CN114729398A - 用于细菌和真菌的快速鉴定及表型抗微生物药物敏感性试验的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用聚合酶链式反应(PCR)作为报告子测定以快速且同时进行细菌鉴定及抗微生物药物敏感性(AST)表型试验的组合物和方法。本发明使用一种已表现出用于多重复用以及处理多种微生物学样品以进行抗微生物药物敏感性试验的能力的策略。
Description
技术领域
本公开涉及分子诊断领域，并且更特别地涉及鉴定和测定来自生物学样品的细菌的抗微生物药物敏感性。
背景技术
迫切需要开发快速简便地检测、鉴定和测定临床样品中细菌性病原体的抗微生物药物敏感性的方法，以指导传染病的诊断和治疗。这一需求的一个很好的示例是在血液感染(BSI)领域。BSI位居北美和欧洲七大死因之列，据估计，美国每年发生170万例败血症事件，导致每年270,000人死亡并且每年美国医疗保健费用支出140亿美元。已证明，缩短导向抗微生物治疗的时间改善了败血症患者的发病率和死亡率，从而缩短了住院时间(LOS)并且降低了住院费用。更快获得敏感性结果还将使抗微生物药物降阶梯更迅速，从而减少不良反应并且减少对耐药性的贡献。因此，仍然需要开发一种测定和试验系统，以在BSI中提供快速的表型抗微生物药物敏感性结果，使临床医生能够更快速地提供最合适的抗微生物疗法，从而改善患者预后。
多微生物血流感染(BSI)被定义为存在至少两种从血培养物中发现的不同微生物，已经越来越多地见诸报道，其发生率占所有BSI事件的6％至32％。多微生物BSI住院患者的死亡率在21％至63％的范围内，为单一微生物感染患者的大约两倍。
传统的抗微生物药物敏感性试验(AST)通过在存在给定抗微生物药物的情况下培养给定细菌来进行，其在液体培养基中和固体琼脂培养基上均可完成。两种最常用的AST方法是：1)微量肉汤稀释法，和2)圆片扩散法(aka Kirby-Bauer)。微量肉汤稀释法同时提供定量(最低抑菌浓度)和定性(敏感、中等与耐药)结果。圆片扩散法仅提供定性结果。
微量肉汤稀释法通过在存在多种浓度的抗微生物药物的情况下培养给定细菌来进行。孵育后，在各种抗微生物药物浓度下观察细菌生长/不生长。未观察到生长的最低浓度为最低抑菌浓度(MIC)，单位为μg/mL。现有指南提供了“折点”，其中将实验确定的特定细菌群或菌种的MIC值解释为对给定的抗微生物药物敏感、中介还是耐药。
圆片扩散法通过在固体琼脂培养基上形成给定细菌的“菌坪”，然后将单个抗生素圆片置于琼脂培养基上来进行。圆片中的抗生素扩散至培养基中，并且孵育后，在该圆片周围形成圆形抑制区。该区域的直径以及有关菌种和抗微生物药物的信息与确定的参比直径折点联合使用，以确定病原体对给定的抗微生物药物敏感、中介还是耐药。
一般来讲，解释AST结果的两个最常用的指南是由以下机构提供的指南：1)美国临床和实验室标准协会(CLSI)，和2)欧洲抗微生物药物敏感性试验委员会(EUCAST)。美国使用CLSI指南，而欧洲国家则使用EUCAST指南。CLSI提供的当前版本是M100 ED30，而EUCAST提供的当前版本是第10版。
发明内容
本发明涉及一种基于聚合酶链式反应(PCR)的快速鉴定和抗微生物药物敏感性试验(ID/AST)系统，该系统支持利用PCR技术快速鉴定和/或确定直接来自临床实验室中使用的阳性血培养物的细菌的抗微生物药物敏感性的特定测定组的自动化工作流程。该系统还具有利用和分析来自其他样品类型(诸如尿液和呼吸道感染)的样品的能力。基于PCR的快速ID/AST系统使用仪器、消耗品、试剂和数据管理的功能，提供从使用试剂处理样品到结果解释的工作流程。靶标鉴定和抗微生物药物敏感性结果即该系统的输出。
本发明还涉及一种基于PCR的快速ID/AST血流感染(BSI)组，它是一种体外诊断测试，利用PCR技术快速鉴定选定的细菌或真菌，并且在基于PCR的快速ID/AST系统上执行表型抗微生物药物敏感性试验(AST)。基于PCR的快速ID/AST BSI测定可直接对阳性血培养物样品、阳性前血培养物进行或者可能直接从患者血清进行。该测定适合辅助诊断和鉴定可引起菌血症的特定病原体的抗微生物药物敏感性。该组设计用于分析最常见的BSI革兰氏阴性和革兰氏阳性病原体，并且有望用于真菌。TaqMan 5′核酸酶实时PCR测定配置与ID策略相结合，应当能够根据需要为多微生物学样品、单一微生物学样品和分离物检测提供最低抑菌浓度(MIC)以及敏感、中等与耐药(SIR)信息。这些结果应当与其他临床和实验室结果联合使用。应当遵循处理阳性血培养物的标准实验室规程，以确保根据需要提供用于补充检测的分离物。
本发明还涉及基于PCR的快速ID/AST表型筛选测试，其为利用PCR技术的体外诊断测试，用于目标病原体或病原体组的快速鉴定及其对单一药物、药物类别或药物组合的表型敏感性试验。基于PCR的快速ID/AST筛选测定直接从临床样品进行，或从细菌/真菌分离物进行。这些测定将指示棘手的耐药性病原体存在与否，以帮助确保患者和医院的安全。这些类型的检测示例针对的是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，MRSA)、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，VRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐碳青霉烯肠杆菌科(Enterobacteriaceae，CRE)、耳念珠菌(Candida auris)和MDR淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)。
因此，本发明的一个方面涉及一种方法，该方法其使用定量实时PCR测定作为报告子，以同时鉴定和确定对至少一种抗微生物药物或一种抗微生物药物类别具有相似或相同的临床折点的目标细菌或真菌群的抗微生物药物敏感性。在一个实施方案中，目标细菌或真菌群存在于血流感染(BSI)、胃肠道感染、呼吸道感染、泌尿系统感染、鼻感染、直肠感染或伤口感染中。在一个实施方案中，对细菌或真菌群的鉴定通过检测对该细菌或真菌群具有特异性的信号来实现。在一个实施方案中，特异性信号通过使用引物和探针寡核苷酸来检测，与非来自细菌或真菌群的靶基因相比，该引物和探针寡核苷酸以更高的选择性与来自细菌或真菌群的靶基因杂交。在一个实施方案中，靶基因选自rplP、ompA、tuf、rpoB、ddl、ddlA、fdnG、sodA、gyrB、O-抗原乙酰基转移酶、ecfX、tusA、CPE、sip和nuc。
在另一个实施方案中，细菌或真菌群代表分类目。在一个实施方案中，分类目为肠杆菌目。在另一个实施方案中，细菌或真菌群包括分类科。在一个实施方案中，分类科选自肠杆菌科、耶尔森氏菌科、摩根氏菌科或所述科的组合。在又一个实施方案中，细菌或真菌群包括分类属。在一个实施方案中，分类属选自肠球菌属、念珠菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、葡萄球菌属、寡养单胞菌属、链球菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、沙门氏菌属、柠檬酸杆菌属、沙雷氏菌属、耶尔森氏菌属、摩根氏菌属、普罗维登斯菌属或变形杆菌属。
在另一个实施方案中，细菌或真菌群代表分类种。在一个实施方案中，分类神选自粪肠球菌(Efs)、屎肠球菌(Efm)、大肠杆菌(Eco)、肺炎克雷伯氏菌(Kpn)、产酸克雷伯氏菌(Kox)、阴沟肠杆菌(Ecl)、产气肠杆菌(Kae)、弗氏柠檬酸杆菌(Cfi)、柯氏柠檬酸杆菌(Cko)、摩氏摩根氏菌(Mmg)、斯氏普罗维登斯菌(Pst)、奇异变形杆菌(Pms)、普通变形杆菌(Pvs)、白色念珠菌(Cal)、耳念珠菌(Cau)、铜绿假单胞菌(Pae)、鲍氏不动杆菌(Abi)、皮氏不动杆菌(Api)、医院不动杆菌(Ano)、金黄色葡萄球菌(Sau)、表皮葡萄球菌(Sep)、、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Sma)、肺炎链球菌(Spn)、无乳链球菌(Sag)或酿脓链球菌(Spy)。
在又一个实施方案中，该方法进一步包括选自以下的步骤：使用额外的引物和探针寡核苷酸来验证对细菌或真菌群的鉴定，与非来自该细菌或真菌群的第二靶基因相比，该额外的引物和探针寡核苷酸以更高的选择性与来自该细菌或真菌群的第二靶基因杂交；或确定抗微生物药物敏感性表型或者毒素或毒力表型的机制；或验证和确定步骤两者。在另一个实施方案中，该方法进一步包括同时鉴定和确定多于一个细菌或真菌群的抗微生物药物敏感性，其中每个细菌或真菌群对至少一种抗微生物药物或一种抗微生物药物类别具有相似或相同的临床折点。
在另一方面，本发明涉及一种方法，该方法使用定量实时PCR测定作为报告子，以同时鉴定和确定肠杆菌目细菌对抗微生物药物或一类抗微生物药物的抗微生物药物敏感性，其通过使用引物和探针寡核苷酸来进行，与不属于该肠杆菌目分类目的靶基因相比，该引物和探针寡核苷酸以更高的选择性与属于肠杆菌目分类目的靶基因杂交。在一个实施方案中，靶基因选自rplP、gyrB和rpoB。在一个实施方案中，与不属于肠杆菌目分类目的靶基因相比，以更高的选择性与属于肠杆菌目分类目的靶基因杂交的引物和探针寡核苷酸包含含有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：16的核苷酸序列。在一个实施方案中，与非肠杆菌目中的gyrB相比，以更高的选择性与肠杆菌目中的gyrB杂交的引物和探针寡核苷酸包含含有SEQID NO：8至SEQ ID NO：10的核苷酸序列。
在另一方面，本发明涉及一种方法，该方法使用多重定量实时PCR测定作为报告子，以同时鉴定和确定来自生物学样品(即，来自多微生物生物学样品)的多个细菌或真菌菌株的抗微生物药物敏感性。在一个实施方案中，生物学样品选自全血、血浆、血清、红细胞级分、唾液、脑脊液、精液、粪便、尿液、鼻拭子、伤口拭子、皮肤拭子、直肠拭子、胆汁、淋巴、痰、灌洗液或它们的组合。在一个实施方案中，生物学样品为全血、血浆、血清或它们的组合。在一个实施方案中，在执行PCR测定之前培养生物学样品。在另一个实施方案中，生物学样品为细菌或真菌分离物。在另一个实施方案中，所述多个细菌或真菌菌株被分为至少一个细菌或真菌群，所述至少一个细菌或真菌群对至少一种抗微生物药物或抗微生物药物类别具有相似或相同的临床折点。在一个实施方案中，所述多个细菌或真菌菌株被分为多于一个细菌或真菌群，其中每个细菌或真菌群对至少一种抗微生物药物或一种抗微生物药物类别具有相似或相同的临床折点。
在另一个实施方案中，对所述多个细菌菌株的鉴定利用多个菌株特异性5′核酸酶
寡核苷酸探针，每个探针用具有不同发射波长的荧光染料标记。在一个实施方案中，对所述多个细菌菌株的鉴定利用TAGS(温度辅助信号生成)技术。在另一个实施方案中，方法进一步包括选自以下的步骤：验证对所述多个细菌或真菌菌株的鉴定；或确定抗微生物药物敏感性表型或者毒素或毒力表型的机制；或验证和确定步骤两者。
在另一方面，本发明涉及使用定量PCR测定来同时鉴定和确定目标细菌或真菌菌株或者目标细菌或真菌群对抗微生物药物或抗微生物药物类别的敏感、中等与耐药(SIR)信息，其中对目标菌株或目标群的鉴定和对SIR信息的确定从与PCR数据相关联的一种或多种数学关系得出。在一个实施方案中，数学关系选自阈值循环(Ct)、斜率、S形曲线拟合的拐点、绝对荧光强度(AFI)或端点相对强度(ERI)。在另一个实施方案中，数学关系为不同抗微生物药物浓度或不同抗微生物药物之间的相对表达式，并且选自ΔCt、2^(ΔCt)、Δ拐点、ΔAFI或ΔERI。在一个实施方案中，数学关系为选自阈值循环(Ct)、斜率、S形曲线拟合的拐点、绝对荧光强度(AFI)或端点相对强度(ERI)的数学关系的组合。在又一个实施方案中，数学关系为不同抗微生物药物浓度或不同抗微生物药物之间的相对表达式的组合，并且选自ΔCt、2^(ΔCt)、Δ拐点、ΔAFI或ΔERI。在另一个实施方案中，方法进一步包括选自以下的步骤：验证对目标细菌或真菌菌株或者目标细菌或真菌群的鉴定；或确定抗微生物药物敏感性表型或者毒素或毒力表型的机制；或验证和确定步骤两者。在另一个实施方案中，方法进一步包括鉴定和确定多于一个目标细菌或真菌菌株或者多于一个目标细菌或真菌群的抗微生物药物敏感性，其中每个目标菌株或目标群对至少一种抗微生物药物或一种抗微生物药物类别具有相似或相同的临床折点。
附图说明
图1.在不存在抗微生物药物的情况下(显示为“参比”)，细菌发生持续的基因组DNA复制。在存在抗微生物药物的情况下，耐药细菌将以与参比相似的基因组拷贝数进行复制，而敏感细菌将受到复制抑制，导致拷贝数减少。这种生长差异提供了可通过qPCR确定的表型读数。
图2.A原始qPCR数据显示为生长曲线，其中在每个PCR循环中测量荧光(例如，来自TaqMan探针)。对于耐药分离菌，生长曲线看起来相似，与在不同的抗微生物药物浓度下孵育4小时无关；而在敏感分离菌中，荧光强度呈剂量依赖性降低，并且信号超过背景(阈值)水平所需的循环次数(其通常称为循环阈值或Ct值)增加。
图2.B基于Ct值表示相同的qPCR数据，其中耐药分离菌的Ct值随抗微生物药物浓度的变化很小或没有变化，而敏感分离菌的Ct值呈剂量依赖性增加(表现为检测到较少数量的复制细菌)。
图3.A数学关系诸如“斜率”、“Ct”、“拐点”、“绝对荧光强度(AFI)”和“端点相对强度(ERI)”描述了原始qPCR扩增曲线的行为。
图3.B这些特征可通过将存在抗微生物药物时获得的数值与不存在抗微生物药物时获得的数值联系起来，作为抗微生物药物暴露量的函数进行进一步评估。然后可使用这些特征的相对变化，例如“ΔCt”、“Δ拐点”或“ΔAFI”来确定给定药物的菌株MIC，从而允许利用核准的折点确定菌株耐药性和敏感性。
图4.利用划分模型将细菌分离物分类为耐药或敏感。划分利用基尼系数来确定使两个类别的分散最大化的特征和阈值。仅利用两次分割以防止过度拟合，并允许进行二维图形表示以便于可视化。
图5.使用表III中公开的靶向gyrB基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试。仅观察到构成肠杆菌目(Enterobacterales)的菌种(包括大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)和奇异变形杆菌(P.mirabilis))的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图6.使用表II中公开的靶向rplP基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试。仅观察到构成肠杆菌目的菌种的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图7.使用表IV中公开的靶向rpoB基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试。仅观察到构成肠杆菌目的菌种的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图8.使用表V中公开的靶向ompA基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌肺炎克雷伯氏菌(K.pneumomae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(Koxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aerugmosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii)。仅观察到不动杆菌(Acinetobacter)属内的常见病原体(鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii))的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图9.使用表VI中公开的靶向rpoB基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试。仅观察到不动杆菌(Acinetobacter)属内的常见病原体的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图10.使用表VII中公开的靶向gyrB基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试。仅观察到不动杆菌(Acinetobacter)属内的常见病原体的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图11.使用表VIII中公开的靶向tuf基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii)。仅观察到假单胞菌(Pseudomonas)属内的病原体(铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图12.使用表IX中公开的靶向gyrB基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试。仅观察到假单胞菌(Pseudomonas)属内的病原体(铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图13.使用表X中公开的靶向rpoB基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试。仅观察到假单胞菌(Pseudomonas)属内的病原体(铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图14.使用表XI中公开的靶向fdnG基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aerugmosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii)。仅规察到嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomas maltophilia)种的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图15.使用表XII中公开的靶向gyrB基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试。仅观察到嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomas maltophilia)种的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图16.使用表XIII中公开的靶向tuf基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试。仅观察到嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomas maltophilia)种的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图17.使用表XV中公开的靶向rpoB基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阳性病原体进行测试：无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。仅观察到肠球菌(Enterococcus)属内的病原体(屎肠球菌(E.faecium)和粪肠球菌(E.faecalis))的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图18.使用表XVI中公开的靶向ddl基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阳性病原体进行测试。仅观察到肠球菌(Enterococcus)属内的病原体(屎肠球菌(E.faecium)和粪肠球菌(E.faecalis))的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图19.使用表XVII中公开的靶向gyrB基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阳性病原体进行测试。仅观察到肠球菌(Enterococcus)属内的病原体(屎肠球菌(E.faecium)和粪肠球菌(E.faecalis))的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图20.使用表XVIII中公开的靶向CPE基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阳性病原体进行测试：无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。仅观察到金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)种内的病原体的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图21.使用表XIX中公开的靶向gyrB基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阳性病原体进行测试。仅观察到金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)种内的病原体的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图22.使用表XX中公开的靶向ddlA基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阳性病原体进行测试。仅观察到金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)种内的病原体的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图23.使用表XXII中公开的靶向gyrB基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阳性病原体进行测试：无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。仅观察到无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)种内的病原体的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图24.使用表XXIII中公开的靶向sip基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阳性病原体进行测试。仅观察到无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)种内的病原体的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图25.使用表XXIV中公开的靶向ddlA基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阳性病原体进行测试。仅观察到无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)种内的病原体的生长曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增。
