JP7194548B2 - シュードモナス・エルギノーサの23S rRNAに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅するプライマーおよびこれを利用したシュードモナス・エルギノーサの検出方法 - Google Patents
シュードモナス・エルギノーサの23S rRNAに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅するプライマーおよびこれを利用したシュードモナス・エルギノーサの検出方法 Download PDFInfo
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Description
(1)試料からRNAを抽出する工程
(2)(1)で抽出したRNAに相補的な塩基配列を作製する工程
(3)シュードモナス・エルギノーサの23S rRNAに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーと、(2)で作製した塩基配列を用いて増幅反応を行う工程
(4)増幅の有無を確認する工程
を含むことを特徴とするシュードモナス・エルギノーサの検出方法
である。
s-Pa-F(配列番号1)
GTCGTCTTTTAGATGACGAAGTGG
s-Pa-R(配列番号2)
TGGTATCTTCGACCAGCCAGA
シュードモナス・エルギノーサ ATCC10145 基準株(Type strain)
(配列番号3)
シュードモナス・エルギノーサ ATCC9027
(配列番号4)
シュードモナス・エルギノーサ ATCC15442
(配列番号5)
シュードモナス・エルギノーサ JCM2776
(配列番号6)
シュードモナス・エルギノーサ JCM5961
(配列番号7)
シュードモナス・エルギノーサ DSM6195
(配列番号8)
ATCC:10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 USA
JCM:〒305-0074 日本国茨城県つくば市高野台3-1-1 理化学研究所 バイオリソース研究センター 微生物材料開発室(JCM)
DSM:DSM's Head Office Het Overloon 16411 TE Heerlen, the Netherlands.
(1)試料からRNAを抽出する工程
(2)(1)で抽出したRNAに相補的な塩基配列を作製する工程
(3)シュードモナス・エルギノーサの23S rRNAに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーと、(2)で作製した塩基配列を用いて増幅反応を行う工程
(4)増幅の有無を確認する工程
を含む。
プライマーの作製およびこれを用いたシュードモナス・エルギノーサの検出:
<材料および方法>
(1)使用菌株
使用菌株を表1に示した。各菌株の培養条件も表1に示した。各菌株の純培養菌液(DAPI染色法により菌数計測)から、松田らの方法(Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. (2007) Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol 73: 32-9.)にて2x108cells/mlの菌数に相当する総RNAおよび総DNAを抽出して以下の実験に供した。
A : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて37℃、140rpmの条件で18時間振盪培養
B : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて37℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
C : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて30℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
D : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて26℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
E: 液体培養, ニュートリエント液体培地 (ニッスイ) にて26℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
a : 平板培養, BHI平板培地 (Becton Dickinson) にて37℃、18時間培養
T:基準株
公共データベースには、Type strain(YIT 6108T)以外のシュードモナス・エルギノーサ菌株および近縁種の23Sr RNA配列が登録されていなかったことから、シュードモナス・エルギノーサ 6菌株および近縁種8菌株を対象(表1)に、23S rRNA解読用のプライマー(表2)(配列番号9~26)を新たに設計して23Sr RNA遺伝子配列の解読を実施した。RT-PCRにはQiagen One Step RT-PCR kit(Qiagen)を用い、50℃、30分間、95℃、15分間の条件で逆転写反応を行った後、94℃、20秒、各プライマーセットのアニーリング温度で20秒、72℃で目的の増幅サイズに合わせた秒数を1サイクルとして、45サイクル反応させた。さらに、増幅したDNA断片をシーケンス解析し、プライマーウォーキングによって23S rRNA遺伝子配列の全長を決定した(図1)。シーケンシングはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific Inc.)を用いて反応させ、精製後、3500 Genetic Analyzer(Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific Inc.)で実施した。これによりシュードモナス・エルギノーサ6菌株および近縁種8菌株の23S rRNA配列を得た(シュードモナス・エルギノーサ6菌株の23S rRNA配列に相補的な塩基配列は配列番号3~8に記載のもの、近縁種8菌株の23S rRNA配列に相補的な塩基配列は配列番号27~34に記載のもの)。
(2)で得られたシュードモナス・エルギノーサ6菌株および近縁種8菌株の23S rRNA配列に相補的な塩基配列(14菌株)について、Clustal Xソフトウェアを用いて整列を行った後、シュードモナス・エルギノーサに特異的な配列をもとにプライマーの設計を行った(表3:配列番号1~2)。なお、その他の細菌のrRNA遺伝子配列に相補的な塩基配列と交差しないことをNCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)により確認した。
合成したプライマーの特異性の検討には、代表的な腸内細菌および感染症起因菌の21菌種(21菌株)、ならびにシュードモナス・エルギノーサ6菌株および近縁種9菌種12株(計39菌株)を対象とした(表4)。2x108cells/mlの菌数に相当する濃度となるよう調整したRNAを鋳型として、RNase free water(AmbionTM、Thermo Fisher Scientific Inc.)で適宜希釈し、定量的RT-PCR法1反応当り1×105cells相当から1×101cells相当のRNAを調製した。定量的RT-PCR法にはQiagen OneStep RT-PCR kitを用い、94℃、20秒、60℃、20秒、72℃、35秒を1サイクルとして、45サイクル反応させた。
A : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて37℃、140rpmの条件で18時間振盪培養
B : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて37℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
C : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて30℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
D : 液体培養,BHI液体培地 (Becton Dickinson) にて26℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
E : 液体培養, ニュートリエント液体培地 (ニッスイ) にて30℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
F : 液体培養, ニュートリエント液体培地 (ニッスイ) にて26℃、140rpmの条件で22時間振盪培養
a : 平板培養, BHI平板培地 (Becton Dickinson) にて37℃、18時間培養
T:基準株
Ref.1:Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Kado Y, Nomoto K. (2007) Sensitive quantitative detection of commensal bacteria by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol 73: 32-9.
