen, the Netherlands.
シュードモナス・エルギノーサ ＡＴＣＣ１０１４５ 基準株（Type strain）
（配列番号３）
シュードモナス・エルギノーサ ＡＴＣＣ９０２７
（配列番号４）
シュードモナス・エルギノーサ ＡＴＣＣ１５４４２
（配列番号５）
シュードモナス・エルギノーサ ＪＣＭ２７７６
（配列番号６）
シュードモナス・エルギノーサ ＪＣＭ５９６１
（配列番号７）
シュードモナス・エルギノーサ ＤＳＭ６１９５
（配列番号８）
ＡＴＣＣ：10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 USA
ＪＣＭ：〒３０５－００７４ 日本国茨城県つくば市高野台３－１－１ 理化学研究所 バイオリソース研究センター 微生物材料開発室（ＪＣＭ）
ＤＳＭ：DSM's Head Office Het Overloon 16411 TE Heerlen, the Netherlands.
上記シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列のうち、配列番号４～７に記載の塩基配列で示されるシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列は新規のものである。
以上説明した本発明のプライマーは、シュードモナス・エルギノーサを検出する方法（以下、「本発明検出方法」という）に利用することができる。
具体的に本発明検出方法は、以下の工程（１）～（４）
（１）試料からＲＮＡを抽出する工程
（２）（１）で抽出したＲＮＡに相補的な塩基配列を作製する工程
（３）シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーと、（２）で作製した塩基配列を用いて増幅反応を行う工程
（４）増幅の有無を確認する工程
を含む。
（１）試料からＲＮＡを抽出する工程
（２）（１）で抽出したＲＮＡに相補的な塩基配列を作製する工程
（３）シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーと、（２）で作製した塩基配列を用いて増幅反応を行う工程
（４）増幅の有無を確認する工程
を含む。
本発明検出方法の工程（１）において用いられる試料としては、特に限定されないが、例えば、血液、糞便、喀痰、尿、臓器、洗浄液、組織、細胞が挙げられる。これらの試料の中でも血液、糞便が好ましい。
上記試料からＲＮＡを抽出する方法は、特に限定されないが、例えば、フェノールやクロロホルム、ベンジルクロライドなどの有機溶剤を用いて抽出する方法や、ガラスビーズ振盪により物理的に菌体を破砕する方法、アルカリを直接添加する方法、加熱処理による方法、あるいはプロテアーゼ処理法等の方法が挙げられる。また、試料からＲＮＡを抽出するにあたり、市販のＲＮＡ抽出キットを用いてもよい。これらの方法の中でもプロテアーゼ処理を含む方法がＲＮＡの抽出の所要時間が短く、かつ抽出効率が高い点から好ましい。
具体的に、試料として血液や糞便を用いる場合、ＲＮＡの抽出は、ホットフェノール法（文献： Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. (2007) Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol 73: 32-39.）等に基づいて行うことができる。また、抽出したＲＮＡに相補的な塩基配列を作製する工程では、逆転写酵素を用いた公知の方法で行うことができる。
本発明検出方法の工程（３）において、上記したシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅するプライマーと、（２）で作製した塩基配列を用いた増幅反応には、例えばＰＣＲ等の公知のプライマーを用いる増幅反応が利用できる。これらの増幅反応の中でもＰＣＲが好ましい。また、これら増幅反応は公知の条件を用いることができる。更に、これら増幅反応は、市販のＰＣＲキット等を利用してもよい。また、（２）と（３）の工程を併せてＲＴ－ＰＣＲ法で行ってもよい。
具体的に、増幅反応として、定量的ＲＴ－ＰＣＲを用いた場合、抽出したＲＮＡを鋳型として、市販のＲＴ－ＰＣＲキット等で、４０～６０℃で２０～４０分間、８０～９５℃で１０～２０分間、ＲＴ反応を行い、次いで、９０～９８℃で１０～３０秒間、５０～７０℃で１０～３０秒間、７０～８０℃で２０～４０秒間を１サイクルとするＰＣＲ反応を４０～６０サイクル行えばよい。
本発明検出方法の工程（４）において、増幅の有無の確認は、アガロースゲル電気泳動等の公知の方法で行うことができる。この増幅が有った場合には、試料中にシュードモナス・エルギノーサが含まれていたと判断することができる。
以上説明した本発明検出方法により、シュードモナス・エルギノーサをＲＮＡ抽出等に３時間程度、増幅反応に３時間程度の計６時間程度で迅速に検出することができる。特に、本発明検出方法では、シュードモナス・エルギノーサを高感度で検出することができる。具体的には、試料が血液の場合、血液１ｍｌ中の１ｃｅｌｌのシュードモナス・エルギノーサを検出することが可能である。また、試料が糞便の場合には、糞便１ｇ中の１００ｃｅｌｌのシュードモナス・エルギノーサを検出することが可能である。
また、本発明検出方法を実施するためには、本発明のプライマーを含むシュードモナス・エルギノーサの検出キットを利用することもできる。このキットには、更に、酵素試薬等の本発明のプライマーによりシュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を増幅可能な試薬、ポジティブ・コントロールとなる菌のＲＮＡ等を含ませてもよい。酵素試薬としては、鎖置換活性を有する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ等の核酸合成酵素、ｄＮＴＰ等の核酸合成の基質等の組合せが挙げられる。
なお、本発明のプライマーは、上記した通り、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列を特異的に増幅するものであるから、これをプライマーを用いた他の病原菌等の検出キット等にも利用できることは言うまでもない。
