JP2023502674A - 細菌および真菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗菌剤感受性（ＡＳＴ）について迅速かつ同時に細菌を同定し、表現型を試験するためのレポーターアッセイとしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するための組成物および方法に関する。本発明は、抗菌剤感受性試験のための複数菌サンプルの多重化および取り扱いの能力を示した戦略を使用する。

Description

発明の分野
本開示は、分子診断の分野に関し、より詳細には、生物学的サンプルからの細菌の抗菌剤感受性の同定および決定に関する。

発明の背景
感染性疾患の診断および処置の指標とするために、臨床サンプル中の細菌性病原体の抗菌剤感受性の検出、同定および決定のための開発または迅速かつ簡便な方法が緊急に必要とされている。上記方法を必要とする良い例は、血流感染症（ＢＳＩ）である。ＢＳＩは、北米および欧州の死因の上位７位にランク付けされており、米国では年間推定１７０万件の敗血症事象があり、年間２７０，０００人が死亡し、年間１４０億ドルの米国における医療費の一因となっている。指向性抗菌療法までの時間を短縮することで、敗血症患者の罹患率および死亡率が改善されることが示されており、その結果、入院期間（ＬＯＳ）の短縮および病院費用の削減がもたらされる。より速く感受性の結果が出ると、より迅速な抗菌剤の漸減を可能にし、有害作用の減少および薬物耐性への寄与の減少がもたらされる。したがって、臨床医が最も適切な抗菌療法をより迅速に提供し、患者の転帰を改善することを可能にするＢＳＩにおける迅速な表現型抗菌剤感受性結果を提供するアッセイおよび試験システムの開発が依然として必要とされている。

血液培養物から見出される少なくとも２つの異なる微生物の存在として定義される、複数菌による血流感染症（ＢＳＩ）がいっそう報告されており、その割合は全ＢＳＩ発症の６％～３２％に及んでいる。複数菌によるＢＳＩを有する入院患者の死亡率は２１％～６３％の範囲であり、単一菌感染を有する患者の死亡率の約２倍であった。

従来の抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）は、所与の抗菌剤の存在下で所与の細菌を増殖させることによって実施され、これは液体培養と固体寒天培地の両方で実施し得る。ＡＳＴの２つの最も一般的な方法は以下のとおりである。１）微量液体希釈法、および２）ディスク拡散法（別名Ｋｉｒｂｙ－Ｂａｕｅｒ）。微量液体希釈法は、定量的（最小阻害濃度）結果および定性的（感受性、中間および耐性）結果の両方を提供する。ディスク拡散法は定性的な結果のみを提供する。

微量液体希釈法は、複数の濃度の抗菌剤の存在下で所与の細菌をインキュベートすることによって実施される。インキュベーション後、抗菌剤の各濃度で細菌の増殖／増殖なしが観察される。増殖が観察されない最低濃度は最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）であり、μｇ／ｍＬの単位を有する。確立されたガイドラインは、特定の細菌群または種について実験的に決定されたＭＩＣ値が所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性であると解釈される「ブレイクポイント」を提供する。

ディスク拡散法は、固体寒天培地上に所与の細菌の「細菌叢」を作成し、次いで寒天培地上に単一の抗生物質ディスクを配置することによって実施される。ディスク中の抗生物質は培地中に拡散し、インキュベーション後、ディスクの周りに円形の阻害領域が形成される。領域の直径は、細菌種および抗菌剤に関する情報と共に、病原体が所与の抗菌剤に対して感受性であるか、中間であるか、または耐性であるかを決定するために、参照で確立された直径ブレイクポイントと併せて使用される。

一般に、ＡＳＴの結果を解釈するために最も一般的に使用される２つのガイドラインは、以下のものからのガイドラインである。１）臨床検査標準協議会（ＣＬＳＩ）、および２）抗菌剤感受性試験における欧州委員会（ＥＵＣＡＳＴ）。米国はＣＬＳＩガイドラインを使用し、欧州の国々はＥＵＣＡＳＴガイドラインを使用している。ＣＬＳＩの最新のバージョンはＭ１００ ＥＤ３０であり、ＥＵＣＡＳＴの最新のバージョンはバージョン１０である。

発明の概要
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をベースとする迅速な同定および抗菌剤感受性試験（ＩＤ／ＡＳＴ）システムに関し、このシステムは、臨床検査室で使用するための陽性血液培養物から直接、細菌の抗菌剤感受性の迅速な同定および／または決定のためにＰＣＲ技術を利用する特定のアッセイパネルのための自動ワークフローをサポートする。このシステムはまた、尿路感染症および呼吸器感染症などの他のサンプルタイプからのサンプルを利用および分析する能力を有する。ＰＣＲをベースとする迅速な高速ＩＤ／ＡＳＴシステムにより、機器、消耗品、試薬、およびデータ管理の機能を使用して、試薬を用いたサンプル処理から結果解釈までのワークフローが提供される。標的の同定および抗菌剤感受性の結果は、システムからの出力である。

本発明はまた、ＰＣＲをベースとする迅速なＩＤ／ＡＳＴ血流感染（ＢＳＩ）パネルに関し、選択された細菌または真菌の迅速な同定のためにＰＣＲ技術を利用し、ＰＣＲをベースとする迅速なＩＤ／ＡＳＴシステムに対して表現型抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）を実施するインビトロ診断試験である。ＰＣＲをベースとする迅速ＩＤ／ＡＳＴ ＢＳＩアッセイは、陽性血液培養サンプルに対して直接、前陽性血液培養物に対して、または潜在的に患者血清から直接実施し得る。このアッセイは、菌血症を引き起こし得る特定の病原体の抗菌剤感受性の診断および同定の補助として示される。このパネルは、真菌の可能性を有する最も一般的なＢＳＩグラム陰性およびグラム陽性病原体を分析するように設計されている。ＩＤ戦略をＴａｑＭａｎ ５’ヌクレアーゼリアルタイムＰＣＲアッセイと組み合わせた構成により、複数菌サンプル、単菌サンプル、および必要に応じた分離株試験のための最小阻害濃度（ＭＩＣ）および感受性、中間および耐性（ＳＩＲ）情報を提供する能力が提供されるはずである。

これらの結果は、他の臨床所見および検査所見と併せて使用されるべきである。陽性血液培養物を処理するための標準的な実験プロトコルに従うべきであり、必要に応じて補足試験のための分離株の利用可能性を確保する。
本発明はまた、インビトロ診断試験であるＰＣＲをベースとする迅速ＩＤ／ＡＳＴ表現型スクリーニング試験に関し、単一の薬物、薬物のクラスまたは薬物の組み合わせについての標的病原体または病原体の群の迅速な同定および表現型感受性試験のためにＰＣＲ技術を利用する。ＰＣＲをベースとする迅速ＩＤ／ＡＳＴスクリーニングアッセイは、臨床サンプルまたは細菌／真菌分離株から直接実施される。これらのアッセイにより、問題のある薬物耐性病原体の存在が示され、患者および病院における安全性に役に立つ。これらの種類の試験の例は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（ＣＲＥ）、カンジダ・アウリス、およびＭＤＲ淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）についてである。

したがって、本発明の一態様は、少なくとも１つの抗菌剤または１つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する細菌または真菌の群の抗菌剤感受性を同時に同定および決定するためにレポーターとして定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを使用する方法に関する。一実施形態では、細菌または真菌の標的群は、血流感染症（ＢＳＩ）、胃腸感染症、呼吸器感染症、尿路感染症、鼻感染症、直腸感染症または創傷感染症に存在する。一実施形態では、細菌または真菌の群の同定は、細菌または真菌の群に特異的なシグナルを検出することによるものである。一実施形態では、特異的なシグナルは、細菌または真菌の群に由来しない標的遺伝子よりも細菌または真菌の群に由来する標的遺伝子により選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドを使用することによって検出される。一実施形態では、標的遺伝子は、ｒｐｌＰ、ｏｍｐＡ、ｔｕｆ、ｒｐｏＢ、ｄｄｌ、ｄｄｌＡ、ｆｄｎＧ、ｓｏｄＡ、ｇｙｒＢ、Ｏ－抗原アセチラーゼ、ｅｃｆＸ、ｔｕｓＡ、ＣＰＥ、ｓｉｐ、およびｎｕｃから選択される。

別の実施形態では、細菌または真菌の群は、分類学上の目を表す。一実施形態では、分類学上の目はエンテロバクター目である。別の実施形態では、細菌または真菌の群は、分類学上の科を含む。一実施形態では、分類学上の科は、腸内細菌科、エルシニア科（Ｙｅｒｓｉｎｉａｃｅａｅ）、モルガネラ科（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａｃｅａｅ）、または前記科の組み合わせから選択される。さらに別の実施形態では、細菌または真菌の群は、分類学上の属を含む。一実施形態では、分類学上の属は、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、またはプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）から選択される。

別の実施形態では、細菌または真菌の群は、分類学上の種を表す。一実施形態では、分類学上の種は、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（Ｅｆｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）（Ｅｆｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅｃｏ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ｋｐｎ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）（Ｋｏｘ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）（Ｅｃｌ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）（Ｋａｅ）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）（Ｃｆｉ）、シトロバクター・コセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ）（Ｃｋｏ）、モルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）（Ｍｍｇ）、プロビデンシア・スチュアルティ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ）（Ｐｓｔ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（Ｐｍｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（Ｐｖｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）（Ｃａｌ）、カンジダ・アウリス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ）（Ｃａｕ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（Ｐａｅ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（Ａｂｉ）、アシネトバクター・ピティー（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｔｔｉｉ）（Ａｐｉ）、アシネトバクター・ノソコマリス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）（Ａｎｏ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（Ｓａｕ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（Ｓｅｐ）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）（Ｓｍａ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｓｐｎ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｓａｇ）、またはストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐｙ）から選択される。

さらに別の実施形態では、本方法は、細菌もしくは真菌の群からのものではない第２の標的遺伝子よりも標的細菌もしくは真菌の群からのものである第２の標的遺伝子により選択的にハイブリダイズする追加のプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドを用いて細菌もしくは真菌の群の同定を検証すること、または抗菌剤感受性表現型または毒素表現型もしくは病原性表現型の機構を決定すること、または検証工程と決定工程の両方から選択される工程を更に含む。別の実施形態では、本方法は、細菌または真菌の各群が少なくとも１つの抗菌剤または１つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する、細菌または真菌の１つを超える群の抗菌剤感受性を同時に同定および決定することを更に含む。

別の態様では、本発明は、エンテロバクター目の分類学上の目ではない標的遺伝子よりもエンテロバクター目の分類学上の目である標的遺伝子により選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドを使用することによって、抗菌剤または抗菌剤のクラスに対する腸内細菌目の細菌の抗菌剤感受性を同時に同定および決定するためにレポーターとして定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを使用する方法に関する。一実施形態では、標的遺伝子は、ｒｐｌＰ、ｇｙｒＢ、およびｒｐｏＢから選択される。一実施形態では、分類学上のエンテロバクター目ではない標的遺伝子よりも分類学上のエンテロバクター目である標的遺伝子に対してより選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドは、配列番号１～１６を含むヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、非腸エンテロバクター目のｇｙｒＢよりもエンテロバクター目のｇｙｒＢに対してより選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドは、配列番号８～１０を含むヌクレオチド配列を含む。

別の態様では、本発明は、生物学的サンプル、すなわち複数菌の生物学的サンプルからの複数の細菌株または真菌株の抗菌剤感受性を同時に同定および決定するために、レポーターとして多重化定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを使用する方法に関する。一実施形態では、生物学的サンプルは、全血、血漿、血清、赤血球画分、唾液、脳脊髄液、精液、便、尿、鼻腔スワブ、創傷スワブ、皮膚スワブ、直腸スワブ、胆汁、リンパ液、痰、洗浄液、またはそれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、生物学的サンプルは、全血、血漿、血清またはそれらの組み合わせである。一実施形態では、生物学的サンプルは、ＰＣＲアッセイを実施する前に培養される。別の実施形態では、生物学的サンプルは細菌または真菌の分離株である。別の実施形態では、複数の細菌株または真菌株は、少なくとも１つの抗菌または抗菌クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する細菌または真菌の少なくとも１つの群にグループ化される。一実施形態では、複数の細菌株または真菌株は、細菌または真菌の１つを超える群にグループ化され、細菌または真菌の各群は、少なくとも１つの抗菌剤または１つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する。

別の実施形態では、複数の細菌株の同定は、それぞれ異なる発光波長を有する蛍光色素で標識された複数の株特異的５’ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））オリゴヌクレオチドプローブを利用する。一実施形態では、複数の細菌株の同定は、ＴＡＧＳ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｇｎａｌ）技術を利用する。別の実施形態では、本方法は、複数の細菌株または真菌株の同定を検証する工程、または抗菌剤感受性表現型または毒素表現型もしくは病原性表現型の機構を決定する工程、または検証および決定工程の両方から選択される工程を更に含む。

別の態様では、本発明は、定量的ＰＣＲアッセイを使用して、抗菌剤または抗菌剤のクラスに対する標的細菌株もしくは真菌株または細菌もしくは真菌の標的群の感受性、中間および耐性（ＳＩＲ）情報を同時に同定および決定する方法に関し、標的株または標的群の同定およびＳＩＲ情報の決定は、ＰＣＲデータに関連する１つ以上の数学的関係から導出される。一実施形態では、数学的関係は、閾値サイクル（Ｃｔ）、勾配、シグモイド曲線適合の変曲、絶対蛍光強度（ＡＦＩ）、またはエンドポイント相対強度（ＥＲＩ）から選択される。別の実施形態では、数学的関係は、種々の抗菌剤濃度または種々の抗菌剤間の相対的表現であり、ΔＣｔ、２＾（ΔＣｔ）、ΔＩｎｆｌｅｃｔｉｏｎ、ΔＡＦＩ、またはΔＥＲＩから選択される。一実施形態では、数学的関係は、閾値サイクル（Ｃｔ）、勾配、シグモイド曲線適合の変曲、絶対蛍光強度（ＡＦＩ）、またはエンドポイント相対強度（ＥＲＩ）から選択される数学的関係の組み合わせである。さらに別の実施形態では、数学的関係は、種々の抗菌剤濃度または種々の抗菌剤間の相対的表現の組み合わせであり、ΔＣｔ、２＾（ΔＣｔ）、ΔＩｎｆｌｅｃｔｉｏｎ、ΔＡＦＩ、またはΔＥＲＩから選択される。別の実施形態では、本方法は、標的細菌株もしくは真菌株または細菌もしくは真菌の標的群の同定を検証する工程、または抗菌剤感受性表現型または毒素表現型もしくは病原性表現型の機構を決定する工程から選択される工程、または検証および決定工程の両方を更に含む。別の実施形態では、本方法は、１つを超える標的細菌株もしくは真菌株または細菌もしくは真菌の１つを超える標的群の抗菌剤感受性を同定および決定することを更に含み、各標的株または標的群は、少なくとも１つの抗菌剤または１つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する。

