CN117441025A - 用于少量细胞的无显微镜定量检测的微流体条形码样细胞传感器 - Google Patents

Abstract

一种不依赖于资源且具有成本效益的抗微生物剂敏感性测试(AST)系统或装置，其可以快速处理大量样品。AST系统包括基于自适应线性过滤器阵列的条形码样细胞传感器，用于实施一种用于对样品中体积非常小的细胞进行计数的全自动且无显微镜的方法，其中悬浮细胞集中在与细胞数量成正比的不同长度的微型条中。AST系统还包括一种片上培养，其花费的时间比标准方法少得多，从而实现了低成本且不依赖于资源的便携式AST平台，可以通过便携式设备如手机由该平台获得结果。

Description

用于少量细胞的无显微镜定量检测的微流体条形码样细胞传 感器

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年5月24日提交的美国临时专利申请号63/192,559的优先权，其公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及一种用于基于自适应线性过滤器阵列对体积非常小的细胞进行计数的细胞传感器。更具体地，本发明涉及一种使用全自动且无显微镜的细胞传感器来对体积非常小的细胞进行计数的方法，其中悬浮细胞集中在与样品中存在的细胞数量成正比的不同长度的微型条中。

背景技术

在过去的几十年里，抗微生物剂一直被视为细菌感染的灵丹妙药。然而，公众、医生和农业行业普遍过度使用和滥用抗微生物剂加速了某些微生物中抗微生物剂耐药性(AMR)的自然发展。抗生素的过度使用/滥用尤其猖獗。根据最近发表在PNAS上的一份备受瞩目的报道，2000年至2015年期间，抗生素用量的已确定的日剂量(DDD)增加了65％(从211亿DDD增加到348亿DDD)。令人担忧的是，AMR是对全球健康和现代文明的最大威胁之一，除非全球采取应对措施，否则到2050年，估计每年将有1000万人因此而死亡。

临床相关的AMR最受公众和研究人员的关注，许多新的抗微生物剂敏感性测试(AST)方法正在被开发出来，以帮助医生提供更加个性化的治疗。然而，在设备齐全的医疗机构之外尚没有足够的工具来处理AMR问题。这些问题实际上涵盖了广泛的情况，例如，对水、食品和公共设施安全的频繁调查；流行病期间对大量样品的紧急调查；或低收入国家中的任何AMR测试。以环境中的AMR为例，报道证明，即使环境中抗生素耐药性细菌的浓度非常低，也可能最终影响人类健康，更不用说世界上监管较少地区的畜牧业中的严重过度使用抗微生物剂。同时，AMR细菌通过多种方式从一个地方转移到另一个地方，极大地扩大了AMR威胁的范围。不幸的是，AMR细菌筛选工具的缺乏使我们在这种情况下无能为力。例如，报道发现，在全世界的环境隔室内存在大量抗生素耐药性细菌，特别是那些偏远/欠发达地区，由于各种人为活动的污染，其中一些细菌的浓度特别高。为了监测上述情况下的这种AMR风险，迫切需要一种高效且不依赖于资源的AST方法，该方法可以在不需要先进的临床测定设施的情况下快速筛选大量样品；如果在这种筛选中检测到疑似含有AMR细菌的样品，则可以将其送回实验室进行常规检测。与现有的惯常AST方法相比，这种潜在的AST工具将填补依赖设施的标准测试与现场大规模AMR测试或在没有这种设施资源的地方进行大规模AMR测试的需求之间的空白。

目前的AST方法可以分为两类：基于表型的AST和基于基因型的AST。基于表型的AST在实际应用中经常被用作标准方法，包括纸片扩散法、肉汤微量稀释和E测试法。这些常规方法已经成熟，被认为是可靠的，并且通常在实验室中进行，因为它们是基于培养的方法，显示了药物对细菌增殖的抑菌作用。这些方法通过在宏观尺度上可观察到的细胞数量变化来确定抗生素所需的最小抑制浓度(MIC)，这通常需要至少9-20小时的孵育时间，不适于现场大量样品的常规筛选。实际上，当样品中的初始细菌密度不高时，通常需要额外的预孵育时间。例如，通过肉汤稀释法测定MIC值通常需要10⁵个细胞。此外，这些方法通常是劳动密集的、耗时的且操作成本高，对于现场大规模筛选而言是显著的缺点。在考虑流行病爆发等极端情况时，当需要同时处理大量时间敏感的疑似样品时，基于培养的表型AST的致命弱点会更加突出。

为了实现快速AST，研究人员提出了多种基于基因型的方法，如全基因组测序和基于聚合酶链式反应(PCR)的方法。然而，由于技术复杂性高、设备/消耗品成本高，在资源有限的条件下(例如，在偏远/欠发达地区评估AMR或需要进行大规模测试的紧急情况等)使用这些方法仍然不切实际。此外，基于PCR的AST方法需要对编码耐药性的细菌基因有详细的先验知识，以便设计必要的引物，因此如果出现新的未知耐药机制，可能会出现假阴性结果。另一方面，如果在样品中检测到具有已知AMR功能的基因，则可能会出现假阳性结果。

毫无疑问，快速性和可靠性对于AMR测试至关重要；为此，在过去十年中，许多研究人员研究了基于微流体的表型AST。微流体AST方法可以通过在单细胞水平上观察细菌而将检测AMR和测定MIC值所需的时间减少到仅2-3小时。例如，在本发明人之前的论文中，利用单细胞策略的聚丙烯(PP)微流体芯片实现了快速且低成本的AST，其中可以通过在显微镜下观察细胞形态和表面化学变化来评估MIC。此外，微流体AST需要的样品量比常规AST少得多。然而，这些现有设备依赖于昂贵且繁琐的仪器(例如，用于检查单个细胞的高质量显微镜)进行分析，这影响了AST设备的便携性和在资源有限的条件下实现AMR细菌的快速且高通量现场筛选的可及性。

总之，目前用于评估潜在抗微生物剂耐药性环境样品的大多数AST方法仍然是基于培养和基于基因型的方法。这些方法中的大多数仍然存在劳动密集、昂贵和耗时的问题，使得它们不适用于资源有限的条件下需要即时检测(POCT)的大规模常规测试。尽管已经开发了一些先进的AST，但它们仍然受到各种限制的阻碍，如高操作成本、高技术背景要求、以及对复杂和昂贵仪器的依赖。这些限制使得当前的AST不适合在偏远和资源有限的地区实际实施。已经开发了一些POCT设备来解决这些情况下面临的挑战，旨在在资源有限的条件下实现AST。然而，它们中的大多数仍然受到不同限制的阻碍，如在定量方面表现差、通用性有限、甚至周转时间长，使其无法提供快速的AST功能，即及时获得定量MIC值。一般来说，缺乏一种可以分析非常少量细菌的无显微镜方法一直是在资源有限的条件下实现基于培养的快速AST的主要障碍(图1)。至于常规和基于自动化系统的AST，它们是成熟的并且是基于培养的方法，通常需要16-24小时和6.5-12小时来报告AST结果。相比之下，使用单细胞策略的AST将具有更早的MIC检测点，其报告AST结果仅需2-3小时。然而，所报道的基于微流体的AST仍然受到不同的限制，例如，高操作成本、依赖于复杂和昂贵的仪器等，这使得它们不适合在偏远和资源有限的地区实际实施。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种不使用单细胞检测的加速表型AST方法。

在本发明的一个方面，提供了一种基于微流体的平台，用于实施一锅法(one-pot)抗微生物剂敏感性测试(AST)，其包括细胞培养、药物-细胞孵育和一种或更多种化合物处理后的活细胞无显微镜定量分析，该基于微流体的平台包括：热载物台；光源；和目视检查窗，

其中热载物台包括细胞培养区和细胞传感区，并且其中细胞培养区包括至少三个流体入口和相对于至少三个流体入口在下游的药物浓度梯度发生器，以及多个微室，并且其中药物浓度梯度发生器包括多个分流流体通道，其将流体入口中的至少两个下游的流体进行分流；所述多个微室各自具有一个或更多个用于细胞培养的加深微孔；

细胞传感区包括多个自适应线性过滤器通道，其经由一体式连接器连接至细胞培养区的多个流体出口，其中自适应线性过滤器通道中的每一个配置为接收来自细胞培养区的培养细胞，并且随后所接收的培养细胞将积聚在自适应线性过滤器通道中的每一个的下游末端，

