CN112522434A

CN112522434A - 一种用于同时检测多种致病性真菌的引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN112522434A
Application number: CN202011552286.6A
Authority: CN
Inventors: 杜蔚安; 黄怀球; 吴榕; 郑阳阳; 黄志杰
Original assignee: Guangdong Huamei Zhongyuan Biological Science & Technology Co ltd; Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Guangdong Huamei Zhongyuan Biological Science & Technology Co ltd; Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2040-12-24
Also published as: CN112522434B

Abstract

本发明公开了一种用于同时检测多种致病性真菌的引物组及试剂盒。所述引物组包括14对引物，所述引物可特异性复合扩增14种目标真菌的DNA序列，所述目标真菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、烟曲霉、土曲霉、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、絮状表皮癣菌、孢子丝菌、犬小孢子菌、着生芽菌和马拉色菌。所述试剂盒采用多重荧光标记PCR扩增技术进行复合扩增，一次反应能够同时鉴别多种常见致病性真菌，检测效率高，速度快、成本低，并且通过对真菌ITS或β‑tubulin数据库中序列进行种间和种内比对，选择种内保守区设计扩增引物，具有非常强的种属特异性。整个检测过程可在2‑3小时内完成，检测速度快，能够满足临床样品快速检验的要求。

Description

一种用于同时检测多种致病性真菌的引物组及试剂盒

技术领域

本公开属于微生物检测技术领域，具体涉及一种用于同时检测多种致病性真菌的引物组，含有该引物组的试剂盒，以及其应用。

背景技术

真菌病是由致病性真菌引起的一类疾病的统称，常见的致病性真菌有念珠菌、曲霉菌、毛癣菌、絮状表皮癣菌、孢子丝菌、犬小孢子菌、着生芽菌、马拉色菌等。根据感染人体的部位不同可分为浅部真菌病和深部真菌病。浅部真菌病的致病真菌多为癣菌，以及犬小孢子菌和马拉色菌等，一般会侵犯人的皮肤、指甲和毛发，虽然很少有致死的情况，但发病率高，易复发；深部真菌病的致病真菌多为念珠菌、曲霉菌、孢子丝菌和着生芽菌等，危害较大，往往会侵袭人的皮下组织、黏膜和内脏，且由于器官移植、放疗化疗、导管介入治疗技术的广泛应用以及抗生素的滥用，使深部真菌病的发病率日渐升高。

致病真菌的准确检测是治疗的基础，对于真菌病的精准治疗具有重要意义。目前临床上常用的诊断方法为直接镜检法，培养检查法和血清学检测。直接镜检法和培养检查法都是基于形态学的检查方法。直接镜检虽然快速、简便，但其阴性结果不能排除真菌感染，且有假阳性结果。培养检查法可以辅助直接镜检法的不足，提高阳性率，但培养周期过长，至少需1-2周。血清学检测虽然检测迅速，但容易出现假阳性结果，且难于确定具体菌种。

因此，对于致病真菌的检测，人们把目光放在了分子生物学上，如PCR技术、基因芯片技术等检测方法。普通PCR与荧光定量PCR技术能对微量真菌进行快速检测，且特异性高，但一次实验只能检测一种或几种致病真菌，检测通量较低；基因芯片技术虽然检测通量高，但操作繁琐，检测耗时较长。

发明内容

本发明公开了一种用于同时检测多种致病性真菌的引物组及试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。

一种引物组包括14对引物，所述引物可特异性复合扩增14种目标真菌的DNA序列，所述目标真菌包括白色念珠菌(Candida albicans，C.Albicans)、热带念珠菌(Candidatropicalis，C.Tropicalis)、光滑念珠菌(Candida glabrata，C.Glabrata)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis，C.Parapsilosis)、克柔念珠菌(Candida krusei，C.Krusei)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus，A.Fumigatus)、土曲霉(Aspergillus terrestris，A.Terrestris)、须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes，T.Mentagrophytes)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum，T.Rubrum)、絮状表皮癣菌(Epidermophyton flocculus，E.Flocculus)、孢子丝菌(Sporothrix schenckii，S.Schenckii)、犬小孢子菌(Microsporum caninum，M.Caninum)、着生芽菌(Fonsecaea pedrosoi，F.Pedrosoi)和马拉色菌(Malassezia fufur，M.Fufur)。本发明利用常见致病性真菌高度特异性的PCR扩增引物，对样本DNA进行复合扩增反应，结合毛细管电泳技术对扩增产物进行分离分析，可以检测样品中是否含有上述14种致病真菌，并能进一步确定致病真菌种类，是一种简单高效、快速、高度灵敏高特异性的检测技术。