抗菌剤が存在しない場合（参照として示される）、細菌はゲノムＤＮＡ複製を進行中である。抗菌剤の存在下では、耐性細菌は参照と同様のゲノムコピー数で複製するが、感受性細菌は複製が阻害され、コピー数はより少なくなる。この増殖の差は、ｑＰＣＲによって決定し得る表現型の読み出しを提供する。 生のｑＰＣＲデータは、蛍光（例えば、ＴａｑＭａｎプローブから）が各ＰＣＲサイクルで測定される増殖曲線として示されている。耐性分離株については、増殖曲線は、種々の抗菌剤濃度で４時間のインキュベーションに関係なく同様に観察されるが、感受性分離株では、蛍光強度の用量依存的減少およびシグナルがバックグラウンド（閾値）レベルを交差するのに必要なサイクル数の増加（これは一般にサイクル閾値またはＣｔ値と呼ばれる）が観察される。 同じｑＰＣＲデータをＣｔ値に基づいて表し、ここで、耐性分離株は抗菌剤濃度の関数としてＣｔ値の変化がほとんどないかまたは全くないが、感受性分離株はより少数の複製細菌を検出することによってＣｔ値の用量依存的増加を有する。 「勾配」、「Ｃｔ」、「変曲（Ｉｎｆｌｅｃｔｉｏｎ）」、「絶対蛍光強度（ＡＦＩ）」、および「エンドポイント相対強度（ＥＲＩ）」などの数学的関係は、生のｑＰＣＲ増幅曲線の挙動を記述する。 これらの特徴は、抗菌剤の存在下で得られた数値を抗菌剤の非存在下で得られた数値に戻すことによって、抗菌剤曝露の関数として更に評価し得る。次いで、「ΔＣｔ」、「Δ変曲」または「ΔＡＦＩ」などのこれらの特徴の相対的変化を使用して、所与の薬物に対する株ＭＩＣを決定し得、承認されたブレイクポイントを利用して株の耐性および感受性の決定が可能になる。 分割モデルを使用して、細菌分離株を耐性または感受性として分類した。分割は、ジニ指数を利用して、どの特徴および閾値が２つのクラスの分散を最大化するかが決定される。オーバーフィッティングを防止するために２つの分割のみが利用され、視覚化を容易にするために２次元のグラフィック表示を可能にする。 ｇｙｒＢ遺伝子を標的とする表ＩＩＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体に対して試験した。増殖曲線は、エンテロバクター目（大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、およびＰ．ミラビリスを含む）を構成する種についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｒｐｌＰ遺伝子を標的とする表ＩＩに示されるライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体に対して試験した。増殖曲線は、エンテロバクター目を構成する種についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｒｐｏＢ遺伝子を標的とする表ＩＶに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体に対して試験した。増殖曲線は、エンテロバクター目を構成する種についてのみ観察された。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｏｍｐＡ遺伝子を標的とする表Ｖに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティーに対して試験した。増殖曲線は、アシネトバクター属（Ａ．バウマニおよびＡ．ピティー）に属する一般的な病原体についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｒｐｏＢ遺伝子を標的とする表ＶＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体に対して試験した。増殖曲線は、アシネトバクター属に属する一般的な病原体についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｇｙｒＢ遺伝子を標的とする表ＶＩＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体に対して試験した。増殖曲線は、アシネトバクター属に属する一般的な病原体についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｔｕｆ遺伝子を標的とする表ＶＩＩＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティーに対して試験した。増殖曲線は、シュードモナス属に属する病原体（緑膿菌）についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｇｙｒＢ遺伝子を標的とする表ＩＸに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体に対して試験した。増殖曲線は、シュードモナス属に属する病原体（緑膿菌）についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｒｐｏＢ遺伝子を標的とする表Ｘに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体に対して試験した。増殖曲線は、シュードモナス属に属する病原体（緑膿菌）についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｆｄｎＧ遺伝子を標的とする表ＸＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティーに対して試験した。増殖曲線は、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）の種についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｇｙｒＢ遺伝子を標的とする表ＸＩＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体に対して試験した。増殖曲線は、ステノトロホモナス・マルトフィリアの種についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｔｕｆ遺伝子を標的とする表ＸＩＩＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体に対して試験した。増殖曲線は、ステノトロホモナス・マルトフィリアの種についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｒｐｏＢ遺伝子を標的とする表ＸＶに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体：Ｓ．アガラクチア、肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、Ｅ．フェシウム、Ｅ．フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびＳ．エピデルミディスに対して試験した。増殖曲線は、エンテロコッカス属に属する病原体（Ｅ．フェシウムおよびＥ．フェカリス）についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｄｄｌ遺伝子を標的とする表ＸＶＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体に対して試験した。増殖曲線は、エンテロコッカス属に属する病原体（Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）およびＥ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ））についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｇｙｒＢ遺伝子を標的とする表ＸＶＩＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体に対して試験した。増殖曲線は、エンテロコッカス属に属する病原体（Ｅ．フェシウムおよびＥ．フェカリス）内の病原体についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ＣＰＥ遺伝子を標的とする表ＸＶＩＩＩに開示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体：Ｓ．アガラクチア、肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、Ｅ．フェシウム、Ｅ．フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびＳ．エピデルミディスに対して試験した。増殖曲線は、黄色ブドウ球菌の種に属する病原体についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｇｙｒＢ遺伝子を標的とする表ＸＩＸに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体に対して試験した。増殖曲線は、黄色ブドウ球菌の種に属する病原体についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｄｄｌＡ遺伝子を標的とする表ＸＸに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体に対して試験した。増殖曲線は、黄色ブドウ球菌の種に属する病原体についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｇｙｒＢ遺伝子を標的とする表ＸＸＩＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体：Ｓ．アガラクチア、肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、Ｅ．フェシウム、Ｅ．フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびＳ．エピデルミディスに対して試験した。増殖曲線は、ストレプトコッカス・アガラクチア種に属する病原体についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｓｉｐ遺伝子を標的とする表ＸＸＩＩＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体に対して試験した。増殖曲線は、ストレプトコッカス・アガラクチア種に属する病原体についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ｄｄｌＡ遺伝子を標的とする表ＸＸＩＶに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体に対して試験した。増殖曲線は、ストレプトコッカス・アガラクチア種に属する病原体についてのみ観察される。非標的生物については有意な増幅は観察されなかった。 ＲＤＮ１８（１８ｓ ｒＲＮＡ）遺伝子を標的とする表ＸＸＶＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的な真菌病原体：カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・アウリスに対して試験した。増殖曲線は、カンジダ属内の病原体についてのみ観察される。グラム陰性および陽性生物についても試験したが、有意な増幅は示されなかった（データは示さず）。 ＲＤＮ５８（５．８ｓｒＲＮＡ）遺伝子を標的とする表ＸＸＶＩＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的な真菌病原体：カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・アウリスに対して試験した。増殖曲線は、カンジダ属内の病原体についてのみ観察される。グラム陰性および陽性生物についても試験したが、有意な増幅は示されなかった（データは示さず）。 １６ｓ遺伝子を標的とする表ＸＸＶＩＩＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティーに対して試験した。増殖曲線は全てのグラム陰性病原体について観察される。 １６ｓ遺伝子を標的とする表ＸＸＶＩＩＩに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体：Ｓ．アガラクチア、肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、Ｅ．フェシウム、Ｅ．フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびＳ．エピデルミディスに対して試験した。増殖曲線は全てのグラム陽性病原体について観察される。 臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ１００ ＥＤ ３０によって決定されるグラム陰性細菌生物について確立された最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）ブレイクポイント。ブレイクポイントは、抗菌剤感受性試験からのＭＩＣの結果を解釈し、生物の「グループ化」を所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性のいずれかとして分類するために使用される。生物のグループ化は、種、属、目、または特定の生化学的特性を含むがこれらに限定されない種々のレベルであり得る。 臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ１００ ＥＤ ３０によって決定されるグラム陰性細菌生物について確立された最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）ブレイクポイント。 ブレイクポイントは、抗菌剤感受性試験からのＭＩＣの結果を解釈し、生物の「グループ化」を所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性のいずれかとして分類するために使用される。 生物のグループ化は、種、属、目、または特定の生化学的特性を含むがこれらに限定されない種々のレベルであり得る。 臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ１００ ＥＤ ３０によって決定されるグラム陽性細菌生物について確立された最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）ブレイクポイント。ブレイクポイントは、抗菌剤感受性試験からのＭＩＣの結果を解釈し、生物の「グループ化」を所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性のいずれかとして分類するために使用される。生物のグループ化は、種、属、目、または特定の生化学的特性を含むがこれらに限定されない種々のレベルであり得る。 臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ６０ ＥＤ １によって決定されるム真菌生物（酵母）について確立された最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）ブレイクポイント。ブレイクポイントは、抗真菌剤感受性試験（ＡＦＳＴ）からのＭＩＣの結果を解釈し、生物の「グループ化」を所与の抗真菌剤に対して感受性、中間または耐性のいずれかとして分類するために使用される。生物のグループ化は、種、属、目、または特定の生化学的特性を含むがこれらに限定されない種々のレベルであり得る。注意すべきは、カンジダ・アウリスにはＡＦＳＴが推奨されているが、ＣＬＳＩもＣＤＣも現在この種のブレイクポイントを確立していないことである。ＡＦＳＴは、密接に関連するカンジダ属菌に起因し、専門家の意見を使用し、特定の抗真菌剤に対するカンジダ・アウリス分離株の感受性を決定する。 ３つの異なる標的遺伝子（ｇｙｒＢ、ｒｐｌＰ、およびｒｐｏＢ）および３つのクラスの抗菌剤：フルオロキノロン（ＣＩＰ）、アミノグリコシド（ＧＥＮ）およびカルバペネム（ＭＥＭ）を利用するエンテロバクター目の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験。 ３つの異なる標的遺伝子（ｔｕｆ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ）および３つのクラスの抗菌剤：フルオロキノロン（ＣＩＰ）、アミノグリコシド（ＧＥＮ）およびカルバペネム（ＭＥＭ）を利用する緑膿菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験。 ３つの異なる標的遺伝子（ｏｍｐＡ、ｒｐｏＢ、およびｇｙｒＢ｝、および３つのクラスの抗菌剤：フルオロキノロン（ＣＩＰ）、アミノグリコシド（ＧＥＮ）およびカルバペネム（ＭＥＭ）を利用するアシネトバクターの迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験。 ３つの異なる標的遺伝子（ｇｙｒＢ、ｄｄｌＡ、ｔｕｆ｝、および１つのクラスの抗菌剤：セファロスポリン（ＦＯＸ）を利用する黄色ブドウ球菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験。 ３つの異なる標的遺伝子（ｒｐｏＢ、ｄｄｌ、およびｇｙｒＢ｝、および２つのクラスの抗菌剤：ベータ－ラクタム（ＡＭＰ）およびグリコペプチド（ＶＡＮ）を利用するエンテロコッカス・フェシウムの迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験。 カンジダの迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験に使用されるＲＤＮ１８およびＲＤＮ５８遺伝子を標的とするプライマーおよびプローブ。 任意の所与のグラム陰性細菌またはグラム陽性細菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験に使用される１６ｓ遺伝子を標的とするプライマーおよびプローブ。 グラム陰性病原体ＰＣＲマルチプレックスマスターミックスの包括的および排他的性能。 マルチプレックスＰＣＲアッセイのブレイクポイント群、チャネルおよび色素波長および名称。 グラム陽性病原体ＰＣＲマルチプレックスマスターミックスの包括的および排他的性能。 マルチプレックスＰＣＲアッセイのブレイクポイント群、チャネルおよび色素波長および名称。 感受性と耐性とを区別するための閾値は、各プライマー／プローブセットに固有であり得、図４に概説されるように集団の統計的分離を使用して決定される。シプロフロキサシン感受性に関連する閾値は、Ａ）アシネトバクター・バウマニ（Ａｂｉ）、Ｂ）腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏ）、およびＣ）緑膿菌（Ｐａｅ）について示されており、３つの異なる抗生物質濃度でのＣｔ蛍光値、相対蛍光強度（ＲＦＩ）、およびＣｔ蛍光値の前の勾配の変化に基づく。 Ａ）Ａ．バウマニ（Ａｂｉ）、Ｅ．クロアカ（Ｅｃｌ）、大腸菌（Ｅｃｏ）、Ｋ．アエロゲネス（Ｋａｅ）、Ｋ．ニューモニエ（Ｋｐｎ）、および緑膿菌（Ｐａｅ）について、耐性分離株および感受性分離株の分布が示されている。Ｂ）感受性および特異性が実施例２１で定義されているとおりである図４２の閾値を使用した、種間にわたるシプロフロキサシンの感受性、特異性およびカテゴリー一致。 感受性と耐性とを区別するための閾値は、各プライマー／プローブセットに固有であり得、図４に概説されるように集団の統計的分離を使用して決定される。ゲンタマイシン感受性に関連する閾値は、Ａ）アシネトバクター・バウマニ（Ａｂｉ）、Ｂ）腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏ）、およびＣ）緑膿菌（Ｐａｅ）について示されており、生の蛍光データに適合する曲線の変曲サイクル、絶対蛍光強度（ＡＦＩ）の変化、および適合度に基づく。 Ａ）Ａ．バウマニ（Ａｂｉ）、Ｅ．クロアカ（Ｅｃｌ）、大腸菌（Ｅｃｏ）、Ｋ．アエロゲネス（Ｋａｅ）、Ｋ．ニューモニエ（Ｋｐｎ）、および緑膿菌（Ｐａｅ）について、耐性分離株および感受性分離株の分布が示されている。Ｂ）感受性および特異性が実施例２１で定義されているとおりである図４４の閾値を使用した、種間にわたるゲンタマイシンの感受性、特異性およびカテゴリー一致。 感受性と耐性とを区別するための閾値は、各プライマー／プローブセットに固有であり得、図４に概説されるように集団の統計的分離を使用して決定される。メロペネム感受性に関連する閾値は、Ａ）アシネトバクター・バウマニ（Ａｂｉ）、Ｂ）腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏ）、およびＣ）緑膿菌（Ｐａｅ）について示されており、抗生物質なしおよび最低抗生物質濃度に対するＣｔ値の変化、絶対Ｃｔ値、および絶対蛍光強度（ＡＦＩ）に基づく。 Ａ）Ａ．バウマニ（Ａｂｉ）、Ｅ．クロアカ（Ｅｃｌ）、大腸菌（Ｅｃｏ）、Ｋ．アエロゲネス（Ｋａｅ）、Ｋ．ニューモニエ（Ｋｐｎ）、および緑膿菌（Ｐａｅ）について、耐性分離株および感受性分離株の分布が示されている。Ｂ）感受性および特異性が実施例２１で定義されたとおりである、図４６の閾値を使用した、種間にわたるメロペネムの感受性、特異性、およびカテゴリー一致。 Ａ）細菌を全血に添加し、赤血球を分離し、細菌を含む血漿を市販の血液培養ボトルに接種し、一晩インキュベートし、次いで標準的なアッセイワークフローに従って作製した陽性血液培養サンプルから直接分離株を試験するためのワークフロー。Ｂ）様々な耐性分離株および感受性分離株に対する抗生物質（ゲンタマイシン）の関数としてのＣｔ値の変化は、表現型の結果が陽性血液培養から直接細菌で得られ得ることを示している。 種々の感受性の組み合わせを有する２つのグラム陰性菌（ＫｐｎおよびＡｂｉ）の１：１の比を有する複数菌ＡＳＴを、種々の濃度の３つの種々の抗生物質の非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした。それぞれの種は、感受性および耐性分離株を分離するデルタＣＴ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。 種々の感受性の組み合わせを有する２つのグラム陰性菌（ＫｐｎおよびＡｂｉ）の１：１の比を有する複数菌ＡＳＴを、種々の濃度の３つの種々の抗生物質の非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした。それぞれの種は、感受性および耐性分離株を分離するデルタＣＴ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。 １つのグラム陰性生物（Ｋｐｎ）と、感受性の組み合わせが異なる１つのグラム陽性生物（Ｓａｒ）との１：１の比の複数菌ＡＳＴを、種々の濃度の３つの種々の抗生物質の非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした。それぞれの種は、感受性および耐性分離株を分離するデルタＣＴ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。Ｎ／Ａは、対応する細菌－薬物の組み合わせについて臨床的に関連する解釈がないことを示す。 １つのグラム陰性生物（Ｋｐｎ）と、感受性の組み合わせが異なる１つのグラム陽性生物（Ｓａｒ）との１：１の比の複数菌ＡＳＴを、種々の濃度の３つの種々の抗生物質の非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした。それぞれの種は、感受性および耐性分離株を分離するデルタＣＴ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。Ｎ／Ａは、対応する細菌－薬物の組み合わせについて臨床的に関連する解釈がないことを示す。 １つのグラム陰性生物（Ｋｐｎ）と、感受性の組み合わせが異なる１つの真菌生物（Ｃａｌ）との１：１の比の複数菌ＡＳＴを、種々の濃度の３つの種々の抗生物質の非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした。グラム陰性種は、感受性および耐性分離株を分離するデルタＣＴ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。Ｎ／Ａは、対応する生物－薬物の組み合わせについて臨床的に関連する解釈がないことを示す。フルコナゾールのＣａｌ感受性を示す。 １つのグラム陰性生物（Ｋｐｎ）と、感受性の組み合わせが異なる１つの真菌生物（Ｃａｌ）との１：１の比の複数菌ＡＳＴを、種々の濃度の３つの種々の抗生物質の非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした。グラム陰性種は、感受性および耐性分離株を分離するデルタＣＴ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。Ｎ／Ａは、対応する生物－薬物の組み合わせについて臨床的に関連する解釈がないことを示す。フルコナゾールのＣａｌ感受性を示す。 種々の感受性の組み合わせを有する２つのグラム陽性生物（ＥｆｓおよびＳａｒ）の１：１の比の複数菌ＡＳＴを、種々の濃度の１つの抗生物質の非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした。２つの種はいずれも、感受性および耐性分離株を分離するデルタＣＴ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。 種々の感受性の組み合わせを有する２つのグラム陽性生物（ＥｆｓおよびＳａｒ）の１：１の比の複数菌ＡＳＴを、種々の濃度の１つの抗生物質の非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした。２つの種はいずれも、感受性および耐性分離株を分離するデルタＣＴ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。 １つのグラム陽性生物（Ｓａｒ）と、感受性の組み合わせが異なる１つの真菌生物（Ｃａｌ）との１：１の比の複数菌ＡＳＴを、種々の濃度の１つの抗生物質の非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした。グラム陽性種は、感受性および耐性分離株を分離するデルタＣＴ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。Ｎ／Ａは、対応する生物－薬物の組み合わせについて臨床的に関連する解釈がないことを示す。フルコナゾールのＣａｌ感受性を示す。 １つのグラム陽性生物（Ｓａｒ）と、感受性の組み合わせが異なる１つの真菌生物（Ｃａｌ）との１：１の比の複数菌ＡＳＴを、種々の濃度の１つの抗生物質の非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした。グラム陽性種は、感受性および耐性分離株を分離するデルタＣＴ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。Ｎ／Ａは、対応する生物－薬物の組み合わせについて臨床的に関連する解釈がないことを示す。フルコナゾールのＣａｌ感受性を示す。 ｂｌａＫＰＣ、ｂｌａＶＩＭ、ｂｌａＮＤＭ、およびｂｌａＯＸＡ－４８遺伝子を標的とする、表ＸＸＸＩＸに示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、カルバペネム耐性の既知の機構を有するグラム陰性病原体に対して試験した。陽性（Ｐｏｓ）シグナルは、標的となる抵抗機構についてのみ観察された。 Ｐ．スチュアルティのｃｉｔＣ遺伝子およびサルモネラのｉｎｖＡ遺伝子を標的とする、表ＸＬに開示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｃ．フロインデイ、Ｐ．スチュアルティ、Ｐ．レットゲリ、Ｓ．エンテリカ、Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティーに対して試験した。種特異的増殖曲線のみが観察された。これらの結果は、エンテロバクター目内のいくつかの特定の種に対するブレイクポイントに基づくＡＳＴ呼び出しの改善を可能にする種特異的検出セットの非限定的な例を表す。 Ｓ．アガラクチアのｇｙｒＢ遺伝子、Ｓ．アガラクチアのｄｄｌＡ遺伝子、肺炎球菌のｔｕｆ遺伝子、およびＳ．ピオゲネスのｓｐｅＢ遺伝子を標的とする、表ＸＬＩに開示されるプライマーおよびプローブを使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体：Ｓ．アガラクチア、肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、Ｅ．フェシウム、Ｅ．フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびＳ．エピデルミディスに対して試験した。種特異的増殖曲線のみが観察された。これらの結果は、スタフィロコッカス属およびストレプトコッカス属内のいくつかの特定の種に対する改善されたブレイクポイントに基づくＡＳＴ呼び出しを可能にする種特異的検出セットの非限定的な例を表す。 左側のパネルは、非種特異的プライマー／プローブセット（例えば、腸内細菌目の標的遺伝子にハイブリダイズするセット）を利用したＩＤ－ＡＳＴ ＰＣＲアッセイにおいて感受性株と耐性株を区別するための閾値が、表現型発現における種特異的差異によって交絡され得ることを示す。右側のパネルは、種同定を提供する種特異的プライマー／プローブセットの使用が個々の種ごとに別々の解釈を可能にし、ＣＬＳＩ基準に対する改善されたカテゴリーの合意をもたらすことを示す。 シグモイド関数を生のＰＣＲ曲線データに適合させた後、曲線のパラメータと特徴を計算するデータ解釈戦略。次いで、種々の抗生物質濃度の存在と非抗生物質基準との間で特徴を比較して、相対的な特徴変化を導出する。次いで、予測モデルを訓練するために、グランドトゥルースＭＩＣと共に相対変化特徴を別々の機械学習アルゴリズムに入力する。次いで、訓練されたモデルが、最終的な予測ＭＩＣを返すための投票アンサンブルとして参加する。 どのようにして種ＩＤ、抗菌剤感受性試験、耐性機構検出、およびユニバーサル１６ｓ ｒＲＮＡ表現型情報を組み合わせて結果を返すかを示す図であり、種ＩＤを使用してＭＩＣ予測のための適切なアルゴリズムを選択し、次にそれを規制機関からの適切なブレイクポイントと比較して感受性情報を決定する。