光源设置在自适应线性过滤器通道的下游末端附近或近端，用于向在自适应线性过滤器通道中的每一个的下游末端处积聚的培养细胞照射一定波长的光，以便通过设置在多个自适应线性过滤器通道的外壳上方的目视检查窗可视化积聚的培养细胞，并且来源于其的图像信号能够被配备有成像功能的便携式设备直接捕获。

在某些实施方案中，自适应线性过滤器通道中的每一个包括至少一个主通道和在与该至少一个主通道平行的方向上设置的至少两个侧通道，并且至少一个主通道通过相对于至少一个主通道和至少两个侧通道在正交方向上设置的多个纳米级通道化通道与至少两个侧通道连通，使得流经自适应线性过滤器通道的至少一个主通道的含有培养细胞的流体基于过滤作用通过多个纳米级通道化通道被引导至至少两个侧通道。

在某些实施方案中，至少一个主通道和至少两个侧通道具有相同的横截面积，其中通道高度与通道宽度的纵横比小于1。

在某些实施方案中，至少一个主通道和至少两个侧通道具有约8μm的平均通道高度。

在某些实施方案中，至少一个主通道和至少两个侧通道具有约16μm的平均通道宽度。

在某些实施方案中，纳米级通道化通道具有与至少一个主通道和至少两个侧通道相同的通道宽度，和约800nm的平均通道高度。

在某些实施方案中，细胞传感区包括至少八个自适应线性过滤器通道，以形成具有不同长度的可见微型条的自适应线性过滤器通道的阵列，该不同长度的可见微型条对应于用根据细胞培养区的药物浓度梯度发生器的分流流体通道的不同流体通道的不同浓度的一种或更多种化合物处理后，在自适应线性过滤器通道中的每一个通道处积聚的细胞的不同数量。

在某些实施方案中，可见微型条的长度与用来自细胞培养区处的药物浓度梯度发生器的分流流体通道之一的特定浓度的一种或更多种化合物处理细胞后积聚在相应的自适应线性过滤器通道处的活细胞的增殖速率成正比。

在某些实施方案中，含有药物的流体被加载到相对于药物浓度梯度发生器设置在上游的流体入口中的一个中，而纯流体被加载到同样相对于药物浓度梯度发生器设置在上游的另一个流体入口中。

在某些实施方案中，含有细胞的流体被加载到相对于微室设置在上游的流体入口中。

在某些实施方案中，含有感兴趣的细菌的样品最初通过流体入口中的一个注入细胞培养区；随后，将掺杂有抗生素的培养基和单独的培养基分别通过流体入口中的另外两个注入细胞培养区。将细菌在药物浓度梯度中培养约1-3小时，然后通过增加流速将其推入细胞计数区。然后，细菌将积聚在条形码样细胞传感区的自适应线性过滤器内，在革兰氏染色之后，可以通过使用配备有微距镜头转换器的手机捕获并分析结果。

在某些实施方案中，将细菌培养物从细胞培养区推到条形码样细胞传感区的流体的增加的流速为约0.15μl/min至约2μl/min。

在另一些实施方案中，将细菌培养物从细胞培养区推到条形码样细胞传感区的流体的流速取决于多种因素而变化，包括但不限于细菌黏附性、细菌疏水性、以及细胞培养区和细胞传感区内的微流体通道的聚合物表面相对于感兴趣的细菌的表面黏附性和疏水性。

在某些实施方案中，流体的流速越快，细菌在细胞传感区的自适应线性过滤器中的积聚速率越高。

在某些实施方案中，流体的流速增加至基本上未观察到通道化通道脱黏的水平。

在某些实施方案中，对在自适应线性过滤器通道处积聚的细胞进行革兰氏染色，使得在光源的照射下，来源于经革兰氏染色的细胞的图像信号被配备有成像功能的便携式设备直接捕获，并且其中由光源照射的光的波长在可见光范围内。

在某些实施方案中，至少热载物台的细胞培养区和细胞传感区由一种或更多种生物相容的热塑性材料制成，同时当纯流体被加载到流体入口之一中以将培养的细胞朝向下游方向冲洗到细胞培养区的流体出口时，在细胞培养区培养的细胞不会黏附在细胞培养区的微流体通道的内表面上。

在某些实施方案中，热塑性材料包括聚丙烯。

在本发明的另一方面，提供了一种用于筛选或评估潜在候选药物对一种或更多种微生物的抗微生物剂活性的系统，该系统包括容纳本文所述的基于微流体的平台的外壳、全自动流体泵、用于控制将不同流体加载到平台的流体入口的主电路板和多个控制组件、连接到基于微流体的平台的一个或更多个流体入口的试剂室、带有恒温器的药物-细胞孵育室、和无影灯面板，该恒温器用于控制其中一种或更多种微生物与不同浓度的潜在候选药物一起孵育的细胞培养区的温度，该无影灯面板用于通过配备到便携式设备的微距镜头从可见检查窗捕获基于微流体的平台的细胞传感区处可视化的积聚细胞的图像。

在本发明的另一方面，提供了一种用于筛选或评估潜在候选药物对感兴趣的一种或更多种微生物的抗微生物剂活性的方法，该方法包括：

将潜在候选药物加载到本文所述的系统的试剂室中；

使用安装在配对工作站或便携式设备中的相应软件程序来控制系统的自动流体泵的电源开/关和由自动流体泵生成的流体的流量；

将感兴趣的一种或更多种微生物加载到基于微流体的平台的相应流体入口；

在系统的药物-细胞孵育室中，在由恒温器控制的恒温下，用在基于微流体的平台的细胞培养区中的不同浓度的潜在候选药物处理一种或更多种微生物，持续足够的时间；

通过配对工作站或便携式设备的软件程序激活系统的抗微生物剂敏感性测试功能，在用不同浓度的潜在候选药物处理之后，将一种或更多种微生物的细胞培养物经由一体式连接器从细胞培养区冲洗到基于微流体的平台的细胞传感区；

在系统的无影灯面板的照射下，通过与工作站或便携式设备配对的成像模块，捕获来源于细胞传感区的自适应线性过滤器阵列处积聚的一种或更多种微生物的培养细胞的可见条的图像；

将捕获的图像转换为可见条的不同长度的图像数据；

将可见条的不同长度的图像数据与参考图像数据进行比较，以确定潜在候选药物对感兴趣的一种或更多种微生物的抗微生物剂活性。

在某些实施方案中，在由恒温器控制的恒温下，在基于微流体的平台的细胞培养区中，用不同浓度的潜在候选药物处理一种或更多种的持续时间为微生物约1-3小时。

在某些实施方案中，一种或更多种微生物包含抗微生物剂耐药性(AMR)微生物。

在本发明的又一方面，提供了一种用于评估微生物对化合物的抗微生物剂耐药性的方法，其包括：

将化合物加载到本文所述的系统的试剂室中；

使用安装在配对工作站或便携式设备中的相应软件程序来控制系统的自动流体泵的电源开/关和由自动流体泵生成的流体的流量；

将微生物加载到基于微流体的平台的相应流体入口；

在系统的药物-细胞孵育室中，在由恒温器控制的恒温下，用在基于微流体的平台的细胞培养区中的不同浓度的化合物处理微生物，持续足够的时间；

通过配对工作站或便携式设备的软件程序激活系统的抗微生物剂敏感性测试功能，将用不同浓度的化合物处理后的微生物的细胞培养物经由一体式连接器从细胞培养区冲洗到基于微流体的平台的细胞传感区；

在系统的无影灯面板的照射下，通过与工作站或便携式设备配对的成像模块，捕获来源于细胞传感区的自适应线性过滤器阵列处积聚的微生物的培养细胞的可见条的图像；

将捕获的图像转换为可见条的不同长度的图像数据；

将可见条的不同长度的图像数据与参考图像数据进行比较，以确定微生物对化合物的抗微生物剂耐药性。

在某些实施方案，在由恒温器控制的恒温下，在基于微流体的平台的细胞培养区中，用不同浓度的化合物处理微生物的持续时间为约1-3小时。

在某些实施方案中，用于评估微生物的抗微生物剂耐药性的化合物是一种或更多种抗微生物剂，包括但不限于庆大霉素、氨苄青霉素、四环素和红霉素；并且该微生物包括细菌的一种或更多种菌株。