图26.使用表XXVI中公开的靶向RDN18(18s rRNA)基因的引物和探针的PCR测定对常见的真菌病原体进行测试：白色念珠菌(C.albicans)和耳念珠菌(C.auris)。仅观察到念珠菌(Candida)属内的病原体的生长曲线。还测试了革兰氏阴性和阳性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。
图27.使用表XXVII中公开的靶向RDN58(5.8srRNA)基因的引物和探针的PCR测定对常见的真菌病原体进行测试：白色念珠菌(C.albicans)和耳念珠菌(C.auris)。仅观察到念珠菌(Candida)属内的病原体的生长曲线。还测试了革兰氏阴性和阳性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。
图28.使用表XXVIII中公开的靶向16s基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii)。观蔡所有革兰氏阴性病原体的生长曲线。
图29.使用表XXVIII中公开的靶向16s基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阳性病原体进行测试：无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。观察所有革兰氏阳性病原体的生长曲线。
图30-1和图30-2.根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)文件M100ED 30确定的革兰氏阴性细菌生物的既定最低抑菌浓度(MIC)折点。折点用于解释抗微生物药物敏感性试验的MIC结果，并且将生物的“分组”分类为对给定抗微生物药物敏感、中介或耐药。生物的分组可处于不同的水平，包括但不限于种、属、目或特定的生化特性。
图31.根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)文件M100 ED 30确定的革兰氏阳性细菌生物的既定最低抑菌浓度(MIC)折点。折点用于解释抗微生物药物敏感性试验的MIC结果，并且将生物的“分组”分类为对给定抗微生物药物敏感、中介或耐药。生物的分组可处于不同的水平，包括但不限于种、属、目或特定的生化特性。
图32.根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)文件M60 ED 1确定的真菌生物(酵母)的既定最低抑菌浓度(MIC)折点。折点用于解释抗真菌药敏感性试验(AFST)的MIC结果，并将生物的“分组”分类为对给定抗真菌药敏感、中介或耐药。生物的分组可处于不同的水平，包括但不限于种、属、目或特定的生化特性。应当指出，虽然建议对耳念珠菌(Candidaauris)进行AFST，但CLSI或CDC目前均未确定该菌种的折点；相反，AFST来自密切相关的念珠菌(Candida)属，并且利用专家意见来确定耳道假丝酵母(C.auris)分离物对给定抗真菌药的敏感性。
图33.利用三种不同的靶基因(gyrB、rplP和rpoB)和三类抗菌剂：氟喹诺酮类(CIP)、氨基糖苷类(GEN)和碳青霉烯类(MEM)对肠杆菌目(Enterobacterales)进行快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验。
图34.利用三种不同的靶基因(tuf，gyrB，rpoB)和三类抗菌剂：氟喹诺酮类(CIP)、氨基糖苷类(GEN)和碳青霉烯类(MEM)对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)进行快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验。
图35.利用三种不同的靶基因(ompA、rpoB和gyrB)和三类抗菌剂：氟喹诺酮类(CIP)、氨基糖苷类(GEN)和碳青霉烯类(MEM)对不动杆菌(Acinetobacter)进行快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验。
图36.利用三种不同的靶基因(gyrB，ddlA，tuf)和一类抗菌剂：头孢菌素类(FOX)对金黄色葡萄球菌(S.aureus)进行快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验。
图37.利用三种不同的靶基因(rpoB、ddl和gyrB)和两类抗菌剂：β-内酰胺(AMP)和糖肽(VAN)，对屎肠球菌(Enterococcusfaecium)进行快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验。
图38.用于念珠菌(Candida)的快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验的靶向RDN18和RDN58基因的引物和探针。
图39.用于任何给定的革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌的快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验的靶向16s基因的引物和探针。
图40A.革兰氏阴性病原体PCR多重预混液的包容性和排他性性能。图40B.多重PCR检测的折点组、通道和染料波长以及名称。
图41A.革兰氏阳性病原体PCR多重预混液的包容性和排他性性能。图41B.多重PCR检测的折点组、通道和染料波长以及名称。
图42.区分敏感和耐药的阈值对于每个引物/探针组可以是唯一的，并且使用如图4中所概述的种群的统计分离来确定。与环丙沙星敏感性相关联的阈值针对A)鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii，Abi)、B)肠杆菌科(Enterobacteriaceae，Entero)和C)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pae)显示，并且基于三种不同抗生素浓度下Ct值、相对荧光强度(RFI)和Ct荧光值之前的斜率的变化。
图43.A)针对鲍氏不动杆菌(A.baumanii，Abi)、阴沟肠杆菌(E.cloacae，Ecl)、大肠杆菌(E.coli，Eco)、产气克雷伯菌(K.aerogenes，Kae)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae，Kpn)和铜绿假单胞菌(P.aerugmosa，Pae)显示耐药和敏感分离菌的分布。B)使用图42中的阈值得到的不同菌种对环丙沙星的敏感性、特异性和分类一致性，其中敏感性和特异性如实例21中所定义。
图44.区分敏感和耐药的阈值对于每个引物/探针组可以是唯一的，并且使用如图4中所概述的种群的统计分离来确定。与庆大霉素敏感性相关联的阈值针对A)鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii，Abi)、B)肠杆菌科(Enterobacteriaceae，Entero)和C)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pae)显示，并且基于拐点周期、绝对荧光强度(AFI)的变化以及曲线拟合至原始荧光数据的拟合优度。
图45.A)针对鲍氏不动杆菌(A.baumanii，Abi)、阴沟肠杆菌(E.cloacae，Ecl)、大肠杆菌(E.coli，Eco)、产气克雷伯菌(K.aerogenes，Kae)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae，Kpa)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa，Pae)显示耐药和敏感分离菌的分布。B)使用图44中的阈值得到的不同菌种对庆大霉素的敏感性、特异性和分类一致性，其中敏感性和特异性如实例21中所定义。
图46.区分敏感和耐药的阈值对于每个引物/探针组可以是唯一的，并且使用如图4中所概述的种群的统计分离来确定。与美罗培南敏感性相关联的阈值针对A)鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii，Abi)、B)肠杆菌科(Enterobacteriaceae，Entero)和C)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pae)显示，并且基于相对于无抗生素和最低抗生素浓度的Ct值变化、绝对Ct值和绝对荧光强度(AFI)。
图47.A)针对鲍氏不动杆菌(A.baumanii，Abi)、阴沟肠杆菌(E.cloacae，Ecl)、大肠杆菌(E.coli，Eco)、产气克雷伯菌(K.aerogenes，Kae)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae，Kpa)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa，Pae)显示耐药和敏感分离菌的分布。B)使用图46中的阈值得到的不同菌种对美罗培南的敏感性、特异性和分类一致性，其中敏感性和特异性如实例21中所定义。
图48.A)直接从阳性血培养物样品中检测分离物的工作流程，这些样品通过以下方法形成：将细菌添加至全血中，分离红细胞，将含有细菌的血浆接种到商业血培养瓶中，孵育过夜，然后遵循标准测定工作流程。B)各种耐药和敏感分离菌的Ct值随抗生素(庆大霉素)的变化，表明可以直接从阳性血培养物中获得细菌的表型结果。
图49.多微生物AST，其中在不存在或存在不同浓度的三种不同抗生素的情况下，将具有不同敏感性组合的两种革兰氏阴性菌(Kpn和Abi)以1：1的比例一起孵育。各菌种在相应的检测通道中表现出适当的表型，如ΔCT阈值所示，该阈值将敏感和耐药分离菌分开，为各种多微生物情形提供了准确的抗微生物药物敏感性结果。
图50.多微生物AST，其中在不存在或存在不同浓度的三种不同抗生素的情况下，将具有不同敏感性组合的一种革兰氏阴性菌(Kpn)和一种革兰氏阳性菌(Sar)以1∶1的比例一起孵育。各菌种在相应的检测通道中表现出适当的表型，如ΔCT阈值所示，该阈值将敏感和耐药分离菌分开，为各种多微生物情形提供了准确的抗微生物药物敏感性结果。N/A表示对相应的细菌-药物组合无临床相关的解释。
图51.多微生物AST，其中在不存在或存在不同浓度的一种抗生素的情况下，将具有不同敏感性组合的一种革兰氏阴性生物(Kpn)和一种真菌生物(Cal)以1∶1的比例一起孵育。革兰氏阴性菌种在相应的检测通道中表现出适当的表型，如ΔCT阈值所示，该阈值将敏感和耐药分离菌分开，为各种多微生物情形提供了准确的抗微生物药物敏感性结果。N/A表示相应的生物-药物组合无临床相关的解释。表示Cal对氟康唑的敏感性。
图52.多微生物AST，其中在不存在或存在不同浓度的一种抗生素的情况下，将具有不同敏感性组合的两种革兰氏阳性生物(Efs和Sar)以1∶1的比例一起孵育。两种菌种在相应的检测通道中表现出适当的表型，如ΔCt阈值所示，该阈值将敏感和耐药分离菌分开，为各种多微生物情形提供了准确的抗微生物药物敏感性结果。
图53.多微生物AST，其中在不存在或存在不同浓度的三种不同抗生素的情况下，将具有不同敏感性组合的一种革兰氏阳性生物(Sar)和一种真菌生物(Cal)以1：1的比例一起孵育。革兰氏阳性菌种在相应的检测通道中表现出适当的表型，如ΔCt阈值所示，该阈值将敏感和耐药分离菌分开，为各种多微生物情形提供了准确的抗微生物药物敏感性结果。N/A表示相应的生物-药物组合无临床相关的解释。表示Cal对氟康唑的敏感性。
图54.使用表XXXIX中公开的靶向blaKPC、blaVIM、blaNDM和blaOXA-48基因的引物和探针的PCR测定对具有已知的碳青霉烯类耐药机制的革兰氏阴性病原体进行测试。仅观察到靶向耐药机制的阳性(Pos)信号。
图55.使用表XL中公开的靶向斯氏普罗维登斯菌(P.stuartii)的citC基因和沙门氏菌属(Salmonella)的invA基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行测试：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、斯氏普罗维登斯菌(P.stuartii)、雷氏普罗威登斯菌(P.rettgeri)、肠道沙门氏菌(S.enterica)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii)。仅观察到菌种特异性生长曲线。这些结果代表菌种特异性检测组的非限制性示例，这些检测组允许改善肠杆菌目内的一些特定菌种的基于折点的AST检出。
图56.使用表XLI中公开的靶向无乳链球菌(S.agalactiae)的gyrB基因、无乳链球菌(S.agalactiae)的ddlA基因、肺炎链球菌(S.pneumonia)的tuf基因和酿脓链球菌(S.pyogenes)的speB基因的引物和探针的PCR测定对常见的革兰氏阳性病原体进行测试：无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。仅观察到菌种特异性生长曲线。这些结果代表菌种特异性检测组的非限制性示例，这些检测组允许改善葡萄球菌(Staphylococcus)属和链球菌(Streptococcus)属内的一些特定菌种的基于折点的AST检出。
图57.左图显示，在利用非菌种特异性引物/探针组(例如，与肠杆菌目中的靶基因杂交的组)的ID-AST PCR测定中区分敏感菌株和耐药菌株的阈值可能被表型表现中的菌种特异性差异混淆。右图显示，使用提供菌种鉴定的菌种特异性引物/探针组将能够分别解释每个单独菌种，从而改善与CLSI标准的分类一致性。
图58.数据解释策略，其中将S形函数拟合至原始PCR曲线数据，然后计算曲线参数和特征。然后比较存在各种抗生素浓度的情况与无抗生素参比之间的特征，以得出相对特征变化。然后将相对变化特征与地面真值MIC一起输入单独的机器学习算法中，以训练预测模型。然后，经训练的模型作为投票集合参与，以返回最终预测的MIC。
图59.显示如何组合菌种ID、抗微生物药物敏感性试验、耐药机制检测和通用16srRNA表型信息以返回结果的图表，其中使用菌种ID选择适当的MIC预测算法，然后对其与来自监管机构的适当折点进行比较以来确定敏感性信息。
具体实施方式
定义
所公开的方法可包括进行至少一个循环步骤，该循环步骤包括使用一对或多对引物从样品扩增核酸分子基因靶标的一个或多个部分。如本文所用的“样品”或“生物学样品”是指以下样品，其包括但不限于全血、血浆、血清、红细胞级分、唾液、脑脊液、精液、粪便、尿液、直肠拭子、胆汁、淋巴、痰液、灌洗液或它们的组合。如本文所用的“引物”是指与靶细菌基因特异性退火并且在适当条件下从其启动DNA合成从而产生相应扩增产物的寡核苷酸引物。所讨论的引物中的每一种与相应靶核酸分子内或邻近的靶标退火，使得每种扩增产物的至少一部分含有对应于靶标的核酸序列。如果样品中存在靶细菌基因核酸中的一种或多种，则产生一种或多种扩增产物，因此靶细菌基因扩增产物中的一种或多种的存在指示样品中存在细菌菌株。扩增产物应含有与靶细菌基因的一种或多种可检测探针互补的核酸序列。如本文所用的“探针”是指与编码靶细菌基因的核酸序列特异性退火的寡核苷酸探针。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤，其中使样品与一种或多种可检测探针接触以检测样品中细菌菌株的存在或不存在。
如本文所用，术语“扩增”是指合成与模板核酸分子的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度将引物与模板核酸退火，以及从引物酶促延伸以产生扩增产物。扩增通常需要存在脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(例如，
Taq)和适当的缓冲液和/或聚合酶最佳活性的辅助因子(例如，MgCl2和/或KCl)。
如本文所用的术语“引物”是本领域技术人员已知的，是指能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成的寡聚化合物，主要是指寡核苷酸，但也指经修饰的寡核苷酸，即例如寡核苷酸的3′-端提供游离3′-OH基团，另外的“核苷酸”可通过模板依赖性DNA聚合酶附接到该基团，从而建立3′至5′磷酸二酯键，由此使用三磷酸脱氧核苷并由此释放焦磷酸根。因此，除了可能的预期功能之外，“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间没有根本区别。
术语“杂交”是指一种或多种探针与扩增产物的退火。杂交条件通常包括低于探针解链温度但避免探针非特异性杂交的温度。
术语“5′到3′核酸酶活性”是指核酸聚合酶的活性，通常与核酸链合成相关，由此从核酸链的5′末端去除核苷酸。
术语“热稳定聚合酶”是指热稳定的聚合酶，即该酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，并且在经受升高的温度持续实现双链模板核酸变性所需的时间时不会不可逆地变性。通常，合成在每个引物的3′末端处起始，并且沿着模板链以5′至3′方向前进。已从黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(T.ruber)、嗜热栖热菌(T.thermophilus)、水生栖热菌(Taquaticus)、乳栖热菌(T.lacteus)、红色栖热菌(T.rubens)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)分离出热稳定的聚合酶。然而，并非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是补充该酶。
术语“其互补序列”是指与给定核酸具有相同长度并且与其完全互补的核酸。
当用于核酸时，术语“延伸”或“伸长”是指额外的核苷酸(或其他类似分子)掺入核酸时。例如，核酸任选地被掺入核苷酸的生物催化剂延伸，例如通常在核酸的3′末端添加核苷酸的聚合酶。
在两个或更多个核酸序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性(例如，如使用技术人员可用的序列比较算法中的一种或通过视觉检查所测量的)时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同核苷酸。适于测定序列同一性百分比和序列相似性的示例性算法是在例如以下文献中描述的BLAST程序：Altschul等人(1990)“Basic local alignment search tool”J.Mol.Biol.215：403-410；Gish等人(1993)“Identification of protein codingregions bydatabase similarity search”Nature Genet.3∶266-272；Madden等人(1996)“Applications of network BLAST server”Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul等人(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database searchprograms”Nucleic Acids Res.25：3389-3402；以及Zhang等人(1997)“PowerBLAST：A newnetwork BLAST application for interactive or automated sequence analysis andannotation”Genome Res.7：649-656中。
寡核苷酸上下文中的“修饰的核苷酸”是指这样的改变，其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被不同的核苷酸替换，为寡核苷酸提供所需的特性。在本文所述的寡核苷酸中，可被取代的示例性修饰的核苷酸包括例如C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2，6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧黄嘌呤核苷、吡唑并嘧啶、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2′-O-甲基核糖-U、2′-O-甲基核糖-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等。可以在寡核苷酸中取代的许多其他修饰的核苷酸在本文中提及或在本领域中另外已知。在某些实施例中，经修饰的核苷酸取代相对于相应的未经修饰的寡核苷酸的解链温度修饰寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步说明，在一些实施方案中，某些经修饰的核苷酸取代可减少非特异性核酸扩增(例如，最小化引物二聚体形成等)，增加预期的靶扩增子的产量等。这些类型的核酸修饰的实例描述于例如美国专利号6,001,611中。