発明の詳細な説明
定義
開示される方法は、１つ以上のプライマー対を使用してサンプルからの核酸分子遺伝子標的の１つ以上の部分を増幅することを含む、少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含み得る。本明細書で使用される「サンプル」または「生物学的サンプル」は、全血、血漿、血清、赤血球画分、唾液、脳脊髄液、精液、便、尿、直腸スワブ、胆汁、リンパ液、痰、洗浄液、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないサンプルを指す。本明細書で使用される「プライマー」は、標的細菌遺伝子に特異的にアニーリングし、それぞれの増幅産物を産生する適切な条件下で標的細菌遺伝子からＤＮＡ合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。検討されるプライマーは各々、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含むように、それぞれの標的核酸分子内またはそれに隣接する標的にアニーリングする。１つ以上の増幅産物は、標的細菌遺伝子核酸の１つ以上がサンプル中に存在し、その結果、標的細菌遺伝子増幅産物の１つ以上の存在がサンプル中のその細菌株の存在を示すことを条件として生成される。増幅産物は、標的細菌遺伝子の１つ以上の検出可能なプローブに相補的な核酸配列を含むべきである。本明細書で使用される「プローブ」は、標的細菌遺伝子をコードする核酸配列に特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドプローブを指す。各サイクリング工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、および検出工程を含み、サンプルは、サンプル中の細菌株の存在または非存在を検出するために１つ以上の検出可能なプローブと接触する。

本明細書で使用される「増幅する」という用語は、鋳型核酸分子の一方または両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、鋳型核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーを鋳型核酸にアニーリングすること、および増幅産物を生成するためにプライマーから酵素的に伸長することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）ならびにポリメラーゼ酵素の最適な活性のための適切な緩衝液および／または補因子（例えば、ＭｇＣｌ_２および／またはＫＣｌ）の存在が必要である。

本明細書で使用される「プライマー」という用語は、当業者に知られており、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドだけでなく、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライミング」することができる修飾オリゴヌクレオチド、すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端が遊離３’－ＯＨ基を提供し、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、それによってピロリン酸が放出される３’～５’ホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによって更に「ヌクレオチド」が結合され得ることを指す。したがって、おそらく意図された機能を除いて、「プライマー」、「オリゴヌクレオチド」、または「プローブ」の間に基本的な違いはない。

「ハイブリダイズする」という用語は、増幅産物への１つ以上のプローブのアニーリングを指す。ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。

「５’－３’のヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。

「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、該酵素は、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に曝された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、鋳型鎖に沿って５’から３’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・ルーバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ、サーマス・サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティスク（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、サーマス・ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびメタノサーマス・ファービダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離されている。それにもかかわらず、酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼをＰＣＲアッセイに使用することもできる。

「その相補体」という用語は、所与の核酸と同じ長さであり、正確に相補的である核酸を指す。

核酸に関して使用される場合の「伸長」または「延長」という用語は、追加のヌクレオチド（または他の類似の分子）が核酸に組み込まれる場合を指す。例えば、核酸は、典型的には核酸の３’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼなどの生体触媒を組み込むヌクレオチドによって必要に応じて伸長される。

２つ以上の核酸配列の状況における「同一」または「パーセント同一性」という用語は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または目視検査によって測定された最大の一致について、比較またはアラインした場合、同一であるか、または同一のヌクレオチド特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。パーセント配列同一性およびパーセント配列類似性を決定するのに適した例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムであり、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）’’Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ’’Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，Ｇｉｓｈら（１９９３）’’Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ’’Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２，Ｍａｄｄｅｎら（１９９６）’’Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ’’Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１，Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）’’Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ’’Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，およびＺｈａｎｇら（１９９７）’’ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ’’Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６に開示されている。

オリゴヌクレオチドの文脈における「改変ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドによって置換される変化を指す。本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて置換され得る例示的な修飾ヌクレオチドとしては、例えば、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類縁体、擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－０－メチルリボーＵ、２’－０－メチルリボーＣ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、Ｎ６－メチル－ｄＡなどが挙げられる。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の改変ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、または当技術分野で知られている。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド置換は、対応する修飾されていないオリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、該オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を修飾する。さらに説明すると、特定の修飾ヌクレオチド置換は、いくつかの実施形態では、非特異的核酸増幅（例えば、プライマーダイマー形成などを最小限に抑える）を減少させ、意図する標的アンプリコンの収率を増加させることなどができる。これらのタイプの核酸修飾の例は、例えば、米国特許第６，００１，６１１号明細書に開示されている。

「ＴＡＧＳ」 または「Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｇｎａｌ」（米国特許出願公開第２０１８／００７３０６４号明細書に開示されている）は、熱サイクル中に種々の温度で蛍光データを収集することによって、各蛍光チャネル内の複数の個々の標的の測定を可能にする多重化技術である。結果的に、２つまたは３つの温度チャネルを用いたＴＡＧＳ多重化は、光チャネルあたりの分解可能なターゲットの数を２倍または３倍にし得る。原則として、この技術は、ＰＣＲサイクルあたり１つを超える蛍光リードを収集し得る任意の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）機器に展開し得る。

「抗菌剤」という用語は、通常は微生物を死滅させることによって、またはその増殖を阻害することによって、微生物感染症を処置するために使用される薬剤または薬物を指す。抗菌剤には、細菌感染症を処置するための抗生物質、真菌感染症を処置するための抗真菌剤、原虫感染症を処置するための抗原虫剤、およびウイルス感染症を処置するための抗ウイルス剤が含まれ得る。抗菌剤は、いくつかの異なる様式で分類され（「抗菌クラス」と呼ばれる）、作用機序による分類（例えば、細胞壁合成の阻害、タンパク質または核酸合成の阻害、細胞膜の破壊）、供給源による分類（例えば、天然源または合成物から）、および化学構造による分類（例えば、β－ラクタム、アミノグリコシド、マクロライド、キノロンなど）が挙げられる。

例として、限定されるものではないが、以下が挙げられる：アリルアミン類、アミジノペニシリン類、アミノシクリトール類、アミノグリコシド類、アンフェニコール類、アンサマイシン類、Ｂ－３－グルカンシンターゼ阻害剤類、カルバペネム類、セファロスポリン類、クリシルサイクリン類、環状ポリペプチド類、グリコペプチド類、イミダゾール類、リンコサミド類、リポペプチド類、マクロライド類およびケトリド類、モノバクタム類、ニトロフラントイン類、ニトロイミダゾール類、オキサゾリジノン類、ペニシリン類、ホスホン酸誘導体類、プルロムチリン類、ポリエン類、ポリミキシン類、シュードモン酸類、キノロン類、リミノフェナジン類、ステロイド抗菌剤類、ストレプトグラミン類、スルホンアミド類、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤類、および組み合わせ、スルホン類、テトラサイクリン類およびトリアゾール類。

抗菌性の薬物または薬剤の例としては、ナフチフィン、メシリナム、スペクチノマイシン、クロラムフェニコール、リファンピシン、カスポファンギン、メロペネム、セフトリアキソン、セフェピム、セフタリン、チゲサイクリン、バシトラシン、バンコマイシン、ミコナゾール、クリンダマイシン、ダプトマイシン、エリスロマイシン、テリスロマイシン、アズトレオナム、ニトロフラントイン、メトロニダゾール、リネゾリド、アンピシリン、ホスホマイシン、レタパムリン、アンホテリシン－Ｂ、コリスチン、ムピロシン、シプロフロキサシン、クロファジミン、フシジン酸、キヌプリスチン／ダルホプチン、スルファメトキサゾール、トリメトプリム、ダプゾン、クロルテトラサイクリン、およびフルコナゾールが挙げられるが、これらに限定されない。

「最小阻害濃度」または「ＭＩＣ」という用語は、生物の成長を阻害するために必要な抗菌剤の最低濃度を指す。古典的な培養に基づく試験では、ＭＩＣは、増殖培地および種々の濃度の抗菌剤を含むウェルに細菌を添加した場合に決定される。抗菌剤の濃度を各連続ウェルで２倍にし、ＭＩＣを、インキュベーション期間後に目に見える増殖がない最も低い抗菌剤濃度を有するウェルを同定することによって見出す。「ブレイクポイント」という用語は、ある種の細菌が抗菌剤に対して感受性であるか耐性であるかを定義する、選択された抗菌剤の濃度を指す。ＭＩＣが感受性ブレイクポイント以下である場合、細菌は抗菌剤に感受性であると考えられる。ＭＩＣがこの値より大きい場合、細菌は、抗菌剤に対して中間または耐性であると考えられる。

ブレイクポイントは、現代の微生物学実験室の実践の不可欠な部分であり、抗菌剤に対する感受性および耐性を定義するために使用される。試験方法に応じて、濃度（ｍｇ／リットルまたはμｇ／ｍｌ）またはゾーン直径（ｍｍ）のいずれかとして表される。一般に、全ての感受性試験方法は、解釈基準としても知られているブレイクポイントを必要とするので、試験の結果は、感受性、中間または耐性として解釈され、そのように広範囲の臨床医に報告され得る。「臨床的ブレイクポイント」は、処置が成功する可能性が高い株を、処置が失敗する可能性がより高い細菌から分離する濃度（ＭＩＣ）を指す。それらの最も単純な形態では、これらのブレイクポイントは、感染病原体のＭＩＣを転帰と比較する前向きヒト臨床研究から得られる。

感染性病原体の検出および同定
本開示は、感染性病原体、例えば血流感染の原因となる細菌株を検出する方法を提供する。本方法は、株特異的、種特異的、属特異的、科特異的または目特異的プライマー配列を使用してＰＣＲによって標的遺伝子の一部を増幅する工程、および株特異的、種特異的、属特異的、科特異的または目特異的プローブ核酸配列を使用して増幅産物を検出する工程を含む。標的遺伝子の選択は、公開配列データベースのインシリコ検索、ならびに種（例えば、大腸菌）または目（例えばエンテロバクター目）に特異的であり、他の株およびファミリーを区別する核酸配列の文献検索の結果であった。探索の結果、以下の標的遺伝子が同定された。

エンテロバクター目：ｒｐｌＰ、ｏｍｐＡ、ｔｕｆ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ
腸内細菌科：ｒｐｌＰ、ｏｍｐＡ、ｔｕｆ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ
エンテロコッカス属：ｔｕｆ、ｒｐｏＢ、ｓｏｄＡ、ｄｄｌ、ｇｙｒＢ
シュードモナス属：ｇｙｒＢ、Ｏ－抗原アセチラーゼ、ｒｐｏＢ、ｅｃｆＸ、ｔｕｆ
アシネトバクター属：ｏｍｐＡ、ｔｕｓＡ、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＢ
ステノトロホモナス・マルトフィリア：ｆｄｎＧ、ｇｙｒＢ、ｔｕｆ
黄色ブドウ球菌：ＣＰＥ、ｇｙｒＢ、ｎｕｃ、ｒｐｏＢ、ｔｕｆ、ｄｄｌＡ
スタフィロコッカス・エピデルミディス：ａｌｔＥ、ｆｅｍＡ
コアグラーゼ－陰性ブドウ球菌：ｒｐｏＢ、ｔｕｆ、ｓｏｄＡ
ストレプトコッカス属：ｔｕｆ、ｇｙｒＢ、ｓｉｐ、ｄｄｌＡ
肺炎球菌：ｌｙｔＡ、ＳＰ２０２０、ｐｉａＢ
プロテウス・ミラビリス：ＵｒｅＲ、ＵｒｅＣ
カンジダ・アルビカンス：ＡＣＴ、ＲＰＢ－１、５．８ｓ リボソームＲＮＡ、１８ｓ リボシームＲＮＡ

エンテロバクター目または腸内細菌科に属する細菌の検出のために、リボソームＬ１６タンパク質をコードするｒｐｌＰ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブが提供される（配列番号１～３、表Ｉ）。第２のプローブ（配列番号４、表Ｉ）の追加により、セラチア・マルセッセンス株およびプロテウス・ミラビリス株などのエンテロバクター目の他の一般的な病原体を含むように包括性が更に拡張される。本明細書に例示された以外の核酸を使用しても、サンプル中の高度に特異的な病原体グループ化標的遺伝子を検出し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および／または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける１つ以上の欠失、挿入および／または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号１～４から選択される配列を有する核酸、配列番号１～４の１つと少なくとも、例えば８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、もしくは配列番号１～４の相補体およびバリアントを含む。

エンテロバクター目に属する細菌の検出はまた、ｒｐｌＰ遺伝子を増幅するための他のプライマーおよびプローブ（配列番号５～７、表ＩＩ）、ならびにＤＮＡジャイラーゼサブユニットＢタンパク質をコードするｇｙｒＢ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号８～１０、表ＩＩＩ）、ならびにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするｒｐｏＢ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号１１～１６、表ＩＶ）を含み得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける１つ以上の欠失、挿入および／または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号５～７、８～１０、１１～１６から選択される配列を有する核酸、配列番号５～７、８～１０、１１～１６の１つと少なくとも、例えば８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号５～７、８～１０、１１～１６の相補体およびバリアントを含む。

アシネトバクター・バウマニ（Ａｂｉ）種に属する細菌の検出のために、外膜タンパク質ＡをコードするｏｍｐＡ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブが提供される（表Ｖ参照）。本明細書に例示される核酸以外の核酸も、サンプル中のアシネトバクター属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出するために使用し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および／または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける１つ以上の欠失、挿入および／または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号１７～１９、２０～２２、２９～３１から選択される配列を有する核酸、配列番号１７～１９、２０～２２、２９～３１の１つと、少なくとも例えば８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号１７～１９、２０～２２、２９～３１の相補体およびバリアントを含む。

アシネトバクター・バウマニの検出はまた、ｒｐｏＢ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号２３～２５、表ＶＩ）、ならびにｇｙｒＢ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号２６～２８、表ＶＩＩ）を含み得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける１つ以上の欠失、挿入および／または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号２３～２５、２６～２８から選択される配列を有する核酸、配列番号２３～２５、２６～２８の１つと、少なくとも例えば８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号２３～２５、２６～２８の相補体およびバリアントを含む。

緑膿菌種（Ｐａｅ）に属する細菌の検出のために、伸長因子（配列番号３２～３４、表ＶＩＩＩ）をコードするｔｕｆ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号３２～３４、表ＶＩＩＩ）、ｇｙｒＢ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号３５～３７、表ＩＸ）、ならびにｒｐｏＢ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号３８～４０、表Ｘ）が提供される。本明細書に例示される核酸以外の核酸も、サンプル中のシュードモナス属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出するために使用し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および／または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける１つ以上の欠失、挿入および／または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号３２～３４、３５～３７、３８～４０から選択される配列を有する核酸、配列番号３２～３４、３５～３７、３８～４０の１つと、少なくとも例えば８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号３２～３４、３５～３７、３８～４０の相補体およびバリアントを含む。

ステノトロホモナス・マルトフィリア種に属する細菌（Ｓ．マルトフィリア）の検出のために、ｆｄｎＧ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号４１～４３、表ＸＩ）、ｇｙｒＢ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号４４～４６、表ＸＩＩ）、ならびにｔｕｆ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号４７～４９、表ＸＩＩＩ）が提供される。本明細書に例示される核酸以外の核酸を使用して、サンプル中のステノトロホモナス属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および／または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける１つ以上の欠失、挿入および／または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号４１～４３、４４～４６、４７～４９から選択される配列を有する核酸、配列番号４１～４３、４４～４６、４７～４９の１つと、少なくとも例えば８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号４１～４３、４４～４６、４７～４９の相補体およびバリアントを含む。

エンテロコッカス属に属する細菌の検出のために、ｔｕｆ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号５０～５２、表ＸＩＶ）、ｒｐｏＢ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号５３～５５、表ＸＶ）、ｘｘｘｘをコードするｄｄｌ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号５６～６１、表ＸＶＩ）、ならびにｇｙｒＢ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号６２～６６、表ＸＶＩＩ）が提供される。本明細書に例示される核酸以外の核酸も、サンプル中のエンテロコッカス属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出するために使用し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および／または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける１つ以上の欠失、挿入および／または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号５０～５２、５３～５５、５６～６１、６２～６６から選択される配列を有する核酸、配列番号５０～５２、５３～５５、５６～６１、６２～６６の１つと、少なくとも例えば８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号５０～５２、５３～５５、５６～６１、６２～６６の相補体およびバリアントを含む。

黄色ブドウ球菌（Ｓ．アウレウス）種に属する細菌の検出のための、莢膜形成に関与するタンパク質をコードするＣＰＥ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号６７～６９、７２、表ＸＶＩＩＩ）、ｇｙｒＢ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号７３～７５、表ＸＩＸ）、ｄｄｌＡ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号７６～７８、表ＸＸ）。スタフィロコッカス属に属する細菌を検出するために、ｔｕｆ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号７９～８１、表ＸＸＩＩ）が提供される。本明細書に例示される核酸以外の核酸も、サンプル中のスタフィロコッカス属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出するために使用し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および／または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける１つ以上の欠失、挿入および／または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号６７～６９、７２、７３～７５、７６～７８、７９～８１から選択される配列を有する核酸、配列番号６７～６９、７２、７３～７５、７６～７８、７９～８１の１つと、少なくとも例えば８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号６７～６９、７２、７３～７５、７６～７８、７９～８１の相補体およびバリアントを含む。

ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓ．アガラクチア）の種に属する細菌の検出のために、ｇｙｒＢ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号１２１～１２３、表ＸＸＩＩ）、表面免疫原性タンパク質をコードするｓｉｐ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号８２～８４、表ＸＸＩＩＩ）、ならびにｄｄｌＡ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号８５～８７、表ＸＸＩＶ）が提供される。ストレプトコッカス属に属する細菌の検出のために、ｔｕｆ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号１００～１０２、表ＸＸＶ）が提供される。本明細書に例示される核酸以外の核酸も、サンプル中のストレプトコッカス属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出するために使用し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および／または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける１つ以上の欠失、挿入および／または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号１２１～１２３、８２～８４、８５～８７、１００～１０２から選択される配列を有する核酸、配列番号１２１～１２３、８２～８４、８５～８７、１００～１０２の１つと、少なくとも例えば８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号１２１～１２３、８２～８４、８５～８７、１００～１０２の相補体およびバリアントを含む。

一般的な真菌病原体：カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・アウリスの検出のために、１８ｓリボソームＲＮＡ（１８ｓｒＲＮＡ）遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号８８～９０、表ＸＸＶＩ）、ならびに５．８ｓリボソームＲＮＡ（５．８ｓｒＲＮＡ）遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブ（配列番号９１～９３、表ＸＸＶＩＩ）が提供される。本明細書に例示される核酸以外の核酸を使用して、サンプル中のカンジダ属特異的病原体グループ化標的遺伝子を検出し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および／または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示される標的遺伝子プライマーおよびプローブにおける１つ以上の欠失、挿入および／または置換を含み得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号８８～９０、９１～９３から選択される配列を有する核酸、配列番号８８～９０、９１～９３の１つと、少なくとも例えば８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号８８～９０、９１～９３の相補体およびバリアントを含む。

全てのタイプの細菌の検出のために、１６ｓリボソームＲＮＡ（１６ｓ ｒＲＮＡ）遺伝子中の保存領域を増幅するためのプライマーとプローブの組み合わせ（配列番号９４～９６、表ＸＸＶＩＩＩ）が提供される。

一実施形態では、上述のプライマーおよびプローブのセットは、感染性細菌株の検出および同定のためだけでなく、抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）アッセイの実行にも使用される。したがって、本発明は、細菌の同定（ＩＤ）およびその抗菌剤感受性（ＡＳＴ）の試験が単一のアッセイ設定で同時に決定される定量的リアルタイムＰＣＲ反応を実施するための方法および組成物を開示する。

本明細書に開示されるプライマーおよび／またはプローブのいずれかの機能的に活性なバリアントは、開示される方法においてプライマーおよび／またはプローブを使用することによって同定され得る。本明細書に開示されるプライマーおよび／またはプローブの機能的に活性なバリアントは、開示されるプライマーおよび／またはプローブのそれぞれの配列と比較して、開示の方法またはキットにおいて類似またはより高い特異性および感度を提供するプライマーおよび／またはプローブに関する。

バリアントは、例えば、本明細書に開示されるプライマーおよび／またはプローブのそれぞれの配列の５’末端および／または３’末端における１つ以上のヌクレオチド付加、欠失または置換などの１つ以上のヌクレオチド付加、欠失または置換によって、本明細書に開示されるプライマーおよびプローブの配列から変化し得る。上に詳述したように、プライマー（および／またはプローブ）は化学的に修飾されていてもよく、すなわち、プライマーおよび／またはプローブは修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含んでいてもよい。したがって、プローブ（またはプライマー）は修飾オリゴヌクレオチドである。「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチド類縁体」）は、いくつかの修飾によって天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、依然として、塩基もしくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖もしくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分もしくはリン酸様部分、またはそれらの組み合わせからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分に「標識」を結合させて、「修飾ヌクレオチド」を得ることができる。「ヌクレオチド」中の天然塩基は、例えば７－デアザプリンで置き換えられてもよく、そのようにしても「修飾ヌクレオチド」が得られる。用語「改変ヌクレオチド」または「ヌクレオチド類似体」は、本出願において互換的に使用される。「修飾ヌクレオシド」（または「ヌクレオシド類縁体」）は、「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチド類縁体」）について上に概説したように、何らかの修飾によって天然のヌクレオシドとは異なる。

標的遺伝子のいずれかをコードする核酸分子を増幅する修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドは、例えば、ＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．Ｃａｓｃａｄｅ、コロラド州）のようなコンピュータプログラムを使用して設計され得る。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴としては、検出（例えば、電気泳動によって）を容易にするための適切なサイズの増幅産物、一対のプライマーのメンバーに対する同様の融解温度、および各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性でアニーリングし、合成を開始するのに十分な長さである必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に忠実度が低下するほど長くはない）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは８～５０ヌクレオチド長（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０ヌクレオチド長）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、４０ヌクレオチド長以下である。

プライマーのセットに加えて、本方法は、標的遺伝子の存在または非存在を検出するために１つ以上のプローブを使用し得る。「プローブ」 という用語は、合成的または生物学的に産生された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指し、これは、設計または選択により、定義された所定のストリンジェンシーの下で特異的に（すなわち、優先的に）、この場合は標的遺伝子核酸にハイブリダイズすることを可能にする特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と称され得る。

いくつかの実施形態では、開示される標的遺伝子プローブは、少なくとも１つの蛍光標識で標識され得る。一実施形態では、標的遺伝子プローブは、ドナー蛍光部分、例えば蛍光色素、および対応するアクセプター部分、例えばクエンチャーで標識し得る。一実施形態では、プローブは蛍光部分を含むかまたはそれからなり、核酸配列は本明細書に開示されるプローブ配列を含むかまたはそれからなる。

プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の方法で行うことができる。実施形態は、増幅産物の検出のために単一のプローブまたは一対のプローブを使用することができる。実施形態に応じて、使用するプローブ（単数または複数）は、少なくとも１種の標識および／または少なくとも１種のクエンチャー部分を含み得る。プライマーと同様に、プローブは通常同様の融解温度を有し、各プローブの長さは配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分でなければならないが、合成中に忠実度が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に１５～４０（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチド長である。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号および同第４，９６５，１８８号には、従来のＰＣＲ技術が開示されている。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態において有用なプライマーは、開示される標的遺伝子核酸配列内の核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、または合成的に産生することができる。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性される、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。

鋳型核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲで鋳型として使用することができるようにする前に、二本鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、または酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する１つの方法は、核酸が優位に変性する（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を超える変性）まで加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩濃度、ならびに変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度および核酸長などの反応の特徴に応じて、約９０℃～約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には、約３０秒間～４分間（例えば、１分～２分３０秒、または１．５分）行われる。

二本鎖鋳型核酸が熱によって変性される場合、反応混合物を、開示される標的遺伝子核酸分子上のその標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却する。アニーリングの温度は、通常、約３５℃～約６５℃、（例えば、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒～約１分（例えば、約２０秒～約５０秒、約３０秒～約４０秒）であり得る。次いで、ポリメラーゼの活性が促進または最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こって、鋳型核酸に相補的な生成物を生成するのに充分な温度に、反応混合物を調節する。温度は、核酸鋳型にアニーリングされた各プライマーから伸長生成物を合成するのに充分でなくてはならないが、その相補的な鋳型から伸長生成物を変性させるほど高くすべきではない（例えば、伸長のための温度は、概して、約４０℃～約８０℃（例えば、約５０℃～約７０℃、約６０℃）の範囲である）。伸長時間は、約１０秒～約５分（例えば、約３０秒～約４分、約１分～約３分、約１分３０秒～約２分）であり得る。

ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などの核酸を用いることができる。鋳型核酸は精製される必要はなく、ヒト細胞に含まれる核酸などの複合混合物の微量画分であり得る。核酸分子は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇら、（編集），１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）に記載されているような通常の技術によって生物学的サンプルから抽出され得る。核酸は、プラスミドなどの任意の数の供給源、または細菌、酵母、原虫ウイルス、細胞小器官、または植物もしくは動物などの高等生物を含む天然供給源から得ることができる。

オリゴヌクレオチドプライマーを、プライマー伸長を誘導する反応条件下でＰＣＲ試薬と組み合わせる。例えば、鎖伸長反応には、一般に、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５～１．０μｇのプロトタイピングされた鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼおよび１０％ＤＭＳＯ）が含まれる。反応物は、通常、それぞれ１５０～３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、またはそれらの１つまたは複数の類似体を含有する。

新規に合成された鎖は、反応の後続工程で使用できる二本鎖分子を形成する。標的核酸分子に対応する所望の量の増幅産物を生成するために、鎖分離、アニーリング、および伸長の工程を必要に応じて何度でも繰り返すことができる。反応の制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、およびヌクレオシド三リン酸の量である。サイクリング工程（すなわち、変性、アニーリング、および伸長）は、好ましくは少なくとも１回繰り返される。検出での使用では、サイクリング工程の数は、例えば、サンプルの性質に応じる。サンプルが核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクリング工程が必要となる。一般的に、サイクリング工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０、または１００回繰り返してもよい。

蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同大５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号）は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、可視化できるかまたは他の方法で検出および／または定量することができる、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が起こるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。

一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分と、蛍光性であってもなくてもよく、光以外の形態で移動されたエネルギーを散逸させる対応するクエンチャーとを含有することができる。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光がアクセプター部分によってクエンチされるように、ドナー部分とアクセプター部分との間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光がもはやクエンチされないように、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，９９４，０５６号、および同第６，１７１，７８５号に記載されている。一般的に使用されるドナー－アクセプター対は、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡ対を包含する。一般的に使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬおよびＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーククエンチャーは、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ノヴァト）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビル）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０（ＢＢＱ－６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ、ミシガン州デクスタ）を包含する。

別の例では、それぞれが蛍光部分を含有する２つのオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプローブが適切な位置で増幅産物核酸にハイブリダイゼーションすると、ＦＲＥＴシグナルが生成される。ハイブリダイゼーション温度は、約１０秒間～約１分間、約３５℃～約６５℃の範囲であり得る。

蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（適切なダイクロイックミラーおよび特定の範囲の蛍光発光を監視するためのフィルタを備える）、光子計数光電子増倍管システム、または蛍光光度計を使用して行い得る。エネルギー移動を開始するため、または蛍光体の直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、光ファイバー光源、または所望の範囲の励起のために適切にフィルタリングされた他の高強度光源を用いて行うことができる。

ドナー部分および対応するアクセプター部分「対応する」に関して本明細書で使用される場合、ドナー蛍光部分の発光スペクトルと重複する吸光度スペクトルを有するアクセプター蛍光部分またはダーククエンチャーを指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値よりも少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。したがって、それらの間で効率的な非照射エネルギー移動を行い得る。

蛍光ドナー部分および対応するアクセプター部分は、一般に、（ａ）高効率Ｆｏｒｓｔｅｒエネルギー移動、（ｂ）大きな最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）、（ｃ）可能な限り可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）への発光のシフト；および（ｄ）ドナー励起波長での励起によって生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトのために選択される。例えば、レーザー線付近のその最大励起波長（例えば、ヘリウム－カドミウム４４２ｎｍまたはアルゴン４８８ｎｍ）、高い吸光係数、高い量子収率、およびその蛍光発光に対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重複を有するドナー蛍光部分を選択することができる。対応するアクセプター蛍光部分は、高い吸光係数、高い量子収率、ドナー蛍光部分の発光とのその励起の良好な重複、および可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）の発光を有するものを選択することができる。

ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ－フィコエリトリン、９－アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４－アセトアミド－４’－イソチオ－シアナトスチルベン－２、２’－ジスルホン酸、７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン、スクシンミル１－ピレンブチレート、および４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、またはランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユウロピウム、またはテルビウム）が挙げられる。ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ジャンクションシティ）またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得ることができる。

ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分を、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合することができる。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の距離に影響を及ぼすため、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）の距離であり得る。一般的に、リンカーアームは約１０Å～約２５Åである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号に記載されている種類のものであってもよい。国際公開第８４／０３２８５号はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法、および蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法も開示している。

ＬＣ Ｒｅｄ ６４０などのアクセプター蛍光部分を、アミノリンカー（例えば、ＡＢＩ（カリフォルニア州フォスターシティ）またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から入手可能なＣ６－アミノホスホラミダイト）を含有するオリゴヌクレオチドと組み合わせて、例えば、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０標識オリゴヌクレオチドを生成することができる。フルオレセインなどのドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドに結合させるためによく使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えばＧｌｅｎ ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＣｈｅｍＧｅｎｅ（マサチューセッツ州アッシュランド）製のフルオレセイン－ＣＰＧ）、アミド－リンカー（ＢｉｏＧｅｎｅｘ（カリフォルニア州サンラモン）製のＣＸ－フルオレセイン－ＣＰＧなどの、フルオレセイン－ＮＨＳ－エステル由来）、またはオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン－ＮＨＳ－エステルの結合を必要とする３’－アミノ－ＣＰＧが挙げられる。

本明細書に記載されるように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を利用する標識ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出し得る。１つのＦＲＥＴフォーマットは、増幅産物の有無、したがって標的遺伝子の有無を検出するためにＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、例えば、１種の蛍光色素および１種のクエンチャーで標識された１種の１本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用し、これは蛍光性であってもよく、蛍光性でなくてもよい。第１の蛍光部分が適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーは、ＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分またはダーククエンチャーに移動する。第２の蛍光部分は、一般的には、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリングステップ中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階中に、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分とクエンチャー部分とが、互いに空間的に分離した状態となる。結果として、クエンチャーの不在下において第１の蛍光部分を励起すると、第１の蛍光部分からの蛍光発光を検出し得る。例として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、サンプル中の標的遺伝子の存在または非存在を検出するための本明細書に開示の方法を実施するのに適している。

ＦＲＥＴと組み合わせた分子ビーコンを使用して、リアルタイムＰＣＲ法を使用して増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第１の蛍光部分および第２の蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部分は一般的にはクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造形成を可能にする配列（例えば、ヘアピン）を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内で二次構造が形成された結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部分が空間的に近接する。標的核酸（すなわち、増幅産物）へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、蛍光部分が互いに分離され、それにより、適切な波長の光による励起後、第１の蛍光部分の発光を検出することができる。

ＦＲＥＴ技術の別の共通形式は、２つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは、異なる蛍光部分で標識することができ、一般的に、標的ＤＮＡ分子（例えば、増幅産物）内で互いに近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光源によって４７０ｎｍで励起される。ＦＲＥＴの間、フルオレセインは、そのエネルギーをアクセプター蛍光部分、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ６４０（ＬＣ Ｒｅｄ６４０）またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ７０５（ＬＣ Ｒｅｄ７０５）に伝達する。次いで、アクセプター蛍光部分は、より長い波長の光を放出し、これはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光学検出システムによって検出される。効率的なＦＲＥＴは、蛍光部分が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重なっている場合にのみ起こり得る。放出されたシグナルの強度は、元の標的ＤＮＡ分子の数（例えば、標的株／ファミリーゲノムの数）と相関させ得る。標的核酸の増幅が起こり、増幅産物が産生される場合、ハイブリダイズする工程は、プローブ対のメンバー間のＦＲＥＴに基づく検出可能なシグナルをもたらす。

一般に、ＦＲＥＴの存在はサンプル中に標的遺伝子が存在することを示し、ＦＲＥＴの非存在はサンプル中に標的遺伝子が存在しないことを示す。しかしながら、不十分な検体収集、輸送遅延、不適切な輸送条件、または特定の収集スワブ（アルギン酸カルシウムまたはアルミニウムシャフト）の使用はいずれも、試験結果の成功および／または精度に影響を及ぼし得る条件である。本明細書に開示される方法を使用して、例えば４５サイクル工程以内にＦＲＥＴが検出されると、目的の標的株／科が存在することを示す。

本方法の実施に使用することができる代表的な生物学的サンプルとしては、限定されないが、呼吸器検体、糞便検体、血液検体、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚および軟部組織感染が挙げられる。生物学的サンプルの収集および保存方法は、当技術分野の当業者に知られている。生物学的サンプルを処理して（例えば、当技術分野で公知の核酸抽出方法および／またはキットによって）標的遺伝子核酸を放出させ得、または一部の場合には、生物学的サンプルをＰＣＲ反応成分および適切なオリゴヌクレオチドと直接接触させ得る。

融解曲線分析は、サイクルプロファイルに含め得る追加の工程である。融解曲線分析は、ＤＮＡ二本鎖の半分が一本鎖に分離した温度として定義される融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる特徴的な温度でＤＮＡが融解するという事実に基づいている。ＤＮＡの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、ＧおよびＣヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子は、ＡおよびＴヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子よりも高いＴｍを有する。シグナルが失われる温度を検出することにより、プローブの融解温度を決定し得る。同様に、シグナルが発生する温度を検出することにより、プローブのアニール温度を決定し得る。増幅産物からのプローブの融解温度により、サンプル中の目的の標的株／科の存在または非存在を確認し得る。

各サーモサイクラーランの間に、対照サンプルも同様にサイクルし得る。陽性対照サンプルは、例えば、対照プライマーおよび対照プローブを使用して、（記載された標的遺伝子の増幅産物以外の）標的核酸対照鋳型を増幅し得る。陽性対照サンプルはまた、例えば標的核酸分子を含むプラスミドコンストラクトを増幅し得る。そのようなプラスミド対照は、意図された標的の検出に使用されるのと同じプライマーおよびプローブを使用して、内部で（例えば、サンプル内で）または患者のサンプルと並んで実行される別々のサンプルで増幅し得る。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーションおよび／またはＦＲＥＴ反応の成功または失敗の指標である。各サーモサイクラー実行はまた、例えば標的鋳型ＤＮＡを欠く陰性対照を含み得る。陰性対照は汚染を測定し得る。これにより、システムおよび試薬が偽陽性シグナルを生じないことが保証される。したがって、対照反応は、例えば、プライマーが配列特異性によりアニールし、伸長を開始する能力、ならびにプローブが配列特異性によりハイブリダイズし、ＦＲＥＴが発生する能力を容易に決定し得る。