在某些实施方案中，通过与抗微生物生长的不同浓度化合物对应的可见条长度变化来确定抗微生物剂耐药性。

在某些实施方案中，如果观察到可见条长度之间有显著变化，则导致该显著变化的相应化合物浓度将被视为对微生物的最小抑制浓度，与基于临床实验室标准化协会(CLSI)对相同化合物的建议，使用常规方法获得的标准最小抑制浓度(MIC)值相当；否则，优选以相同浓度或甚至更高浓度的相同化合物重复上述步骤，以验证微生物的抗微生物剂耐药性。

在某些实施方案中，从可见条的不同长度的图像数据相对于不同化合物浓度的图的斜率观察到某些可见条之间的显著长度变化。

在本发明的又一方面，提供了一种用于评估流体样品中抗微生物剂耐药微生物的方法，其包括：

将一种或更多种已知抗微生物剂加载到本文所述的系统的试剂室中；

使用安装在配对工作站或便携式设备中的相应软件程序来控制系统的自动流体泵的电源开/关和由自动流体泵生成的流体的流量；

将流体样品加载到基于微流体的平台的相应流体入口；

在系统的药物-细胞孵育室中，在由恒温器控制的恒温下，用在基于微流体的平台的细胞培养区中的不同浓度的一种或更多种已知化合物处理流体样品，持续足够的时间；

通过配对工作站或便携式设备的软件程序激活系统的抗微生物剂敏感性测试功能，在用不同浓度的一种或更多种已知化合物处理之后，将流体样品中的微生物的细胞培养物经由一体式连接器从细胞培养区冲洗到基于微流体的平台的细胞传感区；

在系统的无影灯面板的照射下，通过与工作站或便携式设备配对的成像模块，捕获来源于细胞传感区的自适应线性过滤器阵列处积聚的微生物的培养细胞的可见条的图像；

将捕获的图像转换为可见条的不同长度的图像数据；

将可见条的不同长度的图像数据与参考图像数据进行比较，以确定流体样品中的微生物对已知化合物的抗微生物剂耐药性。

在某些实施方案中，一种或更多种已知抗微生物剂包括庆大霉素、氨苄青霉素、四环素和红霉素；流体样品中的微生物包括抗微生物剂耐药微生物。

在某些实施方案中，在由恒温器控制的恒温下，在基于微流体的平台的细胞培养区中，用不同浓度的一种或更多种已知化合物处理流体样品的持续时间为约1-3小时。

在本平台或系统的某些实施方案中，在细胞传感区提供了一种新型的条形码样细胞传感器，其可以与微流体培养设备耦合，以使用便携式设备(例如手机(图2))生成AST结果。该传感器利用自适应线性过滤器结构，通过通道侧处的纳米通道的过滤效应将悬浮的细菌细胞集中在可见的微型条中。每个条的长度与上游在一定抗生素浓度下培养的细菌的数量成正比。对应于不同抗生素浓度的若干这些条形成可见的条形码，该条形码可以使用配备有成像功能的便携式设备，例如手机进行成像和分析。

本发明还提供了一种全自动且无显微镜的细胞计数方法，从而实现了一种实用、便携、低成本、高通量的用于微生物测定的平台(图30，表1)。将本发明的条形码样细胞传感器获得的AST结果与以下进行比较：先前公开的基于PP的AST微流体设备(基于显微镜)获得的结果，以及基于临床和实验室标准化协会(CLSI)建议使用常规方法获得的标准最小抑制浓度(MIC)值。

创建本条形码样细胞传感器是为了满足便携式AST的需求，并减少操作所需的资源和人员培训。它利用一组自适应线性过滤器(或多个自适应线性过滤器通道)来实现用于对少量细胞进行计数的全自动且无显微镜的方法，否则在没有显微镜的情况下是看不到细胞的。

在多个实施方案中，在接收药物的细胞培养区的培养期之后，细菌被推到下游传感器区。由此，悬浮细胞集中在自适应线性过滤器中以形成可见的微型条，其长度通常与细胞数量成正比。下文将提供自适应线性过滤器的浓缩效应原理(principle ofconcentration-effect)以及实现本方法的相应设备或系统的制造细节。

在某些实施方案中，染色试剂可以用于使条更清晰地看到。

在另一些实施方案中，这些条可以使用便携式设备或与成像模块结合的设备，例如具有成像功能的手机进行拍照，并且由此获得的图像数据可以用于通过比较暴露于不同药物浓度后的不同细胞数量来确定候选药物的MIC。这提供了快速的表型AST结果，而无需使用复杂的仪器，并且大多在宏观尺度上观察到变化之前。

在与环境相关的AMR检测方面，由于需要对大量样品进行常规监测(这非常昂贵并且是劳动密集的)，因此本系统特别有用。因此，在某些实施方案中，本条形码样细胞传感器与微流体培养设备耦合并通过便携式设备如手机来生成AST结果，以便实现一种实用、便携、低成本、高通量的平台，用于偏远和资源有限地区。

在某些实施方案中，本条形码样细胞传感器支持高通量操作，而无需大量操作(例如，在常规AST中使用的肉汤微量稀释期间的移液)，这是有利的，特别是在资源有限的条件下考虑大量和大尺寸的疑似样品时。

此外，根据本发明某些实施方案对独特的“条形码”的检测实现了全自动数据采集，而无需复杂的仪器或技术人员的劳动。通过简单地扫描“条形码”，可以通过软件程序如手机应用程序确定快速且可靠的AST结果。

换句话说，本发明设备、平台和系统可以在资源有限的条件下快速筛选样品中的AMR细菌，并基本上以瞬时的方式给出初步的MIC值，从而快速确定需要送去进行高级检测的样品(如果有的话)。

本发明的其他方面包括在用于质量保证过程和药物开发过程的抗生素效力检测中使用本平台或系统的方法。

本领域技术人员将理解，本文所述的本发明可经受除那些具体描述之外的变化和修改。

本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括说明书中单独或集体提及或指示的所有步骤和特征，以及步骤或特征中的任何和所有组合或任何两个或更多个。

在整个本公开中，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括/含有”或其变体如“comprises”或“comprising”等变体将被理解为意味着包含所述整数或整数的组，但不排除任何其他整数或整数的组。还要注意，在本公开中，特别是在权利要求书和/或段落中，如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等术语可以具有美国专利法中赋予它的含义；例如，它们可以表示“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等；并且如“基本上由......组成(consisting essentially of)”和“基本上由......组成(consists essentially of)”等术语具有美国专利法中赋予它们的含义，例如，它们允许未明确叙述的要素，但排除在现有技术中发现的要素或影响本发明的基本或新颖特征的要素。

此外，在整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括”或其变体如“包括(includes)”或“包括(including)”将被理解为意味着包括所述整数或整数的组但不排除任何其他整数或整数的组。

本文中使用的选定术语的其他定义可以在本发明的具体实施方式中找到并适用于全文。除非另有定义，否则本文中使用的所有其他技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

通过对随后描述的回顾，本发明的其他方面和优点对本领域技术人员将是显然的。

附图说明

当结合附图时，本发明的上述和其他目的和特征将在本发明的以下描述中变得明显，其中：

图1示出了基于表型的AST的时间线的示意图，包括常规AST，基于自动化系统的AST，基于微流体的AST和使用条形码细胞传感器的AST。

图2示出了根据本发明某些实施方案的本AST系统的示意性和透视图：图2A、图2A1和图2A2示出了便携式AST系统的设计；图2D示出了包含两部分的微流体设备：细胞培养区、条形码样细胞传感器以及连接细胞培养区和条形码样细胞传感器的一体式连接器，其放大示意图如图2A2所示；图2B和图2C示出了使用配备有成像设备(例如采用微距镜头转换器的相机)的便携式设备(例如手机)用于获取在具有各种长度微型条的自适应线性过滤器阵列中积聚的革兰氏染色细菌的图像数据，并分析由其来源的图像数据以根据本发明的某些实施方案确定抗生素对一类微生物的MIC值。

图3示出了条形码样细胞传感器的示意图、模拟和检测结果：图3A示意性地描绘了传统方波过滤器；图3B示意性地描绘了用于细胞传感的自适应线性过滤器和形成条形码样细胞传感器的自适应线性过滤器阵列；图3B示出了通过PDMS通道结构顶部塌陷形成的不同自适应线性过滤器之间的纳米通道(下图)和相应的模拟结果(上图)；图3C示出了条形码样细胞传感器的主通道和侧通道的示意图(左图)、主通道的尺寸(左侧入口)、和条形码样细胞传感器的主通道内流速的模拟结果(右上图和右下图)；图3D示出了荧光共聚焦显微镜下自适应线性过滤器的3-D结构，其中比例尺代表10μm；图3E示出了使用GFP标记的大肠杆菌(E.coli)悬浮液的条形码样细胞传感器内的细胞积聚；比例尺代表150μm。