以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
実 施 例 １
プライマーの作製およびこれを用いたシュードモナス・エルギノーサの検出：
＜材料および方法＞
（１）使用菌株
使用菌株を表１に示した。各菌株の培養条件も表１に示した。各菌株の純培養菌液(DAPI染色法により菌数計測)から、松田らの方法（Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. (2007) Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol 73: 32-9.）にて２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの菌数に相当する総ＲＮＡおよび総ＤＮＡを抽出して以下の実験に供した。
プライマーの作製およびこれを用いたシュードモナス・エルギノーサの検出：
＜材料および方法＞
（１）使用菌株
使用菌株を表１に示した。各菌株の培養条件も表１に示した。各菌株の純培養菌液(DAPI染色法により菌数計測)から、松田らの方法（Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. (2007) Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol 73: 32-9.）にて２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの菌数に相当する総ＲＮＡおよび総ＤＮＡを抽出して以下の実験に供した。
A : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて37℃、140rpmの条件で18時間振盪培養
B : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて37℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
C : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて30℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
D : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて26℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
E: 液体培養, ニュートリエント液体培地 (ニッスイ) にて26℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
a : 平板培養, BHI平板培地 (Becton Dickinson) にて37℃、18時間培養
Ｔ：基準株
（２）２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解読
公共データベースには、Ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ（ＹＩＴ ６１０８Ｔ）以外のシュードモナス・エルギノーサ菌株および近縁種の２３Ｓｒ ＲＮＡ配列が登録されていなかったことから、シュードモナス・エルギノーサ ６菌株および近縁種８菌株を対象（表１）に、２３Ｓ ｒＲＮＡ解読用のプライマー（表２）（配列番号９～２６）を新たに設計して２３Ｓｒ ＲＮＡ遺伝子配列の解読を実施した。ＲＴ－ＰＣＲにはQiagen One Step RT-PCR kit(Qiagen)を用い、５０℃、３０分間、９５℃、１５分間の条件で逆転写反応を行った後、９４℃、２０秒、各プライマーセットのアニーリング温度で２０秒、７２℃で目的の増幅サイズに合わせた秒数を１サイクルとして、４５サイクル反応させた。さらに、増幅したＤＮＡ断片をシーケンス解析し、プライマーウォーキングによって２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の全長を決定した（図１）。シーケンシングはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて反応させ、精製後、3500 Genetic Analyzer（Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific Inc.）で実施した。これによりシュードモナス・エルギノーサ６菌株および近縁種８菌株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を得た（シュードモナス・エルギノーサ６菌株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に相補的な塩基配列は配列番号３～８に記載のもの、近縁種８菌株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に相補的な塩基配列は配列番号２７～３４に記載のもの）。
公共データベースには、Ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ（ＹＩＴ ６１０８Ｔ）以外のシュードモナス・エルギノーサ菌株および近縁種の２３Ｓｒ ＲＮＡ配列が登録されていなかったことから、シュードモナス・エルギノーサ ６菌株および近縁種８菌株を対象（表１）に、２３Ｓ ｒＲＮＡ解読用のプライマー（表２）（配列番号９～２６）を新たに設計して２３Ｓｒ ＲＮＡ遺伝子配列の解読を実施した。ＲＴ－ＰＣＲにはQiagen One Step RT-PCR kit(Qiagen)を用い、５０℃、３０分間、９５℃、１５分間の条件で逆転写反応を行った後、９４℃、２０秒、各プライマーセットのアニーリング温度で２０秒、７２℃で目的の増幅サイズに合わせた秒数を１サイクルとして、４５サイクル反応させた。さらに、増幅したＤＮＡ断片をシーケンス解析し、プライマーウォーキングによって２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の全長を決定した（図１）。シーケンシングはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて反応させ、精製後、3500 Genetic Analyzer（Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific Inc.）で実施した。これによりシュードモナス・エルギノーサ６菌株および近縁種８菌株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を得た（シュードモナス・エルギノーサ６菌株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に相補的な塩基配列は配列番号３～８に記載のもの、近縁種８菌株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に相補的な塩基配列は配列番号２７～３４に記載のもの）。
（３）特異的プライマーの設計
（２）で得られたシュードモナス・エルギノーサ６菌株および近縁種８菌株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に相補的な塩基配列（１４菌株）について、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘソフトウェアを用いて整列を行った後、シュードモナス・エルギノーサに特異的な配列をもとにプライマーの設計を行った（表３：配列番号１～２）。なお、その他の細菌のｒＲＮＡ遺伝子配列に相補的な塩基配列と交差しないことをNCBI BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）により確認した。
（２）で得られたシュードモナス・エルギノーサ６菌株および近縁種８菌株の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列に相補的な塩基配列（１４菌株）について、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘソフトウェアを用いて整列を行った後、シュードモナス・エルギノーサに特異的な配列をもとにプライマーの設計を行った（表３：配列番号１～２）。なお、その他の細菌のｒＲＮＡ遺伝子配列に相補的な塩基配列と交差しないことをNCBI BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）により確認した。
（４）プライマーの特異性の検討
合成したプライマーの特異性の検討には、代表的な腸内細菌および感染症起因菌の２１菌種（２１菌株）、ならびにシュードモナス・エルギノーサ６菌株および近縁種９菌種１２株（計３９菌株）を対象とした（表４）。２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの菌数に相当する濃度となるよう調整したＲＮＡを鋳型として、RNase free water（AmbionTM、Thermo Fisher Scientific Inc.）で適宜希釈し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法１反応当り１×１０５ｃｅｌｌｓ相当から１×１０１ｃｅｌｌｓ相当のＲＮＡを調製した。定量的ＲＴ－ＰＣＲ法にはQiagen OneStep RT-PCR kitを用い、９４℃、２０秒、６０℃、２０秒、７２℃、３５秒を１サイクルとして、４５サイクル反応させた。
合成したプライマーの特異性の検討には、代表的な腸内細菌および感染症起因菌の２１菌種（２１菌株）、ならびにシュードモナス・エルギノーサ６菌株および近縁種９菌種１２株（計３９菌株）を対象とした（表４）。２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの菌数に相当する濃度となるよう調整したＲＮＡを鋳型として、RNase free water（AmbionTM、Thermo Fisher Scientific Inc.）で適宜希釈し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法１反応当り１×１０５ｃｅｌｌｓ相当から１×１０１ｃｅｌｌｓ相当のＲＮＡを調製した。定量的ＲＴ－ＰＣＲ法にはQiagen OneStep RT-PCR kitを用い、９４℃、２０秒、６０℃、２０秒、７２℃、３５秒を１サイクルとして、４５サイクル反応させた。
A : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて37℃、140rpmの条件で18時間振盪培養
B : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて37℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
C : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて30℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
D : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて26℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
E : 液体培養, ニュートリエント液体培地 (ニッスイ) にて30℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
F : 液体培養, ニュートリエント液体培地 (ニッスイ) にて26℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
a : 平板培養, BHI平板培地 (Becton Dickinson) にて37℃、18時間培養
Ｔ：基準株
Ref.1：Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. (2007) Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol 73: 32-9.