一実施形態では、本方法は、汚染を回避する工程を含む。例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、あるサーモサイクラー運転と次のサーモサイクラー運転との間の汚染を低減または排除するために、米国特許第５，０３５，９９６号、同第５，６８３，８９６号および同第５，９４５，３１３号に記載される。

ＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法を使用して、この方法を実施し得る。一実施形態では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器が使用される。以下の特許出願には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用されるリアルタイムＰＣＲが記載されている。国際公開第９７／４６７０７号、同第９７／４６７１４号、および同第９７／４６７１２号。

ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、ＰＣワークステーションを使用して動作させることができ、Ｗｉｎｄｏｗ ＮＴオペレーティングシステムを利用し得る。サンプルからのシグナルは、機械が光学ユニット上にキャピラリーを順次配置するときに得られる。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示し得る。蛍光取得時間は１０～１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリングステップの後、蛍光対サイクル数の定量的表示を、全てのサンプルについて連続的に更新し得る。生成されたデータは、さらなる分析のために保存し得る。

ＦＲＥＴの代替として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎまたはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））等の二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて、増幅産物を検出し得る。二本鎖核酸との相互作用の際、このような蛍光ＤＮＡ結合色素は、適当な波長の光で励起した後、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素等の二本鎖ＤＮＡ結合色素を用い得る。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。

本開示の実施形態は、１つ以上の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。

表現型抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）のためのリアルタイムＰＣＲ
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲまたはｑＲＴ－ＰＣＲ）は、高い特異性および感度でサンプル中の細菌を同定および定量し得るが、抗菌剤の存在下での細菌の増殖を使用して表現型ベースのＡＳＴを実行する際のその信頼性は、一貫性をもって実証されていない。本発明は、ＰＣＲ増殖曲線から導かれる数学的関係を利用して、試験された細菌株が所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性（ＳＩＲ）であるかどうかの決定を行う。ＰＣＲを使用する表現型ＡＳＴ試験の背後にある原理を図１に示す。抗菌剤が存在しない場合（参照として示される）、細菌はゲノムＤＮＡ複製を進行中である。抗菌剤の存在下では、耐性細菌は参照と同様のゲノムコピー数で複製するが、感受性細菌は複製が阻害され、コピー数はより少なくなる。この増殖の差は、ｑＰＣＲによって決定し得る表現型の読み出しを提供する。

耐性細菌株または感受性細菌株のいずれかを図２に示す種々の濃度の抗菌剤と共に４時間インキュベートする仮説的ｑＰＣＲ実験からの生データ。図２Ａにおいては、生のｑＰＣＲデータは、蛍光（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブからの蛍光）が各ＰＣＲサイクルで測定される増殖曲線として示される。耐性分離株については、増殖曲線は、種々の抗菌剤濃度で４時間のインキュベーションに関係なく同様に観察されるが、感受性分離株では、蛍光強度の用量依存的減少およびシグナルがバックグラウンド（閾値）レベルを交差するのに必要なサイクル数の増加（これは一般にサイクル閾値またはＣｔ値と呼ばれる）が観察される。図２Ｂにおいては、同じｑＰＣＲデータがＣｔ値に基づいて表されており、耐性分離株は抗菌剤濃度の関数としてＣｔ値の変化がほとんどまたは全くないが、感受性分離株はより少数の複製細菌を検出することによってＣｔ値の用量依存的増加を示す。

ｑＰＣＲデータを使用して、図３に示す種々の数学的関係を調べることによって、株が所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性であるかどうかを決定し得る。図３Ａは、生のｑＰＣＲ増幅曲線の挙動を表す「勾配」、「Ｃｔ」、「変曲」、「絶対蛍光強度（ＡＦＩ）」、および「エンドポイント相対強度（ＥＲＩ）」などの数学的関係を表す。図３Ｂに示すように、これらの特徴は、抗菌剤の存在下で得られた数値を抗菌剤の非存在下で得られた数値に関連付けることによって、抗菌剤曝露の関数として更に評価し得る。次いで、ΔＣｔまたはΔＡＦＩなどのこれらの特徴の相対的変化を使用して、所与の薬物に対する株ＭＩＣを決定し得、承認されたブレイクポイントを利用して株耐性および感受性の決定が可能になる。

数学的特徴において計算された差から、図４に示すような単純化された分配モデルを使用して、細菌分離株を耐性または感受性として分類した。分割は、ジニ指数を利用して、どの特徴および閾値が２つのクラスの分散を最大化するかが決定される。オーバーフィッティングを防止するために２つの分割のみが利用され、視覚化を容易にするために２次元のグラフィック表示を可能にする。

以下の実施例、表および図は、主題の理解を助けるために提供されており、その主題の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の思想から逸脱することなく、定められた手順に変更を加えることができると理解される。

実施例１ ＰＣＲの条件
標的遺伝子のリアルタイムＰＣＲ検出は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムプラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、カリフォルニア州プレザントン）を使用して行った。増幅試薬の最終濃度を以下に示す：

以下の表は、ＰＣＲ増幅反応に使用される典型的な熱プロファイルを示す：

Ｐｒｅ－ＰＣＲプログラムは、初期変性およびＲＮＡ鋳型の逆転写のための５５°Ｃ、６０°Ｃおよび６５°Ｃでのインキュベーションを含んでいた。３種の温度でのインキュベーションは、より低い温度ではわずかにミスマッチした標的配列（生物の遺伝的変異体など）も転写されるが、より高い温度ではＲＮＡ二次構造の形成が抑制され、したがってより効率的な転写をもたらすという有利な効果を併せ持つ。ＰＣＲサイクリングを２つの測定に分け、いずれの測定も１段階の設定を適用する（アニーリングと伸長を組み合わせる）。５５℃での最初の５サイクルは、わずかにミスマッチした標的配列を予備増幅することによって包括性の増加を可能にするが、第２の測定の４５サイクルは、５８℃のアニーリング／伸長温度を使用することによって特異性を高める。

実施例２ エンテロバクター目を検出するためのプライマー／プローブを使用するＰＣＲ
実施例１に記載されるＰＣＲ条件を使用して、フォワードプライマーＲＭ＿ＥＮＴＦ（配列番号１）、リバースプライマーＲＭ＿ＥＮＴＲＰ（配列番号２）、ならびにｒｐｌＰ遺伝子を標的とする遺伝子を標的とする２つのプローブ、ＲＭ＿ＥＴＰ０２（配列番号３）およびＲＭ＿ＥＴＰ０２Ｂ（配列番号４）を使用するＰＣＲアッセイを、エンテロバクター目からの５つの細菌株：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、および非エンテロバクター目からの２つの細菌株：緑膿菌、およびＡ．バウマニに対して試験した。使用した出発物質の濃度は、ＤＮＡ（約１ｅ７コピー／μｌ）を使用したＳ．マルセッセンスを除いて、全ての株（グリセロールに予め保存された一晩培養物）の培養液について１ｅ８～５ｅ８ＣＦＵ／ｍｌの範囲であった。培養液のサンプル調製は行わなかった。この実験の結果は、エンテロバクター目ファミリーの５つの株についてのみ増殖曲線が観察されるが、２つの非腸内細菌株については観察されないことを示し、それによりエンテロバクター目を検出するためのプライマーおよびプローブのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。同様の実験を行って、緑膿菌特異的プライマーおよびプローブ（配列番号５～８）、ならびにＡ・バウマニ特異的プライマーおよびプローブ（配列番号９～１１）を試験したところ、これも良好な特異性および排他性を示した（データは示さず）。

ｇｙｒＢ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ１８９９（配列番号８）、リバースプライマーＳＥＧＰ１９０１（配列番号９）およびプローブＳＥＧＰ２０１６（配列番号１０）を使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティーに対して試験した。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった（データは示さず）。ゲノムＤＮＡの濃度は、０ｎｇ／μＬであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。図５に示すように、増殖曲線はエンテロバクター目（大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、およびＰ．ミラビリスを含む）を構成する種についてのみ観察された。非標的生物（Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティー）について有意な増幅は観察されず、それにより、エンテロバクター目を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。

エンテロバクター目のｒｐｌＰ遺伝子を標的とするように設計された他のプライマーおよびプローブの組み合わせについてＰＣＲアッセイを行った。ｒｐｌＰ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２８９１（配列番号５）、リバースプライマーＳＥＧＰ２８９２（配列番号６）およびプローブＳＥＧＰ２８９３（配列番号７）を使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティーに対して試験した。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった（データは示さず）。ゲノムＤＮＡの濃度は、０ｎｇ／μＬであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。図６に示すように、増殖曲線はエンテロバクター目（大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、およびＰ．ミラビリスを含む）を構成する種についてのみ観察された。非標的生物（Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティー）について有意な増幅は観察されず、それにより、エンテロバクター目を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。

ｒｐｏＢ遺伝子を標的とするプローブＳＥＧＰ２８０４（配列番号１５）およびＳＥＧＰ２８２２（配列番号１６）と組み合わせて、フォワードプライマーＳＥＧＰ２７９９（配列番号１１）、リバースプライマーＳＥＧＰ２８００（配列番号１２）、ＳＥＧＰ２８０２（配列番号１３）およびＳＥＧＰ２８２１（配列番号１４）を使用するＰＣＲアッセイにおいても同様の結果が得られた。図７に示すように、増殖曲線はエンテロバクター目（大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、およびＰ．ミラビリスを含む）を構成する種についてのみ観察された。非標的生物（Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティー）について有意な増幅は観察されず、それにより、エンテロバクター目を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。

実施例３ アシネトバクター属を検出するためのプライマー／プローブを使用するＰＣＲ
ｏｍｐＡ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２６０３（配列番号２０）、リバースプライマーＳＥＧＰ２６０６（配列番号２１）およびプローブＳＥＧＰ２７６９（配列番号２２）を使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティーに対して試験した。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった（データは示さず）。ゲノムＤＮＡの濃度は、０ｎｇ／μＬであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。図８に示すように、増殖曲線は、アシネトバクター属（Ａ．バウマニおよびＡ．ピティー）に属する優勢な病原体についてのみ観察された。非標的生物（大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｓ．マルトフィリア、および緑膿菌）について有意な増幅は観察されず、それにより、アシネトバクターを検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。

ｒｐｏＢ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２５９０（配列番号２３）、リバースプライマーＳＥＧＰ２５９３（配列番号２４）およびプローブＳＥＧＰ２５９４（配列番号２５）を使用するＰＣＲアッセイ（図９に示す）、ならびにｇｙｒＢ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２６２６（配列番号２６）、リバースプライマーＳＥＧＰ２６２８（配列番号２７）およびプローブＳＥＧＰ２６２９（配列番号２８）を使用するＰＣＲアッセイ（図１０に示す）においても同様の結果が得られた。これらの実験により、アシネトバクターを検出するためのプライマーとプローブの両方の組み合わせについて、良好な包括性および排他性プロファイルが実証される。

実施例４ 緑膿菌を検出するためのプライマー／プローブを使用するＰＣＲ
ｔｕｆ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２３４１（配列番号３２）、リバースプライマーＳＥＧＰ２３４２（配列番号３３）およびプローブＳＥＧＰ２３４３（配列番号３４）を使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティーに対して試験した。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった（データは示さず）。ゲノムＤＮＡの濃度は、０ｎｇ／μＬであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。図１１に示すように、増殖曲線はシュードモナス属に属する病原体（緑膿菌）についてのみ、観察された。非標的生物（大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｓ．マルトフィリア、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピッティー）について有意な増幅は観察されず、それにより、緑膿菌を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。

ｇｙｒＢ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２６３０（配列番号３５）、リバースプライマーＳＥＧＰ２６３１（配列番号３６）およびプローブＳＥＧＰ２６３２（配列番号３７）を使用するＰＣＲアッセイ（図１２に示す）、ならびにｒｐｏＢ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２６３４（配列番号３８）、リバースプライマーＳＥＧＰ２６３７（配列番号３９）およびプローブＳＥＧＰ２６４０（配列番号４０）を使用するＰＣＲアッセイ（図１３に示す）においても同様の結果が得られた。これらの実験により、緑膿菌を検出するためのプライマーとプローブの両方の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証される。

実施例５ ステノトロホモナス・マルトフィリアを検出するためのプライマー／プローブを使用するＰＣＲ
ｆｄｎＧ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２５３２（配列番号４１）、リバースプライマーＳＥＧＰ２５３８（配列番号４２）およびプローブＳＥＧＰ２５４４（配列番号４３）を使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティーに対して試験した。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった（データは示さず）。ゲノムＤＮＡの濃度は、０ｎｇ／μＬであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。図１４に示すように、増殖曲線は、ストレプトマイセス・マルトフィリア（Ｓ．マルトフィリア）についてのみ観察された。非標的生物（大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピッティー）について有意な増幅は観察されず、それにより、Ｓ．マルトフィリアを検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。

ｇｙｒＢ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２５７８（配列番号４４）、リバースプライマーＳＥＧＰ２５７９（配列番号４５）およびプローブＳＥＧＰ２５８０（配列番号４６）を使用するＰＣＲアッセイ（図１５に示す）、ならびにｔｕｆ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２５７２（配列番号４７）、リバースプライマーＳＥＧＰ２５７３（配列番号４８）およびプローブＳＥＧＰ２５７４（配列番号４９）を使用するＰＣＲアッセイ（図１６に示す）においても同様の結果が得られた。これらの実験により、Ｓ．マルトフィリアを検出するためのプライマーとプローブの両方の組み合わせについて、良好な包括性および排他性プロファイルが実証される。

実施例６ エンテロコッカス属を検出するためのプライマー／プローブを使用するＰＣＲ
ｒｐｏＢ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２５２２（配列番号５３）、リバースプライマーＳＥＧＰ２５２５（配列番号５４）およびプローブＳＥＧＰ２７７０（配列番号５５）を使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体：Ｓ．アガラクチア、肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、Ｅ．フェシウム、Ｅ．フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびＳ．エピデルミディスに対して試験した。グラム陰性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった（データは示さず）。ゲノムＤＮＡの濃度は、０ｎｇ／μＬであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。図１７に示すように、エンテロコッカス属に属する病原体（Ｅ．フェシウムおよびＥ．フェカリス）についてのみ増幅曲線が観察される。非標的生物（Ｓ．アガラクチア、肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、黄色ブドウ球菌、およびＳ．エピデルミディス）について有意な増幅は観察されず、それにより、エンテロコッカス属を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。

ｄｄｌ遺伝子を標的とする、フォワードプライマーＳＥＧＰ１６２４（配列番号５６）およびＳＥＧＰ１６２７（配列番号５７）、リバースプライマーＳＥＧＰ１６２５（配列番号５８）およびＳＥＧＰ１６２８（配列番号５９）、ならびにプローブＳＥＧＰ１６２６（配列番号６０）およびＳＥＧＰ１６２９（配列番号６１）を使用するＰＣＲアッセイにおいても同様の結果が得られた（図１８に示す）。ｇｙｒＢ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２８８２（配列番号６２）およびＳＥＧＰ２８８４（配列番号６３）、リバースプライマーＳＥＧＰ２８８５（配列番号６４）およびＳＥＧＰ２８８６（配列番号６５）、ならびにプローブＳＥＧＰ２８８８（配列番号６６）を使用するＰＣＲアッセイにおいても、良好な特異性が観察された（図１９に示す）。これらの実験により、エンテロコッカスを検出するためのプライマーとプローブの両方の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証される。

実施例７ 黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマー／プローブを使用するＰＣＲ
ＣＰＥ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ１４９０（配列番号６７）、リバースプライマーＳＥＧＰ１４９１（配列番号６８）およびプローブＳＥＧＰ１４９２（配列番号７２）を使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体：Ｓ．アガラクチア、肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、Ｅ．フェシウム、Ｅ．フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびＳ．エピデルミディスに対して試験した。グラム陰性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった（データは示さず）。ゲノムＤＮＡの濃度は、０ｎｇ／μＬであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。図２０に示すように、有意な増殖曲線は、黄色ブドウ球菌種に属する病原体についてのみ観察された。非標的生物（Ｓ．アガラクチア、肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、Ｅ．フェシウム、Ｅ．フェカリス、およびＳ．エピデルミディス）について有意な増幅は観察されず、それにより、黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。

ｇｙｒＢ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２７９２（配列番号７３）、リバースプライマーＳＥＧＰ２７９３（配列番号７４）およびプローブＳＥＧＰ２７９４（配列番号７５）を使用するＰＣＲアッセイ（図２１に示す）、ならびにｄｄｌＡ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２９３２（配列番号７６）、リバースプライマーＳＥＧＰ２９３３（配列番号７７）およびプローブＳＥＧＰ２９３５（配列番号７８）を使用するＰＣＲアッセイ（図２２に示す）においても同様の結果が得られた。これらの実験により、黄色ブドウ球菌を検出するためのプライマーとプローブの両方の組み合わせについて、良好な包括性および排他性プロファイルが実証される。

実施例８ ストレプトコッカス・アガラクチアを検出するためのプライマー／プローブを使用するＰＣＲ
ｇｙｒＢ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２９２１（配列番号１２１）、リバースプライマーＳＥＧＰ２９２２（配列番号１２２）およびプローブＳＥＧＰ２９２３（配列番号１２３）を使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体：Ｓ．アガラクチア、肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、Ｅ．フェシウム、Ｅ．フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびＳ．エピデルミディスに対して試験した。グラム陰性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった（データは示さず）。ゲノムＤＮＡの濃度は、０ｎｇ／μＬであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。図２３に示すように、有意な増殖曲線は、ストレプトコッカス・アガラクチア種に属する病原体についてのみ観察された。非標的生物（肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、Ｅ．フェシウム、Ｅ．フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびＳ．エピデルミディス）について有意な増幅は観察されず、それにより、Ｓ．アガラクチア属を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。

