CN112877217B - 一种黄褐奈尼兹皮真菌菌株及其降解鸡毛中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄褐奈尼兹皮菌菌株及其在降解鸡毛中的用途，其形态特征：在PDA培养基上，培养14d，25℃，菌落直径40mm，毡状，淡棕色到灰白色到淡黄红色，中央密集，然后一环状稀疏带，再密集环带，边缘规则；背面黄棕色到乳白色。菌丝分隔，透明，光滑，宽1–5µm。分生孢子有大小两种，大分生孢子十分丰富，表面粗糙，分隔，一般分2–6隔，少数有8个隔，梭形至纺锤形，15–58×4.0–10.5µm。小分生孢子稀少，多数侧生，光滑，透明，椭圆形至棒状，4.0–8.5×1–3.5µm。本发明能很好地降解鸡毛。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种黄褐奈尼兹皮菌菌株，同时还涉及该黄褐奈尼兹皮菌菌株在降解鸡毛中的用途。
背景技术
鸡毛是一种富含角蛋白原料，其粗蛋白含量在80%以上，是一种难以降解的有机质，主要由胱氨酸等20多种氨基酸以肽键作用结合在一起，形成相互高度交叉的长链大分子，其中氢键、二硫键、盐键和酯键等保持角蛋白的空间构型而形成三维结构，稳定性很高，一般条件下都不能被溶解，也不能被一般的蛋白酶所水解。当鸡毛等角蛋白废弃物自然堆积时，降解非常缓慢，易造成大量堆积，与此同时，很多人类或动物病原微生物能以鸡毛角蛋白为碳氮源生长而富集此类真菌，从而引发对生态环境的二次污染及对人类健康造成危害。畜禽累羽毛资源的利用受到阻碍并被大量浪费，通常对于这类资源会采用填埋、焚烧等方式进行处理，但焚烧会对环境和人体健康带来安全隐患，所以运用绿色健康的方法来降解角蛋白尤为重要。鸡毛蛋白资源丰富，是丰富的蛋白质或氨基酸来源，是一种质量稳定、具有较高营养价值的潜在优质蛋白源，可用于生产肥料、饲料、食品添加剂、农药和医药、包覆膜材料以及生物医学材料等等。利用微生物降解鸡毛是一种温和、高效、绿色的方法，具有广阔的发展潜力和极高的实用价值。常用的微生物降解鸡毛主要是细菌、酵母及丝状真菌。在中国专利申请件中，涉及微生物角蛋白降解有6项发明专利，其降解菌株均为细菌。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种能很好地降解鸡毛的黄褐奈尼兹皮菌菌株。
本发明的另一目的在于提供该黄褐奈尼兹皮菌菌株在降解鸡毛中的用途。
本发明的一种黄褐奈尼兹皮菌菌株的分离方法，包括以下步骤：
1. 分离培养
1.1土样的采集：采自云南省昆明市西山公园路边花坛土，采集深度为3-5cm，收集的土样装入无菌塑封袋中带回实验室备用。
1.2 试验用培养基
马丁氏PDA培养基：称取削皮洗净的马铃薯200克，切块，水煮沸30min后过滤，收集滤液，加入葡萄糖20g，20g琼脂粉，充分搅拌均匀后，121℃高压灭菌30min后，冷却至40℃左右，加入1%的灭菌孟加拉红水溶液3mL，1%青霉素液3mL和1%链霉素液 3mL。
1.3菌株的富集与分离：将土壤样品与10g鸡毛粉混合置于培养皿中，保湿25℃恒温培养1个月，待观察到鸡毛上长有菌丝，在超净工作台中，将菌丝挑出至另一干净培养皿中纯化，培养5d，待单菌落长出后转移至新的PDA试管斜面培养基上保存，获得纯化菌株GZAC.YNXS.2，保存备用。
1.4菌株的DNA提取和PCR扩增
刮取培养至产孢后的培养物放入灭菌的研钵中，加入能覆盖住培养物后的液氮对培养物进行研磨，至细小粉末后，放入1.5mL离心管中，按照真菌DNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）的操作流程进行DNA提取。提取完的真菌DNA存放于-20℃冰箱中保存备用。对真菌ITS-5.8S rDNA区域进行扩增，所用引物为ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3’和ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’（由昆明硕擎生物技术有限公司合成）。PCR扩增反应体系为25μL体系：DNA模板2μL，mix21μL，引物ITS5和ITS4各为1μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min； 94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。将检测合格的PCR产物送于昆明硕擎生物技术有限公司进行测序。
2. 菌株的鉴定
纯化菌株黄褐奈尼兹皮菌菌株GZAC.YNXS.2接种至PDA培养基25℃培养14天后（3个重复），对菌落形态进行描述，制片后对显微形态进行测量和描述，具体如下：
