CN117210337B - 一种具有鸡羽毛降解活性的卵孢菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有鸡羽毛降解活性的卵孢菌及其用途,Ovatospora sp.GZUIFR23.001形态特征:该菌分别在MEA、PDA和OA培养基中培养7 d后观察其形态,记录数据。MEA:菌落直径为35‑45 mm;正面,菌丝密集,呈白色;背面,菌落有放射状裂纹,菌丝呈乳白色。OA:菌落形状规则,直径为80‑85 mm,菌丝稀疏,呈乳白色;背面,菌丝呈乳白色。PDA:菌落直径为45‑50 mm,形状不规则;正面,棉絮状菌丝,乳白色;背面,中间有褶皱,乳白色;分生孢子子呈近球形。本发明能很好地降解鸡羽毛。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体来说涉及一种卵孢菌,同时还涉及该卵孢菌在降解鸡羽毛中的用途。
背景技术
鸡羽毛是一种难降解的富含角蛋白的原料。自然界中,当鸡羽毛等角蛋白废弃物堆积时,降解非常缓慢,易造成大量堆积,能富集很多人类或动物病原微生物,从而引发对生态环境的二次污染,并对人类健康造成危害。由于畜禽类羽毛富含蛋白资源,且其利用受到阻碍并被大量浪费。利用微生物降解鸡羽毛是一种温和、高效、绿色的方法,具有广阔的发展潜力和极高的实用价值。常用的微生物降解鸡羽毛主要是细菌、酵母及丝状真菌。如中国专利申请号202011431544.5,公开了真菌黄褐奈尼兹皮菌具有降解鸡羽毛的潜力。但自然界仍有大量具有潜在降解功能的微生物资源值得分离和研究,新资源的积累将为今后高效降解鸡羽毛的合成菌剂奠定菌株基础。
卵孢属真菌目前主要用在降解木质纤维素方面,夏林(2021)利用从新疆荒漠腐木中分离筛选得到的Ovatosporasp. XJ161开展了以玉米秸秆为原料进行的降解研究,发现该菌株具有较强的纤维素和半纤维素降解能力,和具有较弱的木质素降解能力。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种能很好地降解鸡羽毛的卵孢菌。
本发明的另一目的在于提供该卵孢菌在降解鸡羽毛中的用途。
本发明的一种卵孢菌GZUIFR23.001(Ovatosporasp. GZUIFR23.001),其形态特征:该菌分别在MEA、PDA和OA培养基中培养7 d后观察其形态,记录数据。MEA:菌落直径为35-45 mm;正面,菌丝密集,呈白色;背面,菌落有放射状裂纹,菌丝呈乳白色。OA:菌落形状规则,直径为80-85 mm,菌丝稀疏,呈乳白色;背面,菌丝呈乳白色。PDA:菌落直径为45-50mm,形状不规则;正面,棉絮状菌丝,乳白色;背面,中间有褶皱,乳白色;分生孢子子呈近球形。
该菌株已于2023年07月03日保藏到中国科学院微生物研究所(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号),保藏号:CGMCC No. 40675,名称:Ovatosporasp.GZUIFR23.001。
本发明的一种卵孢菌GZUIFR23.001的分离方法,包括以下步骤:
1. 分离培养
1.1土样的采集:采自山东省青岛市某医院绿化土壤,采集深度为3-5cm,收集的土样装入无菌塑封袋中带回实验室备用。
1.2 试验用培养基
马丁氏PDA培养基:称取削皮洗净的马铃薯200克,切块,水煮沸30min后过滤,收集滤液,加入葡萄糖20g,20g琼脂粉,充分搅拌均匀后,121℃高压灭菌30min后,冷却至40℃左右,加入1%的灭菌孟加拉红水溶液3mL,1%青霉素液3mL和1%链霉素液 3mL。
1.3菌株的分离:将土壤样品采用传统的稀释平板法分离,待单菌落长出后转移至新的PDA试管斜面培养基上保存,获得纯化菌株GZUIFR23.001,保存备用。
1.4菌株的DNA提取和PCR扩增
刮取培养至产孢后的培养物放入灭菌的研钵中,加入能覆盖住培养物后的液氮对培养物进行研磨,至细小粉末后,放入1.5mL离心管中,按照真菌DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)的操作流程进行DNA提取。提取完的真菌DNA存放于-20℃冰箱中保存备用。对真菌ITS-5.8S rDNA区域进行扩增,所用引物为ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3’和ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’(由昆明硕擎生物技术有限公司合成)。PCR扩增反应体系为25μL体系:DNA模板2μL,mix21μL,引物ITS5和ITS4各为1μL。PCR反应条件为:94℃预变性5min; 94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,共30个循环;72℃延伸10min,4℃保存。将检测合格的PCR产物送于昆明硕擎生物技术有限公司进行测序。
2. 菌株的鉴定