Ref.2：Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Takahashi T, Kubota H, Nagata S, Yamashiro Y, Nomoto K. (2012) Sensitive quantification of Clostridium difficile cells by reverse transcription-quantitative PCR targeting rRNA molecules. Appl Environ Microbiol 78: 5111-8.
Ref.3：Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Matsumoto K, Takada T, Nomoto K. (2009) Establishment of an analytical system for the human fecal microbiota, based on reverse transcription-quantitative PCR targeting of multicopy rRNA molecules. Appl Environ Microbiol 75: 1961-9.
（５）定量的ＲＴ－ＰＣＲ法および定量的ＰＣＲ法によるプライマー検出感度の検討
上記で用いたシュードモナス・エルギノーサ６菌株のＲＮＡ（あるいはＤＮＡ）を定量的ＲＴ－ＰＣＲ法（あるいは定量的ＰＣＲ法）１反応当り１×１０４ｃｅｌｌｓから１×１０－２ｃｅｌｌｓに相当するように１０倍段階希釈し、この希釈ＲＮＡ（あるいはＤＮＡ）を鋳型に定量的ＲＴ－ＰＣＲ法（あるいは定量的ＰＣＲ法）を行った。得られたＣＴ値と菌数との相関の検討から、定量的解析が可能な菌数の下限値を求めた（定量的ＲＴ－ＰＣＲは３連にて実施）。
上記で用いたシュードモナス・エルギノーサ６菌株のＲＮＡ（あるいはＤＮＡ）を定量的ＲＴ－ＰＣＲ法（あるいは定量的ＰＣＲ法）１反応当り１×１０４ｃｅｌｌｓから１×１０－２ｃｅｌｌｓに相当するように１０倍段階希釈し、この希釈ＲＮＡ（あるいはＤＮＡ）を鋳型に定量的ＲＴ－ＰＣＲ法（あるいは定量的ＰＣＲ法）を行った。得られたＣＴ値と菌数との相関の検討から、定量的解析が可能な菌数の下限値を求めた（定量的ＲＴ－ＰＣＲは３連にて実施）。
（６）ヒト末梢血中のシュードモナス・エルギノーサの検出感度および定量性の検討
健常成人の末梢血液（正常ヒト全血液・Ａ型、４５０ｍｌ、コージンバイオ社、ＣｏｄｅＮｏ．１２０８１４４５）を試験に用いた。２．７ｍｌの末梢血液に、最終菌数が１００、１０１、１０２、１０３および１０４ＣＦＵ／ｍｌ（血液）となるようＢＨＩ液体培地で適宜希釈した０．３ｍｌのシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔ菌液を添加した（試験は各菌数レベルごとに４連にて実施）。各３ｍｌのサンプルのうち、１ｍｌを定量的ＲＴ－ＰＣＲ法、１ｍｌを培養法による菌数測定に供した。なお、検量線の作成には、ＹＩＦ－ＳＣＡＮ（登録商標）（個々の細菌がもつ特徴的遺伝子配列をターゲットとして細菌を選択的に定量する装置）用のスタンダードＲＮＡ（シュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔ）を用いた。培養法によるＣＦＵカウントは、ＢＨＩ平板培地上で同じ試料を培養することによって決定した。
健常成人の末梢血液（正常ヒト全血液・Ａ型、４５０ｍｌ、コージンバイオ社、ＣｏｄｅＮｏ．１２０８１４４５）を試験に用いた。２．７ｍｌの末梢血液に、最終菌数が１００、１０１、１０２、１０３および１０４ＣＦＵ／ｍｌ（血液）となるようＢＨＩ液体培地で適宜希釈した０．３ｍｌのシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔ菌液を添加した（試験は各菌数レベルごとに４連にて実施）。各３ｍｌのサンプルのうち、１ｍｌを定量的ＲＴ－ＰＣＲ法、１ｍｌを培養法による菌数測定に供した。なお、検量線の作成には、ＹＩＦ－ＳＣＡＮ（登録商標）（個々の細菌がもつ特徴的遺伝子配列をターゲットとして細菌を選択的に定量する装置）用のスタンダードＲＮＡ（シュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔ）を用いた。培養法によるＣＦＵカウントは、ＢＨＩ平板培地上で同じ試料を培養することによって決定した。
＜結果＞
（ａ）プライマーの特異性
代表的な腸内細菌および感染症起因菌の２１菌種（２１菌株）、ならびにシュードモナス・エルギノーサ６菌株および近縁種 ９菌種１２株（計３９菌株）と今回設計したプライマー『ｓ－Ｐａ－Ｆ／ｓ－Ｐａ－Ｒ』との交差反応性を調べたところ、当該プライマーはシュードモナス・エルギノーサ６菌株に対してのみ高い特異性を有しており、供試した他の菌株に対しては交差反応性を示さなかった（表５）。
