CN109628620A - 全序列荧光pcr检测oxa-23家族和oxa-51家族基因型的引物、方法及试剂盒 - Google Patents

全序列荧光pcr检测oxa-23家族和oxa-51家族基因型的引物、方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了全序列荧光PCR检测blaOXA‑23家族和blaOXA‑51家族基因型的引物、方法和试剂盒，可实时定量样品中耐药基因含量，灵敏度高，最低检测极限达到100copies/反应；特异性强，可特异性识别blaOXA‑23家族和blaOXA‑51家族基因亚型，与其他非目的基因或人源基因无交叉反应；而且本发明临床诊断效果明显，非常适合大量临床样品的检测，具有极高的应用价值。

Description

全序列荧光PCR检测OXA-23家族和OXA-51家族基因型的引物、 方法及试剂盒
技术领域
本发明属于核酸检测领域，涉及全序列荧光PCR检测OXA-23家族和OXA-51家族基因型的引物、方法及试剂盒。
背景技术
碳青霉烯类抗生素(Carbapenems)属于β-内酰胺类抗生素家族中的一员，对质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(Extended specturnβ-lactamerses,ESBLs)、染色体及质粒介导的头孢菌素酶均具有高度稳定性，曾被认为是紧急治疗抗药性病症的重要方法。然而，随着近几年该类抗生素的广泛应用，临床出现越来越多的碳青霉烯类抗生素耐药菌株，包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及肠杆菌科细菌等。细菌一旦对该类抗生素耐药将表现为多重耐药或泛耐药，而新生抗生素替加环素和多黏菌素毒性较强，常导致患者无药可用。
目前碳青霉烯类耐药机制主要集中在四个方面：①产生碳青霉烯酶(Carbapenemases)；②超广谱β-内酰胺酶和/或AmpCβ-内酰胺酶(简称AmpC酶)过度表达同时合并外膜孔蛋白丢失；③外排泵高表达的膜屏障机制；④药物靶位的改变。在上述几种耐药机制中，产生碳青霉烯酶是细菌对碳青霉烯类耐药最主要的机制。D类酶又称苯唑西林酶(Oxacillin-hydrolyzing，OXA)，可强力水解苯唑西林和氯唑西林，对碳青霉烯的水解能力较弱，但在外排泵过表达或外膜通透性降低的协同作用下可引起高水平耐药。目前国内外碳青霉烯类抗生素耐药菌株以产D类酶OXA-23家族、OXA-51家族最为常见，其它基因型少见。药物选择性压力易导致菌株中碳青霉烯酶基因突变，同一基因家族常出现数个甚至数百个基因型或基因亚型。
现有的方法仅限于检测有限数量的已知基因型，无法覆盖到同一家族基因型或基因亚型。为了解决这一问题，开发一种用于检测碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型的方法势在必行。
发明内容
本发明目的在于提供全序列荧光PCR检测blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因型的引物。
本发明的另一目的在于提供全序列荧光PCR检测blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因型的方法。
本发明的再一目的在于提供全序列荧光PCR检测blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因型的的试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
本发明提供一种全序列荧光定量PCR检测体系，能够快速、准确地检测鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因型，解决传统表型鉴定方法和既往分子生物学方法中操作繁琐、耗时耗力、只能检测有限基因型的技术难题。
一种检测碳青霉烯酶基因blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型的全序列荧光定量PCR引物，引物的核苷酸序列如下所示：
引物blaOXA-23-F：5’-TACTTGCTATGTGGTTGCTT-3’(SEQ ID NO：1)，
引物blaOXA-23-R：5’-ATTTATCTCAARTGGGCTTT-3’(SEQ ID NO：2)，
引物blaOXA-51-F：5’-GTCTTATGAACATTMAARCMCTCT-3’(SEQ ID NO：3)，
引物blaOXA-51-R：5’-TGGGCTATAAACTAACTCTATAAAA-3’(SEQ ID NO：4)。
一种检测碳青霉烯酶基因blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型全序列荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。
进一步的，该试剂盒还包括SYBR Green PCR Master Mix(Taq酶、dNTP、10×PCRBuffer、MgCl2、SYBR Green荧光染料的混合液)、阴性对照品、阳性对照品、标准品和去离子无核酸酶水。
一种检测碳青霉烯酶基因blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型的全序列荧光定量PCR方法，包括以下步骤：
1)从样品中提取DNA；