ｓｉｐ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２２０４（配列番号８２）、リバースプライマーＳＥＧＰ２２０５（配列番号８３）およびプローブＳＥＧＰ２２０６（配列番号８４）を使用するＰＣＲアッセイ（図２４に示す）、ならびにｄｄｌＡ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２９４７（配列番号８５）、リバースプライマーＳＥＧＰ２９４９（配列番号８６）およびプローブＳＥＧＰ２９５１（配列番号８７）を使用するＰＣＲアッセイ（図２５に示す）においても同様の結果が得られた。これらの実験により、Ｓ．アガラクチアを検出するためのプライマーとプローブの両方の組み合わせについて、良好な包括性および排他性プロファイルが実証される。

実施例９ カンジダ属を検出するためのプライマー／プローブを使用するＰＣＲ
ＲＤＮ１８（１８ｓ ｒＲＮＡ）を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ１７１２（配列番号８８）、リバースプライマーＳＥＧＰ１７１３（配列番号８９）およびプローブＳＥＧＰ１７１６（配列番号９０）を使用するＰＣＲアッセイを、一般的な真菌病原体：カンジダ・アルビカンスおよびカンジダ・アウリスに対して試験した。グラム陰性および陽性生物についても試験したが、有意な増幅は示されなかった（データは示さず）。ゲノムＤＮＡの濃度は、０ｎｇ／μＬであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。図２６に示すように、カンジダ属に属する病原体についてのみ有意な増幅曲線が観察された。非標的生物について有意な増幅は観察されず、それにより、カンジダを検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。

ＲＤＮ５８（５．８ｓ ｒＲＮＡ）遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ１７１８（配列番号９１）、リバースプライマーＳＥＧＰ１７１９（配列番号９２）およびプローブＳＥＧＰ１７２２．１（配列番号９３）を使用するＰＣＲアッセイを、Ｃ．アルビカンスおよびＣ．アウリスに対して試験した。グラム陰性および陽性生物についても試験したが、有意な増幅は示されなかった（データは示さず）。ゲノムＤＮＡの濃度は、０ｎｇ／μＬであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。図２７に示すように、カンジダ属に属する病原体についてのみ有意な増幅曲線が観察された。非標的生物について有意な増幅は観察されず、それにより、カンジダを検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。

実施例１０ 一般的なグラム陰性およびグラム陽性病原体を検出するためのＰＣＲ
１６ｓ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ１８３０（配列番号９４）、リバースプライマーＳＥＧＰ１８３１（配列番号９５）およびプローブＳＥＧＰ１８９５．１（配列番号９６）を使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティーに対して試験した。ゲノムＤＮＡの濃度は、０ｎｇ／μＬであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。図２８に示すように、全てのグラム陰性病原体について増幅曲線が観察され、それにより、一般的なグラム陰性病原体を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせが実証された。

１６ｓ遺伝子を標的とするプライマーおよびプローブの同じ組み合わせも、一般的なグラム陽性病原体：Ｓ．アガラクチア、肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、Ｅ．フェシウム、Ｅ．フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびＳ．エピデルミディスに対して同一の濃度で試験した。図２９に示すように、全てのグラム陽性病原体について増幅曲線が観察され、それにより、一般的なグラム陽性病原体を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせが実証された。

実施例１１ ＡＳＴの結果の解釈

一般に、抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）の結果を解釈するために最も一般的に使用される２つのガイドラインは、以下のものからのガイドラインである：１）臨床検査標準協議会（ＣＬＳＩ）、および２）抗菌剤感受性試験における欧州委員会（ＥＵＣＡＳＴ）。米国はＣＬＳＩガイドラインを使用し、欧州の国々はＥＵＣＡＳＴガイドラインを使用している。ＣＬＳＩからの最新のバージョンは、Ｍ１００ ＥＤ３０「抗菌剤感受性試験の性能基準、第３０^版」であり、ＵＲＬ：ｃｌｓｉ．ｏｒｇ／ｓｔａｎｄａｒｄｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｍ１００で入手可能である。ＥＵＣＡＳＴからの現在のバージョンは、バージョン１０、「抗菌剤感受性についての欧州委員会（Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ）、ＭＩＣおよびゾーン直径の解釈のためのブレイクポイント表、バージョン１０．０，２０２０」であり、ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｅｕｃａｓｔ．ｏｒｇ／ｆｉｌｅａｄｍｉｎ／ｓｒｃ／ｍｅｄｉａ／ＰＤＦｓ／ＥＵＣＡＳＴ＿ｆｉｌｅｓ／ Ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ ＿ｔａｂｌｅｓ／ｖ＿１０．０＿Ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ＿Ｔａｂｌｅｓ．ｐｄｆで入手可能である。

図３０－１および図３０－２において確立された最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）のブレイクポイントは、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ１００ ＥＤ３０によって決定されるように、多くのグラム陰性細菌生物（エンテロバクター目、緑膿菌、アシネトバクター属、Ｓ．マルトフィリア）についてμｇ／ｍＬとして示される。ブレイクポイントは、抗菌剤感受性試験からのＭＩＣの結果を解釈し、生物の「グループ化」を所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性のいずれかとして分類するために使用される。生物のグループ化は、種、属、目、または特定の生化学的特性を含むがこれらに限定されない種々のレベルであり得る。

図３１において確立された最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）のブレイクポイントは、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ１００ ＥＤ３０によって決定されるように、多くのグラム陽性細菌生物（黄色ブドウ球菌およびＳ．ルグドゥネンシス、Ｓ．エピデルミディス、エンテロコッカス属、肺炎球菌、ストレプトコッカス／β－溶血性、ビリダンス・ストレプトコッカス）についてμｇ／ｍＬとして示されている。ブレイクポイントは、抗菌剤感受性試験からのＭＩＣの結果を解釈し、生物の「グループ化」を所与の抗菌剤に対して感受性、中間または耐性のいずれかとして分類するために使用される。生物のグループ化は、種、属、目、または特定の生化学的特性を含むがこれらに限定されない種々のレベルであり得る。
図３２において確立された最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の限界点は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ６０ ＥＤ１によって求められる真菌生物（カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ブラブラータ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・アウリス）についてはμｇ／ｍＬとして示される。ブレイクポイントは、抗真菌剤感受性試験（ＡＦＳＴ）からのＭＩＣの結果を解釈し、生物の 「グループ化」 を所与の抗真菌剤に対して感受性、中間または耐性のいずれかとして分類するために使用される。生物のグループ化は、種、属、目、または特定の生化学的特性を含むがこれらに限定されない種々のレベルであり得る。注意すべきは、カンジダ・アウリスにはＡＦＳＴが推奨されているが、ＣＬＳＩもＣＤＣも現在この種のブレイクポイントを確立していないことである。ＡＦＳＴは、密接に関連するカンジダ属菌に起因し、専門家の意見を使用し、特定の抗真菌剤に対するカンジダ・アウリス分離株の感受性を決定する。

実施例１２ ＰＣＲ ＩＤ／ＡＳＴアッセイプロトコル
方法および材料
ａ．抗菌剤（Ａｂｘ）プレートを事前に準備し、必要になるまで－８０℃で保存する
ｉ．希釈剤－陽イオン調整ミューラーヒントンブロス（ＣＡＭＨＢ）
ｉｉ．最終体積－５０μｌ／ウェル
ｉｉｉ．－８０℃から取り出し、使用前に３０分／室温で解凍する

ｂ．ＣＡＭＨＢ中での一晩培養－３７℃／１６～１８時間／５００ｒｐｍ
ｉ．２ｍＬの９６ウェルディープウェルプレート中、１０μｌのグリセロールストック＋４９０μｌのＣＡＭＨＢ
ｃ．光学密度（ＯＤ）によって培養物を１．００Ｅ＋０６ＣＦＵ／ｍＬに標準化する
ｄ．５０μｌの標準化された試験単離物を、概説されるようにＡｂｘプレートの適切なウェルに添加することによって試験プレートを調製する

ｅ．試験プレートを３７℃／４時間／振盪なしでインキュベートする
ｆ．表ＩＶに従ってＰＣＲ試薬を調製する
ｇ．４５μｌのマスターミックスをＰＣＲアッセイプレートの各ウェルに添加する
ｈ．インキュベーション後、試験プレートの５μｌ／ウェルをＰＣＲアッセイプレートにスタンプする
ｉ．最終体積－５０μｌ／ウェル
ｉ．試験プレートについては、３７℃／１２～１６時間／振盪なしでインキュベートを続けて、基準方法の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定する。
Ｊ．ＰＣＲアッセイプレートをｃｏｂａｓ（登録商標）ｚ４８０装置に装填し、表ＩＶの条件下で実行する。
ｋ．インキュベーション後、ＭＩＣの試験プレートを読み取り、表現型感受性あり／中程度／耐性解釈を決定した。

実施例１３ エンテロバクター目のリアルタイムＰＣＲ ＩＤおよびＡＳＴアッセイ
３種の異なる標的遺伝子ｇｙｒＢ、ｒｐｌＰ、およびｒｐｏＢ、ならびに３つのクラスの抗菌剤シプロフロキサシン（フルオロキノロン）、ゲンタマイシン（アミノグリコシド）、およびメロペネム（カルバペネム）を利用するエンテロバクター目の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を行った。使用したプライマー／プローブセットは以下のとおりであった。ｇｙｒＢについては、配列番号８（フォワードプライマー）、配列番号９（リバースプライマー）、配列番号１０（プローブ）；ｒｐｌＰについては、配列番号５（フォワードプライマー）、配列番号６（リバースプライマー）、配列番号７（プローブ）；ｒｐｏＢについては、配列番号１１（フォワードプライマー）、配列番号１２～１４（リバースプライマー）、配列番号１５～１６（プローブ）。Ｋ．ニューモニエ株０１４３（抗菌剤耐性株）および１６５６５（抗菌剤感受性株）の抗菌剤感受性を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ１００ ＥＤ３０に従って解釈して、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、５ｅ５ＣＦＵ／ｍＬで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、４時間インキュベーションした後、実施例１２のプロトコルを使用してＰＣＲをベースとする迅速ＩＤ／ＡＳＴ試験に供した。

結果を図３３に示す。「倍率変化Ａｂｘレベル１」として示されているＹ軸上のパーセンテージは、計算２＾－（Ａｂｘ＿Ｌｅｖｅｌ＿１＿Ｃｔ－Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿Ｃｔ）または２＾－（ΔＣｔ）を使用して決定された。Ａｂｘレベルの表示は、使用された実際の濃度には関係せず、どちらかと言えば、Ａｂｘレベル１が最低濃度であり、各レベルアップが２倍高い濃度である場合に、どの２倍希釈が参照されているかの表示である（表ＸＸＸＩ参照）。倍率変化がどのように計算されるかの例を挙げると、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿Ｃｔ値（すなわち、抗菌剤を添加しない場合のＣｔ値）が２０であり、Ａｂｘ＿Ｌｅｖｅｌ＿１＿Ｃｔ値が２２である場合、倍率変化＝２＾－（２２－２０）＝２＾－２＝１／２×１／２＝２５％である。これらの計算に基づいて、ΔＣｔ値がより低い抗菌剤に耐性の株は、ΔＣｔ値がより高い抗菌剤に感受性の株よりも高い「倍率変化」値を有し、図３３において、Ａｂｘレベル１は、耐性株Ｋｐｎ０１４３と感受性株Ｋｐｎ１６５６５との間の最良の分離をもたらし得た。これらのデータは、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、およびメロペネムに対する感受性または耐性を決定する際に、３つ全ての遺伝子標的（ｇｙｒＢ、ｒｐｌＢ、ｒｐｏＢ）を利用して両方のＫｐｎ株の正しい感受性についての結果が得られることを更に示している。しかしながら、所与の抗菌剤に対する感受性または耐性を決定するために、任意の所与の標的遺伝子が、より良好またはより不良に機能し得る場合があり得る。まとめると、これらの結果は、プライマーおよびプローブが実施例２、図５～図７に示されたようにエンテロバクター目に対する正しい包括性および排他性基準を示し得る限り、種々の標的遺伝子および対立遺伝子がエンテロバクター目の迅速なＰＣＲベースのＩＤ／ＡＳＴに利用され得ることを示している。

実施例１４ 緑膿菌のリアルタイムＰＣＲ ＩＤおよびＡＳＴアッセイ
３つの異なる標的遺伝子、ｔｕｆ、ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢ、および３つのクラスの抗菌剤、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、およびメロペネムを利用する緑膿菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を行った。使用したプライマー／プローブセットは以下のとおりであった。ｔｕｆについては、配列番号３２（フォワードプライマー）、配列番号３３（リバースプライマー）、配列番号３４（プローブ）；ｇｙｒＢについては、配列番号３５（フォワードプライマー）、配列番号３６（リバースプライマー）、配列番号３７（プローブ）；ｒｐｏＢについては、配列番号３８（フォワードプライマー）、配列番号３９（リバースプライマー）、配列番号４０（プローブ）。緑膿菌株１６６５７（耐性）および１７８１６（感受性）の抗菌剤感受性を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ１００ ＥＤ３０に従って解釈して、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、５ｅ５ＣＦＵ／ｍＬで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、４時間のインキュベーション後、実施例１２のプロトコルを使用してＰＣＲをベースとする迅速ＩＤ／ＡＳＴ試験に供した。図３４に示すように、結果は、いくつかの標的対立遺伝子がいくつかの抗菌剤についてより良好に機能するようであるが、２つの緑膿菌株について正しい感受性結果を得るために３つ全ての遺伝子標的を利用できることを示している。まとめると、これらの結果は、種々の標的遺伝子および対立遺伝子が緑膿菌の正しい包括性および排他性基準を提供するならば、それらが迅速なＰＣＲベースのＩＤ／ＡＳＴに利用し得ることを示している（図１１～１３を参照されたい）。

実施例１５ アシネトバクター・バウマニのリアルタイムＰＣＲ ＩＤおよびＡＳＴアッセイ
３つの異なる標的遺伝子、ｏｍｐＡ、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＢ、および３つのクラスの抗菌剤、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、およびメロペネムを利用するアシネトバクター・バウマニの迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を行った。使用したプライマー／プローブセットは以下のとおりであった。ｏｍｐＡについては、配列番号２０（フォワードプライマー）、配列番号２１（リバースプライマー）、配列番号２２（プローブ）；ｒｐｏＢについては、配列番号２３（フォワードプライマー）、配列番号２４（リバースプライマー）、配列番号２５（プローブ）；ｇｙｒＢについては、配列番号２６（フォワードプライマー）、配列番号２７（リバースプライマー）、配列番号２８（プローブ）。Ａ．バウマニ株１７６９４（耐性）および１６４２１（感受性）の抗菌剤感受性を、ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ１００ ＥＤ３０に従って解釈し、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、５ｅ５ＣＦＵ／ｍＬで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、４時間のインキュベーション後、実施例１２のプロトコルを使用してＰＣＲをベースとする迅速ＩＤ／ＡＳＴ試験に供した。図３５に示すように、結果は、いくつかの標的対立遺伝子がいくつかの抗菌剤についてより良好に機能するようであるが、両方のＡｂｉ株について正しい感受性結果を得るために３つ全ての遺伝子標的を利用し得ることを示している。まとめると、これらの結果は、種々の標的遺伝子および対立遺伝子がＡ．バウマニに対する正しい包括性および排他性基準を提供するならば、それらが迅速なＰＣＲをベースとするＩＤ／ＡＳＴに利用され得ることを示している（図８～１０を参照されたい）。

実施例１６ 黄色ブドウ球菌のリアルタイムＰＣＲ ＩＤおよびＡＳＴアッセイ
３つの異なる標的遺伝子（ｇｙｒＢ、ｄｄｌＡ、ｔｕｆ）、および１つのクラスの抗菌剤：セフォキシチン（セファロスポリン）を利用する黄色ブドウ球菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を実施した。使用したプライマー／プローブセットは以下のとおりであった。ｇｙｒＢについては、配列番号７３（フォワードプライマー）、配列番号７４（リバースプライマー）、配列番号７５（プローブ）；ｄｄｌＡについては、配列番号７６（フォワードプライマー）、配列番号７７（リバースプライマー）、配列番号７８（プローブ）；ｔｕｆについては、配列番号７９（フォワードプライマー）、配列番号８０（リバースプライマー）、配列番号８１（プローブ）。黄色ブドウ球菌株１５５０９（耐性）および１６４０５（感受性）の抗菌剤感受性を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ１００ ＥＤ３０に従って解釈し、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、５ｅ５ＣＦＵ／ｍＬで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、４時間のインキュベーション後、実施例１２のプロトコルを使用してＰＣＲをベースとする迅速ＩＤ／ＡＳＴ試験に供した。結果は、図３６に示すように、いくつかの標的対立遺伝子はより良好に機能するようであるが、両方の黄色ブドウ球菌株について正しい感受性結果を得るために、３つ全ての遺伝子標的を利用し得ることを示す。まとめると、これらの結果は、種々の標的遺伝子および対立遺伝子が黄色ブドウ球菌に対する正しい包括性および排他性基準を提供するならば、それらが迅速なＰＣＲベースのＩＤ／ＡＳＴに利用され得ることを示している（図２１～２２を参照されたい）。

実施例１７ エンテロコッカス・フェシウムのリアルタイムＰＣＲ ＩＤおよびＡＳＴアッセイ
３つの異なる標的遺伝子（ｒｐｏＢ、ｄｄｌ、ｇｙｒＢ）、および２つのクラスの抗菌剤、アンピシリン（ベータ－ラクタム）およびバンコマイシン（糖ペプチド）を利用するエンテロコッカス・フェシウムエンテロコッカス・フェシウムの迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を行った。使用したプライマー／プローブセットは以下のとおりであった。ｒｐｏＢについては、配列番号５３（フォワードプライマー）、配列番号５４（リバースプライマー）、配列番号５５（プローブ）；ｄｄｌについて、配列番号５６～５７（フォワードプライマー）、配列番号５８～５９（リバースプライマー）、配列番号６０～６１（プローブ）；ｇｙｒＢについては、配列番号６２～６３（フォワードプライマー）、配列番号６４～６５（リバースプライマー）、配列番号６６（プローブ）。Ｅ．フェシウム株１８４８３（耐性）および１８４４６（感受性）の抗菌剤感受性を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ１００ ＥＤ３０に従って解釈し、それぞれ所与の抗菌剤に対する耐性および感受性を決定した。各株を、５ｅ５ＣＦＵ／ｍＬで、種々の濃度の示された抗菌剤を含有するウェルに接種し、４時間のインキュベーション後、実施例１２のプロトコルを使用してＰＣＲをベースとする迅速ＩＤ／ＡＳＴ試験に供した。結果は、図３７に示すように、いくつかの標的対立遺伝子はより良好に機能するようであるが、両方のＥ．フェシウム株について正しい感受性結果を得るために、３つ全ての遺伝子標的を利用し得ることを示す。まとめると、これらの結果は、種々の標的遺伝子および対立遺伝子がＥ．フェシウムの正しい包括性および排他性基準を提供するならば、それらが迅速なＰＣＲベースのＩＤ／ＡＳＴに利用し得ることを示している（図１７～１９を参照されたい）。