图4A示出了在氨苄青霉素存在下的大肠杆菌经革兰氏染色后的AST结果。

图4B示出了在庆大霉素存在下的金黄色葡萄球菌(S.aureus)经革兰氏染色后的AST结果。

图5示出了通过使用不同的方法的微生物在LB琼脂板上的生长：用于对照样品的LB琼脂板(图5A)；使用平板涂布法(图5B)和平板划线法(图5C)的饮用水样品；。

图6A示出了从饮用水样品中分离的细菌分离株的MALDI-TOF质谱，其中从饮用水样品中鉴定的可能物种是表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。

图6B示出了从饮用水样品中分离的细菌分离株的MALDI-TOF质谱，其中从饮用水样品中鉴定的可能物种是杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)。

图6C示出了从饮用水样品中分离的细菌分离株的MALDI-TOF质谱，其中从饮用水样品中鉴定的可能物种是头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)。

图7示出了不同颗粒填充条件(PP1和PP2)下细胞传感器内速度分布的数值模拟。两组放大图分别示出了第一侧通道和微通道末端侧通道的正交投影。

图8示出了不同颗粒填充条件(PP1和PP2)下细胞传感器的第一侧通道(第一行)和末端侧通道(第二行)的放大正交投影，以示出细胞传感器内速度分布的模拟结果。

图9示出了不同颗粒填充条件下细胞传感器的第一侧通道(第一行)和末端侧通道(第二行)的放大XY平面投影，以示出细胞传感器内速度分布的模拟结果。

图10示出了不同数量的侧通道(4、8、16、32)下，细胞传感器内流体流动的速度大小的数值模拟。每个通道布局中的两张放大图分别示出了第一侧通道和微通道末端侧通道的正交投影。

图11示出了在不同数量的侧通道(4、8、16、32)下，微通道末端侧通道的放大正交投影，以示出细胞传感器内速度分布的模拟结果。

图12示出了在不同数量的侧通道(4、8、16、32)下，细胞传感器的第一侧通道的放大正交投影，以示出细胞传感器内速度分布的模拟结果。

图13示出了在不同数量的侧通道(4、8、16、32)下，细胞传感器的第一侧通道的放大XY平面投影，以示出细胞传感器内速度分布的模拟结果。

图14示出了在不同数量的侧通道(4、8、16、32)下，微通道末端侧通道的放大XY平面投影，以示出细胞传感器内速度分布的模拟结果。

图15示出了不同高度的主通道(4μm、8μm、16μm)下，细胞传感器内流体流动的速度大小的数值模拟。每个通道布局中的两张放大图分别示出了第一侧通道和微通道末端的侧通道的正交投影。

图16示出了不同高度的主通道(4μm、8μm、16μm)下细胞传感器的第一侧通道(第一行)和末端第二侧通道(第二行)的放大正交投影，以示出细胞传感器内速度分布的模拟结果。

图17示出了不同高度的主通道(4μm、8μm、16μm)下细胞传感器的第一侧通道(第一行)和末端第二侧通道(第二行)的放大XY平面投影，以示出细胞传感器内速度分布的模拟结果。

图18示出了不同宽度的主通道(8μm、16μm、32μm)下，细胞传感器内流体流动的速度大小的数值模拟。每个通道布局中的两张放大图分别示出了第一侧通道和微通道末端侧通道的正交投影。

图19示出了不同宽度的主通道(8μm、16μm、32μm)下细胞传感器的第一侧通道(第一行)和末端侧通道(第二行)的放大正交投影，以示出细胞传感器内速度分布的模拟结果。

图20示出了不同宽度的主通道(8μm、16μm、32μm)下细胞传感器的第一侧通道(第一行)和末端第二侧通道(第二行)的放大XY平面投影，以示出细胞传感器内速度分布的模拟结果。

图21示出了如何通过根据本发明某些实施方案的本系统从AST结果获得的积聚细菌的斜率确定抗生素对细菌样品的MIC值。

图22示出了根据本发明某些实施方案的本条形码样细胞传感器捕获设备的实例，以及通过使用本发明开发的移动应用程序直接生成的MIC结果：条形码细胞传感器捕获设备(图22A)和用于细胞传感器内积聚细菌的分析过程(图22B)；通过开发的移动应用程序(图22C1)分析的MIC值和AST结果，以及由移动应用程序(图22C2)和计算机辅助(图22C3)处理的细胞传感器结果的详细信息。

图23示出了为用于根据本发明某些实施方案的便携式抗微生物剂敏感性测试(AST)系统中的微流体PP芯片的下游设备的条形码样细胞传感器：条形码样细胞传感器的透视图像视图(图23A)和显微图像视图(图23B)；比例尺分别为5mm和100μm；在使用时在主通道中积聚有细菌的条形码样细胞传感器的自适应线性过滤器的放大视图(图23C)。

图24示意性地示出了根据本发明某些实施方案的便携式抗微生物剂敏感性测试(AST)系统的条形码细胞传感器的操作程序：图24A示出了样品加载步骤(步骤1)；图24B示出了抗生素加载杆(步骤2)；图24C示出了细菌加载步骤(步骤3)。

图25示出了在1μL/min的流速下，不同浓度的细菌[表达GFP的大肠杆菌]在相等时间段内的细菌积聚表现的比较。细菌的光密度分别为OD 0.05(图25A)、OD 0.25(图25B)和OD 0.50(图25C)；比例尺代表100μm。

图26示出了在2μL/min流速下的细菌积聚表现；比例尺代表100μm。

图27示出了在不同浓度抗生素下使用肉汤微量稀释法对细菌分离株的AST结果：庆大霉素(图27A)和氨苄青霉素(图27B)。

图28示出了在不同情况下用于AST结果评估的一般指南。

图29示出了自适应线性过滤器内不同类型积聚细菌的革兰氏染色结果：图29A示出了自适应线性过滤器通道内的积聚细菌；图29B示出了革兰氏阳性细菌[金黄色葡萄球菌]的革兰氏染色结果；图29C示出了革兰氏阴性菌[大肠杆菌]。

图30示出了本便携式AST仪器整体设计的前视图(图30A)和透视图(图30B)的示意图。该仪器由六个不同的室构成，包括(1)用于细胞孵育的室，(2)用于试剂储存的室，(3)用于细胞培养区的恒温器，(4)用于照片捕获的无影灯面板；以及用于(5)蠕动泵和(6)主电路板的室。

图31示出了用于根据本发明某些实施方案的开发的移动应用程序的用户界面，其适用于通过分析条形码样细胞传感器内积聚的细菌来获得MIC值和AST结果。

图32示意性地描绘了结合了基于PP的微流体AST芯片和条形码样细胞传感器的本AST系统，以及该系统如何以“条形码”形式给出AST结果，以被通过根据本发明某些实施方案的便携式设备的移动应用程序捕获和分析。

图33示出了带有条形码样微通道的“条形码”细胞传感器的实际图片，该微通道可以与特定的移动应用程序结合使用以检测抗生素耐药细菌。

图34示意性地描绘了具有适用于不同目的的不同设计的条形码样细胞传感器设备。

图35示出了用于呈圆形/圆盘形和载玻片形式的AST和“条形码”细胞传感器设备的集成离心微流体平台的示意图。

具体实施方式

对于本领域技术人员来说显然的是，可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下进行修改，包括进行添加和/或替换。可以省略具体细节，以免使发明晦涩难懂；然而，撰写本公开是为了使本领域技术人员能够在不进行过度实验的情况下实践本文中的教导。

本公开提供了以下细节以帮助理解和实现本发明，并且不应被认为是将保护范围限于下文描述的那些细节。

材料

SU-8 2050永久环氧负性光刻胶购自美国Microchem公司。聚二甲基硅氧烷(PDMS，RTV615)及其固化剂购自Momentive Performance Materials(Waterford,NY)。聚丙烯(PP)购自Orient Hongye Chemical Co.,Ltd.(中国山东)。大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC 29213)购自上海FuxiangBiotechnology Co.,Ltd.(中国上海)。表达绿色荧光蛋白(GFP)的大肠杆菌获自香港科技大学的Hongkai Wu。细菌革兰氏染色试剂盒购自BaSO生物科技有限公司(中国台湾NTC)。Luria Bertani(LB)肉汤粉，含琼脂的LB肉汤(Lennox)，包括氨苄青霉素(AMP)、庆大霉素(GEN)、四环素(TET)、红霉素(ERY)的抗生素以及所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich。用于实验的热载物台和注射器输液泵分别购自Xinruiqi Electronic,Inc.(LKTC-B1-T，中国)和Cole-Parmer仪器有限公司(EW-74900-05，美国)。