2)以提取的DNA为模板，用上述所述的引物blaOXA-23-F和blaOXA-23-R、引物blaOXA-51-F和blaOXA-51-R分别进行荧光定量PCR扩增反应；
3)对待测样品中的碳青霉烯酶基因blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型进行结果分析；
上述方法不用于疾病的诊断和治疗。
进一步的，步骤2)中的全序列荧光定量PCR扩增反应体系为：
进一步的，步骤2)中全序列荧光定量PCR扩增反应程序为：94℃预变性30s；95℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸45s循环45次；溶解曲线步骤：65℃逐渐升温至98℃，每秒升高0.18℃，每0.11s采集一次荧光。
进一步的，步骤3)中所述结果分析的具体过程为：当待测样品溶解曲线Tm值与阳性对照Tm值不一致，为阴性；当待测样品溶解曲线Tm值与阳性对照Tm值一致，且扩增曲线呈S型，Cp值显示在5～40为阳性；根据标准品的Cp值和浓度绘制标准曲线，将待检样品Cp值代入标准曲线公式，计算待检样品中含有的blaOXA-23家族或blaOXA-51家族基因亚型浓度。
本发明的有益效果是：
本发明特异性强，与其它非目的基因或人源基因无交叉反应；灵敏度高，最低检测限为100copies/反应；本发明可用于体外定量检测耐碳青霉烯酶革兰阴性杆菌中blaOXA-23家族和blaOXA-51家族全部基因型，为临床抗感染的研究提供理论依据，并为碳青霉烯酶分子流行病学研究提供参考。
附图说明
图1是本发明全序列荧光定量PCR检测体系建立和评估流程图。
图2是本发明设计的blaOXA-23家族全序列引物Primer-BLAST比对结果。
图3是本发明设计的blaOXA-51家族全序列引物Primer-BLAST比对结果。
图4是普通PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果分析，其中图中泳道M为DNA MarkerDL2000；泳道1为blaOXA-23；泳道2为blaOXA-51；泳道3为blaOXA-23的阴性对照NC1；泳道4为blaOXA-51的阴性对照NC2。
图5是本发明阳性对照全序列荧光定量PCR方法溶解曲线：其中(A)为blaOXA-23-like的溶解曲线，Tm值为85.00-85.04℃；(B)为blaOXA-51-like的溶解曲线，Tm值为85.29-85.34℃。
图6是本发明全序列荧光定量PCR检测方法灵敏度分析，其中1E2～1E6表示102～106；其中A为blaOXA-23-like质粒10倍梯度稀释扩增曲线；B.为blaOXA-23-like质粒10倍梯度稀释溶融解曲线；C.为blaOXA-51-like质粒10倍梯度稀释扩增曲线；D.为blaOXA-51-like质粒10倍梯度稀释溶解曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1检测碳青霉烯酶基因blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因的全序列引物
实验设计流程图如图1。采用GenBank基因序列数据库的基因全序列及侧翼，与Clustal X比对，选择保守区设计针对碳青霉烯酶基因blaOXA-23家族和blaOXA-51家族的全序列荧光定量PCR特异性引物。其中blaOXA-23家族全序列引物可扩增碳青霉烯酶基因blaOXA-23家族目前已发现的6种基因型(见表1)，blaOXA-51家族全序列引物可扩增碳青霉烯酶基因blaOXA-51家族目前已知的93种基因型(见表2)。引物经Oligo6、PrimerPremier5.0和NCBI Primer-BLAST软件比对分析，以避免潜在的非特异性扩增片段，blaOXA-23家族全序列引物Primer-BLAST比对结果如图2，blaOXA-51家族全序列引物Primer-BLAST比对结果如图3。
表1 blaOXA-23-like基因引物可检测的基因型
表2 blaOXA-51-like基因引物可检测的基因型
本发明根据基因亚型设计引物，通过对所设计的引物进行大量的筛选，筛选出一组灵敏性高和特异性强的引物序列，其序列如下：
blaOXA-23-like基因
blaOXA-23-F：5’-TACTTGCTATGTGGTTGCTT-3’(SEQ ID NO：1)；
blaOXA-23-R：5’-ATTTATCTCAARTGGGCTTT-3’(SEQ ID NO：2)；
扩增片段为856bp；
blaOXA-51-like基因
blaOXA-51-F：5’-GTCTTATGAACATTMAARCMCTCT-3’(SEQ ID NO：3)；
blaOXA-51-R：5’-TGGGCTATAAACTAACTCTATAAAA-3’(SEQ ID NO：4)。
扩增片段为847bp。
实施例2阳性标准品的制备、PCR扩增条件优化
阳性标准品的制备：
收集含碳青霉烯类耐药基因blaOXA-23家族基因亚型的基因序列和blaOXA-51家族基因亚型的基因序列的阳性菌株，于含2mg/L亚胺培南的选择培养基分离培养，取单个菌落，制备成2麦氏单位(浊度单位)菌液，取500μl菌液用于提取菌株全基因组DNA作为模板。
使用特异性引物扩增靶基因，
退火温度的优化：
设置不同退火温度，分别为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，反应条件为95℃5min进行预变性及启动Taq酶，然后95℃15s变性，55～65℃退火延伸30s，共40个循环。