実施例１８ カンジダ属のリアルタイムＰＣＲ ＩＤおよびＡＳＴアッセイ
図３８に示すような、以下のプライマーおよびプローブを使用して、標的遺伝子ＲＤＮ１８（１８ｓリボソームＲＮＡ）およびＲＤＮ５８（５．８ｓリボソームＲＮＡ）を用いて、カンジダの迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を実施し得る。ＲＤＮ１８について、配列番号８８（フォワードプライマー）、配列番号８９（リバースプライマー）、配列番号９０（プローブ）；ＲＤＮ５８について、配列番号９１（フォワードプライマー）、配列番号９２（リバースプライマー）、配列番号９３（プローブ）。カンジダについての正確な包括性および排他性の基準を図２６～２７に示す。

実施例１９ 汎用リアルタイムＰＣＲ ＩＤおよびＡＳＴアッセイ
広く保存された１６ｓリボソームＲＮＡ遺伝子を標的として、配列番号９４（フォワードプライマー）、配列番号９５（リバースプライマー）および配列番号９６（プローブ）である図３９に示すプライマーおよびプローブを使用して、任意の所与のグラム陰性菌またはグラム陽性菌の迅速な同定および表現型抗菌剤感受性試験を実施し得る。

実施例２０ ブレイクポイント群を用いたマルチプレックスＰＣＲ ＩＤアッセイ
図４０Ａは、グラム陰性病原体ＰＣＲマルチプレックスマスターミックスの包括性および排他性性能を示す。アシネトバクターＰＣＲ検出セットは、ｏｍｐＡ遺伝子を標的とする、フォワードプライマーＳＥＧＰ２６０３（配列番号２０）、リバースプライマーＳＥＧＰ２６０６（配列番号２１）、およびプローブＳＥＧＰ２７６９（配列番号２２）を利用したものであり（表Ｖ参照）、アッセイ結果はチャンネル１に報告されている。緑膿菌ＰＣＲ検出セットは、ｔｕｆ遺伝子を標的とする、フォワードプライマーＳＥＧＰ２３４１（配列番号３２）、リバースプライマーＳＥＧＰ２３４２（配列番号３３）、およびプローブＳＥＧＰ２３４３（配列番号３４）を利用し（表ＶＩＩＩ参照）、アッセイ結果はチャネル２に報告されている。エンテロバクター目ＰＣＲ検出セットは、ｇｙｒＢ遺伝子を標的とする、フォワードプライマーＳＥＧＰ１８９９（配列番号８）、リバースプライマーＳＥＧＰ１９０１（配列番号９）およびプローブＳＥＧＰ２０１６（配列番号１０）を利用し（表ＩＩＩを参照）、アッセイ結果はチャネル３に報告されている。一般的な細菌ＰＣＲ検出セットは、１６ｓｒＲＮＡ遺伝子を標的とする、フォワードプライマーＳＥＧＰ１８３０（配列番号９４）、リバースプライマーＳＥＧＰ１８３１（配列番号９５）およびプローブＳＥＧＰ１８９５．１（配列番号９６）を利用し（表ＸＸＶＩＩＩ参照）、アッセイ結果はチャネル４に報告されている。最後に、一般的な内部対照ＰＣＲ検出セットは、フォワードプライマーＳＥＧＰ１９５２（ＡＣＡＡＣＣＧＣＧＣＣＡＴＡＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡ＜ｔ＿ＢＢ＿ｄＣ＞；配列番号９７）、リバースプライマーＳＥＧＰ１９５３（ＧＴＣＧＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＡＣＡＧＴＡＣＣＡ＜ｔ＿ＢＢ＿ｄＣ＞；配列番号９８）およびプローブＳＥＧＰ１９５４（＜ＣＹ５．５＞ＴＧＣＧＣＧＴＣＣＣＧ＜ＢＨＱ＿２＞ＴＴＴＴＧＡＴＡＣＴＴＣＧＴＡＡＣＧＧＴＧＣ＜Ｐｈｏｓ＞；配列番号９９）を利用し、アッセイ結果はチャネル５に報告されている。ブレイクポイント群、チャネルおよび色素波長を図４０Ｂに要約する。ゲノムＤＮＡの濃度は、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。マルチプレックス反応を、一般的なグラム陰性病原体：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティーから単離されたゲノムＤＮＡに対して試験した。さらに、一般的なグラム陽性病原体から単離されたゲノムＤＮＡでは有意な増幅は観察されなかった（データは示さず）。設計されたように、増幅曲線が所望の病原体について正しいチャネルで観察され、多重反応が非常に強い包括性および排他性を有することを示している。

図４１Ａは、グラム陽性病原体ＰＣＲマルチプレックスマスターミックスの包括性および排他性性能を示す。ストレプトコッカスＰＣＲ検出セットは、ｔｕｆ遺伝子を標的とする、フォワードプライマーＳＥＧＰ１７０５（配列番号１００）、リバースプライマーＳＥＧＰ１７０６（配列番号１０１）、およびプローブＳＥＧＰ１７０９．１（配列番号１０２）を利用し（表ＸＸＶ参照）、アッセイ結果はチャネル１に報告されている。スタフィロコッカスＰＣＲ検出セットは、ｔｕｆ遺伝子を標的とする、フォワードプライマーＳＥＧＰ１８３５（配列番号７９）、リバースプライマーＳＥＧＰ１８３６（配列番号８０）、およびプローブＳＥＧＰ１８３８（配列番号８１）を利用し（表ＸＸＩ参照）、アッセイ結果はチャネル２に報告されている。エンテロコッカスＰＣＲ検出セットは、ｒｐｏＢ遺伝子を標的とする、フォワードプライマーＳＥＧＰ２５２２（配列番号５３）、リバースプライマーＳＥＧＰ２５２５（配列番号５４）、およびプローブＳＥＧＰ２７７０（配列番号５５）を利用し（表ＸＶ参照）、アッセイ結果はチャネル３に報告すされている。一般的な細菌ＰＣＲ検出セットは、１６ｓｒＲＮＡ遺伝子を標的とする、フォワードプライマーＳＥＧＰ１８３０（配列番号９４）、リバースプライマーＳＥＧＰ１８３１（配列番号９５）、およびプローブＳＥＧＰ１８９５．１（配列番号９６）を利用し（表ＸＸＶＩＩＩ参照）、アッセイ結果はチャネル４に報告されている。最後に、一般的な内部対照ＰＣＲ検出セットは、フォワードプライマーＳＥＧＰ１９５２（配列番号９７）、リバースプライマーＳＥＧＰ１９５３（配列番号９８）およびプローブＳＥＧＰ１９５４（配列番号９９）を利用し、アッセイ結果はチャネル５に報告されている。ブレイクポイント群、チャネルおよび色素波長を図４１Ｂに要約する。ゲノムＤＮＡの濃度は、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。マルチプレックス反応を、一般的なグラム陽性病原体：Ｓ．アガラクチア、肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、Ｅ．フェシウム、Ｅ．フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびＳ．エピデルミディス由来の精製ゲノムＤＮＡに対して試験した。さらに、一般的なグラム陰性病原体から単離されたゲノムＤＮＡでは有意な増幅は観察されなかった（データは示さず）。設計されたように、増幅曲線が所望の病原体について正しいチャネルで観察され、多重反応が非常に強い包括性および排他性を有することを示している。

実施例２１ ＰＣＲ－ＡＳＴアッセイの分析
図４２は、図４に概説されるように、異なるチャネルに分離され、集団の統計的分離を使用して解釈される複数の病原体群の感受性分離株と耐性分離株を区別するために使用し得る種々の閾値を示す、多様なグラム陰性株に対する一連のＰＣＲ－ＡＳＴアッセイからのグラフを含む。シプロフロキサシン感受性に関連する閾値は、
Ａ）ｏｍｐＡ遺伝子を標的とする配列番号１７～１９のプライマー／プローブを使用するアシネトバクター・バウマニ（Ａｂｉ）、Ｂ）ｒｐｌＰ遺伝子を標的とする配列番号１～３のプライマー／プローブを使用したエンテロバクター目（Ｅｎｔｅｒｏ）、およびＣ）Ｏ－アセチラーゼ遺伝子を標的とする、表ＸＸＸＩＩＩに示されるようなプライマー／プローブを使用する緑膿菌（Ｐａｅ）について示されており、シプロフロキサシンなしの対照（ΔＣｔ）に対する２μｇ／ｍＬのシプロフロキサシンでのＣｔ値の変化、０．５μＲＦＩｇ／ｍＬのシプロフロキサシンおよび１μｇ／ｍＬのシプロフロキサシンでのΔＣｔ、および０．５μｇ／ｍＬのシプロフロキサシンでのＣｔ蛍光値の前の傾き（傾き）および１μｇ／ｍＬのシプロフロキサシンでのΔＣｔに基づく。

図４３Ａ）は、Ａｂｉ、Ｐａｅ、および菌株Ｅ．クロアカ（Ｅｃｌ）、大腸菌（Ｅｃｏ）、Ｋ．アエロゲネス（Ｋａｅ）、およびＫ．ニューモニエ（Ｋｐｎ）に細分されたエンテロバクター目について試験した耐性および感受性分離株の分布を示す。図４２の閾値を使用した種間でのシプロフロキサシンの感受性、特異性およびカテゴリー一致を図４３Ｂ）に示す。感受性は、全陽性／（全陽性＋偽陰性）として定義され：特異性は、総陰性／（総陰性＋偽陽性）として定義され；カテゴリー一致は、（全陽性＋全陰性）／（全陽性＋偽陰性＋全陰性＋偽陽性）として定義される。

図４４は、ゲンタマイシン感受性に関連する閾値が、それぞれのプライマー／プローブセットを使用するＡ）Ａｂｉ、Ｂ）Ｅｎｔｅｒｏ、およびＣ）Ｐａｅについて示される第２のＰＣＲ－ＡＳＴアッセイからのグラフを含み、１μｇ／ｍＬのゲンタマイシンでの注入サイクル、１μｇ／ｍＬのゲンタマイシンおよび８μｇ／ｍＬのゲンタマイシンでの絶対蛍光強度（ΔＡＦＩ）の変化、ならびに１６μｇ／ｍＬのゲンタマイシンおよび４μｇ／ｍＬのゲンタマイシンでのΔＡＦＩでの生蛍光データに適合する曲線の適合度に基づいている。図４５Ａ）は、Ａｂｉ、Ｐａｅ、および菌株エンテロバクター．クロアカ（Ｅｃｌ）、大腸菌（Ｅｃｏ）、クレブシエラ．アエロゲネス（Ｋａｅ）、およびクレブシエラ．ニューモニエ（Ｋｐｎ）に細分されたエンテロバクター目について試験した耐性および感受性分離株の分布を示す。図４４の閾値を使用した種間にわたるゲンタマイシンの感受性、特異性およびカテゴリー一致を図４５Ｂ）に示す。

図４６は、それぞれのプライマー／プローブセットを使用する、Ａ）Ａｂｉ、Ｂ）Ｅｎｔｅｒｏ、およびＣ）Ｐａｅについて、メロペネム感受性に関連する閾値が示される第３のＰＣＲ－ＡＳＴアッセイからのグラフを含み、メロペネムなしの対照（ΔＣｔ）に対する４μｇ／ｍＬのメロペネムでのＣｔ値の変化、０．２５μｇ／ｍＬでの最低メロペネム濃度（ΔＡｂｘ－Ｃｔ）および０．２５μｇ／ｍＬメロペネムでの絶対Ｃｔ値（Ｃｔ）に対する４μｇ／ｍＬのメロペネムでのＣｔ値の変化、ならびに１μｇ／ｍＬのメロペネムでの絶対蛍光強度（ＡＦＩ）および４μｇ／ｍＬメロペネムでのΔＣｔに基づく。図４７Ａ）は、Ａｂｉ、Ｐａｅおよびエンテロバクター目Ｅｃｌ、Ｅｃｏ、ＫａｅおよびＫｐｎについて試験した耐性および感受性分離株の分布を示す。図４６の閾値を使用した種間にわたるゲンタマイシンの感受性、特異性およびカテゴリー一致を図４７Ｂ）に示す。

図４８Ａ）は、一定濃度の細菌を全血に添加し、赤血球を分離し、細菌を含む血漿を市販の血液培養ボトルに接種し、一晩インキュベートし、次いでゲンタマイシンに耐性または感受性であることが知られている分離株を試験するための実施例１２に記載されているＰＣＲ－ＡＳＴアッセイプロトコルに従うことによって作成された、陽性血液培養サンプルから直接細菌分離株を試験するためのワークフローを記載する。図４８Ｂ）は、Ｃｔ値（ΔＣｔ）の変化を使用して耐性分離株を感受性分離株と区別する本実験の結果を示し、表現型の結果が陽性血液培養物から細菌上で直接得られ得ることを示す。

実施例２２ 複数菌サンプルの多重ＩＤ－ＡＳＴ ＰＣＲアッセイ
Ａ．Ｋｐｎ／ＡｂｉマルチプレックスＰＣＲ ＩＤ－ＡＳＴアッセイを、異なる感受性の組み合わせを有する２つのグラム陰性生物、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｐｎ）およびアシネトバクター・バウマニ（Ａｂｉ）を１：１の比で用いて、種々の濃度の３つの異なる抗生物質、シプロフラキソシン、ゲンタマイシンおよびメロペネムの非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした複数菌サンプルで実施した。Ｋｐｎシグナルの検出はＡＴＴＯ標識プローブからのものであり、Ａｂｉシグナルの検出はＨＥＸ標識プローブからのものであった。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表ＸＸＸＩＶに示し、結果を図４９に示す。それぞれの種は、感受性（感受性）株および耐性株を分離するデルタＣＴ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、それにより、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。

Ｂ．Ｋｐｎ／ＳａｒマルチプレックスＰＣＲ ＩＤ－ＡＳＴアッセイを、異なる感受性の組み合わせを有する１つのグラム陰性生物クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｐｎ）および１つのグラム陽性菌黄色ブドウ球菌（Ｓａｒ）を、１：１の比で用いて、種々の濃度の３つの異なる抗生物質、シプロフロキサシン、セフォキシチンおよびメロペネムの非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした複数菌サンプルで実施した。Ｋｐｎシグナルの検出はＨＥＸ標識プローブからのものであり、Ｓａｒシグナルの検出はＦＡＭ標識プローブからのものであった。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表ＸＸＸＶに示し、結果を図５０に示す。Ｎ／Ａは、対応する細菌－薬物の組み合わせについて臨床的に関連する解釈がないことを示す。それぞれの種は、感受性（感受性）株および耐性株を分離するデルタＣＴ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、それにより、種々の複数菌シナリオについて正確な抗菌剤感受性結果を提供した。

Ｃ．Ｋｐｎ／ＣａｌマルチプレックスＰＣＲ ＩＤ－ＡＳＴアッセイを、１つのグラム陰性生物、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｐｎ）、および異なる感受性の組み合わせを有する１つの真菌生物、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｌ）を１：１の比で用いて、種々の濃度の２つの異なる抗生物質、シプロフロキサシンおよびメロペネムの非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした複数菌サンプルで実施した。Ｋｐｎシグナルの検出はＨＥＸ標識プローブからのものであり、Ｃａｌシグナルの検出はＦＡＭ標識プローブからのものであった。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表ＸＸＸＶＩに示し、結果を図５１に示す。Ｎ／Ａは、対応する生物－薬物の組み合わせについて臨床的に関連する解釈がないことを示す。フルコナゾールのＣａｌ感受性を示す。Ｋｐｎ株は、感受性分離株および耐性分離株を分離するデルタ－Ｃｔ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、正確な抗菌剤感受性結果を提供した。

Ｄ．Ｅｆｓ／ＳａｒマルチプレックスＰＣＲ ＩＤ－ＡＳＴアッセイを、２つのグラム陽性生物、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｆｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓａｒ）を１：１の比で用い、異なる感受性の組み合わせを、種々の濃度のバンコマイシンの非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした複数菌サンプルで実施した。Ｅｆｓシグナルの検出はＨＥＸ標識プローブからのものであり、Ｓａｒシグナルの検出はＦＡＭ標識プローブからのものであった。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表ＸＸＸＶＩＩに示し、結果を図５２に示す。２つの種はいずれも、感受性分離株と耐性分離株とを分離するデルタ－Ｃｔ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、この複数菌の状況に対する正確な抗菌剤感受性結果を提供した。

Ｅ．Ｓａｒ／ＣａｌマルチプレックスＰＣＲ ＩＤ－ＡＳＴアッセイを、異なる感受性の組み合わせを有する１つのグラム陽性生物、黄色ブドウ球菌（Ｓａｒ）および１つの真菌生物、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｌ）を１：１の比で用い、種々の濃度のセフォキシチンの非存在下または存在下で一緒に共インキュベートした複数菌サンプルで実施した。Ｓａｒシグナルの検出はＦＡＭ標識プローブからのものであり、Ｃａｌシグナルの検出はＨＥＸ標識プローブからのものであった。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表ＸＸＸＶＩＩＩに示し、結果を図５３に示す。Ｎ／Ａは、対応する生物－薬物の組み合わせについて臨床的に関連する解釈がないことを示す。フルコナゾールのＣａｌ感受性を示す。Ｓａｒ株は、感受性分離株と耐性分離株を分離するデルタ－Ｃｔ閾値によって示されるように、対応する検出チャネルにおいて適切な表現型を示し、正確な抗菌剤感受性結果を提供した。