进一步，所述引物特异性复合扩增所述目标真菌的核糖体DNA内转录间隔区序列或微管蛋白基因序列。针对念珠菌属、毛癣菌属以及絮状表皮癣菌、孢子丝菌、犬小孢子菌、着生芽菌和马拉色菌均为特异性扩增其DNA内转录间隔区(rDNA ITS)序列；而针对曲霉菌属，则特异性扩增其微管蛋白(β-tubulin)基因序列。

进一步，所述引物的核苷酸序列及对应特异性扩增的目标真菌以及优选的工作浓度如表1所示：

表1多重PCR扩增引物序列

另一方面，本发明还公开了一种试剂盒，包括多重扩增检测体系，所述多重扩增检测体系包括如上所述的引物组。所述引物组中每对特异性扩增所述目标真菌的所述引物中至少一条所述引物的5’端标记有荧光发光基团，所述荧光发光基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX中的任意一种。

进一步，所述多重扩增检测体系总量为10μL，包括4.0μL Reaction Mix，2.0μL引物混合物，0.4μL热启动Taq酶(5U/μL)，1.0μL待测DNA模板(1ng/μL)，以及2.6μL H₂O。

本发明提供的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。所述阳性对照品包括含有白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、烟曲霉、土曲霉、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、絮状表皮癣菌、孢子丝菌、犬小孢子菌、着生芽菌和马拉色菌种属特异性DNA片段的重组质粒。

上述提供的试剂盒的使用方法包括以下步骤：

(1)提取真菌DNA。

(2)以步骤(1)中提取的DNA作为模板，进行荧光标记多重PCR复合扩增反应。多重PCR扩增反应体系为10μL，包括4.0μL Reaction Mix，2.0μL引物混合物，0.4μL热启动Taq酶(5U/μL)，1.0μL待测DNA模板(1ng/μL)，以及2.6μL H₂O。PCR扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸10min。

(3)利用毛细管电泳进行检测，取PCR扩增产物1μL与0.4μL荧光分子量内标和12μL去离子甲酰胺混合，3000rpm下离心3min去除气泡，95℃变性3min，冰浴3min，利用遗传分析仪进行电泳检测；可根据实际情况对扩增产物进行适当稀释，使检测荧光值位于1000-5000RFU之间。

(4)分析步骤(3)中的电泳结果。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过对真菌ITS或β-tubulin数据库中序列进行种间和种内比对，选择种内保守区设计扩增引物，具有非常强的种属特异性。