术语“TAGS”或“温度辅助信号生成”(公开于美国专利公开号2018/0073064中)是一种多路复用技术，其能够通过在热循环期间采集不同温度下的荧光数据以测量每个荧光通道中的多个单独靶标。因此，使用两个或三个温度通道的TAGS多路复用可使每个光通道的可分辨靶标数量增加一倍或两倍。原则上，该技术可部署在任何能够在每个PCR循环中采集多个荧光读数的定量PCR(qPCR)仪器上。
术语“抗微生物药物”是指用于治疗微生物感染的药剂或药物，其通常通过杀灭微生物或通过抑制其生长来治疗。抗微生物药物可包括用于治疗细菌感染的抗生素、用于治疗真菌感染的抗真菌药、用于治疗原生动物感染的抗原虫药和用于治疗病毒感染的抗病毒剂。抗微生物药物以几种不同的方式分类(并且称为“抗微生物药物类别”)，并且包括按作用机制分类(例如，抑制细胞壁合成、抑制蛋白质或核酸合成、破坏细胞膜)、按来源分类(例如，来自天然来源或合成)以及按化学结构分类(例如，β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类等)。
抗微生物药物类别的实例包括但不限于：烯丙胺类、脒基青霉素类、氨基环醇类、氨基糖苷类、酰胺醇类、安沙霉素类、B-3-葡聚糖合酶抑制剂、碳青霉烯类、头孢菌素类、甘氨酰环素类(Glycylcyclines)、环状多肽类、糖肽类、咪唑类、林可酰胺类、脂肽类、大环内酯类和酮内酯类、单环β-内酰胺类、呋喃妥因类、硝基咪唑类、噁唑烷酮类、膦酸(Phosphonicacid)衍生物、截短侧耳素、多烯类、多粘菌素类、假单胞菌酸类、喹诺酮类、氯苯吩嗪类(Riminophenazines)、类固醇抗菌剂、链阳性菌素类、磺胺类、二氢叶酸还原酶抑制剂和组合、砜类、四环素类和三唑类。
抗微生物药物或药剂的实例包括但不限于：萘替芬、美西林、大观霉素、氯霉素、利福平、卡泊芬净、美罗培南、头孢曲松、头孢吡肟、头孢洛林、替加环素、杆菌肽、万古霉素、咪康唑、克林霉素、达托霉素、红霉素、泰利霉素、氨曲南、呋喃妥因、甲硝唑、利奈唑胺、氨苄青霉素、磷霉素、瑞他莫林、两性霉素-B、粘菌素、莫匹罗星、环丙沙星、氯法齐明、夫西地酸、奎奴普丁/达福普汀、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、氨苯砜、金霉素和氟康唑。
术语“最低抑菌浓度”或“MIC”是指抑制生物生长所需的抗微生物药物的最低浓度。在经典基于培养的测试中，在将细菌添加至含有生长培养基和不同浓度的抗微生物药物的孔中时确定MIC。在每个连续的孔中，抗微生物药物的浓度加倍，并且通过鉴定其中在孵育期后无可见生长的具有最低抗微生物药物浓度的孔来确定MIC。术语“折点”是指抗微生物药物的选定浓度，其定义一种细菌对抗微生物药物敏感还是耐药。如果MIC小于或等于敏感性折点，则认为细菌对抗微生物药物敏感。如果MIC大于该值，则认为细菌对抗微生物药物中介或耐药。
折点是现代微生物学实验室实践的组成部分，用于定义对抗微生物药物的敏感性和耐药性。根据试验方法不同，它们以浓度(以mg/L或μg/ml为单位)或区域直径(以mm为单位)来表示。一般来讲，所有敏感性试验方法都需要折点，也称为解释标准，以便可以将试验结果解释为敏感、中介或耐药，从而报告给各类临床医生。“临床折点”是指将治疗成功可能性高的菌株与治疗更可能失败的细菌分开的浓度(MIC)。在其最简单的形式中，这些折点源自前瞻性人类临床研究，这些研究对结果与感染病原体的MIC进行比较。
传染性病原体的检测和鉴定
本公开提供了检测传染性病原体(例如引起血流感染的细菌菌株)的方法。这些方法包括以下步骤：使用菌株特异性、种特异性、属特异性、科特异性或目特异性引物序列通过PCR来扩增靶基因的部分；以及使用菌株特异性、种特异性、属特异性、科特异性或目特异性探针核酸序列来检测扩增产物。靶基因选择是对公共序列数据库进行计算机搜索以及具有菌种(例如大肠杆菌(E.coli))或特定目(例如肠杆菌目)特异性并且与其他菌株和目区别开来的核酸序列进行文献搜索的结果。作为搜索的结果，确定了以下靶基因：
肠杆菌目：rplP、ompA、tuf、gyrB、rpoB
肠杆菌科：rplP、ompA、tuf、gyrB、rpoB
肠球菌属：tuf、rpoB、sodA、ddl、gyrB
假单胞菌属：gyrB、O-抗原乙酰基转移酶、rpoB、ecfX、tuf
不动杆菌属：ompA、tusA、rpoB、gyrB
嗜麦芽糖寡养单胞菌(Strenotrophomonas maltophilia)：fdnG、gyrB、tuf
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：CPE、gyrB、nuc、rpoB、tuf、ddlA
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)：altE、femA
凝固酶阴性葡萄球菌：rpoB、tuf、sodA
链球菌属：tuf、gyrB、sip、ddlA
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)：lytA、SP2020、piaB
奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)：UreR、UreC
白色念珠菌(Candida albicans)：ACT、RPB-1、5.8s核糖体RNA、18s核糖体RNA
为检测属于肠杆菌目或肠杆菌科的细菌，提供了用于扩增编码核糖体L16蛋白的rplP基因的引物和探针(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3，表I)。添加第二个探针(SEQ ID NO：4，表I)进一步扩展了包容性，将肠杆菌目中的其他常见的病原体纳入其中，诸如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)菌株。除了本文例举的那些核酸之外的核酸也可用于检测样品中的高特异性病原体分组靶基因。例如，本领域技术人员可使用常规方法来评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性功能变体可包括例如本文所公开的靶基因引物和探针中的一个或多个缺失、插入和/或取代。更具体地，寡核苷酸的实施方案例各自包括具有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4、其基本上相同的变体的序列的核酸，其中该变体与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：4中的一者或SEQ ID NO：1至SEQID NO：4和变体的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性。
表I：用于检测肠杆菌科或肠杆菌目的寡核苷酸
对属于肠杆菌目的细菌的检测还可包括用于扩增rplP基因(SEQ ID NO：5至SEQID NO：7，表II)的其他引物和探针，以及用于扩增编码DNA旋转酶亚基B蛋白的gyrB基因(SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：10，表III)的引物和探针和用于扩增编码DNA依赖性RNA聚合酶的rpoB基因(SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：16，表IV)的引物和探针。代表性功能变体可包括例如本文所公开的靶基因引物和探针中的一个或多个缺失、插入和/或取代。更具体地，寡核苷酸的实施方案例各自包括具有选自SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8至SEQID NO：10、SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：16、其基本上相同的变体的序列的核酸，其中该变体与SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：16中的一者或SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：16和变体的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性。
表II：用于检测肠杆菌目的寡核苷酸
表III：用于检测肠杆菌目的寡核苷酸
表IV：用于检测肠杆菌目的寡核苷酸
为检测属于鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)种的细菌，提供了用于扩增编码外膜蛋白A的ompA基因的引物和探针(见表V)。除了本文例举的那些核酸之外的核酸也可用于检测样品中的不动杆菌属特异性病原体分组靶基因。例如，本领域技术人员可使用常规方法来评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性功能变体可包括例如本文所公开的靶基因引物和探针中的一个或多个缺失、插入和/或取代。更具体地，寡核苷酸的实施方案例各自包括具有选自SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：29至SEQ ID NO：31、其基本上相同的变体的序列的核酸，其中该变体与SEQID NO：17至SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：29至SEQ ID NO：31中的一者或SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20至SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：29至SEQ ID NO：31和变体的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性。
表V：用于检测鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的寡核苷酸
对鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的检测还可包括用于扩增rpoB基因(SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：25，表VI)和用于扩增gyrB基因(SEQ ID NO：26至SEQ ID NO：28，表VII)的引物和探针。代表性功能变体可包括例如本文所公开的靶基因引物和探针中的一个或多个缺失、插入和/或取代。更具体地，寡核苷酸的实施方案例各自包括具有选自SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26至SEQ ID NO：28、其基本上相同的变体的序列的核酸，其中该变体与SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26至SEQ ID NO：28中的一者或SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26至SEQ ID NO：28和变体的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性。
表VI：用于检测鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的寡核苷酸
表VII：用于检测鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的寡核苷酸
为检测属于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pae)种的细菌，提供了用于扩增编码延伸因子的tuf基因(SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：34，表VIII)以及gyrB基因(SEQID NO：35至SEQ ID NO：37，表IX)和rpoB基因(SEQ ID NO：38至SEQ ID NO：40，表X)的引物和探针。除了本文例举的那些核酸之外的核酸也可用于检测样品中的假单胞菌属特异性病原体分组靶基因。例如，本领域技术人员可使用常规方法来评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性功能变体可包括例如本文所公开的靶基因引物和探针中的一个或多个缺失、插入和/或取代。更具体地，寡核苷酸的实施方案例各自包括具有选自SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35至SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38至SEQ ID NO：40、其基本上相同的变体的序列的核酸，其中该变体与SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35至SEQID NO：37、SEQ ID NO：38至SEQ ID NO：40中的一者或SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：34、SEQID NO：35至SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38至SEQ ID NO：40和变体的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性。
表VIII：用于检测铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的寡核苷酸
表IX：用于检测铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的寡核苷酸
表X：用于检测铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的寡核苷酸
为检测属于嗜麦芽糖寡养单胞菌(Strenotrophomonas maltophilia，S.maltophilia)种的细菌，提供了用于扩增fdnG基因(SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：43，表XI)、gyrB基因(SEQ ID NO：44至SEQ ID NO：46，表XII)和tuf基因(SEQ ID NO：47至SEQ IDNO：49，表XIII)的引物和探针。除了本文例举的那些核酸之外的核酸也可用于检测样品中的寡养单胞菌属特异性病原体分组靶基因。例如，本领域技术人员可使用常规方法来评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性功能变体可包括例如本文所公开的靶基因引物和探针中的一个或多个缺失、插入和/或取代。更具体地，寡核苷酸的实施方案例各自包括具有选自SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44至SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47至SEQ ID NO：49、其基本上相同的变体的序列的核酸，其中该变体与SEQ ID NO：41至SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：44至SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47至SEQ ID NO：49中的一者或SEQ IDNO：41至SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44至SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47至SEQ ID NO：49和变体的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性。
表XI：用于检测嗜麦芽糖寡养单胞菌(Strenotrophomonas maltophilia)的寡核苷酸
表XII：用于检测嗜麦芽糖寡养单胞菌(Strenotrophomonas maltophilia)的寡核苷酸
表XIII：用于检测嗜麦芽糖寡养单胞菌(Strenotrophomonas maltophilia)的寡核苷酸
为检测属于肠球菌(Enterococcus)属的细菌，提供了用于扩增tuf基因(SEQ IDNO：50至SEQ ID NO：52，表XIV)、rpoB基因(SEQ ID NO：53至SEQ ID NO：55，表XV)、编码xxxx的ddl基因(SEQ ID NO：56至SEQ ID NO：61，表XVI)以及gyrB基因(SEQ ID NO：62至SEQ IDNO：66，表XVII)的引物和探针。除了本文例举的那些核酸之外的核酸也可用于检测样品中的肠球菌属特异性病原体分组靶基因。例如，本领域技术人员可使用常规方法来评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性功能变体可包括例如本文所公开的靶基因引物和探针中的一个或多个缺失、插入和/或取代。更具体地，寡核苷酸的实施方案例各自包括具有选自SEQ IDNO：50至SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53至SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56至SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：66、其基本上相同的变体的序列的核酸，其中该变体与SEQ ID NO：50至SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53至SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56至SEQ IDNO：61、SEQ IDNO：62至SEQ ID NO：66中的一者或SEQ ID NO：50至SEQ ID NO：52、SEQ IDNO：53至SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56至SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：66和变体的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性。
表XIV：用于检测肠球菌(Enterococcus)属的寡核苷酸
表XV：用于检测肠球菌(Enterococcus)属的寡核苷酸
表XVI：用于检测肠球菌(Enterococcus)属的寡核苷酸
表XVII：用于检测肠球菌(Enterococcus)属的寡核苷酸
为检测属于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Saureus)种的细菌，提供了用于扩增编码参与荚膜形成的蛋白质的CPE基因(SEQ ID NO：67至SEQ ID NO：69、SEQ IDNO：72，表XVIII)以及gyrB基因(SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：75，表xIX)和ddlA基因(SEQ IDNO：76至SEQ ID NO：78，表XX)的引物和探针。为检测属于葡萄球菌(Staphylococcus)属的细菌，提供了用于扩增tuf基因的引物和探针(SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：81，表XXII)。除了本文例举的那些核酸之外的核酸也可用于检测样品中的葡萄球菌(Staphylococcus)属特异性病原体分组靶基因。例如，本领域技术人员可使用常规方法来评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性功能变体可包括例如本文所公开的靶基因引物和探针中的一个或多个缺失、插入和/或取代。更具体地，寡核苷酸的实施方案例各自包括具有选自SEQ IDNO：67至SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76至SEQID NO：78、SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：81、其基本上相同的变体的序列的核酸，其中该变体与SEQ ID NO：67至SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：75、SEQ IDNO：76至SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：81中的一者或SEQ ID NO：67至SEQ IDNO：69、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76至SEQ ID NO：78、SEQID NO：79至SEQ ID NO：81和变体的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性。
表XVIII：用于检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的寡核苷酸
表XIX：用于检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的寡核苷酸
表XX：用于检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的寡核苷酸
表XXI：用于检测葡萄球菌(Staphylococcus)属的寡核苷酸