（ａ）プライマーの特異性
代表的な腸内細菌および感染症起因菌の２１菌種（２１菌株）、ならびにシュードモナス・エルギノーサ６菌株および近縁種 ９菌種１２株（計３９菌株）と今回設計したプライマー『ｓ－Ｐａ－Ｆ／ｓ－Ｐａ－Ｒ』との交差反応性を調べたところ、当該プライマーはシュードモナス・エルギノーサ６菌株に対してのみ高い特異性を有しており、供試した他の菌株に対しては交差反応性を示さなかった（表５）。
（+: ＞104cells相当のCT値, -: ＜101cellsのCT値あるいは非検出）。
Ｔ：基準株
次いでシュードモナス・エルギノーサ６菌株に対する特異性を解析した。一反応あたり１０５ｃｅｌｌｓとなるように各菌株ＲＮＡ鋳型として定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析を行い、菌数を算出した。なお、検量線の作成には、ＹＩＦ－ＳＣＡＮ用のスタンダードＲＮＡ（シュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔ）を用いた。その結果、定量値が５．１～５．４（ｌｏｇ１０ｃｅｌｌｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ）の範囲に収まり、シュードモナス・エルギノーサ６菌株をほぼ同等に定量可能なことが示された（データは未掲載）。
（ｂ）プライマーの検出感度
シュードモナス・エルギノーサ６菌株に対するプライマー『ｓ－Ｐａ－Ｆ／ｓ－Ｐａ－Ｒ』の検出感度を検討した。全ＲＮＡを鋳型とした定量的ＲＴ－ＰＣＲ法による解析では、供した全６菌株において、１×１０－２～１×１０４ｃｅｌｌｓの範囲で菌数に対して高い相関を示し、かつ高い検出感度を有していた（図２、下限値：１×１０－２ｃｅｌｌｓ）。全ＤＮＡを鋳型にした定量的ＰＣＲ法による解析でも、ＣＴ値と菌数の間には高い相関が認められたが、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法に比べて１００倍程度感度が低いことが明らかになった（図２、下限値：１×１００ ｃｅｌｌｓ）。今回検討した６菌株の近似式はほぼ一致した（図２）。
シュードモナス・エルギノーサ６菌株に対するプライマー『ｓ－Ｐａ－Ｆ／ｓ－Ｐａ－Ｒ』の検出感度を検討した。全ＲＮＡを鋳型とした定量的ＲＴ－ＰＣＲ法による解析では、供した全６菌株において、１×１０－２～１×１０４ｃｅｌｌｓの範囲で菌数に対して高い相関を示し、かつ高い検出感度を有していた（図２、下限値：１×１０－２ｃｅｌｌｓ）。全ＤＮＡを鋳型にした定量的ＰＣＲ法による解析でも、ＣＴ値と菌数の間には高い相関が認められたが、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法に比べて１００倍程度感度が低いことが明らかになった（図２、下限値：１×１００ ｃｅｌｌｓ）。今回検討した６菌株の近似式はほぼ一致した（図２）。
（ｃ）定量的RT-PCR法と培養法による末梢血に添加した シュードモナス・エルギノーサの検出菌数の相関
定量的ＲＴ－ＰＣＲ法と培養法はいずれも末梢血に添加した１ｃｅｌｌのシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔを検出可能であった。また、ＣＴ値と培養法で求めた生菌数の間には、それぞれ血液１ｍｌ当り１００～１０４ＣＦＵの範囲で高い相関が認められた（図３、近似式：ｙ＝０．８１６９ｘ－０．１６２、Ｒ２＝０．９８９６）。
定量的ＲＴ－ＰＣＲ法と培養法はいずれも末梢血に添加した１ｃｅｌｌのシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔを検出可能であった。また、ＣＴ値と培養法で求めた生菌数の間には、それぞれ血液１ｍｌ当り１００～１０４ＣＦＵの範囲で高い相関が認められた（図３、近似式：ｙ＝０．８１６９ｘ－０．１６２、Ｒ２＝０．９８９６）。
以上の結果より、本発明のプライマーでは定量的ＲＴ－ＰＣＲ法（ＹＩＦ－ＳＣＡＮ）により血液１ｍｌ中の１ｃｅｌｌのシュードモナス・エルギノーサを検出することが可能であり、臨床検体中の本菌の検出に有用なプライマーであることが示された。
実 施 例 ２
ヒト糞便中のシュードモナス・エルギノーサの検出：