黄褐奈尼兹皮菌菌株GZAC.YNXS.2菌株的形态学描述：在PDA培养基上，培养14d，25℃，菌落直径40mm，毡状，淡棕色到灰白色到淡黄红色，中央密集，然后一环状稀疏带，再密集环带，边缘规则；背面黄棕色到乳白色。菌丝分隔，透明，光滑，宽1–5 µm。分生孢子有大小两种，大分生孢子十分丰富，表面粗糙，分隔，一般分2–6隔，少数有8个隔，梭形至纺锤形，15–58×4.0–10.5µm。小分生孢子稀少，多数侧生，光滑，透明，椭圆形至棒状，4.0–8.5×1–3.5µm。该菌株形态特征与原始报道的黄褐奈尼兹皮菌描述基本一致。
基于ITS rDNA序列，下载相似性大的黄褐奈尼兹皮菌菌株GZAC.YNXS.2菌株序列，用ClustaXI 5.3软件对该菌株和下载的序列进行比对，用RxAML软件以Isaria farinosa为外群，对黄褐奈尼兹皮菌菌株GZAC.YNXS.2菌株与相关菌株构建ML系统发育树。结果表明，该菌株序列与黄褐奈尼兹皮菌菌株的其余序列以高支持率较好地聚在一起。综合形态特征和分子数据，GZAC.YNXS.2菌株鉴定为黄褐奈尼兹皮菌（Nannizzia fulva）。
本发明的黄褐奈尼兹皮菌菌株GZAC.YNXS.2（Nannizzia fulva GZAC.YNXS.2），于2020年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西咱1号院3号），保藏编号：CGMCC 20753。
菌种的保种和传代：
将GZAC.YNXS.2菌株在PDA培养基平皿上活化，培养7天后，在无菌条件下，分别切4-5个0.5mm的菌丝块放入已灭菌的30%甘油冻存管中，3支放入-20°C冰箱中保存，3支放入-80°C超低温冰箱中保存，并定期检查菌株存货情况。
本发明的黄褐奈尼兹皮菌菌株在降解鸡毛中的用途。
一种黄褐奈尼兹皮菌菌株降解鸡毛的方法，包括以下步骤：
（1）配制鸡毛10g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、氯化钠1.2g/L、硫酸锌镁0.05g/L、氯化钙0.2/L g，pH7.0的发酵液；
（2）将黄褐奈尼兹皮菌菌株配置为1×107/mL孢子的悬浮液；
（3）吸取上述悬浮液1mL接种到100mL发酵液中，在25℃先静置48小时，然后再振荡培养96小时。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果，本发明经分离从土壤中得到了一株黄褐奈尼兹皮菌菌株GZAC.YNXS.2，能适应本地自然环境。经实验表明，该黄褐奈尼兹皮菌菌株具有非常出色的鸡毛降解能力，可用于鸡毛的生物降解，在微生物肥料、氨基酸饲料生产和生态环境保护中具有潜在应用价值。
具体实施方式
一种黄褐奈尼兹皮菌菌株的分离方法，包括以下步骤：
1. 分离培养
1.1土样的采集：采自云南省昆明市西山公园路边花坛土，采集深度为3-5cm，收集的土样装入无菌塑封袋中带回实验室备用。
1.2 试验用培养基
马丁氏PDA培养基：称取削皮洗净的马铃薯200克，切块，水煮沸30min后过滤，收集滤液，加入葡萄糖20g，20g琼脂粉，充分搅拌均匀后，121℃高压灭菌30min后，冷却至40℃左右，加入1%的灭菌孟加拉红水溶液3mL，1%青霉素液3mL和1%链霉素液 3mL。
1.3菌株的富集与分离：将土壤样品与10g鸡毛粉混合置于培养皿中，保湿25℃恒温培养1个月，待观察到鸡毛上长有菌丝，在超净工作台中，将菌丝挑出至另一干净培养皿中纯化，培养5d，待单菌落长出后转移至新的PDA试管斜面培养基上保存，获得纯化菌株GZAC.YNXS.2，保存备用。
1.4菌株的DNA提取和PCR扩增
刮取培养至产孢后的培养物放入灭菌的研钵中，加入能覆盖住培养物后的液氮对培养物进行研磨，至细小粉末后，放入1.5mL离心管中，按照真菌DNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）的操作流程进行DNA提取。提取完的真菌DNA存放于-20℃冰箱中保存备用。对真菌ITS-5.8S rDNA区域进行扩增，所用引物为ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3’和ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’（由昆明硕擎生物技术有限公司合成）。PCR扩增反应体系为25μL体系：DNA模板2μL，mix21μL，引物ITS5和ITS4各为1μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min； 94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。将检测合格的PCR产物送于昆明硕擎生物技术有限公司进行测序。
2. 菌株的鉴定