表1：本AST仪器的材料成本估算。

设备制造

用于基于PP的AST设备的微结构的结构掩模是在AutoCAD 2018中设计的，并在激光打印机(Kernel Electronics(Shen Zhen)CO.，LTD.，中国)上制作。在某些实施方案中，所有光刻胶微结构均使用多层软刻蚀术制造。为了制造用于基于PP的微流体AST芯片的热成型母版，将PDMS预聚物和固化剂的混合物(10:1的比例)倒在模板上，并在75℃固化30分钟。接下来，将PDMS层小心地从模板上剥离，然后附着在玻璃基板上，作为母版以成型PP基板。将PP基板放在PDMS母版上，并夹上另一个平板载玻片。两个垫片用于控制PP基板的厚度。然后，将该组件放在热压缩机上，并在175℃在0.24MPa下压花1分钟。压花后，将微图案化的PP基板从热压花机中取出，并轻轻冷却至室温，用于与另一个PP基板进行进一步的热黏合工艺，以组装基于PP的AST芯片。在黏合之前，可以在用于管道连接的PP平板上钻孔。PP基板与这种钻孔的PP平板组装在两块5-mm厚的钢板之间。在黏合过程中使用两个与芯片等厚的垫片。然后，将该组件放在热压缩机上，并在145℃压花2h。冷却至室温后，得到整个基于PP的AST微流芯片。

自适应线性过滤器的设计由AutoCAD进行。在某些实施方案中，设备的主要结构包括微米级主通道和两个用于过滤用途的侧通道。同时，设计了数十个纳米级通道化通道，用于液体培养基的通道化。过滤器的主通道、两个过滤通道和通道化通道的宽度为16μm，其中微米级通道(主通道和两个侧通道)的高度为8μm，纳米级通道(通道化通道)的高度为0.8μm。所谓的“条形码”细胞传感器是微流体聚丙烯(PP)AST芯片的下游设备，其中对应于PP MFAST芯片的八个不同出口的八个不同的自适应线性过滤器组合在一起，以形成条形码样细胞传感器。

在某些实施方案中，为了制造条形码细胞传感器，将PDMS预聚物和固化剂的混合物(10:1的比例)倒在模板上，并在75℃固化30分钟。然后将图案化的PDMS母版小心地从模板上剥离。为了将PDMS微型设备黏合至载玻片上，PDMS母版和载玻片的黏合侧用臭氧处理5分钟。处理后，PDMS和载玻片迅速接触，立即形成不可逆黏合(图3B)，然后将黏合的PDMS设备在120℃加热20分钟，以提高黏合强度，以便进行进一步的AST实验(图23)。

抗微生物剂和细菌溶液的制备

通过将储备粉末以1000μg/mL的浓度溶解在去离子水中，直接制备抗生素(AMP、GEN、TET、ERY)的储备溶液。使用接种环将分离的大肠杆菌(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)菌落悬浮到2mL LB肉汤培养基中，并在37℃下孵育过夜至约5×10⁵CFU/mL。使用紫外-可见分光光度计(Cary 8454紫外-可见光二极管阵列系统，美国安捷伦)读取细菌悬浮液的OD浓度。

真实样品的采集与制备

2019年6月至2019年11月期间，根据ISO 18593:2018食物链微生物学-表面采样的水平方法指南，收集了所有测试样品。此外，所有样品均采集自政府场所和大学设施中十个不同地点处的饮水机。如前所述，通过擦拭测试了饮水机出口表面。简言之，用一次性无菌棉签擦拭饮水机出口的表面，然后迅速放入Lysogeny broth(LB)肉汤溶液中1分钟，以制备样品溶液。采集的样品在运输过程中保持在4℃，并在37℃富集12-14小时。在细菌富集后，在LB琼脂上涂布样品悬浮液或用其划线，用于进一步的细菌分离和AST使用。对于复杂的样品，建议进行简单过滤，然后在选择性生长培养基内进行预孵育。如果需要ID，可以使用稀释涂布。此外，还可以将抗真菌剂和藻类抑制剂添加到这些样品中，以对抗和抑制真菌、酵母和藻类的生长。

所有测试样品均采集自多个政府场所和大学设施中十个不同地点处的饮水机。样品容器在用于样品采集前保持无菌；将采集的样品保持在4℃，并在采集后24小时内进行分析。每个采样点进行3次样品采集，并检测每个样品的抗微生物剂敏感性3次。(图5)通过使用基质辅助激光解吸电离飞行时间成像质谱(MALDI-TOF IMS)对真实样品进行细菌鉴定。将1μL样品移液至涂有氧化铟锡(ITO)的载玻片上，并在热板上干燥；然后在基质应用后立即通过MALDI-TOF IMS分析带有细菌的ITO载玻片(图6，表2)。

从饮用水样品中分离出了十种不同的分离株，用于进一步测试抗微生物剂敏感性，其中MALDI-TOF-MS已在测试前用于细菌的物种鉴定。通过以相应MS谱对UniProt进行搜索，成功鉴定出了十株分离株中的八株，其中UniProt的源代码可在https://github.com/dipcarbon/BacteriaMSLF获得。在这八种分离株中鉴定出了三种可能的细菌物种，它们是表皮葡萄球菌、杨氏柠檬酸杆菌和头状葡萄球菌。

表皮葡萄球菌(图6A)和头状葡萄球菌(图6C)是葡萄球菌菌株的凝固酶阴性物种(CoNS)，它们通常产生粘稠的生物膜/甚至多层生物膜，使抗生素变得不那么有效。表皮葡萄球菌和头状葡萄球菌可能引起感染或甚至败血症，并且已在不同的报告中报道了一些广泛的耐药性菌株。另一方面，杨氏柠檬酸杆菌(图6B)是人类的机会性病原体，与尿路感染(UTI)、胃肠炎、败血症等一系列感染有关。

表2：使用MALDI-TOF-MS从饮用水样品分离的细菌分离株的细菌鉴定结果。+代表阳性。

抗微生物剂敏感性实验

为了在基于PP的AST芯片上进行AST，在使用前将细菌在培养箱内于37℃预活化15分钟。在测试开始时，通过入口3注射细菌；在荧光显微镜下监测细菌的注射(图24A)。将细菌接种到培养室后，以1μL/分钟的速率将掺杂有抗生素的培养基和单独的培养基分别注射到入口1和入口2中(图24B)。然后将AST芯片在37℃的恒温器平台上孵育2小时。为了评估AMR，将PP AST芯片培养室内的细菌以1μL/分钟的速度冲洗到条形码细胞传感器中。在冲洗过程中使用革兰氏染色剂，使条形码细胞传感器内的细菌可见，并被手机摄像头捕获。为了进行比较，AST也使用传统的肉汤微量稀释方法进行，如图27所示；细菌的MIC值被评估为在没发生可见的细菌生长的情况下的最低抗生素浓度。

根据CLSI批准的标准和Nature Protocol中描述的程序，对样品进行完全相同的肉汤微量稀释(BMD)测试。为了进行BMD测试，将LB肉汤培养基和抗生素都添加到96孔微孔板中。通过使用两倍稀释，产生的抗生素的浓度梯度从128μg/mL到0.125μg/mL。将样品内鉴定的细菌分离株在37℃富集8-12小时，以便在测试前达到5×10⁶CFU/mL，将10μL细菌悬浮液接种到肉汤中以达到5×10⁵CFU/mL的细菌最终浓度。将接种的微孔板在37℃孵育16-20小时以进行进一步检查。为了评估样品的MIC值，目视检查微孔板，并将防止细菌可见生长的抗生素的最低浓度记录为该样品的MIC值。同时，Mueller Hinton肉汤也被用来执行BMD以进行交叉检查；两个AST结果都与CLSI推荐的MIC质量控制范围一致。

根据本公开的AST结果，所鉴定的所有分离株(分离株1-8)都显示出对庆大霉素的敏感性，其中所有分离株同时对氨苄青霉素具有耐药性。同时，以混合细菌样品作为参照，测试MIC值，以证明多菌AST筛选的可行性。对于混合细菌样品的AST结果，样品在庆大霉素中的MIC值为4-8μg/mL(图27A)。另一方面，混合细菌样品显示出对氨苄青霉素的耐药性(图27B)。

