JP2011510612A - Pseudomonasaeruginosaの検出および/または監視のための組成物、キットおよび関連する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、米国特許法§119(e)の下、2007年4月2日に出願された米国仮特許出願第60/909,687号(この仮出願は、その全体が参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
本願に関連する配列表は、紙複製物の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、390082_402PC_SEQUENCE_LISTING.txtである。テキストファイルは、18KBであり、2008年4月2日に作成され、明細書の出願と同時に米国PCT受理官庁にEFS−Web経由で電子形式で提出される。
本発明は、試験のために、例えば、診断試験のために、血液製剤スクリーニングのために、バイオプロセス、食品、水、工業若しくは環境試料における微生物検出のために、さらに、他の目的のために採取された試料中の均一若しくは不均一な核酸混合物の大小様々な一成分として、又は単独で存在し得る、Pseudomonas aeruginosaを種特異的に同定するための組成物、方法及びキットに関する。
当業者であればわかることであるが、本発明の好ましいオリゴヌクレオチド、組成物、反応混合物及びキットは、Pseudomonas aeruginosaの検出を改善するために核酸増幅方法に使用される。かかる方法及び技術は、周知であり、確立されているが、核酸増幅、検出などの説明のための好ましい態様を以下に考察する。
「核酸」という用語は、単一の「核酸」及び複数の「核酸」を包含するものとし、共有結合した2個以上のヌクレオチド、ヌクレオシド又は核酸塩基(例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド)の任意の鎖を指す。核酸としては、ウイルスゲノム若しくはその一部、DNA若しくはRNA、細菌ゲノム若しくはその一部、真菌、植物若しくは動物のゲノム又はその一部、メッセンジャーRNA(mRNA)、リボソームRNA(rRNA)、転移RNA(tRNA)、プラスミドDNA、ミトコンドリアDNA、又は合成DNA若しくはRNAが挙げられるが、これらだけに限定されない。核酸は、線状(例えば、mRNA)、環状(例えば、プラスミド)又は分枝状、さらには二本鎖又は一本鎖状であり得る。核酸は、核酸の機能又は挙動を変える修飾塩基を含み得る(例えば、更なるヌクレオチドが核酸に付加するのを防止する3’末端ジデオキシヌクレオチドの付加)。本明細書では核酸の「配列」とは、核酸を構成する塩基の配列を指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸鎖を意味するのに本明細書では使用することができる。本願を通して、核酸は、5’末端から3’末端方向に命名される。標準核酸(例えば、DNA及びRNA)は、「3’から5’方向」に、すなわち、成長する核酸の5’末端にヌクレオチドが付加することによって、典型的には合成される。
「標的核酸」とは、増幅すべき「標的配列」を含む核酸である。標的核酸は、本明細書に記載のDNA又はRNAとすることができ、一本鎖又は二本鎖とすることができる。標的核酸は、標的配列に加えて、増幅されなくてもよい別の配列を含んでもよい。典型的な標的核酸としては、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、真菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、ウイルス、細菌又は真核細胞由来のrRNA、tRNA又はmRNA、ミトコンドリアDNA、染色体DNAなどが挙げられる。
ある実施形態においては、本発明の核酸は、参照核酸の連続塩基領域と少なくとも80%、90%又は100%同一である連続塩基領域を含む。低分子核酸、例えば、本発明のある種のオリゴヌクレオチドの場合、「問い合わせ(query)」核酸の塩基領域と参照核酸の塩基領域の同一性の程度は、手操作によるアラインメントによって決定することができる。「同一性」は、比較する核酸の糖及び骨格領域とは無関係に、窒素塩基の配列のみを比較することによって決定される。したがって、問い合わせ:参照塩基配列アラインメントは、DNA:DNA、RNA:RNA、DNA:RNA、RNA:DNA、又はその任意の組合せ若しくは類似物とすることができる。(RNA中の)Uを(DNA中の)Tに変換することによって、対応するRNAとDNAの塩基配列を比較することができる。