为检测属于无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，S.agalactiae)种的细菌，提供了用于扩增gyrB基因(SEQ ID NO：121至SEQ ID NO：123，表XXII)、编码表面免疫原性蛋白的sip基因(SEQ ID NO：82至SEQ ID NO：84，表XXIII)、以及ddlA基因(SEQ ID NO：85至SEQ ID NO：87，表XXIV)的引物和探针。为检测属于链球菌(Streptococcus)属的细菌，提供了用于扩增tuf基因(SEQ ID NO：100至SEQ ID NO：102，表XXV)的引物和探针。除了本文例举的那些核酸之外的核酸也可用于检测样品中的链球菌属特异性病原体分组靶基因。例如，本领域技术人员可使用常规方法来评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性功能变体可包括例如本文所公开的靶基因引物和探针中的一个或多个缺失、插入和/或取代。更具体地，寡核苷酸的实施方案例各自包括具有选自SEQ ID NO：121至SEQ ID NO：123、SEQID NO：82至SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85至SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：100至SEQ ID NO：102、其基本上相同的变体的序列的核酸，其中该变体与SEQ ID NO：121至SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：82至SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85至SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：100至SEQ IDNO：102中的一者或SEQ ID NO：121至SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：82至SEQ ID NO：84、SEQID NO：85至SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：100至SEQ ID NO：102和变体的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性。
表XXII：用于检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的寡核苷酸
表XXIII：用于检测元乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的寡核苷酸
表XXIV：用于检测元乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的寡核苷酸
表XXV：用于检测链球菌(Streptococcus)属的寡核苷酸
用于检测常见的真菌病原体：白色念珠菌(Candida albicans)和耳念珠菌(Candida auris)，提供了用于扩增18s核糖体RNA(18s rRNA)基因(SEQ ID NO：88至SEQ IDNO：90，表XXVI)和5.8s核糖体RNA(5.8srRNA)基因(SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：93，表XXVII)的引物和探针。除了本文例举的那些核酸之外的核酸也可用于检测样品中的念珠菌属特异性病原体分组靶基因。例如，本领域技术人员可使用常规方法来评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性功能变体可包括例如本文所公开的靶基因引物和探针中的一个或多个缺失、插入和/或取代。更具体地，寡核苷酸的实施方案例各自包括具有选自SEQID NO：88至SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：93、其基本上相同的变体的序列的核酸，其中该变体与SEQ ID NO：88至SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：93中的一者或SEQ ID NO：88至SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：93和变体的互补序列具有至少例如80％、90％或95％的序列同一性。
表XXVI：用于检测念珠菌(Candida)的寡核苷酸
表XXVII：用于检测念珠菌(Candida)的寡核苷酸
为检测所有类型的细菌，提供了用于扩增16s核糖体RNA(16s rRNA)基因(SEQ IDNO：94至SEQ ID NO：96，表XXVIII)中的保守区域的引物和探针组合。
表XXVIII：用于检测一般细菌的寡核苷酸
在一个实施方案中，上述引物和探针组不仅用于检测和鉴定感染菌菌株，而且用于执行抗微生物药物敏感性试验(AST)测定。因此，本发明公开了用于执行定量实时PCR反应的方法和组合物，其中在单一测定设置下同时确定细菌的鉴定(ID)及其抗微生物药物敏感性(AST)试验。
可通过在所公开的方法中使用引物和/或探针来鉴定本文所公开的任何引物和/或探针的功能活性变体。本文所述的引物和/或探针的功能活性变体涉及与本文所述的引物和/或探针的相应序列相比在所描述的方法或试剂盒中提供相似或更高特异性和灵敏度的引物和/或探针。
变体可例如通过一个或多个核苷酸添加、缺失或取代(诸如在本文所述的引物和/或探针的相应序列的5′末端和/或3′末端的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代)，而与本文所述的引物和探针的序列的序列不同。如上所述，引物(和/或探针)可以是经化学修饰的，即引物和/或探针可包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针(或引物)则是经修饰的寡核苷酸。“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)与天然“核苷酸”的不同之处在于一些修饰，但仍由碱基或碱基样化合物、戊呋喃糖基糖或戊呋喃糖基糖样化合物、磷酸部分或磷酸样部分或它们的组合组成。例如，可将“标记”附接到“核苷酸”的碱基部分，由此获得“经修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可被例如7-脱氮嘌呤替换，由此也获得“经修饰的核苷酸”。术语“经修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。“经修饰的核苷”(或“核苷类似物”)与天然核苷的不同之处在于以如上文针对“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)概述的方式进行的一些修饰。
可使用例如计算机程序诸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，Colo.)来设计扩增编码靶基因中任一者的核酸分子的寡核苷酸，包括经修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物。当设计用作扩增引物的寡核苷酸时，重要特征包括但不限于适当大小的扩增产物以便于检测(例如，通过电泳)、一对引物的成员的相似解链温度以及每个引物的长度(即，引物需要足够长以与序列特异性退火并启动合成，但不能太长以至于在寡核苷酸合成过程中保真度降低)。通常，寡核苷酸引物的长度为8至50个核苷酸(例如，长度为8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48个或50个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸引物的长度为40个或更少的核苷酸。
除了一组引物之外，这些方法还可使用一个或多个探针以便检测靶基因的存在或不存在。术语“探针”是指合成或生物产生的核酸(DNA或RNA)，其通过设计或选择而包含特定核苷酸序列，允许它们在定义的预定严格性下特异性(即优先性地)杂交到“靶标核酸”，在本例中为靶基因核酸。“探针”可以称为“检测探针”，意思是它检测靶标核酸。
在一些实施方案中，所述靶基因探针可用至少一种荧光标记物进行标记。在一个实施方案中，靶基因探针可用供体荧光部分(例如荧光染料)和相应的受体部分(例如猝灭剂)标记。在一个实施例中，探针包括荧光部分或由其组成，并且核酸序列含有本文所公开的探针序列或由其组成。
设计用作探针的寡核苷酸可以以类似于设计引物的方式进行。实施例可以使用单个探针或一对探针来检测扩增产物。根据实施例，使用的探针可包含至少一种标记和/或至少一种淬灭剂部分。与引物一样，探针通常具有相似的解链温度，并且每个探针的长度必须足以发生序列特异性杂交，但不能太长以至于在合成过程中保真度降低。寡核苷酸探针的长度通常为15至40(例如，16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。
聚合酶链式反应(PCR)
美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规的PCR技术。PCR通常采用与所选核酸模板(例如DNA或RNA)结合的两种寡核苷酸引物。在一些实施方案中有用的引物包括能够作为所描述的靶基因核酸序列内核酸合成起始点的寡核苷酸。引物可以通过常规方法从限制性消化物中纯化，或它可以合成产生。为了扩增中的最大效率，引物优先为单链的，但引物可以是双链的。首先使双链引物变性(即对其进行处理)以分离链。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。
如果模板核酸是双链的，则必须在它可以用作PCR中的模板前分离两条链。链分离可以通过任何合适的变性方法完成，包括物理、化学或酶促方法。一种分离核酸链的方法涉及加热核酸直到其大部分变性(例如，大于50％、60％、70％、80％、90％或95％变性)。使模板核酸变性所需的加热条件将取决于例如缓冲盐浓度以及被变性的核酸的长度和核苷酸组成，但通常在约90℃至约105℃的范围内持续一段时间，这取决于反应的特征诸如温度和核酸长度。变性通常进行约30秒至4分钟(例如，1分钟至2分钟30秒，或1.5分钟)。
如果通过加热使双链模板核酸变性，则使反应混合物冷却至促进每个引物与所描述的靶基因核酸分子上的靶序列退火的温度。用于退火的温度通常为约35℃至约65℃(例如，约40℃至约60℃；约45℃至约50℃)。退火时间可为约10秒至约1分钟(例如，约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。然后将反应混合物调节至促进或优化聚合酶活性的温度，即足以从退火的引物发生延伸以生成与模板核酸互补的产物的温度。温度应足以从与核酸模板退火的每个引物合成延伸产物，但不应高到使延伸产物从其互补模板变性(例如，用于延伸的温度通常在约40℃至约80℃的范围内(例如，约50℃至约70℃；约60℃))。延伸时间可为约10秒至约5分钟(例如，约30秒至约4分钟；约1分钟至约3分钟；约1分钟30秒至约2分钟)。
PCR测定可以使用核酸，例如RNA或DNA(cDNA)。模板核酸不需要纯化；其可以是复杂混合物的一小部分，诸如人类细胞中包含的核酸。核酸分子可通过常规技术从生物样品中提取，诸如Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications(Persing等人(编)，1993，American Society for Microbiology，Washington D.C.)中所描述的那些技术。核酸可从许多来源获得，诸如质粒或天然来源，包括细菌、酵母、原生动物病毒、细胞器或高等生物，诸如植物或动物。
寡核苷酸引物与在诱导引物延伸的反应条件下的PCR试剂组合。例如，链延伸反应通常包括50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl2、0.001％(w/v)明胶、0.5-1.0μg原变性模板DNA、50pmol每种寡核苷酸引物、2.5U Taq聚合酶和10％DMSO。反应通常包含150至320μM dATP、dCTP、dTTP、dGTP中的每一种或者其一种或多种类似物。
新合成的链形成可用于后续反应步骤的双链分子。可根据需要重复多次链分离、退火和延伸的步骤，以产生所需数量的对应于靶核酸分子的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。优选地重复至少一次循环步骤(即变性、退火和延伸)。为了用于检测，循环步骤的次数将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多循环步骤以扩增足以检测的靶标序列。通常，循环步骤重复至少约20次，但可以重复多达40、60或甚至100次。
荧光共振能量转移(FRET)
FRET技术(参见例如美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)基于这样的概念：当供体荧光部分和相应的受体荧光部分位于彼此相距一定距离内时，两个荧光部分之间会发生能量转移，该能量转移可被可视化或以其他方式检测和/或定量。当供体被具有合适波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移至受体。受体通常以具有不同的波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。在某些系统中，非荧光能量可通过包括基本上非荧光供体部分的生物分子在供体与受体部分之间转移(参见例如美国专利号7,741,467)。
在一个示例中，寡核苷酸探针可含有供体荧光部分和相应的猝灭剂，该猝灭剂可以是或不是荧光的，并且以不同于光的形式耗散转移的能量。当探针完整时，能量转移通常发生在供体和受体部分之间，使得来自供体荧光部分的荧光发射被受体部分猝灭。在聚合酶链反应的延伸步骤期间，与扩增产物结合的探针被例如Taq聚合酶的5′至3′核酸酶活性裂解，使得供体荧光部分的荧光发射不再被猝灭。用于此目的的示例性探针在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785中描述。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗猝灭剂包括BlackHole QuenchersTM(BHQ)(Biosearch Technologies，Inc.，Novato，Cal.)、Iowa BlackTM(Integrated DNA Tech.，Inc.，Coralville，Iowa)、BlackBerryTM Quencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.，Dexter，Mich.)。
在另一个示例中，两个寡核苷酸探针(每个含有荧光部分)可在由寡核苷酸探针与靶核酸序列的互补性决定的特定位置与扩增产物杂交。在寡核苷酸探针在适当位置与扩增产物核酸杂交后，产生FRET信号。杂交温度可在约35℃至约65℃的范围内，持续约10秒至约1分钟。
荧光分析可以使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(包含适当的二向色镜和用于监测特定范围的荧光发射的滤光片)、光子计数光电倍增管系统或荧光计来进行。可利用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、光纤光源或其他经适当过滤以在所需范围内激发的高强度光源来进行激发以启动能量转移或允许直接检测荧光团。
如本文关于供体和相应的受体部分所用，“相应的”是指具有与供体荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱的受体荧光部分或黑暗猝灭剂。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长至少大100nm。因此，可以在它们之间产生有效的非辐射能量传递。
通常针对以下项选择荧光供体和相应的受体部分：(a)高效率的Forster能量转移；(b)较大的最终Stokes位移(＞100nm)；(c)尽可能将发射偏移到可见光谱的红色部分(＞600nm)；以及(d)将发射偏移到比在供体激发波长下激发所产生的Raman水荧光发射高的波长。例如，可选择以下供体荧光部分：其在激光线附近具有其激发最大值(例如，氦-镉442nm或氩488nm)，具有高消光系数、高量子产率，并且其荧光发射与相应的受体荧光部分的激发光谱良好重叠。可选择具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠以及在可见光谱的红色部分(＞600nm)中的发射的相应受体荧光部分。
可在FRET技术中与各种受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、荧光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、荧光黄VS、4-乙酰氨基-4′-异硫基-氰酸茋-2，2′--二磺酸、7-二乙氨基-3-(4′-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺1-芘丁酸酯和4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸茋-2，2′--二-磺酸衍生物。取决于所使用的供体荧光部分，代表性受体荧光部分包括LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺若丹明B磺酰氯、四甲基若丹明异硫氰酸盐、若丹明x异硫氰酸盐、赤藓红异硫氰酸盐、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸盐或镧系元素离子(例如铕或铽)的其他螯合物。供体和受体荧光部分可以从例如Molecular Probes(Junction City，Oreg.)或Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo.)获得。
供体和受体荧光部分可以通过连接基臂连接到合适的探针寡核苷酸上。每个连接基臂的长度很重要，因为连接基臂会影响供体和受体荧光部分之间的距离。连接基臂的长度是以埃
为单位的从核苷酸碱基到荧光部分的距离。通常，连接基臂为约
至约
连接基臂可以是WO 84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开用于将连接基臂连接至特定核苷酸碱基，以及用于将荧光部分连接至连接基臂的方法。
受体荧光部分(诸如LC Red 640)可与含有氨基接头的寡核苷酸(例如，可从ABI(Foster City，Calif.)或Glen Research(Sterling，VA)获得的C6-氨基亚磷酰胺)组合，以产生例如LC Red 640标记的寡核苷酸。经常使用的将供体荧光部分(诸如荧光素)偶联至寡核苷酸的连接基包括硫脲连接基(FITC-衍生的，例如来自Glen Research或ChemGene(Ashland，Mass.)的荧光素-CPG′s)、酰胺连接基(荧光素-NHS-酯衍生的，诸如来自BioGenex(San Ramon，Calif.)的CX-荧光素-CPG)、或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-NHS-酯的3′-氨基-CPGs。
如本文所述，可以使用利用FRET技术的标记杂交探针检测扩增产物。一种FRET形式利用
技术检测扩增产物的存在与否，从而检测靶基因的存在与否。
技术利用一种单链杂交探针，该探针用例如一种荧光染料和一种猝灭剂标记，该猝灭剂可以是或不是荧光的。当第一荧光部分用合适波长的光激发时，吸收的能量根据FRET原理转移至第二荧光部分或暗猝灭剂。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与靶DNA(即，扩增产物)结合并在随后的延伸阶段期间被例如Taq聚合酶的5′至3′核酸酶活性降解。因此，荧光部分和猝灭剂部分变得彼此空间上分离。因此，在不存在猝灭剂的情况下的第一荧光部分激发后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。举例来说，ABI
7700序列检测系统(Applied Biosystems)使用s
技术，并且适合于进行本文所述的用于检测样品中靶基因的存在或不存在的方法。
也可以使用与FRET缀合的分子信标来检测使用实时PCR方法的扩增产物的存在。分子信标技术使用被第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分通常是猝灭剂，且荧光标记一般位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许形成二级结构(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为在探针内的二级结构形成的结果，当探针在溶液中时，两个荧光部分空间接近。在与靶标核酸(即扩增产物)杂交以后，探针的二级结构被破坏，并且荧光部分变得彼此分离，从而使得在用合适波长的光激发后，可以检测第一荧光部分的发射。
FRET技术的另一种常见形式是使用两个杂交探针。每个探针都可以用不同的荧光部分标记，并且通常设计为在靶标DNA分子(例如，扩增产物)中彼此非常接近地杂交。供体荧光部分，例如荧光素，在470nm处被
仪器的光源激发。在FRET期间，荧光素将其能量转移到受体荧光部分，诸如
-Red 640(LC Red 640)或
-Red 705(LC Red 705)。然后受体荧光部分发出更长波长的光，由
仪器的光学检测系统检测。只有当荧光部分直接局部接近，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的FRET才发生。发射信号的强度可与原始靶DNA分子的数量(例如，目标菌株/科基因组的数目)相关。如果靶核酸发生扩增并产生扩增产物，则杂交步骤产生基于探针对成员之间的FRET的可检测信号。
通常，FRET的存在表示样品中存在靶基因，FRET的不存在则表示样品中不存在靶基因。然而，样本采集不足、运输延迟、运输条件不当或使用某些采集拭子(海藻酸钙或铝轴)都是会影响测试结果的成功和/或准确性的条件。使用本文所公开的方法，在例如45个循环步骤内检测到FRET指示存在感兴趣的目标菌株/科。