(2)本发明采用多重荧光标记PCR扩增技术进行复合扩增，一次反应能够同时鉴别多种常见致病性真菌，检测效率高，速度快、成本低。

(3)本发明采用毛细管电泳对扩增产物进行检测，检测灵敏度高，操作简便，适合大规模样品的检测。

(4)本发明所述试剂盒的整个检测过程可在2-3小时内完成，检测速度快，能够满足临床样品快速检验的要求。

附图说明

图1为扩增产物长度排布图；

图2为阳性对照品扩增检测图谱；

图3为致病性真菌的多重检测试剂盒对白色念珠菌模板的特异性结果图谱；

图4为致病性真菌的多重检测试剂盒对热带念珠菌模板的特异性结果图谱；

图5为致病性真菌的多重检测试剂盒对光滑念珠菌模板的特异性结果图谱；

图6为致病性真菌的多重检测试剂盒对近平滑念珠菌模板的特异性结果图谱；

图7为致病性真菌的多重检测试剂盒对克柔念珠菌模板的特异性结果图谱；

图8为致病性真菌的多重检测试剂盒对烟曲霉模板的特异性结果图谱；

图9为致病性真菌的多重检测试剂盒对土曲霉模板的特异性结果图谱；

图10为致病性真菌的多重检测试剂盒对须癣毛癣菌模板的特异性结果图谱；

图11为致病性真菌的多重检测试剂盒对红色毛癣菌模板的特异性结果图谱；

图12为致病性真菌的多重检测试剂盒对絮状表皮癣菌模板的特异性结果图谱；

图13为致病性真菌的多重检测试剂盒对孢子丝菌模板的特异性结果图谱；

图14为致病性真菌的多重检测试剂盒对犬小孢子菌模板的特异性结果图谱；

图15为致病性真菌的多重检测试剂盒对着生芽菌模板的特异性结果图谱；

图16为致病性真菌的多重检测试剂盒对马拉色菌模板的特异性结果图谱。

具体实施方式

以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。

实施例1.分子标记筛选与引物序列构建

收集白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、烟曲霉、土曲霉、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、絮状表皮癣菌、孢子丝菌、犬小孢子菌、着生芽菌和马拉色菌的ITS序列、β-tubulin基因序列、翻译延伸因子(translation elongation factor，TEF)、肌动蛋白(actin)基因、线粒体细胞色素B基因等多种分子标记序列，对不同种属真菌同一分子标记序列的碱基差异信息进行比对。最终筛选出14段种间变异性较大但具有种内特异性的保守序列区域作为菌种鉴定的靶标。分别为念珠菌属、毛癣菌属以及絮状表皮癣菌、孢子丝菌、犬小孢子菌、着生芽菌和马拉色菌的ITS序列以及曲霉菌属的β-tubulin序列中变异较大且具有种属特异性的区域。对应的扩增产物长度排布图见图1。

引物设计时在遵循基本设计原则的基础上，还应确保所有引物具有相近的Tm值与GC含量，以及各引物间不形成二聚体或其他交联结构；由于多种真菌ITS或β-tubulin序列间存在较高的同源性，在设计引物时应保证高度的扩增特异性，并采用Genebank中的BLAST功能进行比对评估。

实施例2.荧光标记引物筛选及检测体系的建立

(1)采用酚-氯仿法提取真菌DNA

用接种环从真菌培养基上刮取真菌，注意不要刮到培养基，液氮研磨4-6次，之后采用酚-氯仿法提取真菌DNA。依次加入500μL STE缓冲液(10mM，pH8.0)，50μL 10％SDS，50μL蛋白酶K，56℃水浴6h。加入500μL苯酚-氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，振荡混匀，12000rpm离心10min。将上清移至新离心管中，加入500μL氯仿/异戊醇(24∶1)，振荡混匀，12000rpm离心10min。将上清移至新离心管中，加入2倍体积无水乙醇，12000rpm离心10min。倒掉上清，加入50μL TE缓冲液溶解，-20℃冰箱保存。

(2)引物筛选测试

分别以14种致病真菌的标准菌株DNA为模板，采用设计好的特异性扩增引物进行PCR反应。首先制备10μL PCR反应液，依次向0.2mL离心管内加入Reaction Mix 4.0μL、热启动C-Taq酶(5U/μL)0.4μL、上下游引物各0.5μL、DNA模板(1ng/μL)1.0μL、sdH₂O 3.6μL，充分混匀后短暂离心；将反应管放入热循环仪中，设置参数为95℃预变性2min，94℃变性30s，58-60℃退火1min，72℃延伸50-60s，29-31个循环，最后72℃延伸10min；反应结束后取1μLPCR产物进行毛细管电泳检测，并用GeneMapper ID-X软件分析数据。根据产物峰的峰高与出峰位置筛选高效率与高特异性的引物对。只有当某引物针对该物种DNA模板扩增产生单一目标产物峰、而针对其他物种DNA模板扩增不出峰时，才能被成功筛选为候选引物，进入后续实验流程。

(3)多重荧光PCR检测体系的建立

将测试验证成功的单对荧光标记PCR鉴定引物逐一加入至多重检测体系。由于14对扩增引物间存在极为复杂的相互作用关系，必须经过大量的反复测试与条件优化，以保证多重检测体系中每对引物仍具有较高的扩增效率、均衡性、特异性及灵敏度。最终获得如SEQ ID NO1～28所示的28条特异性PCR扩增引物。基于引物优化好的多重反应体系如下：多重PCR扩增反应体系为10μL，包含4.0μL Reaction Mix，2.0μL引物混合物，0.4μL热启动Taq酶(5U/μL)，1.0μL待测DNA模板(1ng/μL)，以及2.6μL H₂O。