本明細書では「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」又は「オリゴマー」という用語は、単一の「オリゴヌクレオチド」及び複数の「オリゴヌクレオチド」を包含するものとし、本発明の増幅方法及び後続の検出方法における試薬として使用される、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基又は関連化合物の2個以上からなるポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、DNA及び/又はRNA及び/又はその類似体とすることができる。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬に対する特別な機能を意味するのではなく、本明細書に記載のすべてのかかる試薬を網羅するのに包括的に使用される。オリゴヌクレオチドは、多様な機能を果たすことができ、例えば、相補鎖に特異的であり、相補鎖とハイブリッド形成可能であり、さらに核酸ポリメラーゼの存在下で伸長することができる場合にはプライマーとして機能することができ、RNAポリメラーゼによって認識される配列を含み、転写可能である場合にはプロモーターを与えることができ(例えば、T7プロバイダー)、適切に位置する及び/又は修飾されている場合には、ハイブリダイゼーションを阻止する、又はプライマー伸長を妨害する、機能を果たすことができる。本発明の特定のオリゴヌクレオチドをより詳細に以下に記述する。
本明細書では「ブロッキング成分」は、オリゴヌクレオチド又は別の核酸が核酸ポリメラーゼによって効率的に伸長することができないように、オリゴヌクレオチド又は別の核酸の3’末端を「ブロックする」のに使用される物質である。ブロッキング成分は、小分子、例えばリン酸基又はアンモニウム基とすることができ、或いは修飾ヌクレオチド、例えば、3’2’ジデオキシヌクレオチド若しくは3’デオキシアデノシン5’−三リン酸(コルジセピン)、又は別の修飾ヌクレオチドとすることができる。別のブロッキング成分としては、例えば、3’から5’方向の配向を有するヌクレオチド若しくは低分子ヌクレオチド配列の使用(その結果、3’末端に遊離ヒドロキシル基が存在しない。)、3’アルキル基、3’非ヌクレオチド部分(例えば、その内容を参照により本明細書に援用する、Arnold他、「Non−Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes」、米国特許第6,031,091号を参照されたい。)、ホスホロチオアート、アルカンジオール残基、ペプチド核酸(PNA)、3’末端に3’ヒドロキシル基のないヌクレオチド残基、又は核酸結合タンパク質の使用が挙げられる。好ましくは、3’−ブロッキング成分は、3’から5’方向の配向を有するヌクレオチド若しくはヌクレオチド配列、又は3’非ヌクレオチド部分を含み、3’2’−ジデオキシヌクレオチドも遊離ヒドロキシル基を有する3’末端も含まない。3’−ブロッキングオリゴヌクレオチドを調製する別の方法は、当業者に周知である。
プライミングオリゴヌクレオチド又は「プライマー」は、少なくともその3’末端が核酸鋳型に相補的であるオリゴヌクレオチド、及び(水素結合又はハイブリダイゼーションによって)鋳型と複合体を形成して、RNA又はDNA依存性DNAポリメラーゼによって合成を開始するのに適切であるプライマー:鋳型複合体を生成するオリゴヌクレオチドである。プライミングオリゴヌクレオチドは、共有結合したヌクレオチド塩基がその3’末端に付加することによって伸長する。該塩基は、鋳型に相補的である。その結果は、プライマー伸長産物である。本発明のプライミングオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも10ヌクレオチド長であり、最高15、20、25、30、35、40、50ヌクレオチド長以上まで伸長し得る。適切な好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている。(逆転写酵素を含めて)実質的にすべての公知DNAポリメラーゼは、DNA合成を開始するためにオリゴヌクレオチドと一本鎖鋳型の複合体形成(「プライミング」)を必要とするのに対して、RNA複製及び転写(DNAからのRNAの複製)は、一般にプライマーを必要としない。DNAポリメラーゼによって伸長されるまさにその性質によって、プライミングオリゴヌクレオチドは、3’−ブロッキング成分を含まない。
当分野で周知のとおり、「プロモーター」は、核酸に結合し、特定の部位におけるRNAの転写を開始するシグナルとして、DNA依存性RNAポリメラーゼ(「転写酵素」)によって認識される特異的核酸配列である。結合のためには、かかる転写酵素は、プロモーター配列を含む領域において伸長反応によって二本鎖になったDNAを必要とすると一般に考えられたが、本発明者らは、RNAの効率的転写が、鋳型核酸を用いた伸長反応によって二本鎖プロモーターが形成されない条件下でも起こり得ることを確認した。鋳型核酸(転写される配列)は、二本鎖である必要はない。個々のDNA依存性RNAポリメラーゼは、転写促進効率が著しく異なり得る種々のプロモーター配列を認識する。RNAポリメラーゼがプロモーター配列に結合して転写を開始するときには、プロモーター配列は、転写される配列の一部ではない。したがって、それによって産生されるRNA転写物は、プロモーター配列を含まない。