纯化菌株黄褐奈尼兹皮菌菌株GZAC.YNXS.2接种至PDA培养基25℃培养14天后（3个重复），对菌落形态进行描述，制片后对显微形态进行测量和描述，具体如下：
黄褐奈尼兹皮菌菌株GZAC.YNXS.2菌株的形态学描述：在PDA培养基上，培养14d，25℃，菌落直径40mm，毡状，淡棕色到灰白色到淡黄红色，中央密集，然后一环状稀疏带，再密集环带，边缘规则；背面黄棕色到乳白色。菌丝分隔，透明，光滑，宽1–5 µm。分生孢子有大小两种，大分生孢子十分丰富，表面粗糙，分隔，一般分2–6隔，少数有8个隔，梭形至纺锤形，15–58 × 4.0–10.5 µm。小分生孢子稀少，多数侧生，光滑，透明，椭圆形至棒状，4.0–8.5×1–3.5 µm。该菌株形态特征与原始报道的黄褐奈尼兹皮菌描述基本一致。
基于ITS rDNA序列，下载相似性大的黄褐奈尼兹皮菌菌株GZAC.YNXS.2菌株序列，用ClustaXI 5.3软件对该菌株和下载的序列进行比对，用RxAML软件以Isaria farinosa为外群，对黄褐奈尼兹皮菌菌株GZAC.YNXS.2菌株与相关菌株构建ML系统发育树。结果表明，该菌株序列与黄褐奈尼兹皮菌菌株的其余序列以高支持率较好地聚在一起。综合形态特征和分子数据，GZAC.YNXS.2菌株鉴定为黄褐奈尼兹皮菌（Nannizzia fulva）。
实验例1 黄褐奈尼兹皮菌菌株对鸡毛降解实验
实验材料与方法
1.1鸡毛的处理：鸡毛采集于贵阳市花溪区一农贸家禽屠宰场，将采集的鸡毛自来水清洗并浸泡12h，流水冲洗干净，121℃高压灭菌30 mins后，置于50℃烘箱里烘干，备用。
1.2发酵培养基的制备
鸡毛10g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钠1.2g、硫酸锌0.05g、氯化钙0.2g，定容到100ml，pH7.0，121℃高压灭菌30 mins，备用。
1.3黄褐奈尼兹皮菌菌株孢子悬浮液的制备
在超净工作台内，将黄褐奈尼兹皮菌菌株GZAC.YNXS.2在PDA培养基上25℃培养7d的菌丝轻轻刮下，转移至已灭菌的装有10mL 0.05%Tween-80的试管中，一起置于漩涡震荡仪上震荡1min后静置，在超净工作台中用3层擦镜纸对悬浮液进行过滤，将过滤后的孢子悬浮液滴经血球计数板计数，并将孢子浓度调整至1×107个/mL，取1mL接种到装有100mL发酵液的发酵培养基中。
1.4降解鸡毛的培养方法
将装有100mL发酵培养基的三角瓶静置于25℃培养箱中培养48h，再置于摇床中110rpm，25℃摇床培养96h。
上述3个重复，对比发酵前后发酵液中鸡毛结构情况、可溶性蛋白和鸡毛降解率。
1.5蛋白质标准曲线的绘制
1）称取考马斯亮蓝G250，100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1L备用。
2）0.2mol/L，pH7.0磷酸缓冲液和标准蛋白溶液的配制：称取KH2PO4 2.12g和K2HPO4 5.56g用蒸馏水溶解，混合后定容至200mL。再称取100mg牛血清蛋白，配制成1mg/mL的标准蛋白质溶液。
3）取7支试管，分别加入标准蛋白质溶液0、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL，再分别加入考马斯亮蓝定容至5mL，摇匀，在595nm波长下测吸光度，并通过吸光度值计算样品中可溶性蛋白的含量。
绘制蛋白质标准曲线。
1.6 发酵液中可溶性蛋白含量的测定
取100μL培养获得的发酵液，分别加入考马斯亮蓝定容至5mL，摇匀，在595nm波长下测吸光度，并通过蛋白质标准曲线计算样品中可溶性蛋白的含量。
1.7 发酵液中鸡毛滤渣的重量
将发酵6天的发酵液用快速定性滤纸过滤，将过滤所得的鸡毛滤渣用烘箱烘干，测其重量。
2.实验结果
2.1发酵液中鸡毛结构完整性比较
鸡毛是富角蛋白基质，结构比较复杂，难以降解。经黄褐奈尼兹皮菌菌株GZAC.YNXS.2降解后，原来完整的鸡毛结构被降解为碎末状。
2.2发酵液中可溶性蛋白含量测定
发酵液中可溶性蛋白含量越高表明降解效果越好。由标准曲线计算，该培养方法测定的可溶性蛋白含量由基础发酵液中无可溶性蛋白增加为174.8μg/mL，说明鸡毛降解效果较好。
2.3发酵液中鸡毛渣含量测定
该培养方法中测定的鸡毛滤渣重量由对照的1g/100mL降低为0.528g/100mL，降解率为47.2%，说明鸡毛降解较好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (2)
1.一种黄褐奈尼兹皮菌（Nannizzia fulva）菌株GZAC.YNXS.2，其特征在于：所述菌株的保藏号为CGMCC 20753。
2.如权利要求1所述的黄褐奈尼兹皮菌菌株在降解鸡毛中的用途。
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