实施例2.致病性真菌的多重检测试剂盒的构建

除多重荧光标记PCR扩增反应体系之外，多重检测试剂盒中还需配备阳性对照品和阴性对照品。

(1)阳性对照品的制备

以致病性真菌的DNA提取产物为模板进行特异性靶标序列的常规PCR扩增，将扩增产物克隆至pMD18T载体，并转化至DH-5α大肠杆菌感受态细胞；采用蓝白斑筛选法挑选成功导入重组质粒的大肠杆菌，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序分析，验证插入片段的结构大小与碱基序列。验证正确后通过培养重组大肠杆菌获得重组质粒的大量拷贝，最后将14个含有特异性靶标序列的重组质粒进行等摩尔比混合均匀，即得阳性对照品。图2为阳性对照品的特异性荧光标记PCR扩增检测图谱。

实施例3.灵敏度测试

将14种致病真菌的DNA浓度稀释为0.1ng/μL，0.01ng/μL，0.005ng/μL，0.002ng/μL，0.001ng/μL，0.0005ng/μL，0.0002ng/μL按实施例2提供的致病性真菌的多重检测试剂盒进行检测，结果如表2所示，多重荧光标记PCR检测体系对14种真菌的检测灵敏度为10²个拷贝。

表2多重检测试剂盒的灵敏度结果

实施例4.特异性测试

利用致病性真菌的多重检测试剂盒分别针对单个致病性真菌模板进行检测，检测方法参照实施例1。附图3-16依次为依次为白色念珠菌模板、热带念珠菌模板、光滑念珠菌模板、近平滑念珠菌模板、克柔念珠菌模板、烟曲霉模板、土曲霉模板、须癣毛癣菌模板、红色毛癣菌模板、絮状表皮癣菌模板、孢子丝菌模板、犬小孢子菌模板、着生芽菌模板和马拉色菌模板的检测图谱。每种真菌模板均只在对应的目标位置出现单一检测峰，而在其他位置均不出峰，说明实施例2提供的致病性真菌的多重检测试剂盒具有良好的特异性。

实施例5.临床样本检测

由中山大学附属第三医院皮肤科提供20份含有致病真菌的临床样本，样本类型包括组织、痰液、尿液等，使用实施例2提供的致病性真菌的多重检测试剂盒进行检测。同时利用真菌通用引物对提取的真菌DNA进行扩增与测序验证，测序结果与本发明检测结果的对比如表3所示。其中有17份样本被成功检出，且鉴定的菌种结果与通用引物测序的检测结果的一致率为100％；另外3份样本经测序鉴定为黑曲霉、毛孢子菌、新生隐球菌，不在本发明检测范围内，因此未被检出。以上结果显示实施例2提供的致病性真菌的多重检测试剂盒具有很高的准确性。

表3临床样本检测结果与测序结果对比表

上述实施例仅为本发明的较佳实施方式，故不能依此限定本发明实施的范围，在没有背离本发明的精神实质和原理的前提下，所作出的改变、修饰、替代、组合等均包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学附属第三医院;广东华美众源生物科技有限公司

<120> 一种用于同时检测多种致病性真菌的引物组及试剂盒

<130> 2020

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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Claims

1.一种引物组，其特征在于，包括14对引物，所述引物可特异性复合扩增14种目标真菌的DNA序列，所述目标真菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、烟曲霉、土曲霉、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、絮状表皮癣菌、孢子丝菌、犬小孢子菌、着生芽菌和马拉色菌。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物特异性复合扩增所述目标真菌的核糖体DNA内转录间隔区序列或微管蛋白基因序列。

3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物的核苷酸序列及对应特异性扩增的目标真菌为：

4.一种试剂盒，其特征在于，包括多重扩增检测体系，所述多重扩增检测体系包括如权利要求1至3任一项所述的引物组，每对特异性扩增所述目标真菌的所述引物中至少一条所述引物的5’端标记有荧光发光基团，所述荧光发光基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的工作浓度为0.10～0.18μM。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述多重扩增检测体系为10μL，包括Reaction Mix 4.0μL，所述引物组2.0μL，5U/μL的热启动Taq酶0.4μL，1ng/μL的待测DNA模板1.0μL，以及H₂O 2.6μL。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品是含有白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、烟曲霉、土曲霉、须癣毛癣菌、红色毛癣菌、絮状表皮癣菌、孢子丝菌、犬小孢子菌、着生芽菌和马拉色菌种属特异性DNA片段的重组质粒。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，多重扩增检测体系的扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸50s，30个循环；最后72℃延伸10min。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，采用毛细管电泳对扩增产物进行检测。

10.权利要求1至3中任意一项所述的引物组以及权利要求4至9中任意一项所述的试剂盒在真菌种属鉴定中的应用。