本発明においては、「終結オリゴヌクレオチド」又は「ブロッカーオリゴ」は、プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸長を「終結させ」、それによって新生核酸鎖に明確な3’末端を与えるように、標的配列の5’末端付近の標的核酸の領域に相補的である塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。終結オリゴヌクレオチドは、新生核酸鎖に所望の3’末端を与えるのに十分な位置において、標的核酸とハイブリッド形成するように設計される。終結オリゴヌクレオチドの位置決めは、その設計に応じて変更することができる。終結オリゴヌクレオチドは、修飾でも無修飾でもよい。ある実施形態においては、終結オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個以上の2’−O−メチルリボヌクレオチドを用いて合成される。これらの修飾ヌクレオチドは、相補的二重鎖の熱安定性を向上させる。2’−O−メチルリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を高め、それによって修飾オリゴヌクレオチドの半減期を延長する機能も果たす。例えば、その内容を参照により本明細書に援用する、Majlessi et al.(1988)Nucleic Acids Res.26,2224−9を参照されたい。2’−O−メチルリボヌクレオチドに加えて、又はその代わりに、本明細書に記載の別の修飾を利用することができる。例えば、終結オリゴヌクレオチドは、PNA又はLNAを含むことができる。例えば、その内容を参照により本明細書に援用する、Petersen et al.(2000)J.Mol.Recognit.13,44−53を参照されたい。本発明の終結オリゴヌクレオチドは、典型的には、伸長を阻止するブロッキング成分をその3’末端に含む。終結オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによる新生核酸鎖の更なる伸長を終結させるために、オリゴヌクレオチドに結合したタンパク質又はペプチドも含むことができる。本発明の終結オリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも10塩基長であり、最高15、20、25、30、35、40、50ヌクレオチド長以上まで伸長し得る。適切な好ましい終結オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている。終結オリゴヌクレオチドは、典型的又は必然的に3’ブロッキング成分を含むが、「3’ブロックされた」オリゴヌクレオチドは、必ずしも終結オリゴヌクレオチドではないことに留意されたい。本発明の別のオリゴヌクレオチド、例えば、プロモーターオリゴヌクレオチド及びキャッピングオリゴヌクレオチドも、同様に、典型的又は必然的に3’ブロックされる。
「伸長オリゴヌクレオチド」又は「伸長オリゴ」とは、T7プロバイダーと同じ意味のオリゴヌクレオチドを指し、構造を開く、又は特異性を改善する、ヘルパーオリゴヌクレオチドとして作用することができる。伸長オリゴヌクレオチドは、プロモーターオリゴヌクレオチドの第1の領域の3’末端に隣接する、又はその近くの鋳型DNAとハイブリッド形成する。伸長オリゴヌクレオチドは、伸長オリゴヌクレオチドの5’末端塩基がプロモーターオリゴヌクレオチドの3’末端塩基の3、2又は1塩基以内にあるように、鋳型DNAとハイブリッド形成することが好ましい。最も好ましくは、伸長オリゴヌクレオチドの5’末端塩基は、伸長オリゴヌクレオチド及びプロモーターオリゴヌクレオチドが鋳型DNAとハイブリッド形成するときに、プロモーターオリゴヌクレオチドの3’末端塩基に隣接する。伸長オリゴヌクレオチドの伸長を防止するために、3’末端ブロッキング成分が典型的には含まれる。伸長オリゴヌクレオチドは、好ましくは10から50ヌクレオチド長、より好ましくは20から40ヌクレオチド長、最も好ましくは30から35ヌクレオチド長である{米国特許出願公開第2006/0046265号参照}。
「プローブ」又は「検出プローブ」とは、検出しようとする標的配列の領域と厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成するように、該領域に部分的又は完全に相補的である塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む分子を意味する。当業者には理解されるように、プローブは、人の介在なしには天然に存在しない形で(例えば、異質な核酸で組み換えられた、単離された、又はある程度精製された)、単離核酸分子、又はその類似体を含む。