计算流体动力学(CFD)模拟

使用COMSOL Multiphysics 5.4(COMSOL公司，马萨诸塞州)进行了计算流体动力学模拟，以研究产生纳米通道的顶部塌陷结构的形成，以及不同类型颗粒堆积和通道设计下微流体通道内流体流动的速度大小。(图7-图20)在AutoCAD 2019中建立了具有纳米通道化通道的自适应细胞传感器的3D模型，并将其网格化为三角形单元用于COMSOL模拟。所有模拟均基于不可压缩的纳维-斯托克斯方程，并假设微流体通道的内表面是不滑的。

使用COMSOL Multiphysics 5.4(COMSOL公司，马萨诸塞州)研究顶部塌陷结构的形成以及微流体细胞传感器内的速度分布。此外，为了模拟细胞传感器内的流体动力学，进行以下假设：1.样品流体的黏度和密度恒定，2.假设细胞传感器的内部边界层为不滑的，3.样品流体的流速在模型入口处完全展开，并服从不可压缩的纳维-斯托克斯方程，以及4.没有影响样品流体的重力或其他体积力。所有3D模型均由AutoCAD 2019建立，并网格化为三角形单元，用于COMSOL模拟。

其中f是外部加速度场[m.s^-2]，ρ是密度[kg.m^-3]，p是压力场[pa]，v是运动黏度[m².s^-1]，u是流体速度场[m.s^-1]，并且t是时间[s]。

为了更好地模拟细菌积聚过程中细胞传感器内速度分布的真实情况，在进行进一步模拟之前，已经测试了不同的颗粒堆积条件。为了便于进一步模拟，根据图7-图9中获得和示出的模拟结果，假设所有细菌颗粒均为球形并以面心立方堆积方式进行堆积。模拟中的变量主要基于侧通道数(图10-图14)、主通道的宽度(图18-图20)和高度(图10-图17)方面的差异。

图像采集和分析

如前所述，细菌样品在孵育2小时后被冲洗到“条形码”细胞传感器中，将形成不同长度的积聚细菌条。此外，通过计算积聚细菌条内的斜率，将会出现一个急转点以指示MIC值的范围。所谓的转折点，处于积聚细菌长度具有显著差异的条之间，积聚长度的差异代表了细菌数量的显著变化。根据CLSI，MIC被定义为给定抗微生物剂抑制特定细菌生长的最低浓度。因此，可以通过比较log[斜率]值来观察细菌生长的显著差异点(在给定抗生素的特定浓度下)来评估样品的MIC值。

将基于PP的AST微流芯片放置在倒置荧光显微镜Eclipse Ts2R(日本尼康)上，该显微镜配备有Infinity 3s数码相机(加拿大Lumenera公司)，以捕获照片。对于“条形码”细胞传感器，在革兰氏染色后通过使用配备有21X微距镜头(美国olloclip)的手机捕获图像。通过在基于PP的AST芯片内孵育后的细菌细胞数量和形态变化以及细胞传感器内的细菌的积聚长度来评估MIC值。图片利用ImageJ 1.52程序(图21)进行后处理，并在所提供的移动应用程序(图22和图31)上进行进一步分析和统计。

本发明AST系统的总体设计

本发明自动AST系统包括两个主要部分：用于将细菌暴露于测试药物的微流体细胞培养区和用于无显微镜细胞计数的条形码样细胞传感器区(图2A1、图2A2和图2D)。该系统是一种微流体设备，包括外壳、热载物台、光源(如LED灯)和检查窗，其中细胞培养区包括圣诞树结构的药物浓度梯度发生器，随后是用于细菌培养的带有加深微孔的微室，设置在药物浓度梯度发生器的下游。细菌标本通过以下方式接种于接收药物的培养区：首先加载到细胞培养区的入口之一，即如图24所示的入口3，同时将含药物的细胞培养基和单独的细胞培养基分别从入口1和入口2注入，如图2A1所示，然后冲洗到细胞传感器区以完成AST。在某些实施方案中，在通过使用增加的流速将细菌推入细胞计数区之前，在药物浓度梯度中培养细菌1-3小时。然后，细菌将积聚在条形码样传感区的自适应线性过滤器内，并且在革兰氏染色之后，可以使用配备有微距镜头转换器(图2B)的便携设备如手机(图2C)捕获和分析结果。图2D和图34示出了根据本发明多种实施方案制造的实际微流体设备的图像，其包含通过一体式连接器连接的细胞培养区和条形码细胞传感器。本发明条形码样细胞传感器的关键特征是，流经自适应线性过滤器的悬浮细菌细胞将积聚在自适应线性过滤器通道的下游末端；然后，积聚细胞将产生可见的条，其长度与悬浮细胞的数量成正比，从而实现无显微镜细胞计数功能(图3A2)。由于在细胞培养区中采用多个细胞培养通道用于AST目的，因此通道中的每一个连接一个细胞计数过滤器，并且这些过滤器并联排列以生成条形码样结构(图3，图23A-图23B，图32和图33)。手机可以用于拍摄这种条形码样结构，并生成对不同条相对长度的分析，从而提供有关检测药物抗检测样品的MIC值的信息。这允许快速且无显微镜地对少量细菌计数，从而实现快速、易于使用且便携的AST。

细胞培养区

本发明AST系统的微流体细胞培养区用于执行表型AST，其中细菌暴露于多种浓度的抗生素并显示出不同的增殖速率。如图2A所示，该模块包括两部分：多个分流流体通道(圣诞树结构)(作为用于进料抗生素的浓度梯度发生器)和若干用于细菌培养的加深微孔。需要流体流动来为细胞培养物提供营养支持并在细胞培养区生成抗生素浓度梯度。在中间区域的加深微孔结构被设计为实现更合适的剪切速率，从而有利于细菌在培养期间的附着。这种3D腔室设计根本上的独特之处在于它具有垂直分层的流速分布，而用于降低剪切速率的常规设计则通常使用平面布局。本发明设计可以利用细菌细胞的沉降效应，自发地将它们稳定在加深微孔的底面上，该处的剪切应力低于腔室的大部分的剪切应力。这种设计的好处是，在细胞加载过程中实现了主通道中的高流速，从而实现快速和高通量操作。将细菌预加载到加深微孔中后，将掺杂有抗生素的培养基和单独的培养基分别注入入口1和2(图2A1和图24A-图24C)。因此，将在设备上生成线性抗生素浓度梯度阶梯，并影响在加深微孔中培养的细胞。此外，通过改变浓度梯度发生器部分的设计和流体控制，可以生成对数浓度梯度而不是线性浓度梯度。

细胞培养区由称为聚丙烯(PP)的热塑性材料制成。选择PP来制作此模块有两个原因。首先，PP由于其溶剂相容性和防污性能而广泛用于商业和工业实施。与PDMS相比，PP具有高成本效益，且与溶剂相容、可重复使用、不吸收疏水性药物分子，并且为水分蒸发材料，可以解决PDMS通道中药物浓度偏差的问题，从而提供更可靠的AST结果。其次，本发明系统的设计要求细胞在培养期间留在培养室中，而后移动到下游传感器通道。根据之前的一些发现，在PDMS通道中培养的细胞将在培养期后附着在通道底部，而后无法冲到下游。相比之下，PP通道允许细胞暂时沉降，随后通过简单地增加流速而向下游移动。

如上文所讨论的，常规方法通过观察样品的宏观变化(如菌落的形成或浊度的变化)来获得AST结果，这需要多于十个小时才能完成。在之前的研究中，已经证实通过监测单个细胞的变化，可以在2-3小时内获得片上AST结果。虽然这种策略可以比常规AST方法快得多地获得AST结果，但它依赖于用显微镜检查单细胞，为资源依赖性和劳动密集型的。为了解决在常规现场筛选中、特别是在资源有限的条件下的实施瓶颈，本发明由此提供了条形码样细胞传感器。