健康な３名のボランティアの糞便を混ぜ合わせ、この糞便に９倍量のＴＳＢ培地を添加して激しく攪拌し、糞便１０倍希釈液を作製した。－８０℃にて凍結保存されているシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔのビーズストック１個を１０ｍｌのＴＳＢ培地に添加して培養した後、この培養液を用いて９００μｌの糞便１０倍希釈液に、最終菌数が１０２ＣＦＵ／ｇ（糞便）となるように調製した。また、対照としてシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔを添加していない糞便１０倍希釈液を調製した。
ヒト糞便中のシュードモナス・エルギノーサの検出：
健康な３名のボランティアの糞便を混ぜ合わせ、この糞便に９倍量のＴＳＢ培地を添加して激しく攪拌し、糞便１０倍希釈液を作製した。－８０℃にて凍結保存されているシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔのビーズストック１個を１０ｍｌのＴＳＢ培地に添加して培養した後、この培養液を用いて９００μｌの糞便１０倍希釈液に、最終菌数が１０２ＣＦＵ／ｇ（糞便）となるように調製した。また、対照としてシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔを添加していない糞便１０倍希釈液を調製した。
シュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔを１０２ＣＦＵ／ｇで添加した糞便１０倍希釈液について、上記実施例１と同様にして、ＲＮＡを抽出した後、ＲＴ－ＰＣＲを行ったところ、陽性反応を示した。また、対照であるシュードモナス・エルギノーサ ＹＩＴ ６１０８Ｔを添加していない糞便１０倍希釈液はＲＴ－ＰＣＲを行っても陽性反応を示さなかった。
実 施 例 ３
シュードモナス・エルギノーサの検出キット：
以下を含むシュードモナス・エルギノーサの検出キットを作製した。
・プライマーｓ－Ｐａ－Ｆ
・プライマーｓ－Ｐａ－Ｒ
・鎖置換活性を有する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ
・ｄＮＴＰ
・ポジティブ・コントロールとなる菌（シュードモナス・エルギノーサの標準菌株(Pseudomonas aeruginosa ATCC10145T)のＲＮＡ
シュードモナス・エルギノーサの検出キット：
以下を含むシュードモナス・エルギノーサの検出キットを作製した。
・プライマーｓ－Ｐａ－Ｆ
・プライマーｓ－Ｐａ－Ｒ
・鎖置換活性を有する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ
・ｄＮＴＰ
・ポジティブ・コントロールとなる菌（シュードモナス・エルギノーサの標準菌株(Pseudomonas aeruginosa ATCC10145T)のＲＮＡ
本発明によれば、シュードモナス・エルギノーサを血液、糞便等から高感度に、かつ、迅速に分別定量可能なため、シュードモナス・エルギノーサによる院内感染を制御することができる。また、本プライマーと薬剤耐性プライマーを併用することで、多剤耐性緑膿菌のモニタリングが可能となる。
Claims (2)
- 配列番号１および２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなり、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーセット。
- 以下の工程（１）～（４）
（１）血液または糞便から選ばれる試料からＲＮＡを抽出する工程
（２）（１）で抽出したＲＮＡに相補的な塩基配列を作製する工程
（３）配列番号１および２に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなり、シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーセットと、（２）で作製した塩基配列を用いて増幅反応を行う工程
（４）増幅の有無を確認する工程
を含むことを特徴とするシュードモナス・エルギノーサの検出方法。
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| JP2018187032A JP7194548B2 (ja) | 2018-10-02 | 2018-10-02 | シュードモナス・エルギノーサの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅するプライマーおよびこれを利用したシュードモナス・エルギノーサの検出方法 |
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|---|---|---|---|---|
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