核酸ハイブリダイゼーションは、完全又は部分的に相補的であるヌクレオチド配列を有する2本の核酸鎖が所定の反応条件下で一体となって、安定な二本鎖ハイブリッドを形成するプロセスである。どちらの核酸鎖も、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)又はその類似体とすることができる。したがって、ハイブリダイゼーションは、RNA:RNAハイブリッド、DNA:DNAハイブリッド、RNA:DNAハイブリッド、又はその類似体を含み得る。この二本鎖構造の2本の構成鎖は、ハイブリッドとも称し、水素結合によって一体化される。この水素結合は、最も一般的には、塩基アデニンとチミン若しくはウラシル(AとT若しくはU)又はシトシンとグアニン(CとG)を単一核酸鎖上に含むヌクレオチド間で形成されるが、塩基対合は、これらの「正規の(canonical)」対のメンバーではない塩基間でも形成され得る。非正規塩基対合は、当分野で周知である。(例えば、Roger L.P.Adams et al.,”The Biochemistry Of The Nucleic Acids”(11th ed.1992)を参照されたい。)
「厳密な」ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、特定の検出プローブが、試験試料中に存在する他の核酸よりも標的核酸とハイブリッド形成することができる条件を指す。これらの条件は、プローブのGC含量及び長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試薬又は溶液の組成、並びに得ようとするハイブリダイゼーション特異性の程度を含めて、諸因子に応じて変わり得ることを理解されたい。特定の厳密なハイブリダイゼーション条件を以下に開示する。
上述したように、本発明は、一般に、核酸増幅方法を用いて対象試料中のPseudomonas aeruginosaを検出するための組成物及び方法に関する。「増幅」又は「核酸増幅」とは、本明細書に更に記述するように、意図した特定の標的核酸配列の少なくとも一部を含む標的核酸の複数の複製体の産生を意味する。複数の複製体は、アンプリコン又は増幅産物とも称する。
ある実施形態においては、増幅前に、例えば標的捕捉手法を用いて、試料から標的核酸を精製又は濃縮することが好ましい場合がある。「標的捕捉」(TC)とは、一般に、磁気的に誘引可能な粒子などの固体担体上に標的ポリヌクレオチドを捕捉することを指し、固体担体は、標的ポリヌクレオチド精製手順の1つ以上の洗浄段階中に標的ポリヌクレオチドを保持する。このようにして、標的ポリヌクレオチドは、後続の核酸増幅段階前に十分に精製される。多数の標的捕捉方法が公知であり、本明細書に記載の方法と併用するのに適切である。
特定の核酸ハイブリダイゼーションの監視に使用することができる本質的にあらゆる標識及び/又は検出システムを、本発明に関連して使用して、Pseudomonas aeruginosaアンプリコンを検出することができる。多数のかかるシステムが公知であり、当業者に利用可能であり、その説明のための例を以下に手短に考察する。
本明細書に記載のとおり、本発明によるPseudomonas aeruginosa核酸を増幅及び検出するのに好ましい部位は、Pseudomonas aeruginosa 23s rRNAの800領域に存在することが判明した。さらに、この領域内の特に好ましいオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドセットが、改善された感度、選択性及び特異性でPseudomonas aeruginosa 23sを増幅するために特定された。本発明のオリゴヌクレオチドは、Pseudomonas aeruginosa標的配列と高い特異性でハイブリッド形成することができ、その結果、試料中のPseudomonas aeruginosaの存在及び/又はレベルを検出し、Pseudomonas aeruginosaの存在を他のPseudomonadsの存在から区別するのに使用することができる核酸増幅反応に関与できることを理解されたい。
本発明は、Pseudomonas aeruginosaの23s rRNAの800領域を検出するポリヌクレオチド増幅反応を実施するための組成物、反応混合物及びキットも包含する。例示的なキットは、Pseudomonas aeruginosaの23s rRNAの800領域の逆ストランドに相補的である第1及び第2の増幅オリゴヌクレオチドを含む。ある種の好ましいキットは、転写を伴う増幅反応、好ましくはTMA反応に使用される本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む。好ましい一実施形態においては、本発明のキットは、本明細書に記載のT7プロバイダーオリゴヌクレオチド、本明細書に記載の非T7プライマーオリゴヌクレオチドを含み、場合によっては、本明細書に記載の検出オリゴヌクレオチド、捕捉オリゴヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド及び/又は伸長オリゴヌクレオチドの1種類以上を含めて、増幅及び/又は検出を容易にする1種類以上の別の補助的なオリゴヌクレオチドを更に含んでもよい。
説明のためのアッセイ試薬及び手順の記述
以下の実施例は、本明細書に記載のTMA実験に用いられる典型的なアッセイ試薬、手順、条件などを記述する。それに反することを明記しない限り、試薬調製、装置調製及びアッセイ手順は、本質的に以下に記載のように実施された。