条形码样细胞传感器

提供本发明条形码样细胞传感器是为了满足便携式AST的需求，并减少操作所需的资源和培训。它利用一组自适应线性过滤器(多个自适应线性过滤器通道)来实现用于对少量细胞计数的全自动且无显微镜的方法，否则，在没有显微镜的情况下是看不到细胞的。在接收药物的细胞培养区的培养期之后，细菌被推到下游传感器区(图2A1和图2A2)。悬浮细胞集中在自适应线性过滤器中以形成可见的微型条，其长度通常与细胞数量成正比(图3A2和图3E)。自适应线性过滤器的浓缩效应原理和制造细节将在后面的章节中讨论。染色试剂可以用于使条更清晰可见；这些条可以使用手机拍摄，并用于比较暴露于不同药物浓度后的不同细胞数量(图2B和图2C)。这提供了快速的表型AST结果，而无需使用复杂的仪器(图30A和图30B，表1)，并且大多在宏观尺度上观察到变化之前。例如，在与环境相关的AMR测试方面，需要对大量样品进行常规监测，这是非常昂贵并且劳动密集的。在这种情况下，本发明的系统特别有用。条形码样细胞传感器可以整体或独立使用，这取决于检测或分选细胞的目的。图35示出了用于AST和条形码样细胞传感器的呈圆形或圆盘形和载玻片形式的集成离心微流体平台的示意图的实例。圆盘形AST离心微流体平台将细胞培养区和细胞传感区集成到同一平台中，主要用于AST目的。相比之下，载玻片AST离心平台仅集成了细胞传感区，使得其可以与不同的药物-细胞和细胞-细胞相互作用研究一起使用，包括AST和细胞分选，例如CAR-T细胞分选。此外，通过改变设计的尺寸(例如，主通道和侧通道的宽度和高度、通道化通道的数量和排列等)，与用于检测或分选目的的本发明条形码样细胞传感器兼容的多种细胞类型可包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和植物细胞等。图34描绘了根据本发明多个实施方案的条形码样细胞传感器的三种不同设计，包括一个U形传感器(错流过滤)和两个Y形传感器(分别为错流过滤和垂直流过滤)。不同的传感器(过滤器)设计用于不同的细胞类型，取决于传感器内的流体特性，如存在细胞时流体的剪切应力和速度。通过传感器的不同设计，条形码样细胞传感器可以用于广泛种类细胞类型的AST和细胞分析，包括细菌、哺乳动物细胞、酵母、植物细胞等，特别是在细胞分选后细胞可能受到分选过程影响的情况下。

本发明AST系统中条形码样细胞传感器的操作步骤

图24示出了本发明AST系统中条形码细胞传感器的操作程序的详细信息。如前所述，本发明AST系统的设计包含两部分：第一部分是用于细菌培养的微流体(MF)PP AST芯片，第二部分是用于检查所培养细菌的MIC值的条形码样细胞传感器。开始时，将含有细菌的预培养样品通过入口3注入PP AST芯片中，并在倒置荧光显微镜下监测注射过程(图24A)。将细菌注射到PP AST芯片的培养室内后，将掺杂有抗生素的培养基和培养基分别通过入口1和入口2注入芯片中(图24B)。由于PP AST芯片的独特设计，产生了抗生素的浓度梯度，加深微室内的细菌在恒温器平台上在37℃下进一步培养1-3小时。

在药物浓度梯度内培养细菌1-3小时后，使用增加的流速将加深微室内的细菌推入下游条形码细胞传感器，以进行细胞计数和MIC评估(图24C)。PP AST芯片的八个不同出口对应于条形码细胞传感器上的八个不同入口，冲洗入细胞传感器的细菌将积聚并生成可见的图案以供检查。样品的MIC值可以通过简单地使用倒置显微镜比较不同浓度抗生素下传感器内的积聚细菌的长度来评估。为了实现和提高本发明AST系统的便携性和便利性，还可以在简单的革兰氏染色过程后使用配备有镜头转换器的手机来评估MIC值，以增加积聚细菌的可视性(图29A-图29C)。

用于感测细胞数量的自适应线性过滤器

条形码细胞传感器的关键要求是线性过滤器，其可以将悬浮液中的细菌集中到紧密堆积的条中，从而可以大体上通过所形成的条的长度来估计悬浮细胞数量。实现这种“细胞数量标尺”通常有两个障碍。首先是细菌的尺寸小：由于细菌细胞的直径仅为0.5-1μm，由于技术限制，报道的微芯片上的微加工过滤结构通常难以针对细菌减小规模。制造预先设计的纳米通道对于生产具有成本效益的设备来说可能是昂贵且不切实际的。相反，报道的片上细菌过滤通常是用纳米孔膜实现的，纳米孔膜很难进一步微加工成特殊的流体动力学设计，并且不适合本发明条形码传感器的基于透射率的成像需求。因此，需要一种具有成本效益的策略来在通道的侧壁上产生纳米孔阵列。

在本公开中，利用弹性体PDMS的自发变形和自黏性质来解决这一挑战。在低弹性模量(G≤1MPa)的情况下，低纵横比的PDMS通道容易塌陷，所得结构可以通过自黏效应稳定，甚至可以在加热后被固定。本发明中用于形成纳米级通道的顶部塌陷结构的示意图如图3B和图3D所示。在数篇不同的报告中已观察到并解释了所谓的顶部塌陷结构。简言之，顶部塌陷的形成可以归因于外部压缩载荷和PDMS与玻璃基板之间的内部黏附。冲头宽度(PW)和通道高度(CH)是顶部塌陷结构形成的两个最重要的决定因素。在本发明中，由于通道高度与冲头宽度的纵横比(CH/PW<<1)小，PDMS通道的顶部会因界面黏附而变形并接触玻璃基板。在这方面，两个基板之间的黏附驱动力可以描述为下面的等式，其中假设γ是PDMS和玻璃基板之间的黏附能量：

此外，黏附力的强度可以确定为如下所示的等式：

其中E是杨氏模量；CW代表通道宽度。

COMSOL模拟也用于本发明的某些实施方案中以预测塌陷结构并设计通道结构(图3B和图3C)。据报道，这种塌陷现象是自发的，对施加到弹性体上的力不敏感，这与本公开中的观察结果一致。这种现象也提供了一种方便和可靠的方式来生产具有成本效益的纳米过滤通道(图3D)。

第二个也是更重要的障碍是线性过滤结构面临的流动阻力问题。为了使细胞从线性通道的一个末端紧密堆积，直观的想法是仅在过滤器结构的末端制造出口。这被证实适用于较短的过滤器结构，但由于细菌细胞的尺寸，在可见长度的堆积物在长过滤器结构中产生之前，流动阻力以及由此产生的压力会迅速升高。在考虑是否在通道侧壁上打纳米孔时，尚不清楚细胞是否会堆积在通道末端或侧壁上的孔上；先前关于哺乳动物细胞过滤的报道观察到细胞均匀地堆积在方波过滤器结构的所有孔上(图3A1)。然而，线性过滤器中细胞的积聚行为可受到几何因素影响，如孔的数量和尺寸以及通道的形状。通常，当孔相对于通道的尺寸小得多时，大多数细胞不会处于朝向孔的局部流场中，而是会被通道中的层流带到下游。如果细胞接触孔周围积聚的堆积物，它是否会离开堆积物取决于三个力：净流向孔的阻力、净流向下游的阻力以及细胞周围速度梯度的升力，因为靠近固体表面的流速低于整体流速。进入单个孔的百分比流速与孔的数量成反比；此外，当孔被细胞阻塞时，随着堆积物上细胞数量的增加，堆积物顶部处流入孔的净流密度将降低。因此，假设当通道侧壁上存在大量纳米孔时，后两种力的作用将有机会超过前一种力，并且孔旁边的堆积物上的细胞将趋于移向下游。因此，在可忽略不计数量的细胞堵塞侧壁上的孔后，细胞的积聚将从通道的末端开始(图3A2)。这将实现条形码传感器所期望的细胞-数量标尺功能。

不同细菌浓度和操作流量下细菌积聚行为的比较

为了验证上文所述的假设，使用COMSOL的流体流动模块进行了流体动力学模拟。

已使用三种不同浓度的细菌悬浮液[表达GFP的大肠杆菌]来测试自适应线性过滤器的表现；将悬浮液注入过滤器中，并在相同的时间内比较细菌的积聚表现(图25)。使用紫外/可见分光光度计评估细菌悬浮液的浓度，三种不同悬浮液在600nm处的光密度分别为OD₆₀₀ 0.507(约4.05×10⁸个细胞)(图25A)、OD₆₀₀ 0.252(约2.01×10⁸个细胞)(图25B)和OD₆₀₀ 0.0470(约3.75×10⁷个细胞)(图25C)。尽管细菌悬浮液的浓度不同，但在相同的流速下，积聚的细菌随时间呈线性关系。