可用于实践所述方法的代表性生物样品包括但不限于呼吸道标本、粪便标本、血液标本、皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤和软组织感染物。生物学样品的收集和储存方法是本领域技术人员已知的。可对生物学样品进行处理(例如，通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒)以释放靶核酸，或者在一些情况下，可使生物学样品直接与PCR反应组分和合适的寡核苷酸接触。
解链曲线分析是可包含在循环曲线中的附加步骤。解链曲线分析基于DNA在称为解链温度(Tm)的特征温度下解链的事实，该解链温度被定义为一半DNA双链体分离成单链时的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此，富含G和C核苷酸的DNA分子具有丰富的A和T核苷酸的DNA分子具有更高的Tm。通过检测信号丢失的温度，可以确定探针的解链温度。类似地，通过检测产生信号的温度，可以确定探针的退火温度。来自扩增产物的探针的解链温度可证实样品中存在或不存在感兴趣的目标菌株/科。
在每个热循环仪运行中，也可以循环控制样品。阳性对照样品可以使用例如对照引物和对照探针扩增靶标核酸对照模板(不同于所述靶标基因的扩增产物)。阳性对照样品也可以扩增，例如，含有靶核酸分子的质粒构建体。这种质粒对照可在内部扩增(例如，在样品内)或在与患者样品并行的单独样品运行中使用与用于检测预期靶标相同的引物和探针扩增。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功或失败的指标。每个热循环仪运行还可以包括一个阴性对照，例如，缺少靶标模板DNA。阴性对照可以测量污染。这确保系统和试剂不会产生假阳性信号。因此，对照反应可以很容易地确定，例如，引物以序列特异性退火和启动延伸的能力，以及探针以序列特异性杂交和发生FRET的能力。
在一个实施例中，该方法包括避免污染的步骤。例如，在美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法，以减少或消除一个热循环仪运行与下一个之间的污染。
可以使用结合FRET技术的常规PCR方法来实践这些方法。在一个实施方案中，使用
仪器。以下专利申请描述了如
技术中使用的实时PCR：WO97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。
作为FRET的替代，使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料(例如，
Green或
(Molecular Probes))，可以检测扩增产物。在与双链核酸相互作用时，这样的荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。还可以使用双链DNA结合染料(诸如核酸)嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常执行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。
应当理解，本公开的实施例不受一种或多种市售仪器的配置的限制。
用于表型抗微生物药物敏感性试验(AST)的实时PCR
尽管定量实时PCR(qPCR或qRT-PCR)能够以高特异性和灵敏度鉴定和量化样品中的细菌，但其在抗微生物药物存在下使用细菌生长执行基于表型的AST中的可靠性尚未得到一致的证明。本发明利用源自PCR生长曲线的数学关系来确定所检测的细菌菌株对给定的抗微生物药物敏感、中介还是耐药(SIR)。使用PCR的表型AST测试背后的原理如图1所示。在不存在抗微生物药物的情况下(显示为“参比”)，细菌发生持续的基因组DNA复制。在存在抗微生物药物的情况下，耐药细菌将以与参比相似的基因组拷贝数进行复制，而敏感细菌将受到复制抑制，导致拷贝数减少。这种生长差异提供了可通过qPCR确定的表型读数。
由假定qPCR实验得到的原始数据，在该实验中，将耐药或敏感细菌菌株与各种浓度的抗微生物药物一起孵育4小时，如图2所示。在图2A中，原始qPCR数据显示为生长曲线，其中在每个PCR循环中测量荧光(例如，来自
探针)。对于耐药分离菌，生长曲线看起来相似，与在不同的抗微生物药物浓度下孵育4小时无关；而在敏感分离菌中，荧光强度呈剂量依赖性降低，并且信号超过背景(阈值)水平所需的循环次数(其通常称为循环阈值或Ct值)增加。在图2B中，基于Ct值表示相同的qPCR数据，其中耐药分离菌的Ct值随抗微生物药物浓度的变化很小或没有变化，而敏感分离菌的Ct值呈剂量依赖性增加(表现为检测到较少数量的复制细菌)。
可使用qPCR数据，通过探索图3所示的各种数学关系来确定菌株对给定的抗微生物药物敏感、中介还是耐药。图3A描述了数学关系，诸如“斜率”、“Ct”、“拐点”、“绝对荧光强度(AFI)”和“端点相对强度(ERI)”描述了原始qPCR扩增曲线的行为。如图3B所示，这些特征可通过将存在抗微生物药物时获得的数值与不存在抗微生物药物时获得的数值联系起来，作为抗微生物药物暴露量的函数进行进一步评估。然后可使用这些特征的相对变化，诸如ΔCt或ΔAFI，来确定给定药物的菌株MIC，从而允许利用核准的折点确定菌株耐药性和敏感性。
根据计算的数学特征的差异，使用简化的划分模型(诸如图4中所示)将细菌分离物分类为耐药或敏感。划分利用基尼系数来确定使两个类别的分散最大化的特征和阈值。仅利用两次分割以防止过度拟合，并允许进行二维图形表示以便于可视化。
实例
提供以下实施例、表和附图以帮助理解主题，该主题的真实范围在所附权利要求中阐述。应当理解的是，在不脱离本发明精神的前提下，可以对阐明的程序进行修改。
实例1 PCR条件
使用
6800/8800系统平台(Roche Molecular Systems，Inc.，Pleasanton，CA)进行靶基因的实时PCR检测。扩增试剂的最终浓度如下所示：
表XXIX：PCR扩增试剂
下表示出了用于PCR扩增反应的典型温度曲线：
表XXX：PCR温度曲线
Pre-PCR程序包括初始变性以及在55℃、60℃和65℃下温育，以对RNA模板进行逆转录。在三种温度下温育同时具有以下有利效果：在较低温度下，轻微错配的靶序列(诸如生物体的遗传变体)也被转录，而在较高温度下，RNA二级结构的形成受到抑制，从而使转录更有效。将PCR循环分成两次测量，其中两次测量应用一步设置(结合退火和延伸)。55℃下的前5个循环允许通过预扩增轻微错配的靶序列来增加包容性，而第二次测量的45个循环通过使用58℃的退火/延伸温度提供了增加的特异性。
实例2使用用于检测肠杆菌目的引物/探针的PCR
使用实例1中所述的PCR条件，使用靶向rplP基因的正向引物RM_ENTF(SEQ ID NO：1)、反向引物RM_ENTRP(SEQ ID NO：2)以及两种探针RM_ETP02(SEQ ID NO：3)和RM_ETP02B(SEQ ID NO：4)对以下细菌菌株进行PCR测定：肠杆菌目中的五种细菌菌株：大肠杆菌(E.Coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)；以及来自非肠杆菌目的两种细菌菌株：铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和鲍氏不动杆菌(A.baumannii)。对于所有菌株(之前储存于甘油中的过夜培养物)的培养液，使用的起始材料的浓度在1e8 CFU/ml与5e8 CFU/ml之间的范围内，其中使用DNA(约1e7拷贝/μl)的粘质沙雷氏菌(S.marcescens)除外。未对培养液进行样品制备。本实验的结果表明，仅观察到肠杆菌目科的五种菌株的生长曲线，而未观察到两种非肠杆菌菌株的生长曲线，从而证明这种用于检测肠杆菌目的引物和探针的特定组合具有良好的包容性和排他性。执行类似的实验，测试铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)特异性引物和探针(SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：8)以及鲍氏不动杆菌(A.baumannii)特异性引物和探针(SEQID NO：9至SEQ ID NO：11)，它们也表现出良好的特异性和排他性(数据未显示)。
使用靶向gyrB基因的正向引物SEGP1899(SEQ ID NO：8)、反向引物SEGP1901(SEQID NO：9)和探针SEGP2016(SEQ ID NO：10)对常见的革兰氏阴性病原体进行PCR测定：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii)。还测试了革兰氏阳性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。除0ng/μL的无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2ng/μL至10ng/μL。如图5所示，仅观察到构成肠杆菌目的菌种(包括大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)和奇异变形杆菌(P.mirabilis))的生长曲线。未观察到非目标生物(嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii))发生有意义的扩增，从而证明这种用于检测肠杆菌目的引物和探针的特定组合具有良好的包容性和排他性特征。
对设计用于靶向肠杆菌目中的rplP基因的其他引物和探针组合执行PCR测定。使用靶向rplP基因的正向引物SEGP2891(SEQ ID NO：5)、反向引物SEGP2892(SEQ ID NO：6)和探针SEGP2893(SEQ ID NO：7)对常见的革兰氏阴性病原体进行PCR测定：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii)。还测试了革兰氏阳性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。除0ng/μL的无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2ng/μL至10ng/μL。如图6所示，仅观察到构成肠杆菌目的菌种(包括大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)和奇异变形杆菌(P.mirabilis))的生长曲线。未观察到非目标生物(嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii))发生有意义的扩增，从而证明这种用于检测肠杆菌目的引物和探针的特定组合具有良好的包容性和排他性特征。
在将靶向rpoB基因的正向引物SEGP2799(SEQ ID NO：11)、反向引物SEGP2800(SEQID NO：12)、SEGP2802(SEQ ID NO：13)和SEGP2821(SEQ ID NO：14)与探针SEGP2804(SEQ IDNO：15)和SEGP2822(SEQ IDNO：16)联合使用的PCR测定中，获得了类似的结果。如图7所示，仅观察到构成肠杆菌目的菌种(包括大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)和奇异变形杆菌(P.mirabilis))的生长曲线。未观察到非目标生物(嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii))发生有意义的扩增，从而证明这种用于检测肠杆菌目的引物和探针的特定组合具有良好的包容性和排他性特征。
实例3使用用于检测不动杆菌(Acinetobacter)属的引物/探针的PCR
使用靶向ompA基因的正向引物SEGP2603(SEQ ID NO：20)、反向引物SEGP2606(SEQID NO：21)和探针SEGP2769(SEQ ID NO：22)对常见的革兰氏阴性病原体进行PCR测定：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii)。还测试了革兰氏阳性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。除0ng/μL的无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2ng/μL至10ng/μL。如图8所示，仅观察到不动杆菌(Acinetobacter)属内的常见病原体(鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii))的生长曲线。未观察到非目标生物(大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(Kaerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))投生有意义的扩增，从而证明这种用于检测不动杆菌(Acinetobacter)的引物和探针的特定组合具有良好的包容性和排他性。
在使用靶向rpoB基因的正向引物SEGP2590(SEQ ID NO：23)、反向引物SEGP2593(SEQ ID NO：24)和探针SEGP2594(SEQ ID NO：25)的PCR测定(如图9所示)中，以及在使用靶向gyrB基因的正向引物SEGP2626(SEQ ID NO：26)、反向引物SEGP2628(SEQ ID NO：27)和探针SEGP2629(SEQ ID NO：28)的PCR测定中(如图10所示)，获得了类似的结果。这些实验证明用于检测不动杆菌(Acinetobacter)的引物和探针的两种组合具有良好的包容性和排他性特征。
实例4使用用于检测铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的引物/探针的PCR
使用靶向tuf基因的正向引物SEGP2341(SEQ ID NO：32)、反向引物SEGP2342(SEQID NO：33)和探针SEGP2343(SEQ ID NO：34)对常见的革兰氏阴性病原体进行PCR测定：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii)。还测试了革兰氏阳性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。除0ng/μL的无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2ng/μL至10ng/μL。如图11所示，仅观察到假单胞菌(Pseudomonas)属内的病原体(铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))的生长曲线。未观察到非目标生物(大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii))发生有意义的扩增，从而证明这种用于检测铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的引物和探针的特定组合具有良好的包容性和排他性。
在使用靶向gyrB基因的正向引物SEGP2630(SEQ ID NO：35)、反向引物SEGP2631(SEQ ID NO：36)和探针SEGP2632(SEQ ID NO：37)的PCR测定(如图12所示)中，以及在使用靶向rpoB基因的正向引物SEGP2634(SEQ ID NO：38)、反向引物SEGP2637(SEQ ID NO：39)和探针SEGP2640(SEQ ID NO：40)的PCR测定中(如图13所示)，获得了类似的结果。这些实验证明用于检测铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的引物和探针的两种组合具有良好的包容性和排他性特征。
实例5使用用于检测嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas
maltophilia)的引
物/探针的PCR
使用靶向fdnG基因的正向引物SEGP2532(SEQ ID NO：41)、反向引物SEGP2538(SEQID NO：42)和探针SEGP2544(SEQ ID NO：43)对常见的革兰氏阴性病原体进行PCR测定：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aerugmosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii)。还测试了革兰氏阳性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。除0ng/μL的无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2ng/μL至10ng/μL。如图14所示，仅观察到嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia，S.maltophilia)的生长曲线。未观察到非目标生物(大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii))发生有意义的扩蹭，从而证明这种用于检测嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)的引物和探针的特定组合具有良好的包容性和排他性。
在使用靶向gyrB基因的正向引物SEGP2578(SEQ ID NO：44)、反向引物SEGP2579(SEQ ID NO：45)和探针SEGP2580(SEQ ID NO：46)的PCR测定(如图15所示)中，以及在使用靶向tuf基因的正向引物SEGP2572(SEQ ID NO：47)、反向引物SEGP2573(SEQ ID NO：48)和探针SEGP2574(SEQ ID NO：49)的PCR测定中(如图16所示)，获得了类似的结果。这些实验证明用于检测嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)的引物和探针的两种组合具有良好的包容性和排他性特征。
实例6使用用于检测肠球菌(Enterococcus)属的引物/探针的PCR
使用靶向rpoB基因的正向引物SEGP2522(SEQ ID NO：53)、反向引物SEGP2525(SEQID NO：54)和探针SEGP2770(SEQ ID NO：55)对常见的革兰氏阳性病原体进行PCR测定：无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。还测试了革兰氏阴性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。除0ng/μL的无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2ng/μL至10ng/μL。如图17所示，仅观察到肠球菌(Enterococcus)属内的病原体(屎肠球菌(E.faecium)和粪肠球菌(E.faecalis))的生长曲线。未观察到非目标生物(无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis))发生有意义的扩增，从而证明这种用于检测肠球菌(Enterococcus)的引物和探针的特定组合具有良好的包容性和排他性特征。
在使用靶向ddl基因的正向引物SEGP1624(SEQ ID NO：56)和SEGP1627(SEQ IDNO：57)、反向引物SEGP1625(SEQ ID NO：58)和SEGP1628(SEQ ID NO：59)以及探针SEGP1626(SEQ ID NO：60)和SEGP1629(SEQ ID NO：61)的PCR测定中，获得了类似的结果(如图18所示)。在使用靶向gyrB基因的正向引物SEGP2882(SEQ ID NO：62)和SEGP2884(SEQ ID NO：63)、反向引物SEGP2885(SEQ ID NO：64)和SEGP2886(SEQ ID NO：65)和探针SEGP2888(SEQID NO：66)的PCR测定中，也观察到良好的特异性(如图19所示)。这些实验证明用于检测肠球菌(Enterococcus)的引物和探针的两种组合具有良好的包容性和排他性特征。
实例7使用用于检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的引物/探针的
PCR
使用靶向CPE基因的正向引物SEGP1490(SEQ ID NO：67)、反向引物SEGP1491(SEQID NO：68)和探针SEGP1492(SEQ ID NO：72)对常见的革兰氏阳性病原体进行PCR测定：无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。还测试了革兰氏阴性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。除0ng/μL的无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2ng/μL至10ng/μL。如图20所示，仅观察到金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)种内的病原体的有意义的生长曲线。未观察到非目标生物(无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis))发生有意义的扩增，从而证明这种用于检测金黄色葡萄球菌(S.aureus)的引物和探针的特定组合具有良好的包容性和排他性特征。
在使用靶向gyrB基因的正向引物SEGP2792(SEQ ID NO：73)、反向引物SEGP2793(SEQ ID NO：74)和探针SEGP2794(SEQ ID NO：75)的PCR测定(如图21所示)中，以及在使用靶向ddlA基因的正向引物SEGP2932(SEQ ID NO：76)、反向引物SEGP2933(SEQ ID NO：77)和探针SEGP2935(SEQ ID NO：78)的PCR测定中(如图22所示)，获得了类似的结果。这些实验证明用于检测金黄色葡萄球菌(S.aureus)的引物和探针的两种组合具有良好的包容性和排他性特征。
实例8使用用于检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的引物/探针的PCR