扩增体系如下：Premix Ex Taq 12.5μL(包含预混的Taq酶、dNTP、10×PCRBuffer、MgCl2)、特异性上游、下游引物(10μM)各1μL、DNA模板1.5μL(DNA含量100-300ng)，无核酸酶去离子水补足25μL。
PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，电泳结果如图4，结果表明本发明设计的引物(SEQ ID NO：1～4)均具有良好的特异性，经过同一样品在不同退火温度下的结果对比，发现56℃下的结果稍好于其他退火温度，因此两对引物组最佳退火温度均为56℃。
实施例3检测blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型的全序列荧光定量PCR检测试剂盒
试剂盒组成：SYBR Green PCR Master Mix(Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer、MgCl2、SYBR Green荧光染料的混合液)、阴性对照品、阳性对照品、标准品、引物blaOXA-23-F、blaOXA-23-R、blaOXA-51-F、blaOXA-51-R和去离子无核酸酶水组成。
反应体系如下：2×SYBR Green PCR Master Mix 10μL、DNA模板1μL(100-300ng)，无核酸酶去离子水补足20μL。扩增体系同时设置阳性对照、阴性对照、标准品(也名阳性标准品)和空白对照。
实施例4检测blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型的全序列荧光定量PCR方法
(1)阳性标准品的制备：
收集含待测blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型的阳性菌株，于含2mg/L亚胺培南的选择培养基分离培养，取单个菌落，制备成2麦氏单位(浊度单位)菌液，取500μl菌液用于提取菌株全基因组DNA作为模板。使用特异性引物扩增靶基因，引物序列如下：
blaOXA-23-F：5’-TACTTGCTATGTGGTTGCTT-3’(SEQ ID NO：1)；
blaOXA-23-R：5’-ATTTATCTCAARTGGGCTTT-3’(SEQ ID NO：2)；
引物对扩增产物长度为：856bp；
blaOXA-51-F：5’-GTCTTATGAACATTMAARCMCTCT-3’(SEQ ID NO：3)；
blaOXA-51-R：5’-TGGGCTATAAACTAACTCTATAAAA-3’(SEQ ID NO：4)；
引物对扩增产物长度为：847bp。
(2)阳性标准品的全序列荧光定量PCR
其中2×SYBR Green PCR Master Mix为Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer、MgCl2、SYBR Green荧光染料的混合液；
全序列荧光定量PCR扩增反应程序为：94℃预变性30s；95℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸45s循环45次；溶解曲线步骤：65℃逐渐升温至98℃，每秒升高0.18℃，每0.11s采集一次荧光。
(3)结果判定：根据溶解曲线Tm值和扩增曲线Cp值共同判定，读取阳性样品Tm值，且扩增曲线呈S型，Cp值显示在5～40之间为阳性。
图5为阳性样品blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型的全序列荧光定量PCR溶解曲线分析，(A)为blaOXA-23-like溶解曲线，Tm值为85.00-85.04℃；(B)为blaOXA-51-like溶解曲线，Tm值为85.29-85.34℃。
实施例5检测blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型的全序列荧光定量PCR方法
1)从样品中提取DNA；
2)以提取的DNA作为模板，进行全序列荧光定量PCR扩增反应获得扩增产物，反应体系如下：
以上反应体系转移至罗氏480适用的八联管中，瞬时离心，避免管壁残留反应液，将八联管置于Lighter Cycler 480荧光定量PCR仪扩增，PCR扩增反应程序如下：
94℃预变性30s；95℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸45s循环45次；溶解曲线步骤：65℃逐渐升温至98℃，每秒升高0.18℃，每0.11s采集一次荧光。
3)结果判定：
根据溶解曲线Tm值和扩增曲线Cp值共同判定，待检样品溶解曲线Tm值与阳性对照Tm值不一致，为阴性；待检样品溶解曲线Tm值与阳性对照Tm值一致，且扩增曲线呈S型，Cp值显示在5-40之间为阳性；根据标准品的Cp值及其相应的浓度绘制标准曲线，根据待测样品Cp值代入标准曲线公式，计算待测样品的浓度。
实施例6全序列荧光定量PCR试剂盒特异性检测
用本发明建立的方法对不同的DNA进行检测，在含有blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型的阳性模板中，分别掺入其它非目的基因的DNA片段：人基因组DNA、质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC70060和金黄色葡萄球菌ATCC25923及耐药基因的六种DNA，验证该多重检测体系的特异性及抗干扰能力，同时设立阳性对照模板作为阳性对照，以灭菌双蒸水为阴性对照。