1. 増幅試薬。「増幅試薬」又は「Amp試薬」は、近似濃度の以下の成分で構成された:0.5mM dATP、0.5mM dCTP、0.5mM dGTP、0.5mM dTTP、10mM ATP、2mM CTP、2mM GTP、12.7mM UTP、30mM MgCl2及び33mM KClのpH7.7の50mM HEPES緩衝剤溶液。プライマー及び他のオリゴヌクレオチドをAmp試薬に添加した。
後続の増幅のために核酸試料を精製及び調製する典型的な標的捕捉手順は、本質的に以下に示すように実施される。
実時間TMA増幅反応を本質的に以下のように実施した。試料30μL、Amp試薬中の増幅及び検出オリゴヌクレオチド、又は標的捕捉手順から得られたAmp試薬中の再懸濁粒子30μLを60℃で10分間インキュベートした。次いで、温度を低下させ、反応混合物を42℃に平衡化した。酵素試薬10μLを添加した。反応混合物を混合し、実時間検出システム(例えば、Bio−Rad Laboratoriesから入手可能なOpticon(商標)若しくはChromo4(商標)検出システム、又はFluoDia(登録商標)T70装置)中で42℃でインキュベートした。
Pseudomonas aeruginosa(Pae)オリゴセットの設計及び初期試験
E.coli 23s rRNA(受託番号V00331)の約700から1000(「800領域」)及び約1400から1600(「1500領域」)ヌクレオチド塩基位置に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の2つの領域を標的にした増幅及び検出オリゴヌクレオチドを評価のために設計し、合成した。
Pseudomonas aeruginosaオリゴセットの更なる特定
バックグラウンドシグナルを更に低下させ、特異性及び感度を改善するために、幾つかの追加のオリゴセットを設計し、試験した。感度を改善するために「伸長」オリゴも導入した。これらの実験を標的捕捉なしで実施した。
Pseudomonas aeruginosaオリゴセットの更なる特性分析及び最適化
下記表9〜13に、本発明のある好ましいオリゴセットの特定及び最適化に関する代表的データを要約して示す。実時間TMA反応から得られたAveRange(RFU)及びTTime(min)結果を示す。好ましいオリゴは、曲線形状(図示せず)並びにAveRange及びTTimeの結果によってこの分析から決定される。好ましいオリゴセットは、ゼロPae rRNA複製レベルにおいて、最低の相対蛍光単位(RFU)及び最長TTimeを有する。ゼロPae rRNA複製レベルにおける高いRFU値は、試薬内の汚染の可能性を示す。
特異的標的捕捉と非特異的標的捕捉の評価
特異的標的捕捉(TC)オリゴヌクレオチド、配列番号66〜71及び特異的TCヘルパーオリゴヌクレオチド、配列番号72&73を、Pseudomonas aeruginosa核酸を標的にするように設計した。ポリdT3dA30末端、(k)18−dT3dA30(「k」は、オリゴヌクレオチドに組み入れられたグアニン(G)とウラシル(U)又はチミン(T)塩基の無秩序な組合せである。)を含む無秩序な2’−メトキシポリ(k)配列を有する非特異的捕捉オリゴヌクレオチド、配列番号65も合成した。
Pseudomonas aeruginosaに関連した生物体との交差反応性の低下
この実施例は、Pseudomonas aeruginosaの近縁の生物体の交差反応性及び増幅を低下させるために実施した追加の実験を記述する。105CFUレベルの近縁Pseudomonads P.stutzeri、P.pseudoalcaligenes及びP.mendocinaと比較して、10CFUのP.aeruginosaで得られたシグナルを示す実時間アッセイデータの例示的なグラフ表示を図1に示す。
Claims (45)
- T7プロバイダーオリゴ及び非T7オリゴを含む、Pseudomonas aeruginosa核酸増幅アッセイに使用するための組成物であって、該T7プロバイダーオリゴが、E.coli 23s rRNAの塩基約725〜825に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列を標的にし、該非T7オリゴが、E.coli 23s rRNAの塩基約845〜950に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、Pseudomonas aeruginosa核酸増幅アッセイに使用するための組成物。