使用靶向gyrB基因的正向引物SEGP2921(SEQ ID NO：121)、反向引物SEGP2922(SEQ ID NO：122)和探针SEGP2923(SEQ ID NO：123)对常见的革兰氏阳性病原体进行PCR测定：无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。还测试了革兰氏阴性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。除0ng/μL的无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2ng/μL至10ng/μL。如图23所示，仅观察到无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)种内的病原体的有意义的生长曲线。未观察到非目标生物(肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis))发生有意义的扩增，从而证明这种用于检测无乳链球菌(S.agalactiae)的引物和探针的特定组合具有良好的包容性和排他性特征。
在使用靶向sip基因的正向引物SEGP2204(SEQ ID NO：82)、反向引物SEGP2205(SEQ ID NO：83)和探针SEGP2206(SEQ ID NO：84)的PCR测定(如图24所示)中，以及在使用靶向ddlA基因的正向引物SEGP2947(SEQ ID NO：85)、反向引物SEGP2949(SEQ ID NO：86)和探针SEGP2951(SEQ ID NO：87)的PCR测定中(如图25所示)，获得了类似的结果。这些实验证明用于检测无乳链球菌(S.agalactiae)的引物和探针的两种组合具有良好的包容性和排他性特征。
实例9使用用于检测念珠菌(Candida)属的引物/探针的PCR
使用靶向RDNl8(18s rRNA)的正向引物SEGP1712(SEQ ID NO：88)、反向引物SEGP1713(SEQ ID NO：89)和探针SEGP1716(SEQ ID NO：90)对常见的真菌病原体进行PCR测定：白色念珠菌(Candida albicans)和耳念珠菌(Candida auris)。还测试了革兰氏阴性和阳性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。除0ng/μL的无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2ng/μL至10ng/μL。如图26所示，仅观察到念珠菌(Candida)属内的病原体的有意义的扩增曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增，从而证明这种用于检测念珠菌(Candida)的引物和探针的特定组合具有良好的包容性和排他性特征。
使用靶向RDN58(5.8s rRNA)基因的正向引物SEGP1718(SEQ ID NO：91)、反向引物SEGP1719(SEQ ID NO：92)和探针SEGP1722.1(SEQ ID NO：93)对白色念珠菌(C.albicans)和耳念珠菌(C.auris)进行PCR测定。还测试了革兰氏阴性和阳性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。除0ng/μL的无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2ng/μL至10ng/μL。如图27所示，仅观察到念珠菌(Candida)属内的病原体的有意义的扩增曲线。未观察到非目标生物发生有意义的扩增，从而证明这种用于检测念珠菌(Candida)的引物和探针的特定组合具有良好的包容性和排他性特征。
实例10用于检测常见的革兰氏阴性和革兰氏阳性病原体的PCR
使用靶向16s基因的正向引物SEGP1830(SEQ ID NO：94)、反向引物SEGP1831(SEQID NO：95)和探针SEGP1895.1(SEQ ID NO：96)对常见的革兰氏阴性病原体进行PCR测定：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii)。除0ng/μL的无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2ng/μL至10ng/μL。如图28所示，观察所有革兰氏阴性病原体的扩增曲线，从而证明这种引物和探针的特定组合可用于检测常见的革兰氏阴性病原体。
还使用靶向16s基因的同一引物和探针组合，对相同浓度下的常见革兰氏阳性病原体进行了测试：无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。如图29所示，观察所有革兰氏阳性病原体的扩增曲线，从而证明这种引物和探针的特定组合可用于检测常见的革兰氏阳性病原体。
实例11
AST结果的解释
一般来讲，解释抗微生物药物敏感性试验(AST)结果的两个最常用的指南是由以下机构提供的指南：1)美国临床和实验室标准协会(CLSI)，和2)欧洲抗微生物药物敏感性试验委员会(EUCAST)。美国使用CLSI指南，而欧洲国家则使用EUCAST指南。CLSI的当前版本是M100 ED30，“抗微生物药物敏感性试验性能标准(Performance Standards forAntimicrobial Susceptibility Testing)，第30版”，可通过以下URL获取：clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100。EUCAST的当前版本是第10版，“欧洲抗微生物药物敏感性试验委员会。用于解释MIC和区域直径的折点表(The EuropeanCommittee on Antimicrobial Susceptibility Testing.Breakpoint tables forinterpretation of MICs and zone diameters)。版本10.0，2020”，可通过以下URL获取：www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_10.0_Breakpoint_Tables.pdf。
在图30-1和30-2中，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)文件M100 ED 30确定的许多革兰氏阴性细菌生物(肠杆菌目、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、不动杆菌(Acinetobacter)属和嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia))的既定最低抑菌浓度(MIC)折点表示为μg/mL。折点用于解释抗微生物药物敏感性试验的MIC结果，并且将生物的“分组”分类为对给定抗微生物药物敏感、中介或耐药。生物的分组可处于不同的水平，包括但不限于种、属、目或特定的生化特性。
在图31中，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)文件M100 ED 30确定的许多革兰氏阳性细菌生物(金黄色葡萄球菌(S.aureus)和路邓葡萄球菌(S.lugdunensis)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肠球菌(Enterococcus)属、肺炎链球菌(S.pneumonia)、β-溶血性链球菌、草绿色链球菌)的既定最低抑菌浓度(MIC)折点表示为μg/mL。折点用于解释抗微生物药物敏感性试验的MIC结果，并且将生物的“分组”分类为对给定抗微生物药物敏感、中介或耐药。生物的分组可处于不同的水平，包括但不限于种、属、目或特定的生化特性。
在图32中，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)文件M60 ED 1确定的真菌生物(白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、克柔念珠菌(Candidakrusei)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、耳念珠菌(Candida auris))的既定最低抑菌浓度(MIC)折点表示为μg/mL。折点用于解释抗真菌药敏感性试验(AFST)的MIC结果，并将生物的“分组”分类为对给定抗真菌药敏感、中介或耐药。生物的分组可处于不同的水平，包括但不限于种、属、目或特定的生化特性。应当指出，虽然建议对耳念珠菌(Candida auris)进行AFST，但CLSI或CDC目前均未确定该菌种的折点；相反，AFST来自密切相关的念珠菌(Candida)属，并且利用专家意见来确定耳道假丝酵母(C.auris)分离物对给定抗真菌药的敏感性。
实例12 PCR ID/AST测定方案
方法和材料：
a.提前制备抗微生物药物(Abx)板，并且储存于-80℃下备用
i.稀释剂-阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(CAMHB)
ii.最终体积-50μl/孔
iii.从-80℃下取出并且在使用前于室温下解冻30分钟
表XXXI：抗微生物药物(Abx)板布局
抗生素(Abx)板布局
b.在CAMHB中培养过夜-37℃/16至18小时/500rpm
i.将10μl甘油原液+490μl CAMHB加入2mL 96孔深孔板中
c.根据光密度(OD)将培养物归一化至1.00E+06CFU/mL
d.通过将50μl归一化测试分离物加入Abx板的适当的孔中来制备测试板，如下表中所述
表XXXII Abx板上的测试分离物布局
抗生素(Abx)板上的测试分离物布局
e.在37℃/4小时/不振摇的条件下孵育测试板
f.根据表IV制备PCR试剂
g.将45μl预混液加入PCR测定板的各个孔中
h.孵育后，将5μl/孔的测试板印到PCR测定板上
i.最终体积-50μl/孔
i.对于测试板，在37℃/12至16小时/不振摇的条件下继续孵育，以确定参考方法最低抑菌浓度(MIC)
j.将PCR测定板装载到
z 480仪器上，并且在表IV的条件下运行。
k.孵育后，读取测试板的MIC并且确定表型敏感/中介/耐药的解释。
实例13肠杆菌目的实时PCR ID和AST测定
利用三种不同的靶基因gyrB、rplP和rpoB以及三类抗微生物药物环丙沙星(氟喹诺酮类)、庆大霉素(氨基糖苷类)和美罗培南(碳青霉烯类)对肠杆菌目(Enterobacterales)进行快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验。使用的引物/探针组如下。对于gyrB，使用SEQ ID NO：8(正向引物)、SEQ ID NO：9(反向引物)、SEQ ID NO：10(探针)；对于rplP，SEQ ID NO：5(正向引物)、SEQ ID NO：6(反向引物)、SEQ ID NO：7(探针)；对于rpoB，使用SEQ ID NO：11(正向引物)、SEQ ID NO：12至SEQ ID NO：14(反向引物)、SEQ IDNO：15至SEQ ID NO：16(探针)。根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)文件M100 ED 30对肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)菌株0143(抗微生物药物耐药菌株)和16565(抗微生物药物敏感菌株)的抗微生物药物敏感性进行解释，以分别确定它们对给定抗微生物药物的耐药性和敏感性。将每种菌株以5e5 CFU/mL接种到包含各种浓度的所示抗微生物药物的孔中，并且在孵育4小时后经受使用实例12的方案的基于PCR的快速ID/AST试验。
结果如图33所示。Y轴上显示为“倍数变化Abx水平1”的百分比是使用计算式2^-(Abx_Level_1_Ct-Reference_Ct)或2^-(ΔCt)确定的。Abx水平指示与所用的实际浓度无关，而是所指称的2倍稀释度是指其中Abx水平1为最低浓度并且每个水平升高为高2倍的浓度(见表XXXI)。举例说明如何计算倍数变化，如果Reference_Ct值(即未添加抗微生物药物的Ct值)为20并且Abx_Level_1_Ct值为22，则倍数变化＝2^-(22-20)＝2^-2＝1/2×1/2＝25％。基于这些计算，对具有较低ΔCt值的抗微生物药物耐药的菌株将具有比对具有较高ΔCt值的抗微生物药物敏感的菌株更高的“倍数变化”值，并且在图33中，Abx水平1能够使耐药菌株Kpn 0143与敏感菌株Kpn 16565之间产生最佳分离。这些数据进一步表明，在确定对环丙沙星、庆大霉素和美罗培南的敏感性或耐药性时，可利用所有三种基因靶标(gyrB，rplB，rpoB)获得两种Kpn菌株的正确的敏感性结果。但是，在某些情况下，任何给定的靶基因在确定对给定抗微生物药物的敏感性或耐药性方面都可能表现得更好或更差。总之，这些结果表明，可利用不同的靶基因和等位基因对肠杆菌目(Enterobacterales)进行快速的基于PCR的ID/AST，只要引物和探针可表现出正确的肠杆菌目(Enterobacterales)的包容性和排他性标准即可，如实例2、图5至7中所示。
实例14铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的实时PCR ID和AST测定
利用三种不同的靶基因tuf、gyrB、rpoB和三类抗微生物药物环丙沙星、庆大霉素和美罗培南对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)进行快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验。使用的引物/探针组如下。对于tuf，使用SEQ ID NO：32(正向引物)、SEQ IDNO：33(反向引物)、SEQ IDNO：34(探针)；对于gyrB，使用SEQ ID NO：35(正向引物)、SEQ IDNO：36(反向引物)、SEQ ID NO：37(探针)；对于rpoB，使用SEQ ID NO：38(正向引物)、SEQ IDNO：39(反向引物)、SEQ ID NO：40(探针)。根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)文件M100ED 30对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株16657(耐药菌株)和17816(敏感菌株)的抗微生物药物敏感性进行解释，以分别确定它们对给定抗微生物药物的耐药性和敏感性。将每种菌株以5e5 CFU/mL接种到包含各种浓度的所示抗微生物药物的孔中，并且在孵育4小时后经受使用实例12的方案的基于PCR的快速ID/AST试验。结果如图34所示，表明可利用所有三种基因靶标获得两种铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的正确的敏感性结果，尽管某些靶等位基因似乎对某些抗微生物药物表现得更好。总之，这些结果表明可利用不同的靶基因和等位基因进行快速的基于PCR的ID/AST，只要它们为铜绿假单胞菌(P.aerugmosa)提供正确的包容性和排他性标准即可(见图11至13)。
实例15鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii)的实时PCR ID和AST测定
利用三种不同的靶基因ompA、rpoB、gyrB和三类抗微生物药物环丙沙星、庆大霉素和美罗培南对鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii)进行快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验。使用的引物/探针组如下。对于ompA，使用SEQ ID NO：20(正向引物)、SEQ IDNO：21(反向引物)、SEQ ID NO：22(探针)；对于rpoB，使用SEQ ID NO：23(正向引物)、SEQ IDNO：24(反向引物)、SEQ ID NO：25(探针)；对于gyrB，使用SEQ ID NO：26(正向引物)、SEQ IDNO：27(反向引物)、SEQ ID NO：28(探针)。根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)文件M100ED 30对鲍氏不动杆菌(A.baumannii)菌株17694(耐药菌株)和16421(敏感菌株)的抗微生物药物敏感性进行解释，以分别确定它们对给定抗微生物药物的耐药性和敏感性。将每种菌株以5e5 CFU/mL接种到包含各种浓度的所示抗微生物药物的孔中，并且在孵育4小时后经受使用实例12的方案的基于PCR的快速ID/AST试验。结果如图35所示，表明可利用所有三种基因靶标获得两种Abi菌株的正确的敏感性结果，尽管某些靶等位基因似乎对某些抗微生物药物表现得更好。总之，这些结果表明可利用不同的靶基因和等位基因进行快速的基于PCR的ID/AST，只要它们为鲍氏不动杆菌(A.baumannii)提供正确的包容性和排他性标准即可(见图8至10)。
实例16金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的实时PCR ID和AST测定
利用三种不同的靶基因(gyrB，ddlA，tuf)和一类抗菌剂头孢西丁(头孢菌素)对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)进行快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验。使用的引物/探针组如下。对于gyrB，使用SEQ ID NO：73(正向引物)、SEQ ID NO：74(反向引物)、SEQ ID NO：75(探针)；对于ddlA，使用SEQ ID NO：76(正向引物)、SEQ ID NO：77(反向引物)、SEQ ID NO：78(探针)；对于tuf，使用SEQ ID NO：79(正向引物)、SEQ ID NO：80(反向引物)、SEQ ID NO：81(探针)。根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)文件M100 ED 30对金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌株15509(耐药菌株)和16405(敏感菌株)的抗微生物药物敏感性进行解释，以分别确定它们对给定抗微生物药物的耐药性和敏感性。将每种菌株以5e5CFU/mL接种到包含各种浓度的所示抗微生物药物的孔中，并且在孵育4小时后经受使用实例12的方案的基于PCR的快速ID/AST试验。结果如图36所示，表明可利用所有三种基因靶标获得两种金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌株的正确的敏感性结果，尽管某些靶等位基因似乎表现得更好。总之，这些结果表明可利用不同的靶基因和等位基因进行快速的基于PCR的ID/AST，只要它们为金黄色葡萄球菌(S.aureus)提供正确的包容性和排他性标准即可(见图21至22)。
实例17屎肠球菌(Enterococcus
faecium)的实时PCR ID和AST测定
利用三种不同的靶基因(rpoB，ddl，gyrB)和两类抗微生物药物氨苄青霉素(β-内酰胺)和万古霉素(糖肽)对屎肠球菌(Enterococcus faecium)进行快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验。使用的引物/探针组如下。对于rpoB，使用SEQ ID NO：53(正向引物)、SEQ ID NO：54(反向引物)、SEQ ID NO：55(探针)；对于ddl，使用SEQ ID NO：56至SEQ IDNO：57(正向引物)、SEQ ID NO：58至SEQ ID NO：59(反向引物)、SEQ IDNO：60至SEQ ID NO：61(探针)；对于gyrB，使用SEQ ID NO：62至SEQ ID NO：63(正向引物)、SEQ ID NO：64至SEQID NO：65(反向引物)、SEQ ID NO：66(探针)。根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)文件M100 ED 30对屎肠球菌(E.faecIum)菌株18483(耐药菌株)和18446(敏感菌株)的抗微生物药物敏感性进行解释，以分别确定它们对给定抗微生物药物的耐药性和敏感性。将每种菌株以5e5 CFU/mL接种到包含各种浓度的所示抗微生物药物的孔中，并且在孵育4小时后经受使用实例12的方案的基于PCR的快速ID/AST试验。结果如图37所示，表明可利用所有三种基因靶标获得两种屎肠球菌(E.faecIum)菌株的正确的敏感性结果，尽管某些靶等位基因似乎表现得更好。总之，这些结果表明可利用不同的靶基因和等位基因进行快速的基于PCR的ID/AST，只要它们为屎肠球菌(E.faecium)提供正确的包容性和排他性标准即可(见图17至19)。
实例18念珠菌(Candida)属的实时PCR ID和AST测定
可使用靶基因RDN18(18s核糖体RNA)和RDN58(5.8s核糖体RNA)以及图38中所示的引物和探针对念珠菌(Candida)进行快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验，其中对于RDN18：使用SEQ ID NO：88(正向引物)、SEQ ID NO：89(反向引物)、SEQ ID NO：90(探针)；对于RDN58：使用SEQ ID NO：91(正向引物)、SEQ ID NO：92(反向引物)、SEQ ID NO：93(探针)。念珠菌的正确的包容性和排他性标准如图26至27所示。
实例19通用实时PCR ID和AST测定
可使用广泛保守的16s核糖体RNA基因作为靶标并且使用如图39所示的引物和探针(其为SEQ ID NO：94(正向引物)、SEQ ID NO：95(反向引物)和SEQ ID NO：96(探针))，对任何给定的革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌进行快速鉴定和表型抗微生物药物敏感性试验。
实例20包含折点组的多重PCR ID测定