Ref.2:Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Takahashi T, Kubota H, Nagata S, Yamashiro Y, Nomoto K. (2012) Sensitive quantification of Clostridium difficile cells by reverse transcription-quantitative PCR targeting rRNA molecules. Appl Environ Microbiol 78: 5111-8.
Ref.3:Matsuda K, Tsuji H, Asahara T, Matsumoto K, Takada T, Nomoto K. (2009) Establishment of an analytical system for the human fecal microbiota, based on reverse transcription-quantitative PCR targeting of multicopy rRNA molecules. Appl Environ Microbiol 75: 1961-9.
上記で用いたシュードモナス・エルギノーサ6菌株のRNA(あるいはDNA)を定量的RT-PCR法(あるいは定量的PCR法)1反応当り1×104cellsから1×10-2cellsに相当するように10倍段階希釈し、この希釈RNA(あるいはDNA)を鋳型に定量的RT-PCR法(あるいは定量的PCR法)を行った。得られたCT値と菌数との相関の検討から、定量的解析が可能な菌数の下限値を求めた(定量的RT-PCRは3連にて実施)。
健常成人の末梢血液(正常ヒト全血液・A型、450ml、コージンバイオ社、CodeNo.12081445)を試験に用いた。2.7mlの末梢血液に、最終菌数が100、101、102、103および104CFU/ml(血液)となるようBHI液体培地で適宜希釈した0.3mlのシュードモナス・エルギノーサ YIT 6108T菌液を添加した(試験は各菌数レベルごとに4連にて実施)。各3mlのサンプルのうち、1mlを定量的RT-PCR法、1mlを培養法による菌数測定に供した。なお、検量線の作成には、YIF-SCAN(登録商標)(個々の細菌がもつ特徴的遺伝子配列をターゲットとして細菌を選択的に定量する装置)用のスタンダードRNA(シュードモナス・エルギノーサ YIT 6108T)を用いた。培養法によるCFUカウントは、BHI平板培地上で同じ試料を培養することによって決定した。
(a)プライマーの特異性
代表的な腸内細菌および感染症起因菌の21菌種(21菌株)、ならびにシュードモナス・エルギノーサ6菌株および近縁種 9菌種12株(計39菌株)と今回設計したプライマー『s-Pa-F/s-Pa-R』との交差反応性を調べたところ、当該プライマーはシュードモナス・エルギノーサ6菌株に対してのみ高い特異性を有しており、供試した他の菌株に対しては交差反応性を示さなかった(表5)。
(+: >104cells相当のCT値, -: <101cellsのCT値あるいは非検出)。
T:基準株
シュードモナス・エルギノーサ6菌株に対するプライマー『s-Pa-F/s-Pa-R』の検出感度を検討した。全RNAを鋳型とした定量的RT-PCR法による解析では、供した全6菌株において、1×10-2~1×104cellsの範囲で菌数に対して高い相関を示し、かつ高い検出感度を有していた(図2、下限値:1×10-2cells)。全DNAを鋳型にした定量的PCR法による解析でも、CT値と菌数の間には高い相関が認められたが、定量的RT-PCR法に比べて100倍程度感度が低いことが明らかになった(図2、下限値:1×100 cells)。今回検討した6菌株の近似式はほぼ一致した(図2)。
定量的RT-PCR法と培養法はいずれも末梢血に添加した1cellのシュードモナス・エルギノーサ YIT 6108Tを検出可能であった。また、CT値と培養法で求めた生菌数の間には、それぞれ血液1ml当り100~104CFUの範囲で高い相関が認められた(図3、近似式:y=0.8169x-0.162、R2=0.9896)。
ヒト糞便中のシュードモナス・エルギノーサの検出:
健康な3名のボランティアの糞便を混ぜ合わせ、この糞便に9倍量のTSB培地を添加して激しく攪拌し、糞便10倍希釈液を作製した。-80℃にて凍結保存されているシュードモナス・エルギノーサ YIT 6108Tのビーズストック1個を10mlのTSB培地に添加して培養した後、この培養液を用いて900μlの糞便10倍希釈液に、最終菌数が102CFU/g(糞便)となるように調製した。また、対照としてシュードモナス・エルギノーサ YIT 6108Tを添加していない糞便10倍希釈液を調製した。
シュードモナス・エルギノーサの検出キット:
以下を含むシュードモナス・エルギノーサの検出キットを作製した。
・プライマーs-Pa-F
・プライマーs-Pa-R
・鎖置換活性を有する鋳型依存性DNAポリメラーゼ
・dNTP
・ポジティブ・コントロールとなる菌(シュードモナス・エルギノーサの標準菌株(Pseudomonas aeruginosa ATCC10145T)のRNA
Claims (2)
- 配列番号1および2に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなり、シュードモナス・エルギノーサの23S rRNAに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーセット。
- 以下の工程(1)~(4)
(1)血液または糞便から選ばれる試料からRNAを抽出する工程
(2)(1)で抽出したRNAに相補的な塩基配列を作製する工程
(3)配列番号1および2に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドからなり、シュードモナス・エルギノーサの23S rRNAに相補的な塩基配列の少なくとも一部を特異的に増幅することを特徴とするプライマーセットと、(2)で作製した塩基配列を用いて増幅反応を行う工程
(4)増幅の有無を確認する工程
を含むことを特徴とするシュードモナス・エルギノーサの検出方法。
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