纯化菌株卵孢菌 GZUIFR23.001接种至PDA培养基45℃培养7天后(3个重复),对菌落形态进行描述,制片后对显微形态进行测量和描述,具体如下:
卵孢菌 GZUIFR23.001菌株的形态学描述:该菌分别在MEA、PDA和OA培养基中培养7 d后观察其形态,记录数据。MEA:菌落直径为35-45 mm;正面,菌丝密集,呈白色;背面,菌落有放射状裂纹,菌丝呈乳白色。OA:菌落形状规则,直径为80-85 mm,菌丝稀疏,呈乳白色;背面,菌丝呈乳白色。PDA:菌落直径为45-50 mm,形状不规则;正面,棉絮状菌丝,乳白色;背面,中间有褶皱,乳白色;分生孢子子呈近球形。
基于ITS rDNA序列,下载相似性大的卵孢菌 GZUIFR23.001菌株序列,用ClustaXI5.3软件对该菌株和下载的序列进行比对,用RxAML软件以Triangulariaallahabadensis和T. verruculosa为外群,对卵孢菌 GZUIFR23.001菌株与相关菌株构建ML系统发育树。结果表明,该菌株序列与卵孢菌的其余序列以高支持率较好地聚在一起。综合形态特征和分子数据,菌株GZUIFR23.001鉴定属于卵孢菌属(Ovatospora)。
本发明的卵孢菌GZUIFR23.001(OvatosporaGZUIFR23.001),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西咱1号院3号),保藏编号:CGMCC40675。
菌种的保种和传代:
将GZUIFR23.001菌株在PDA培养基平皿上活化,培养7天后,在无菌条件下,分别切4-5个0.5mm的菌丝块放入已灭菌的30%甘油冻存管中,3支放入-20°C冰箱中保存,3支放入-80°C超低温冰箱中保存,并定期检查菌株存货情况。
本发明的卵孢菌GZUIFR23.001在降解鸡羽毛中的用途。
本发明与现有技术相比,具有明显的有益效果,从以上技术方案可知:本发明的卵孢菌GZUIFR23.001(OvatosporaGZUIFR23.001),能适应本地自然环境。经实验表明,该卵孢菌具有非常出色的鸡羽毛降解能力,可用于鸡羽毛的生物降解,在微生物肥料、氨基酸饲料生产和生态环境保护中具有潜在应用价值。
具体实施方式
一种卵孢菌的分离方法,包括以下步骤:
1. 分离培养
1.1土样的采集:采自山东省青岛市某医院绿化土壤,采集深度为3-5cm,收集的土样装入无菌塑封袋中带回实验室备用。
1.2 试验用培养基
马丁氏PDA培养基:称取削皮洗净的马铃薯200克,切块,水煮沸30min后过滤,收集滤液,加入葡萄糖20g,20g琼脂粉,充分搅拌均匀后,121℃高压灭菌30min后,冷却至40℃左右,加入1%的灭菌孟加拉红水溶液3mL,1%青霉素液3mL和1%链霉素液 3mL。
1.3菌株的分离:将土壤样品采用稀释平板法进行分离,待发现单菌落长出后转移至新的PDA试管斜面培养基上保存,获得纯化菌株GZUIFR23.001,保存备用。
1.4菌株的DNA提取和PCR扩增
刮取培养至产孢后的培养物放入灭菌的研钵中,加入能覆盖住培养物后的液氮对培养物进行研磨,至细小粉末后,放入1.5mL离心管中,按照真菌DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)的操作流程进行DNA提取。提取完的真菌DNA存放于-20℃冰箱中保存备用。对真菌ITS-5.8S rDNA区域进行扩增,所用引物为ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3’和ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’(由昆明硕擎生物技术有限公司合成)。PCR扩增反应体系为25μL体系:DNA模板2μL,mix21μL,引物ITS5和ITS4各为1μL。PCR反应条件为:94℃预变性5min; 94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,共30个循环;72℃延伸10min,4℃保存。将检测合格的PCR产物送于昆明硕擎生物技术有限公司进行测序。
2. 菌株的鉴定
纯化菌株卵孢菌GZUIFR23.001接种至PDA培养基45℃培养7天后(3个培养基),对菌落形态进行描述,制片后对显微形态进行测量和描述,具体如下:
卵孢菌GZUIFR23.001菌株的形态学描述:该菌分别在MEA、PDA和OA培养基中45℃培养7d后观察其形态,记录数据。MEA:菌落直径为3.5-4.5cm;正面,菌丝密集,呈白色;背面,菌落有放射状裂纹,菌丝呈乳白色。OA:菌落形状规则,直径为8.0-8.5cm,菌丝稀疏,呈乳白色;背面,菌丝呈乳白色。PDA:菌落直径为4.5-5.0cm,形状不规则;正面,棉絮状菌丝,乳白色;背面,中间有褶皱,乳白色。该菌的孢子呈近球形。