- 前記T7プロバイダーが、E.coli 23s rRNAの塩基725〜775に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列を標的にし、前記非T7プライマーが、E.coli 23s rRNAの塩基900〜950に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項1に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーが、E.coli 23s rRNAの塩基739〜766に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列を標的にし、前記非T7プライマーが、E.coli 23s rRNAの塩基918〜943に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項1に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号2、配列番号1、配列番号11又は配列番号14から選択され、前記非T7プライマーが、配列番号22、配列番号24、配列番号19又は配列番号15から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーが配列番号2であり、前記非T7プライマーが配列番号24である、請求項1に記載の組成物。
- 検出オリゴを更に含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記検出オリゴがトーチオリゴ又は分子ビーコンである、請求項6に記載の組成物。
- 前記トーチオリゴが、配列番号51、配列番号54、配列番号50又は配列番号56から選択される、請求項7に記載の組成物。
- 伸長オリゴを更に含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記伸長オリゴが、配列番号43又は配列番号44から選択される、請求項9に記載の組成物。
- ブロッカーオリゴを更に含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記ブロッカーオリゴが、配列番号29、配列番号26、配列番号40又は配列番号42から選択される、請求項11に記載の組成物。
- T7プロバイダーオリゴ、配列番号2及び非T7オリゴ、配列番号24を含み、場合によってはブロッカーオリゴ配列番号29、トーチオリゴ配列番号54、伸長オリゴ配列番号44、標的捕捉オリゴ配列番号69を更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴ配列番号73を更に含む、Pseudomonas aeruginosa核酸増幅アッセイに使用するための組成物。
- T7プロバイダーオリゴ及び非T7オリゴを含む、Pseudomonas aeruginosa増幅アッセイに使用するためのキットであって、該T7プロバイダーオリゴが、E.coli 23s rRNAの塩基約725〜825に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列を標的にし、該非T7オリゴが、E.coli 23s rRNAの塩基約845〜950に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、Pseudomonas aeruginosa増幅アッセイに使用するためのキット。
- 前記T7プロバイダーが、E.coli 23s rRNAの塩基725〜775に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列を標的にし、前記非T7プライマーが、E.coli 23s rRNAの塩基900〜950に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項14に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーが、E.coli 23s rRNAの塩基739〜766に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列を標的にし、前記非T7プライマーが、E.coli 23s rRNAの塩基918〜943に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項14に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号2、配列番号1、配列番号11又は配列番号14から選択され、前記非T7プライマーが、配列番号22、配列番号24、配列番号19又は配列番号15から選択される、請求項14に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーが配列番号2であり、前記非T7プライマーが配列番号24である、請求項14に記載のキット。
- 検出オリゴを更に含む、請求項14に記載のキット。
- 前記検出オリゴがトーチオリゴ又は分子ビーコンである、請求項19に記載のキット。
- 前記トーチオリゴが、配列番号51、配列番号54、配列番号50又は配列番号56から選択される、請求項20に記載のキット。
- 伸長オリゴを更に含む、請求項14に記載のキット。
- 前記伸長オリゴが、配列番号43又は配列番号44から選択される、請求項22に記載のキット。
- ブロッカーオリゴを更に含む、請求項14に記載のキット。
- 前記ブロッカーオリゴが、配列番号29、配列番号26、配列番号40又は配列番号42から選択される、請求項24に記載のキット。