检测结果发现，仅阳性对照基因的扩增曲线呈S型，blaOXA-23Cp值为12.51，Tm值为85.04；blaOXA-51Cp值为13.00，Tm值为85.34，表明本发明建立的方法可以特异性鉴别blaOXA-23以及blaOXA-51全基因序列。
实施例7全序列荧光定量PCR试剂盒灵敏度检测
制备质粒阳性标准品，并以10倍进行梯度稀释，稀释至浓度分别为106,105,104,103,102,10copies/μl 6个梯度浓度，确定本发明检测体系的最低检测限。
结合图6表明，在最优反应条件下，本发明对blaOXA-23和blaOXA-51质粒检测下限为100copies/反应；A.为blaOXA-23-like质粒10倍梯度稀释扩增曲线；B.为blaOXA-23-like质粒10倍梯度稀释融解曲线；C.为blaOXA-51-like质粒10倍梯度稀释扩增曲线；D.为blaOXA-51-like质粒10倍梯度稀释融解曲线。
实施例8临床适用性分析
采用本发明的方法(检测系统)对临床分离的碳青霉烯类耐药株进行筛查，观察各碳青霉烯酶基因blaOXA-23家族和blaOXA-51家族的分布情况，联合常规PCR分析结果，对该检测系统的诊断吻合度(Kappa系数)进行分析，以评估该联合检测系统的临床实用性。
(1)利用本发明全序列荧光定量PCR试剂盒对临床分离的65株耐碳青霉烯革兰阴性杆菌进行基因组DNA提取。
(2)以提取的DNA作为模板，分别对样品进行荧光定量PCR扩增反应获得扩增产物；
PCR反应体系为：
其中2×SYBR Green PCR Master Mix为Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer、MgCl2和SYBR Green荧光染料的混合液；
PCR扩增反应程序如下：94℃预变性30s；95℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸45s循环45次；溶解曲线步骤：65℃逐渐升温至98℃，每秒升高0.18℃，每0.11s采集一次荧光。
同时用常规PCR方法平行检测获得的DNA模板，作为对比。
(3)结果
经过对临床样品进行本发明荧光定量PCR检测，上述65株耐碳青霉烯革兰阴性杆菌中，blaOXA-23-like基因阳性的有49株肺炎克雷伯菌；blaOXA-51-like阳性的有44株产酸克雷伯菌。其中，blaOXA-23-like基因和blaOXA-51-like基因都呈阳性有42株：包括34株鲍曼不动杆菌、4株铜绿假单胞菌、2株粘质沙雷菌、1株大肠埃希菌和1株阴沟肠杆菌；仅blaOXA-23-like基因呈阳性有7株：包括4株铜绿假单胞菌、2株肺炎克雷伯杆菌和1株阴沟肠杆菌；仅blaOXA-51-like基因呈阳性有2株：分别是1株肺炎克雷伯杆菌和1株鲍曼不动杆菌。上述其中的65株耐碳青霉烯革兰阴性杆菌，本发明检出14株菌株为阴性。上述结果与常规PCR扩增后的测序结果有较高的一致性(见表3)。
表3全序列荧光PCR与传统PCR对临床65株耐碳青霉烯革兰阴性杆菌检测结果比对
从表3可知，与普通PCR相比，本发明建立的全序列荧光定量PCR方法检测blaOXA-23-like和blaOXA-51-like的灵敏度分别为98％和100％，本发明建立的全序列荧光定量PCR方法检测blaOXA-23-like和blaOXA-51-like的特异性分别为80％和90％，本发明建立的全序列荧光定量PCR方法检测blaOXA-23-like和blaOXA-51-like的Kappa系数分别是0.818和0.928。
上述65株耐碳青霉烯革兰阴性杆菌中，使用本发明的荧光定量PCR方法可以检测到blaOXA-23家族和blaOXA-51家族的基因，与PCR测序结果相一致。
综上所述，本发明建立的全序列荧光定量PCR检测试剂盒可检测OXA-23家族6个基因型和OXA-51家族93个基因型，该试剂盒具有快速、准确、灵敏度高、特异性强、方便实施等优点，该试剂盒的推广应用将为临床快速确定碳青霉烯类耐药菌感染提供依据，为碳青霉烯类抗生素耐药的分子流行病学研究提供新手段，也为细菌耐药机制的研究提供了新思路。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 全序列荧光PCR检测OXA-23家族和OXA-51家族基因型的引物、方法及试剂盒
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
tacttgctat gtggttgctt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
atttatctca artgggcttt 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
gtcttatgaa cattmaarcm ctct 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
tgggctataa actaactcta taaaa 25

Claims (8)

1.一种检测碳青霉烯酶基因blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型的全序列荧光定量PCR引物，引物的核苷酸序列如下所示：