実施例２３ カルバペネム耐性の機構を決定するためのＰＣＲアッセイ
ｂｌａＫＰＣ、ｂｌａＶＩＭ、ｂｌａＮＤＭおよびｂｌａＯＸＡ－４８遺伝子を標的とするＰＣＲアッセイを、カルバペネム耐性の既知の機構を有するグラム陰性病原体：Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、緑膿菌、Ａ．バウマニ、大腸菌およびＫ．アエロゲネスに対して試験した。このアッセイで使用されるプライマーおよびプローブを表ＸＸＸＩＸに示す。ゲノムＤＮＡの濃度は、鋳型なし対照以外の全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。この実験の結果を図５４に示す。図において陽性（Ｐｏｓ）として示す増殖曲線は、標的化された耐性機構についてのみ観察された。非標的耐性機構について有意な増幅は観察されず、それにより、カルバペネム耐性の共通の機構を検出するためのプライマーとプローブとのこの特定の組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。

実施例２４ 種特異的ＰＣＲ ＩＤ－ＡＳＴアッセイ
Ｐ．スチュアルティのｃｉｔＣ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２１６４（配列番号１１５）、リバースプライマーＳＥＧＰ２１６６（配列番号１１６）およびプローブＳＥＧＰ２１６７（配列番号１１７）、ならびにサルモネラのｉｎｖＡ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２１１９（配列番号１１８）、リバースプライマーＳＥＧＰ２１２１（配列番号１１９）およびプローブＳＥＧＰ２１２０（配列番号１２０）を使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陰性病原体：大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、Ｅ．クロアカ、Ｋ．オキシトカ、Ｋ．アエロゲネス、Ｓ．マルセッセンス、Ｐ．ミラビリス、Ｃ．フロインデイ、Ｐ．スチュアルティ、Ｐ．レットゲリ、Ｓ．エンテリカ、Ｓ．マルトフィリア、緑膿菌、Ａ．バウマニ、およびＡ．ピティーに対して試験した。配列を、以下の表ＸＬに示す。グラム陽性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった（データは示さず）。ゲノムＤＮＡの濃度は、０ｎｇ／μＬであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。図５５に示すように、有意な増幅曲線は種特異的であった。非標的生物について有意な増幅は観察されず、それにより、それぞれのグラム陰性標的種を検出するためのプライマーとプローブの４つの組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。これらの結果は、エンテロバクター目に属するいくつかの特定の種に対するブレイクポイントに基づくＡＳＴ呼び出しの改善を可能にする種特異的検出セットの非限定的な例を表す。ＣＬＳＩガイドラインは、ここに示されているものなどの一部のエンテロバクター目の種が特定のアミノグリコシド薬に耐性であるが、エンテロバクター目の種の大部分は耐性ではないことを示している。

Ｓ．アガラクチアのｇｙｒＢ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２９２１（配列番号１２１）、リバースプライマーＳＥＧＰ２９２２（配列番号１２２）およびプローブＳＥＧＰ２９２３（配列番号１２３）、Ｓ．アガラクチアのｄｄｌＡ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２９４７（配列番号８５）、リバースプライマーＳＥＧＰ２９４９（配列番号８６）およびプローブＳＥＧＰ２９５１（配列番号８７）、肺炎球菌のｔｕｆ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２７７７（配列番号１２４）、リバースプライマーＳＥＧＰ２７７８（配列番号１２５）およびプローブＳＥＧＰ２７７９（配列番号１２６）、ならびにＳ．ピオゲネスのｓｐｅＢ遺伝子を標的とするフォワードプライマーＳＥＧＰ２１１３（配列番号１２７）、リバースプライマーＳＥＧＰ２１１４（配列番号１２８）およびプローブＳＥＧＰ２１１５（配列番号１２９）を使用するＰＣＲアッセイを、一般的なグラム陽性病原体：Ｓ．アガラクチア、肺炎球菌、Ｓ．ピオゲネス、Ｅ．フェシウム、Ｅ．フェカリス、黄色ブドウ球菌、およびＳ．エピデルミディス由来の精製ゲノムＤＮＡに対して試験した。配列を、以下の表ＸＬＩに示す。グラム陰性生物についても試験し、有意な増幅を示さなかった（データは示さず）。ゲノムＤＮＡの濃度は、０ｎｇ／μＬであった鋳型なし対照を除いて、全てのサンプルについて約２～１０ｎｇ／μＬであった。図５６に示すように、有意な増幅曲線は種特異的であった。非標的生物について有意な増幅は観察されず、それにより、それぞれのグラム陽性標的種を検出するためのプライマーとプローブの４つの組み合わせについて良好な包括性および排他性プロファイルが実証された。これらの結果は、スタフィロコッカス属およびストレプトコッカス属（図３１のＣＬＳＩブレイクポイント・テーブルを参照）に属するいくつかの特定の種に対する改善されたブレイクポイントに基づくＡＳＴ呼び出しを可能にする種特異的検出セットの非限定的な例を表し、これらのＩＤウェルを有することにより、図４１に示すようなより一般的なＩＤ／ＡＳＴ検出セットを利用し得る。

ＰＣＲ ＩＤ－ＡＳＴアッセイにおいて正確なコールを行う際に種特異的プライマー／プローブセットを使用することの影響を図５７に示し得る。左側のパネルでは、非種特異的プライマーおよびプローブの使用は、感受性株と耐性株とを区別し得ないことになる。対照的に、右側のパネルでは、同定を提供する種特異的プライマー／プローブセットの使用により、個々の種ごとに別々の解釈が可能になり、ＣＬＳＩブレイクポイントガイドラインに対する改善されたカテゴリー一致がもたらされる。

実施例２５ ＰＣＲ ＩＤ－ＡＳＴアッセイデータの解釈
図５８は、シグモイド関数を生のＰＣＲ曲線データに当てはめ、次いで曲線パラメータおよび特徴を計算する、ＰＣＲ ＩＤ－ＡＳＴアッセイデータ解釈戦略のワークフローを示す。次いで、種々の抗生物質濃度の存在と非抗生物質基準との間で特徴を比較して、相対的な特徴変化を導出する。特徴量および抗生物質の全体のレベルにわたる変化の回帰モデリングもまた、特徴量－反応関係に対応する追加の特徴を生成するために使用され、通常の最小二乗、リッジ回帰、ラッソ（Ｌａｓｓｏ）、Ｅｌａｓｔｉｃ Ｎｅｔ、ベイズ回帰、またはロジスティック回帰モデルの使用を含み得る。次いで、ニューラルネットワーク、樹形モデル、サポートベクターマシン、または近傍法を含み得る予測モデルを訓練するために、特徴をデータフレームにアセンブルし、グラウンドトゥルースＭＩＣ、またはグラウンドトゥルースＳ／Ｉ／Ｒと共に別々の機械学習アルゴリズムに入力される。訓練は、データを訓練セットおよびホールドアウト試験セットに分割し、続いて訓練セットを交差検証を用いてｋ倍に分割して、分類器のタイプごとに適切なハイパーパラメータ空間を探索することからなる。次いで、平均交差検証スコアおよび保持された試験セットの性能に基づいてモデルを選択する。次いで、訓練されたモデルは、アンサンブルとして参加して最終予測ＭＩＣを返し、これは、重み付けされていない投票、重み付けされた投票、平均確率、重み付けされた確率に基づくか、または前述の分類器タイプの下流の分類器によって解釈され得る。

図５９は、どのようにして種ＩＤ、抗菌剤感受性試験、耐性機構検出、およびユニバーサル１６ｓ ｒＲＮＡ表現型情報を組み合わせて結果を返すかを示す図を示し、種ＩＤを使用してＭＩＣ予測のための適切なアルゴリズムを選択し、その後、規制機関からの適切なブレイクポイントと比較して、感受性情報を決定する。それ故、試験された抗生物質に関連する耐性機構の検出は、その存在が予測されたＭＩＣと一致するかどうかに応じて返される感受性結果に影響を及ぼし得る。種ＩＤが存在しない場合、１６ｓ ｒＲＮＡ表現型情報を使用して、感受性結果のない一般的なＭＩＣを返し得、これは、質量分析などの代替方法で決定される種ＩＤと組み合わせて使用し得る。

アルゴリズム要素を使用してブレイクポイントベースのＡＳＴ呼び出しを改善する具体例がある。一例は、表現型結果呼び出しを調整するための耐性機構検出の使用である。各耐性機構は、事前に知られているその活性に関連する１種以上の抗生物質基質を有し得る。これらの機構はまた、それらの活性を検出し得る種々の期間を有し得る。これらの耐性機構には、４時間以内に強い活性を有さず、はるかに長いインキュベーション時間（１２～２４時間）の後に表現型的にのみ検出し得るものもある。これらの耐性機構について、生物は、単に耐性機構が４時間の期間内で十分に現れていないという理由で、所与の薬物に感受性であると同定され得る。別々のＰＣＲウェルを介したこれらのタイプの耐性機構を検出することで、不一致表現型結果の補正が可能になる。具体的な例は、セラチア・マルセッセンスであり、これは誘導可能であるが４時間の期間内では誘導されないことのある、ＳＭＥカルバペネマーゼ耐性機構をコードする。したがって、これらの耐性Ｓ．マルセッセンス株は、メロペネムに対して表現型的に感受性であるように見えるが、ＳＭＥ遺伝子を検出することで、メロペネム耐性である正しい表現型の予測が可能になる。別の例は、他の抗生物質の感受性を予測するための１つ以上の抗生物質からの表現型感受性の使用である。耐性機構は重複する基質特異性を有することが多いので、このことは、いくつかの抗生物質に対する感受性が他の抗生物質に対する感受性と直接相関することを意味する。同様に、いくつかの抗生物質に対する耐性は、他の抗生物質に対する耐性と直接相関している。これは、多くのＡＳＴ製品の製造業者が使用するＥｘｐｅｒｔ Ｒｕｌｅｓシステムと同様であるが、本発明のＰＣＲ ＩＤ－ＡＳＴアッセイから収集されたデータは、表現型結果解釈の他の方法の補助として使用される。具体的な例は、カルバペネマーゼの性質およびエルタペネムの分解に対する基質特異性が常に高いために、抗生物質エルタペネムに感受性の株が常に抗生物質メロペネムに感受性であることであろう。同様に、メロペネムに耐性の株は、同じ理由でエルタペネムにも耐性である。

前述の発明を明確化および理解するためにある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、形態および詳細の様々な変更を行うことができることが当技術分野の当業者には明らかであろう。例えば、上述した全ての技術および装置を、様々な組合せで使用することができる。

Claims (36)

1. 少なくとも１つの濃度の少なくとも１つの抗菌剤または抗菌剤クラスの存在下で、レポーターとして単一の定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを実施して、少なくとも１つの抗菌剤または１つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する細菌または真菌の標的群の抗菌剤感受性を同時に同定および判定することを含む、方法。
2. 前記細菌または真菌の標的群の前記同定が、前記細菌または真菌の標的群に特異的なシグナルを検出することによるものである、請求項１に記載の方法。
3. 前記特異的なシグナルが、前記細菌または真菌の標的群に由来しない標的遺伝子と比較して、前記細菌または真菌の標的群に由来する標的遺伝子に対してより選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドを使用することによって検出される、請求項２に記載の方法。
4. 前記標的遺伝子が、ｒｐｌＰ、ｏｍｐＡ、ｔｕｆ、ｒｐｏＢ、ｄｄｌ、ｄｄｌＡ、ｆｄｎＧ、ｓｏｄＡ、ｇｙｒＢ、Ｏ抗原アセチル化酵素、ｅｃｆＸ、ｔｕｓＡ、ＣＰＥ、ｓｉｐ、およびｎｕｃから選択される、請求項３に記載の方法。
5. 前記細菌または真菌の標的群が分類学上の目を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記分類学上の目がエンテロバクター目である、請求項５に記載の方法。
7. 前記細菌または真菌の標的群が分類学上の科を表す、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記分類学上の科が、腸内細菌科、エルシニア科（Ｙｅｒｓｉｎｉａｃｅａｅ）、モルガネラ科（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａｃｅａｅ）、または前記科の組み合わせから選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記細菌または真菌の標的群が分類学上の属を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記分類学上の属が、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、プレジオモナス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、またはプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）から選択される、請求項９に記載の方法。
11. 前記細菌または真菌の標的群が分類学上の種を表す、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記分類学上の種が、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、シトロバクター・コセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ）、モルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、プロビデンシア・スチュアルティ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・アウリス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アシネトバクター・ピティー（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｉｔｔｉｉ）、アシネトバクター・ノソコマリス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、またはストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、プレシオモナス・シゲロイデス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）から選択される、請求項１１に記載の方法。
13. － 前記細菌または真菌の標的群に由来しない第２の標的遺伝子と比較して、標的細菌または真菌の標的群に由来する第２の標的遺伝子に対してより選択的にハイブリダイズする追加のプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドを用いて、前記細菌または真菌の標的群の同定を検証する工程；または
    － 抗菌剤感受性表現型または毒素表現型もしくは病原性表現型の機序を決定する工程；または
    検証する工程、および決定する工程の両方
    から選択される工程を更に含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 細菌または真菌の２つ以上の標的群の抗菌剤感受性を同時に同定および判定することを更に含み、細菌または真菌の各標的群が、少なくとも１つの抗菌剤または１つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記細菌または真菌の標的群が、血流感染症（ＢＳＩ）、胃腸感染症、呼吸器感染症、尿路感染症、鼻感染症、直腸感染症または創傷感染症に存在する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記標的遺伝子がｒｐｌＰ、ｇｙｒＢ、およびｒｐｏＢから選択される、請求項６に記載の方法。
17. 分類学上のエンテロバクター目にない標的遺伝子よりも、分類学上のエンテロバクター目にある標的遺伝子に対してより選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドが、配列番号１～１６を含むヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の方法。
18. 非エンテロバクター目のｇｙｒＢよりも、エンテロバクター目のｇｙｒＢに対してより選択的にハイブリダイズするプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドが、配列番号８～１０を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 少なくとも１つの濃度の少なくとも１つの抗菌剤または抗菌剤クラスの存在下で、レポーターとして単一の多重化定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを実施して、生物学的サンプルから複数の細菌株または真菌株の抗菌剤感受性を同時に同定および判定することを含む、方法。
20. 前記生物学的サンプルが、全血、血漿、血清、赤血球画分、唾液、脳脊髄液、精液、尿、便、直腸スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、皮膚スワブ、胆汁、リンパ液、痰、洗浄液、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記生物学的サンプルが、血液、血漿、血清、またはそれらの組み合わせである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記生物学的サンプルが、前記ＰＣＲアッセイを実施する前に培養される、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 前記生物学的サンプルが、細菌分離株または真菌分離株である、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記複数の細菌株または真菌株が、少なくとも一つの抗菌剤または抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する細菌または真菌の少なくとも一つの群にグループ化される、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記複数の細菌株または真菌株が、細菌または真菌の２つ以上の群にグループ化され、細菌または真菌の各群が、少なくとも一つの抗菌剤または一つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する、請求項２４に記載の方法。
26. 前記複数の細菌株または真菌株の前記同定が、複数の菌株特異的５’ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ）オリゴヌクレオチドプローブを利用し、各プローブが蛍光色素で標識され、各蛍光色素が別の蛍光色素とは異なる発光波長を有する、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記複数の細菌株または真菌株の前記同定が、ＴＡＧＳ（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｇｎａｌ）技術を利用する、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. － 前記複数の細菌株または真菌株の前記同定を検証する工程；または
    － 抗菌剤感受性表現型または毒素表現型もしくは病原性表現型の機序を決定する工程；または
    検証する工程、および決定する工程の両方
    から選択される工程を更に含む、請求項１９～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 少なくとも１つの濃度の少なくとも１つの抗菌剤または抗菌剤のクラスの存在下で、単一の定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを実行して、前記抗菌剤もしくは抗菌剤のクラスに対する標的細菌株もしくは真菌株または細菌もしくは真菌の標的群の感受性、中間および耐性（ＳＩＲ）情報を同時に同定および決定することを含み、前記標的株または標的群の前記同定およびＳＩＲ情報の前記決定が、ＰＣＲデータに関連する１つ以上の数学的関係から導出される、方法。
30. 前記数学的関係が、閾値サイクル（Ｃｔ）、勾配、シグモイド曲線適合の変曲、絶対蛍光強度（ＡＦＩ）、またはエンドポイント相対強度（ＥＲＩ）から選択される、請求項２９に記載の方法。
31. 前記数学的関係が、異なる抗菌剤濃度または異なる抗菌剤間の相対的表現であり、ΔＣｔ、２＾（ΔＣｔ）、Δ変曲、ΔＡＦＩ、もしくはΔＥＲＩ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２９に記載の方法。
32. 前記数学的関係が、閾値サイクル（Ｃｔ）、勾配、シグモイド曲線適合の変曲、絶対蛍光強度（ＡＦＩ）、もしくはエンドポイント相対強度（ＥＲＩ）、またはそれらの組み合わせである、請求項３０に記載の方法。
33. 前記数学的関係が、異なる抗菌剤濃度または異なる抗菌剤間の相対的表現の組み合わせであり、ΔＣｔ、２＾（ΔＣｔ）、Δ変曲、ΔＡＦＩ、もしくはΔＥＲＩ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項３１に記載の方法。
34. － 前記標的細菌株もしくは真菌株または細菌もしくは真菌の標的群の前記同定を検証する工程；または
    － 抗菌剤感受性表現型または毒素表現型もしくは病原性表現型の機序を決定する工程；または
    検証する工程、および決定する工程の両方
    から選択される工程を更に含む、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. ２つ以上の標的細菌株もしくは真菌株または細菌もしくは真菌の２つ以上の標的群の抗菌剤感受性を同定および判定することを更に含み、各標的株または標的群は、少なくとも一つの抗菌剤または一つの抗菌剤クラスに対して類似または同一の臨床的ブレイクポイントを有する、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記ＰＣＲアッセイがリアルタイムＰＣＲアッセイである、請求項２９～３５のいずれか一項に記載の方法。

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