- T7プロバイダーオリゴ、配列番号2及び非T7オリゴ、配列番号24を含み、場合によってはブロッカーオリゴ配列番号29、トーチオリゴ配列番号54、伸長オリゴ配列番号44、標的捕捉オリゴ配列番号69を更に含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴ配列番号73を更に含む、Pseudomonas aeruginosa核酸増幅アッセイ用キット。
- 試料中のPseudomonas aeruginosaの存在を検出するための方法であって、該方法は、T7プロバイダーオリゴ及び非T7オリゴを用いて核酸増幅アッセイを実施することを含み、該T7プロバイダーオリゴが、E.coli 23s rRNAの塩基約725〜825に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列を標的にし、該非T7オリゴが、E.coli 23s rRNAの塩基約845〜950に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、方法。
- 前記T7プロバイダーが、E.coli 23s rRNAの塩基725〜775に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列を標的にし、前記非T7プライマーが、E.coli 23s rRNAの塩基900〜950に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項27に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーが、E.coli 23s rRNAの塩基739〜766に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列を標的にし、前記非T7プライマーが、E.coli 23s rRNAの塩基918〜943に対応するPseudomonas aeruginosa核酸の領域中の配列の相補配列を標的にする、請求項27に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号2、配列番号1、配列番号11又は配列番号14から選択され、前記非T7プライマーが、配列番号22、配列番号24、配列番号19又は配列番号15から選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーが配列番号2であり、前記非T7プライマーが配列番号24である、請求項27に記載の方法。
- 増幅された核酸を検出オリゴを用いて検出することを更に含む、請求項28に記載の方法。
- 前記検出オリゴがトーチオリゴ又は分子ビーコンである、請求項32に記載の方法。
- 前記トーチオリゴが、配列番号51、配列番号54、配列番号50又は配列番号56から選択される、請求項33に記載の方法。
- 伸長オリゴを更に含む、請求項27に記載の方法。
- 前記伸長オリゴが、配列番号43又は配列番号44から選択される、請求項35に記載の方法。
- ブロッカーオリゴを更に含む、請求項28に記載の方法。
- 前記ブロッカーオリゴが、配列番号29、配列番号26、配列番号40又は配列番号42から選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーオリゴが配列番号2であり、前記非T7オリゴが配列番号24であり、前記方法は、場合によってはブロッカーオリゴ配列番号29、トーチオリゴ配列番号54、伸長オリゴ配列番号44、標的捕捉オリゴ配列番号69の使用を含み、場合によっては標的捕捉ヘルパーオリゴ、配列番号73の使用を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記増幅された核酸の検出が実時間で行われる、請求項33に記載の方法。
- P.aeruginosa核酸が、近縁のPseudomonadsの存在下で特異的に検出される、請求項40に記載の方法。
- 検出カットオフが設定され、それによってP.aeruginosa核酸、及びすべてではないが1種類以上の近縁のPseudomonadsが検出される、請求項40に記載の方法。
- Pseudomonas aeruginosa 23sリボソーム核酸の800領域又は1500領域を増幅するように設計された2種類以上の増幅オリゴヌクレオチドを含む試料中のPseudomonas aeruginosaを検出するための組成物。
- Pseudomonas aeruginosa 23sリボソーム核酸を検出するための1種類以上のプローブを更に含む、請求項43に記載の組成物。
- 試料中のPseudomonas aeruginosaの存在を検出するための方法であって、該方法は、請求項43に記載の増幅オリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅アッセイを実施すること、及び増幅された核酸を請求項44に記載の1種類以上のプローブを用いて検出することを含む、方法。
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