基于ITS rDNA序列,下载相似性大的卵孢菌序列,用ClustaXI 5.3软件对该菌株和下载的序列进行比对,用RxAML软件以Triangulariaallahabadensis和T. verruculosa为外群,对卵孢菌GZUIFR23.001菌株与相关菌株构建ML系统发育树。结果表明,该菌株序列与卵孢菌的其余序列以高支持率较好地聚在一起。综合形态特征和分子数据,GZUIFR23.001鉴定属于卵孢菌属(Ovatospora)。
实验例:卵孢菌株对鸡羽毛降解实验
实验材料与方法
1.1鸡羽毛的处理:鸡羽毛采集于贵阳市花溪区一农贸家禽屠宰场,将采集的鸡羽毛自来水清洗并浸泡12h,流水冲洗干净,121℃高压灭菌30 mins后,置于50℃烘箱里烘干,备用。
1.2三种发酵培养基的制备
发酵培养基:鸡羽毛10g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钠1.2g,定容到100ml,pH7.0,121℃高压灭菌30 mins,备用。
硫酸钙发酵培养基:鸡羽毛10g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钠1.2g、硫酸钙0.03g,定容到100ml,pH7.0,121℃高压灭菌30 mins,备用。
硫酸镁发酵培养基:鸡羽毛10g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钠1.2g,硫酸镁0.03g,定容到100ml,pH7.0,121℃高压灭菌30 mins,备用。
1.3卵孢菌株孢子悬浮液的制备
在超净工作台内,将卵孢菌GZUIFR23.001在PDA培养基上45℃培养7d的菌丝轻轻刮下,转移至已灭菌的装有10mL 0.05%Tween-80的试管中,一起置于漩涡震荡仪上震荡1min后静置,在超净工作台中用3层擦镜纸对悬浮液进行过滤,将过滤后的孢子悬浮液滴经血球计数板计数,并将孢子浓度调整至1×107个/mL,取1mL接种到各装有100mL发酵液的发酵培养基中。
1.4降解鸡羽毛的培养方法
将装有100 mL发酵培养基的三角瓶静置于45℃培养箱中摇床培养7天。
上述3种培养基各3个重复,对比发酵前后发酵液中鸡羽毛结构完整性、角蛋白酶活和鸡羽毛降解率。
1.5 发酵液中角蛋白酶活的测定
取1.0 mL 粗酶液与装有0.01 g鸡毛粉的1 mL pH 5.0的50 mmol柠檬酸缓冲液混合。将混合物在50 °C水浴中孵育60 min,加入2.0 mL 10 %三氯乙酸(TCA)终止反应。所得沉淀在10000 × g离心10分钟后分离。取上清液0.2 mL,用纯净水稀释至1.0 mL,加入5.0mL碱性铜试剂(碳酸钠Na2CO3 40 g;酒石酸tartaric acid 7.5 g;硫酸铜CuSO4 4.5 g,蒸馏水1000毫升:最终pH为9.9 ± 0.5)。然后,加入0.5 mL福林酚试剂,试管在黑暗中保存30分钟,使试管形成蓝色。阴性对照用不含角蛋白的0% TCA 2 mL孵育。在660 nm处测定吸光度,以酪氨酸为标准。根据L -酪氨酸标准曲线,一个单位的角化酶活性对应在标准测试条件1)-(2)所示。"L-酪氨酸浓度 = 吸光度/(0.0018×1000)mg/mL=(g/L)" (1)"角蛋白酶活性= (L-酪氨酸浓度)/0.0001812 IU/mL/min" (2)1.6发酵液中鸡羽毛滤渣的重量
将发酵7天的发酵液用快速定性滤纸过滤,将过滤所得的鸡羽毛滤渣用烘箱烘干,测其重量。降解率=(原始鸡羽毛重量-鸡羽毛滤渣重量/原始鸡羽毛重量)×100%
2.实验结果
2.1发酵液中鸡羽毛结构完整性比较
鸡羽毛是富角蛋白基质,结构比较复杂,难以降解。经卵孢菌GZUIFR23.001降解后,原来完整的鸡羽毛结构被降解为碎末状。
2.2发酵液中角蛋白酶活含量测定
该培养方法测定的角蛋白酶活在发酵培养基中为688.82IU/mL/min,硫酸镁发酵培养基中为713.35 IU/mL/min,硫酸钙发酵培养基中为482.38 IU/mL/min,说明在硫酸镁发酵培养基中降解鸡羽毛的酶活最好。
2.3发酵液中鸡羽毛渣含量测定
该培养方法中测定的降解率在发酵培养基中为69.21%,硫酸镁发酵培养基中的为65.64%,硫酸钙发酵培养基中的为52.23%,说明在发酵培养基中的鸡羽毛降解率最好。
综上结果表明,该卵孢菌GZUIFR23.001具有较好的降解鸡羽毛效果,在不同成分的发酵培养基中降解效果不同,但从降解率来说在发酵培养基中的降解率最高,在硫酸镁发酵培养基中的角蛋白酶活最高。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,任何未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (2)
1.一种卵孢菌(Ovatospora sp.)GZUIFR23.001,其特征在于:所述菌种的保藏号为CGMCC No. 40675。
2.如权利要求1所述的卵孢菌GZUIFR23.001在降解鸡羽毛中的用途。
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