图40A显示了革兰氏阴性病原体PCR多重预混液的包容性和排他性性能。不动杆菌属(Acinetobacter)PCR检测组利用靶向ompA基因的正向引物SEGP2603(SEQ ID NO：20)、反向引物SEGP2606(SEQ ID NO：21)和探针SEGP2769(SEQ ID NO：22)(见表V)，并且测定结果报告于通道1中。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PCR检测组利用靶向tuf基因的正向引物SEGP2341(SEQ ID NO：32)、反向引物SEGP2342(SEQ ID NO：33)和探针SEGP2343(SEQ ID NO：34)(见表VIII)，并且测定结果报告于通道2中。肠杆菌目(Enterobacterales)PCR检测组利用靶向gyrB基因正向引物SEGP1899(SEQ ID NO：8)、反向引物SEGP1901(SEQID NO：9)和探针SEGP2016(SEQ ID NO：10)(见表III)，并且测定结果报告于通道3中。通用细菌PCR检测组利用靶向16s rRNA基因的正向引物SEGP1830(SEQID NO：94)、反向引物SEGP1831(SEQ ID NO：95)和探针SEGP1895.1(SEQID NO：96)(见表XXVIII，并且测定结果报告于通道4中。最后，通用内部对照PCR检测组利用正向引物SEGP1952(ACAACCGCGCCATACATGTCAAGA<t_BB_dC>；SEQ ID NO：97)、反向引物SEGP1953(GTCGGGCCGCTTATACAGT ACCA<t_BB_dC>；SEQ IDNO：98)和探针SEGP1954(<CY5.5>TGCGCGTCCCG<BHQ_2>TTTTGATACTTCGTAACGGTGC<Phos>；SEQ ID NO：99)，并且测定结果报告于通道5中。折点组、通道和染料波长汇总于图40B中。所有样品的基因组DNA浓度为约2ng/μL至10ng/μL。对从常见革兰氏阴性病原体中分离的基因组DNA测试多重反应：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(Koxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aerugmosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii)。此外，对于从常见革兰氏阳性病原体中分离出的基因组DNA，未观察有意义的扩增(数据未显示)。与设计一样，在所需病原体的正确通道中观察到扩增曲线，表明多重反应具有非常强的包容性和排他性。
图41A显示了革兰氏阳性病原体PCR多重预混液的包容性和排他性性能。链球菌属(Streptococcus)PCR检测组利用靶向tuf基因的正向引物SEGP1705(SEQ ID NO：100)、反向引物SEGP1706(SEQ ID NO：101)和探针SEGP1709.1(SEQ ID NO：102)(见表XXV)，并且测定结果报告于通道1中。葡萄球菌属(Staphylococcus)PCR检测组利用靶向tuf基因的正向引物SEGP1835(SEQ ID NO：79)、反向引物SEGP1836(SEQ ID NO：80)和探针SEGP1838(SEQ IDNO：81)(见表XXI)，并且测定结果报告于通道2中。肠球菌属(Enterococcus)PCR检测组利用靶向rpoB基因的正向引物SEGP2522(SEQ ID NO：53)、反向引物SEGP2525(SEQ ID NO：54)和探针SEGP2770(SEQ ID NO：55)(见表XV)，并且测定结果报告于通道3中。通用细菌PCR检测组利用靶向16s rRNA基因的正向引物SEGP1830(SEQ ID NO：94)、反向引物SEGP1831(SEQID NO：95)和探针SEGP1895.1(SEQ ID NO：96)(见表XXVIII)，并且测定结果报告于通道4中。最后，通用内部对照PCR检测组利用正向引物SEGP1952(SEQ ID NO：97)、反向引物SEGP1953(SEQ ID NO：98)和探针SEGP1954(SEQ ID NO：99)，并且测定结果报告于通道5中。折点组、通道和染料波长汇总于图41B中。所有样品的基因组DNA浓度为约2ng/μL至10ng/μL。对来自常见革兰氏阳性病原体的纯化基因组DNA测试多重反应：无乳链球菌(S.agalactitae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。此外，对于从常见革兰氏阴性病原体中分离出的基因组DNA，未观察有意义的扩增(数据未显示)。与设计一样，在所需病原体的正确通道中观察到扩增曲线，表明多重反应具有非常强的包容性和排他性。
实例21 PCR-AST测定的分析
图42包含来自有关不同革兰氏阴性菌株的一系列PCR-AST测定的图，其显示了不同阈值，这些阈值可用于区分多个病原体组的敏感和耐药分离物，将其分为不同通道并且使用图4中所概述的群体的统计分离进行解释。与环丙沙星敏感性相关联的阈值针对以下示出：A)鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanni)(Abi)，使用靶向ompA基因的SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：19的引物/探针，B)肠杆菌科(Entero)，使用靶向靶向rplP基因的SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：3的引物/探针，和C)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pae)，使用如表XXXIII中所示的引物/探针并且靶向O-抗原乙酰基转移酶基因，并且基于2μg/mL环丙沙星下相对于无环丙沙星对照的Ct值的变化(ΔCt)、0.5μg/mL环丙沙星下的相对荧光强度(RFI)和1μg/mL环丙沙星下的ΔCt，以及0.5μg/mL环丙沙星下的Ct荧光值之前的斜率(斜率)和1μg/mL的ΔCt。
表XXXIII用于检测铜绿假单胞菌的寡核苷酸
图43A)显示了针对Abi、Pae以及细分为菌株阴沟肠杆菌(E.cloacae，Ecl)、大肠杆菌(E.Coli，Eco)、产气克雷伯菌(K.aerogenes，Kae)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia，Kpn)的肠杆菌科所测试的耐药和敏感分离物的分布。使用图42中的阈值所得到的环丙沙星在菌种间的敏感性、特异性和分类一致性显示在图43B)中。灵敏度被定义为总阳性数/(总阳性数+假阴性数)；特异性被定义为总阴性数/(总阴性数+假阳性数)；分类一致性被定义为(总阳性数+总阴性数)/(总阳性数+假阴性数+总阴性数+假阳性数)。
图44包含来自第二PCR-AST测定的图，其中示出使用相应的引物/探针组所得到的A)Abi、B)Entero和C)Pae与庆大霉素敏感性相关联的阈值，并且这些阈值基于1μg/mL庆大霉素下的拐点周期、1μg/mL庆大霉素和8μg/mL庆大霉素下的绝对荧光强度的变化(ΔAFI)以及曲线拟合至16μg/mL庆大霉素下的原始荧光数据和4μg/mL庆大霉素下的ΔAFI的拟合优度。图45A)显示了针对Abi、Pae以及肠杆菌科菌株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae，EcL)、大肠杆菌(Escherichia coli，Eco)、产气克雷伯菌(Klebsiella aerogenes，Kae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia，Kpn)所测试的耐药和敏感分离物的分布。使用图44中的阈值所得到的庆大霉素在菌种间的敏感性、特异性和分类一致性显示在图45B)中。
图46包含来自第三PCR-AST测定的图，其中示出使用相应的引物/探针组所得到的A)Abi、B)Entero和C)Pae与美罗培南敏感性相关联的阈值，并且这些阈值基于4μg/mL美罗培南相对于无美罗培南对照的Ct值的变化(ΔCt)、4μg/mL美罗培南相对于最低美罗培南浓度0.25μg/mL下的Ct值的变化(ΔAbx-Ct)和0.25μg/mL美罗培南下的绝对Ct值(Ct)，以及1μg/mL美罗培南下的绝对荧光强度(AFI)和4μg/mL美罗培南下的ΔCt。图47A)显示了针对Abi、Pae和肠杆菌科菌株Ecl、Eco、Kae和Kpn测试的耐药和敏感分离物的分布。使用图46中的阈值所得到的庆大霉素在菌种间的敏感性、特异性和分类一致性显示在图47B)中。
图48A)描述了直接从阳性血培养物样品中检测细菌分离物的工作流程，这些样品通过以下步骤形成：将固定浓度的细菌加入全血中，分离红细胞，将包含细菌的血浆接种到商业血培养瓶中，孵育过夜；然后按照实例12中所述的PCR-AST测定方案测试已知对庆大霉素耐药或敏感的分离物。图48B)显示了该实验的结果，其中使用Ct值的变化(ΔCt)区分耐药和敏感分离物，表明可以直接从阳性血培养物中获得细菌的表型结果。
实例22多微生物学样品的多重ID-AST PCR测定
A.Kpn/Abi对多微生物学样品执行多重PCR ID-AST测定，其中在不存在或存在不同浓度的三种不同抗生素(环丙沙星、庆大霉素和美罗培南)的情况下，将具有不同的敏感性组合的两种革兰氏阴性生物(肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia，Kpn)和鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii，Abi)以1∶1的比例一起孵育。对Kpn信号的检测来自带有ATTO标记的探针，对Abi信号的检测来自带有HEX标记的探针。该测定中使用的引物和探针显示在表XXXIV中，并且结果显示在图49中。各菌种在相应的检测通道中表现出适当的表型，如ΔCt阈值所示，该阈值将敏感(敏感菌株)和耐药菌株分开，从而为该多微生物情况提供了准确的抗微生物药物敏感性结果。
表XXXIV用于Kpn和Abi ID-AST测定的寡核苷酸
B.Kpn/Sar对多微生物学样品执行多重PCR ID-AST测定，其中在不存在或存在不同浓度的三种不同抗生素(环丙沙星、头孢西丁和美罗培南)的情况下，将具有不同的敏感性组合的一种革兰氏阴性生物肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia，Kpn)和一种革兰氏阳性生物金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Sar)以1∶1的比例一起孵育。对Kpn信号的检测来自HEX标记的探针，对Sar信号的检测来自FAM标记的探针。该测定中使用的引物和探针显示在表XXXV中，并且结果显示在图50中。N/A表示对相应的细菌-药物组合无临床相关的解释。各菌种在相应的检测通道中表现出适当的表型，如ΔCt阈值所示，该阈值将敏感(敏感菌株)和耐药菌株分开，从而为该多微生物情况提供了准确的抗微生物药物敏感性结果。
表XXXV用于Kpn和Sar ID-AST测定的寡核苷酸
C.Kpn/Cal对多微生物学样品执行多重PCR ID-AST测定，其中在不存在或存在不同浓度的两种不同抗生素(环丙沙星和美罗培南)的情况下，将具有不同的敏感性组合的一种革兰氏阴性生物肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia，Kpn)和一种真菌生物白色念珠菌(Candida albicans，Cal)以1∶1的比例一起孵育。对Kpn信号的检测来自HEX标记的探针，对Cal信号的检测来自FAM标记的探针。该测定中使用的引物和探针显示在表XXXVI中，并且结果显示在图51中。N/A表示相应的生物-药物组合无临床相关的解释。表示Cal对氟康唑的敏感性。Kpn菌株在相应的检测通道中表现出适当的表型，如ΔCt阈值所示，该阈值将敏感和耐药分离菌分开，提供了准确的抗微生物药物敏感性结果。
表XXXVI用于Kpn和Cal ID-AST测定的寡核苷酸
D.Efs/Sar对多微生物学样品执行多重PCR ID-AST测定，其中在不存在或存在不同浓度的万古霉素的情况下，将具有不同的敏感性组合的两种革兰氏阳性生物(粪肠球菌(Enterococcus faecalis，Efs)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Sar)以1∶1的比例一起孵育。对Efs信号的检测来自HEX标记的探针，对Sar信号的检测来自FAM标记的探针。该测定中使用的引物和探针显示在表XXXVII中，并且结果显示在图52中。两种菌种在相应的检测通道中表现出适当的表型，如ΔCt阈值所示，该阈值将敏感和耐药分离菌分开，为该多微生物情况提供了准确的抗微生物药物敏感性结果。
表XXXVII用于Efs和Sar ID-AST测定的寡核苷酸
E.Sar/Cal对多微生物学样品执行多重PCR ID-AST测定，其中在不存在或存在不同浓度的头孢西丁的情况下，将具有不同的敏感性组合的一种革兰氏阳性生物金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，Sar)和一种真菌生物白色念珠菌(Candida albicans，Cal)以1∶1的比例一起孵育。对Sar信号的检测来自FAM标记的探针，对Cal信号的检测来自HEX标记的探针。该测定中使用的引物和探针显示在表XXXVIII中，并且结果显示在图53中。N/A表示相应的生物-药物组合无临床相关的解释。表示Cal对氟康唑的敏感性。Sar菌株在相应的检测通道中表现出适当的表型，如ΔCt阈值所示，该阈值将敏感和耐药分离菌分开，提供了准确的抗微生物药物敏感性结果。
表XXXVIII用于Sar和Cal ID-AST测定的寡核苷酸
实例23用于确定碳青霉烯耐受性机制的PCR测定
使用靶向blaKPC、blaVIM、blaNDM和blaOXA-48基因的PCR测定对具有已知的碳青霉烯类耐药机制的革兰氏阴性病原体进行测试：肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)、大肠杆菌(E.coli)和产气克雷伯菌(K.aerogenes)。该测定中使用的引物和探针列于表XXXIX中。除无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2-10ng/μL。实验结果显示在图54中。图中显示为阳性(Pos)的生长曲线仅针对靶向耐药机制观察。对于非目标耐药机制，未观察有意义的扩增，从而证明这种用于检测常见的碳青霉烯类耐药机制的引物和探针的特定组合具有良好的包容性和排他性。
表XXXIX用于碳青霉烯耐药性PCR测定的寡核苷酸
实例24菌种特异性PCR ID-AST测定
使用靶向斯氏普罗维登斯菌(P.stuartii)的citC基因的正向引物SEGP2164(SEQID NO：115)、反向引物SEGP2166(SEQ ID NO：116)和探针SEGP2167(SEQ ID NO：117)以及靶向沙门氏菌属(Salmonella)的invA基因的正向引物SEGP2119(SEQ ID NO：118)、反向引物SEGP2121(SEQ IDNO：119)和探针SEGP2120(SEQ ID NO：120)的PCR测定对常见的革兰氏阴性病原体进行了测试：大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、产气克雷伯菌(K.aerogenes)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、斯氏普罗维登斯菌(P.stuartii)、雷氏普罗威登斯菌(P.rettgeri)、肠道沙门氏菌(S.enterica)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(S.maltophilia)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)和皮氏不动杆菌(A.pittii)。序列显示在表XL中。还测试了革兰氏阳性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。除0ng/μL的无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2ng/μL至10ng/μL。如图55所示，有意义的扩增曲线具有菌种特异性。未观察到非目标生物发生有意义的扩增，从而证明用于检测相应的革兰氏阴性目标菌种的引物和探针的四种组合具有良好的包容性和排他性特征。这些结果代表菌种特异性检测组的非限制性示例，这些检测组允许改善肠杆菌目(Enterobacterales)内的一些特定菌种的基于折点的AST检出。CLSI指南表明，某些肠杆菌目(Enterobacterales)菌种(诸如此处显示的那些)对特定的氨基糖苷类药物具有耐药性，而大多数肠杆菌目(Enterobacterales)菌种则没有。
表XL用于检测斯氏普罗维登斯菌(P.stuartii)和沙门氏菌属(Salmonella)的寡核苷酸
使用靶向无乳链球菌(S.agalactiae)的gyrB基因的正向引物SEGP2921(SEQ IDNO：121)、反向引物SEGP2922(SEQ ID NO：122)和探针SEGP2923(SEQ ID NO：123)，靶向无乳链球菌(S.agalactiae)的ddlA基因的正向引物SEGP2947(SEQ ID NO：85)、反向引物SEGP2949(SEQ ID NO：86)和探针SEGP2951(SEQ ID NO：87)、靶向肺炎链球菌(S.pneumoniae)的tuf基因的正向引物SEGP2777(SEQ ID NO：124)、反向引物SEGP2778(SEQID NO：125)和探针SEGP2779(SEQ ID NO：126)以及靶向酿脓链球菌(S.pyogenes)的speB基因的正向引物SEGP2113(SEQ ID NO：127)、反向引物SEGP2114(SEQ ID NO：128)和探针SEGP2115(SEQ ID NO：129)的PCR测定，对常见的革兰氏阳性病原体进行测试：无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)。序列显示在表XLI中。还测试了革兰氏阴性生物，并且未表现出有意义的扩增(数据未显示)。除0ng/μL的无模板对照外，所有样品的基因组DNA浓度均为约2ng/μL至10ng/μL。如图56所示，有意义的扩增曲线具有菌种特异性。未观察到非目标生物发生有意义的扩增，从而证明用于检测相应的革兰氏阳性目标菌种的引物和探针的四种组合具有良好的包容性和排他性特征。这些结果代表菌种特异性检测组的非限制性示例，这些检测组允许改善葡萄球菌(Staphylococcus)属和链球菌(Streptococcus)属内的一些特定菌种的基于折点的AST检出(参见图31中的CLSI折点表)，借助这些ID孔，可利用更通用的ID/AST检测组，诸如图41中所示的那些。
表XLI用于检测元乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)和酿脓链球菌(S.pyogenes)的寡核苷酸
在PCR ID-AST测定中使用菌种特异性引物/探针组进行准确检出的影响可参见图57。在左图中，使用非菌种特异性引物和探针可能导致无法区分敏感菌株和耐药菌株。相比之下，在右图中，使用提供鉴定的菌种特异性引物/探针组能够分别解释每个单独菌种，从而改善与CLSI折点指南的分类一致性。
实例25 PCR ID-AST测定数据的解释
图58显示了PCR ID-AST测定数据解释策略的工作流程，其中将S形函数拟合至原始PCR曲线数据，然后计算曲线参数和特征。然后比较存在各种抗生素浓度的情况与无抗生素参比之间的特征，以得出相对特征变化。还使用特征值的回归建模和抗生素水平的变化生成与特征剂量反应关系相对应的附加特征，并且可包括使用普通最小二乘法、岭回归、套索、弹性网络、贝叶斯回归或Logistic回归模型。然后将特征组装到数据框中，并且与地面真值MIC或地面真值S/I/R一起输入单独的机器学习算法中，以便训练预测模型，这些预测模型可包括神经网络、基于树的模型、支持向量机或最近邻分类器。训练包括将数据拆分为训练集和留出测试集，然后通过交叉验证将训练集拆分为k折，为每种类型的分类器搜索适当的超参数空间。然后基于平均交叉验证得分以及在留出测试集上的表现来选择模型。然后，经过训练的模型作为整体参与以返回最终预测的MIC，该MIC可基于未加权投票、加权投票、平均概率、加权概率，或由上述分类器类型的下游分类器来解释。
图59显示了如何组合菌种ID、抗微生物药物敏感性试验、耐药机制检测和通用16srRNA表型信息以返回结果的图表，其中使用菌种ID选择适当的MIC预测算法，然后对其与来自监管机构的适当折点进行比较以来确定敏感性信息。然后，检测与所测试的抗生素相关联的耐药机制可影响所返回的敏感性结果，该敏感性结果取决于其存在与预测的MIC是否一致。在不存在菌种ID的情况下，可使用16s rRNA表型信息返回不含敏感性结果的通用MIC，其可与通过替代方式(诸如质谱法)确定的菌种ID结合使用。
提供了使用算法元素来改善基于折点的AST检出的具体实例。一个实例是使用耐药机制检测来调整表型结果检出。每种耐药机制可具有与其活性相关联的一种或多种抗生素底物，这些抗生素底物为先验已知的。这些机制也可具有不同的时间范围，在这些时间范围内可检测到它们的活性。其中一些耐药机制在4小时内无稳定的活性，并且只有在更长的孵育时间(12至24小时)后才能检测到表型。对于这些耐药机制，可能仅仅由于该耐药机制在4小时的时间范围内未充分表现出来而将生物鉴别为对给定药物敏感。通过单独的PCR孔检测这些类型的耐药机制，可纠正不一致的表型结果。一个具体实例是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，其有时编码SME碳青霉烯酶耐药机制，该机制为可诱导的，但不是在4小时的时间范围内。因此，这些耐药性粘质沙雷氏菌(S.marsescens)菌株似乎在表型上对美罗培南敏感，但对SME基因的检测将允许正确预测美罗培南耐药性表型。另一个实例是使用一种或多种抗生素的表型敏感性来预测对其他抗生素的敏感性。由于耐药机制通常具有重叠的底物特异性，因此这意味着对某些抗生素的敏感性与对其他抗生素的敏感性直接相关。同样，对某些抗生素的耐药性与对其他抗生素的耐药性直接相关。这类似于许多AST产品制造商所采用的专家规则系统，而由本发明的PCR ID-AST测定所采集的数据将用作表型结果解释的其他方法的辅助。一个具体实例是，对抗生素厄他培南敏感的菌株由于碳青霉烯酶的性质及其对厄他培南降解始终具有较高的底物特异性而始终对抗生素美罗培南敏感。类似地，对美罗培南耐药的任何菌株也会出于同样的原因对厄他培南耐药。