引物blaOXA-23-F：5’-TACTTGCTATGTGGTTGCTT-3’(SEQ ID NO：1)；
引物blaOXA-23-R：5’-ATTTATCTCAARTGGGCTTT-3’(SEQ ID NO：2)；
引物blaOXA-51-F：5’-GTCTTATGAACATTMAARCMCTCT-3’(SEQ ID NO：3)；
引物blaOXA-51-R：5’-TGGGCTATAAACTAACTCTATAAAA-3’(SEQ ID NO：4)。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述的blaOXA-23家族基因亚型包括blaOXA-23、blaOXA-27、blaOXA-73、blaOXA-482、blaOXA-103和blaOXA-133；所述的blaOXA-51家族基因亚型包括blaOXA-51、blaOXA-64、blaOXA-65、blaOXA-66、blaOXA-69、blaOXA-80、blaOXA-82、blaOXA-95、blaOXA-104、blaOXA-115、blaOXA-138、blaOXA-199、blaOXA-234、blaOXA-259、blaOXA-261、blaOXA-262、blaOXA-337、blaOXA-375、blaOXA-376、blaOXA-379、blaOXA-380、blaOXA-381、blaOXA-382、blaOXA-383、blaOXA-390、blaOXA-407、blaOXA-430、blaOXA-431、blaOXA-432、blaOXA-433、blaOXA-497、blaOXA-680、blaOXA-684、blaOXA-685、blaOXA-688、blaOXA-689、blaOXA-690、blaOXA-691、blaOXA-692、blaOXA-693、blaOXA-694、blaOXA-696、blaOXA-698、blaOXA-700、blaOXA-701、blaOXA-702、blaOXA-703、blaOXA-704、blaOXA-705、blaOXA-706、blaOXA-708、blaOXA-709、blaOXA-710、blaOXA-711、blaOXA-712、blaOXA-713、blaOXA-715、blaOXA-718、blaOXA-719、blaOXA-720、blaOXA-721、blaOXA-722、blaOXA-738、blaOXA-740、blaOXA-742、blaOXA-743、blaOXA-744、blaOXA-745、blaOXA-747、blaOXA-748、blaOXA-749、blaOXA-750、blaOXA-751、blaOXA-752、blaOXA-753、blaOXA-754、blaOXA-755、blaOXA-756、blaOXA-757、blaOXA-758、blaOXA-759、blaOXA-760、blaOXA-761、blaOXA-762、blaOXA-765、blaOXA-766、blaOXA-767、blaOXA-768、blaOXA-769、blaOXA-770、blaOXA-771、blaOXA-775、blaOXA-776。
3.一种检测碳青霉烯酶基因blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型全序列荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括SYBR Green PCRMaster Mix、阴性对照品、阳性对照品、标准品和无核酸酶去离子水。
5.一种检测碳青霉烯酶基因blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型的全序列荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)从样品中提取DNA；
2)以提取的DNA为模板，用权利要求1所述的引物对blaOXA-23-F和blaOXA-23-R，引物对blaOXA-51-F和blaOXA-51-R分别进行荧光定量PCR扩增反应，并绘制溶解曲线；
3)对待测样品中的碳青霉烯酶基因blaOXA-23家族和blaOXA-51家族基因亚型进行结果分析；
上述方法不用于疾病的诊断和治疗。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2)中的全序列荧光定量PCR扩增反应体系分别为：
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2)中全序列荧光定量PCR扩增反应程序为：94℃预变性30s；95℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸45s，循环45次；溶解曲线步骤：65℃逐渐升温至98℃，每秒升高0.18℃，每0.11s采集一次荧光。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述结果分析的具体过程为：当待测样品溶解曲线Tm值与阳性对照Tm值不一致，为阴性；当待测样品溶解曲线Tm值与阳性对照Tm值一致，且扩增曲线呈S型，Cp值显示在5～40为阳性；根据标准品的Cp值和浓度绘制标准曲线，将待检样品Cp值代入标准曲线公式，计算待检样品中含有的blaOXA-23家族或blaOXA-51家族基因亚型浓度。
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