虽然为了清楚和理解的目的已经对前述发明进行了一些详细的描述，但是本领域技术人员通过阅读本公开将清楚，可在形式和细节上进行各种改变。例如，上述所有技术和设备可以以各种组合使用。
Claims (36)
1.一种方法，其包括在存在至少一种浓度的至少一种抗微生物药物或抗微生物药物类别的情况下执行单次定量实时PCR测定作为报告子，以同时鉴定和确定对至少一种抗微生物药物或一种抗微生物药物类别具有相似或相同的临床折点的细菌或真菌目标群的抗微生物药物敏感性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中对所述细菌或真菌目标群的鉴定通过检测对所述细菌或真菌目标群具有特异性的信号来进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其中特异性信号通过使用引物和探针寡核苷酸来检测，与非来自所述细菌或真菌目标群的靶基因相比，所述引物和探针寡核苷酸以更高的选择性与来自所述细菌或真菌目标群的所述靶基因杂交。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述靶基因选自rplP、ompA、tuf、rpoB、ddl、ddlA、fdnG、sodA、gyrB、O-抗原乙酰基转移酶、ecfX、tusA、CPE、sip和nuc。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细菌或真菌目标群包括分类目。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述分类目为肠杆菌目。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细菌或真菌目标群代表分类科。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述分类科选自肠杆菌科、耶尔森氏菌科、摩根氏菌科或所述科的组合。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细菌或真菌目标群包括分类属。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述分类属选自肠球菌属、念珠菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、葡萄球菌属、寡养单胞菌属、链球菌属和埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、沙门氏菌属、柠檬酸杆菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、棒杆菌属、微球菌属、芽孢杆菌属、嗜血杆菌属、丙酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、消化链球菌属、梭杆菌属、巴氏杆菌属、乳杆菌属、气球菌属、普雷沃氏菌属、伯克氏菌属、莫拉氏菌属、弧菌属、李斯特氏菌属、邻单胞菌属、耶尔森氏菌属、摩根氏菌属、普罗维登斯菌属或变形杆菌属。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细菌或真菌目标群代表分类种。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述分类种选自粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、柯氏柠檬酸杆菌、摩氏摩根氏菌、斯氏普罗维登斯菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、白色念珠菌、耳念珠菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、皮氏不动杆菌、医院不动杆菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、路邓葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、或酿脓链球菌、类志贺邻单胞菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其进一步包括选自以下的步骤：
-使用额外的引物和探针寡核苷酸来验证对所述细菌或真菌目标群的鉴定，与非来自所述细菌或真菌目标群的第二靶基因相比，所述额外的引物和探针寡核苷酸以更高的选择性与来自所述细菌或真菌目标群的所述第二靶基因杂交；或
-确定抗微生物药物敏感性表型或者毒素或毒力表型的机制；或验证和确定步骤两者。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其进一步包括同时鉴定和确定多于一个细菌或真菌目标群的抗微生物药物敏感性，其中每个细菌或真菌目标群对至少一种抗微生物药物或一种抗微生物药物类别具有相似或相同的临床折点。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述细菌或真菌目标群存在于血流感染(BSI)、胃肠道感染、呼吸道感染、泌尿系统感染、鼻感染、直肠感染或伤口感染中。
16.根据权利要求6所述的方法，其中所述靶基因选自rplP、gyrB和rpoB。
17.根据权利要求6所述的方法，其中与不属于肠杆菌目分类目的所述靶基因相比，以更高的选择性与属于所述肠杆菌目分类目的所述靶基因杂交的所述引物和探针寡核苷酸包含含有SEQ ID NO：1至SEQID NO：16的核苷酸序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中与非肠杆菌目中的gyrB相比，以更高的选择性与肠杆菌目中的gyrB杂交的所述引物和探针寡核苷酸包含含有SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：10的核苷酸序列。
19.一种方法，其包括在存在至少一种浓度的至少一种抗微生物药物或抗微生物药物类别的情况下执行单次多重定量实时PCR测定作为报告子，以同时鉴定和确定来自生物学样品的多个细菌或真菌菌株的抗微生物药物敏感性。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述生物学样品选自全血、血浆、血清、红细胞级分、唾液、脑脊液、精液、尿液、粪便、直肠拭子、鼻拭子、伤口拭子、皮肤拭子、胆汁、淋巴、痰液、灌洗液或它们的组合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述生物学样品为全血、血浆、血清或它们的组合。
22.根据权利要求20和21中任一项所述的方法，其中在执行所述PCR测定之前培养所述生物学样品。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述生物学样品为细菌或真菌分离物。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述多个细菌或真菌菌株被分为至少一个细菌或真菌群，所述至少一个细菌或真菌群对至少一种抗微生物药物或抗微生物药物类别具有相似或相同的临床折点。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述多个细菌或真菌菌株被分为多于一个细菌或真菌群，其中每个细菌或真菌群对至少一种抗微生物药物或一种抗微生物药物类别具有相似或相同的临床折点。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中对所述多个细菌或真菌菌株的鉴定利用多个菌株特异性5′核酸酶(TaqMan)寡核苷酸探针，每个探针用荧光染料标记并且每种荧光染料具有与另一种荧光染料不同的发射波长。
27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其中对所述多个细菌或真菌菌株的鉴定利用TAGS(温度辅助信号生成)技术。
28.根据权利要求19至27中任一项所述的方法，其进一步包括选自以下的步骤：
-验证对所述多个细菌或真菌菌株的鉴定，或
-确定抗微生物药物敏感性表型或者毒素或毒力表型的机制；或验证和确定步骤两者。
29.一种方法，其包括在存在至少一种浓度的至少一种抗微生物药物或抗微生物药物类别的情况下执行单次定量实时PCR测定，以同时鉴定和确定目标细菌或真菌菌株或者细菌或真菌目标群对所述抗微生物药物或所述抗微生物药物类别的敏感、中等与耐药(SIR)信息，其中对目标菌株或目标群的鉴定和对SIR信息的确定从与PCR数据相关联的一种或多种数学关系得出。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述数学关系选自阈值循环(Ct)、斜率、S形曲线拟合的拐点、绝对荧光强度(AFI)或端点相对强度(ERI)。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述数学关系为不同抗微生物药物浓度或不同抗微生物药物之间的相对表达式，并且选自ΔCt、2^(ΔCt)、Δ拐点、ΔAFI或ΔERI或它们的组合。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述数学关系为以下项的组合：阈值循环(Ct)、斜率、S形曲线拟合的拐点、绝对荧光强度(AFI)或端点相对强度(ERI)或它们的组合。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述数学关系为不同抗微生物药物浓度或不同抗微生物药物之间的相对表达式的组合，并且选自ΔCt、2^(ΔCt)、Δ拐点、ΔAFI或ΔERI或它们的组合。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其进一步包括选自以下的步骤：
-验证对所述目标细菌或真菌菌株或者目标细菌或真菌群的鉴定；或
-确定抗微生物药物敏感性表型或者毒素或毒力表型的机制；或验证和确定步骤两者。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的方法，其进一步包括鉴定和确定多于一个目标细菌或真菌菌株或者多于一个细菌或真菌目标群的抗微生物药物敏感性，其中每个目标菌株或目标群对至少一种抗微生物药物或一种抗微生物药物类别具有相似或相同的临床折点。
36.根据权利要求29至35中任一项所述的方法，其中所述PCR测定为实时PCR测定。
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN115798575A (zh) * | 2023-02-06 | 2023-03-14 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种预测克雷伯氏菌属对头孢他啶敏感性的系统及方法 |
| CN115798577A (zh) * | 2023-02-06 | 2023-03-14 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种预测克雷伯氏菌属对左氧氟沙星敏感性的系统及方法 |
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| CN117417989B (zh) * | 2023-11-17 | 2024-05-14 | 河北省畜牧兽医研究所 | 一种用于检测耐药基因的多重荧光定量pcr试剂盒和方法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
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| US5683896A (en) | 1989-06-01 | 1997-11-04 | Life Technologies, Inc. | Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5994056A (en) | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
| CA2123133C (en) | 1991-11-07 | 2005-01-04 | Michael J. Heller | Hybridization of polynucleotides conjugated with chromophores and fluorophores to generate donor-to-donor energy transfer system |
| PT912766E (pt) | 1996-06-04 | 2009-07-16 | Univ Utah Res Found | Monitorização da hibridização durante a pcr |
| JP4281877B2 (ja) | 1996-06-04 | 2009-06-17 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | 生物学的プロセスを実行し且つモニタリングするためのシステムと方法 |
| DK0866071T3 (da) | 1997-03-20 | 2005-01-17 | Hoffmann La Roche | Modificerede primere |
| ES2275336T3 (es) * | 1998-01-23 | 2007-06-01 | Biomerieux B.V. | Arnm del ef-tu para determinar la viabilidad de bacterias. |
| US6706475B1 (en) * | 1998-04-01 | 2004-03-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Oligonucleotide probes for detecting Enterobacteriaceae and quinolone-resistant Enterobacteriaceae |
| FR2831187A1 (fr) | 2001-10-22 | 2003-04-25 | Univ Aix Marseille Ii | Methode de determination de l'activite bacteriostatique ou bactericide des agents antibiotiques par pcr quantitative |
| GB0324650D0 (en) | 2003-10-22 | 2003-11-26 | Acolyte Biomedica Ltd | Using nucleic acids for clinical microbiology testing |
| US7763426B2 (en) | 2004-11-01 | 2010-07-27 | The Regents Of The University Of California | Probes and methods for detection of Escheridia coli and antibiotic resistance |
| US7741467B2 (en) | 2005-10-05 | 2010-06-22 | Roche Molecular Systems, Inc. | Non-fluorescent energy transfer |
| US20090136953A1 (en) | 2007-11-12 | 2009-05-28 | Microphagetm Incorporated | Molecular diagnostic method for determining the resistance of a microorganism to an antibiotic |
| NO330943B1 (no) * | 2009-04-30 | 2011-08-22 | Unilabs Telelabs As | En metode for detektering og/eller typebestemmelse og/eller kvantifisering av human papillomavirus (HPV) type, primere og prober derav samt diagnostisk sett og anvendelse derav. |
| KR101420094B1 (ko) * | 2010-10-27 | 2014-07-17 | (주)바이오니아 | 다양한 생체시료분석을 위한 전자동실시간정량증폭장비, 다양한 생체시료분석을 위한 자동정제 및 반응준비 장치, 전자동 핵산정제 및 실시간 정량 유전자증폭 방법, 전자동 핵산정제방법, 실시간정량ｐｃｒ을 이용한 병원균의 전자동 생균수검사방법, 정량면역ｐｃｒ을 이용한 전자동 항원농도획득방법 및 타겟항원에 라벨링된 부착용 타겟핵산의 정제방법 |
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| CN106661606B (zh) | 2014-06-13 | 2021-12-21 | Q-莱纳公司 | 用于检测和表征微生物的方法 |
| WO2016138471A1 (en) | 2015-02-26 | 2016-09-01 | IDGenomics, Inc. | Process and kit for predicting antibiotic resistance and susceptibility of bacteria |
| WO2017127727A1 (en) | 2016-01-21 | 2017-07-27 | T2 Biosystems, Inc. | Rapid antimicrobial susceptibility testing using high-sensitivity direct detection methods |
| US10570464B2 (en) | 2016-05-09 | 2020-02-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Bacterial pathogen identification by high resolution melting analysis |
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| WO2018056430A1 (ja) | 2016-09-23 | 2018-03-29 | 株式会社Ｄｎａチップ研究所 | 気分障害を検出する方法 |
| KR101850854B1 (ko) * | 2016-10-17 | 2018-04-20 | 연세대학교 원주산학협력단 | 퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 기반 그람양성, 그람음성균 및 캔디다의 검출 및 동정과 항생제 내성여부를 동시 확인할 수 있는 진단법 및 그 키트 |
| US11560584B2 (en) | 2016-12-30 | 2023-01-24 | Quidel Corporation | Phage-mediated immunoassay and methods for determining susceptibility of bacteria to antibiotic or probiotic agents |
| US20200010874A1 (en) | 2017-03-06 | 2020-01-09 | The Johns Hopkins University | Streamlined platform for bacterial identification and antibiotic susceptibility test |
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| US11827944B2 (en) | 2017-10-11 | 2023-11-28 | California Institute Of Technology | Antibiotic susceptibility of microorganisms and related compositions, methods and systems |
| US11060133B2 (en) | 2017-10-26 | 2021-07-13 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Methods for detection and quantification of infectious carbapenem resistant Enterobacteriaceae (CRE) |
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115798575A (zh) * | 2023-02-06 | 2023-03-14 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种预测克雷伯氏菌属对头孢他啶敏感性的系统及方法 |
| CN115798577A (zh) * | 2023-02-06 | 2023-03-14 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种预测克雷伯氏菌属对左氧氟沙星敏感性的系统及方法 |
| CN115798575B (zh) * | 2023-02-06 | 2023-06-02 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种预测克雷伯氏菌属对头孢他啶敏感性的系统及方法 |
| CN117417989A (zh) * | 2023-11-17 | 2024-01-19 | 河北省畜牧兽医研究所 | 一种用于检测耐药基因的多重荧光定量pcr试剂盒和方法 |
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