除细菌浓度外，流速是影响自适应线性过滤器的细菌积聚表现的另一个决定性因素。事实上，细菌对聚合物表面的黏附将取决于许多不同的因素，如细菌的疏水性和特性、聚合物表面的疏水性¹等。并且根据细菌黏附强度的不同，可以使用不同的流速(0.15μL/min-1.5μL/min)将培养室内的细菌冲洗到下游的“条形码”细胞传感器进行检查。在细菌悬浮液浓度不变的情况下，细菌在较高的流速下积聚得更快；与在1μL/min下10分钟内的积聚细菌(图25)相比，在2μL/min下3分钟内可以达到相同的积聚细菌长度(图26)。然而，由于高流速，可能发生通道化通道的部分脱黏，这可能使自适应线性过滤器发生故障，在实验设计中也应考虑到这方面。

模拟结果显示，随着通道侧壁开口数量的增加，被细胞堵塞的孔附近的流速减小，从而减小了向下游的主体流的比值(图3C)。在比较不同位置的净流方向时，通道中的净流一般向着下游，并迅速转入通道末端处的侧壁孔，表明悬浮在主体流中的细胞将迁移到通道末端并堆积在那里。因此，虽然通道的侧壁上有纳米孔，但细菌细胞不会从侧壁开始不断堆积，而是从通道末端开始堆积，因此被称为自适应线性过滤器。

根据计算和模拟的结果，制造并使用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌测试了这些设备(图23)。为了有效过滤细菌，侧纳米通道的孔被制造为具有约0.5μm的内圈(图3C)。当将细菌悬浮液注入过滤通道时，细胞从通道末端开始压缩成条；结晶紫染色后，拍摄形成的条的图像。为了了解条形码细胞传感器的细胞积聚行为，以金黄色葡萄球菌为模型进行计算，金黄色葡萄球菌是直径为约0.85μm的球形细菌。为了通过带有微距镜头转换器的手机进行检测，发现微型条的最小长度为约0.025mm。为了填充长度为0.025mm的通道，根据本文上述模型的计算，需要约1.00×10⁴个细胞。根据本公开中的测量结果，每0.025mm需要约1.04×10⁴个细胞来填充，这符合最初的预期，并证明了本发明传感器的可靠性。本发明条形码样细胞传感器在不同的细胞数量条件和流速下的细菌细胞积聚表现出高线性度(图3E、图25A-C和图26)，表明了传感器的可靠性。

使用“条形码”细胞传感器的快速AST

AST用于确定抗生素对样品细菌样品的有效性。在AST中，测量了抑制细菌增殖的最低抗生素浓度，通常称为MIC值。为了获得MIC值，必须用多种浓度的相同抗生素处理样品，这通常是劳动密集且耗时的。培养区中的微流体梯度发生器使低成本解决方案能够自动生成不同的浓度；这意味着增加更多的抗生素浓度水平不会增加劳动力成本。然而，微流体方法仍然需要使用显微镜或其他复杂的设备来测定MIC值。另一方面，使用线性过滤器阵列形成条形码，使得能够在不需要显微镜的情况下观察细胞对AST的快速响应。提供了用于手机的移动应用程序来自动记录和分析测试结果(图22A、图22B和图22C1-C3)。这样不仅简化了操作，也减少了用户所需的培训量，有助于现场实施。

为了评估本发明条形码AST系统的表现，使用不同的抗生素对不同的细菌进行AST。图4A和图4B分别示出了GFP标记的大肠杆菌对氨苄青霉素以及金黄色葡萄球菌对庆大霉素在革兰氏染色后的AST结果。为了使用本发明条形码细胞传感器测定MIC值，通过手机上的定制开发应用程序将每个积聚细菌微型条的长度转换为长度值。然后将不同药物浓度的条长度值转换为曲线(图4)，并将具有最显著斜率的点确定为MIC值(图21)。然而，在以下两种情况下，不会生成MIC值。首先，所有条的长度都在检测限内。其次，与最大测试药物浓度相对应的条的长度比没有暴露于药物的条的长度长50％(图28)。当出现这两种情况时，建议重复测试进行验证。如果结果得到确认，则认为在第一种情况下，在测试条件下，未从样品中检测到细菌，而在第二种情况下，样品中的细菌对测试的抗生素具有耐药性。使用本发明条形码AST系统获得的不同抗生素的AST结果列于表3中。还列出了使用标准肉汤微量稀释法评估的AST结果和CLSI提供的参考范围进行比较，这证明了本方法与当前标准的一致性。虽然在上一节中讨论了条形码传感器的灵敏度，但值得注意的是，与其他基于培养的检测方法类似，真实样品的灵敏度取决于总处理时间。因此，分析的周转时间可以根据所需的灵敏度调整。通常，周转时间受三个因素影响。第一个因素是样品预处理过程，通常涉及过滤和离心等方法，以去除样品中的非细菌颗粒。与常规AST相比，本方法可以节省制备在多种药物浓度中的样品的时间和人力。第二个因素是片上孵育时间。更长的培养期将允许发生更多的细胞倍增周期，从而提高检测灵敏度。与常规方法相比，本方法不需要通过倍增来等待样品的宏观变化，而是利用线性过滤器阵列将较少数量的细胞集中到微型条中，从而节省了大量时间。典型的孵育时间为3小时；当用不同浓度的抗生素处理时，这允许受抑制细胞和正常细胞之间的数量具有2^3/n(n是细菌的生成时间，以小时为单位)倍的差异。例如，目前工作中使用的两种菌株：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生成时间分别为大约0.3小时和0.5小时。请注意，生成周期会影响分析的检测限。以金黄色葡萄球菌为例，3小时的孵育允许6个周期的分裂，这将使细胞数量增加64倍。如上所述，可检测条的最小长度通常需要1.04×10⁴个细胞，因此在芯片上细胞培养之前，每个加深培养室中的样品需要约0.5×10²个细胞。最后一个因素是数据采集的时间。常规方法中的数据采集过程要么耗费人力，要么依赖于技能，要么依赖于仪器。本系统使用手机记录条码结果并自动处理数据，使得该过程快速、方便并且不需要仪器或技能要求。将培养的细胞从加深室中推出以在线性过滤器中形成条形码图案所需的时间少于15分钟。基于该测量结果，通过每个线性过滤器的流速在高至1μL/分钟的情况下，保持了令人满意的回收率。超过此流速，回收率可能会逐渐降低，这可能是由于通道结构变形或在高流速压力下的细胞压缩。综合考虑这三个因素，使用本系统的典型分析可以在2-3小时内完成。

表3：本发明条形码细胞传感器、其他AST方法(即MIC-肉汤微量稀释)和CLSI标准之间的AST结果比较。

真实样品分析

为了证实本AST系统并评估其可用性和可靠性，分析了真实的环境样品。从不同场所的公共饮水机收集了不同的样品。为了测定公共饮水机的卫生水平，使用无菌棉签擦拭饮水机的喷嘴(约4cm²)；随后，冲洗拭子，并将冲洗液用作样品。在芯片外的样品悬浮液中对细菌进行简单的预孵育和富集后，使用本系统进行AST(图5A-5C所示)。对于更复杂的样品，建议在选择性生长培养基内预孵育，然后进行稀释铺板。

为了更好地了解饮水机上通常出现的细菌物种的类型，在通用的细菌分离过程之后，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间成像质谱(MALDI-TOF IMS)进行细菌鉴定(图6A-图6C)。

基于本公开的发现，在测试样品中已识别出多种细菌物种，包括有可能在饮水机表面形成生物膜并定植的细菌物种(表2)。还进行了传统的肉汤微量稀释AST，以根据CLSI批准的标准验证本传感器的AMR评估结果(图27A和图27B，表4)。总之，这些结果表明，当前科学家和公众对环境相关AMR的关注程度还远远不够。由于AMR微生物可以存在于我们周围的环境中，在日常生活中很容易接触到，如果不采取行动，它们可能在不久的将来对细菌感染的有效治疗构成重大威胁。除了在资源有限的条件下的巨大潜力和特别有利于环境相关AMR研究的大规模筛选能力外，本AST系统还将与临床AST、抗生素效力测试和药物发现过程兼容(图28)。与标准的临床AST不同，本条形码样细胞传感器可以用于提供快速并且不依赖于资源的AMR评估，以同时筛选大量疑似样品。在样品采集后的2至3小时内，可以获得有关疑似样品的AMR评估和MIC结果的初步信息。如果发生情况4(图28)，建议通过增加抗生素浓度进行重新测试。

表4：从饮用水样品获得的细菌分离株的AST结果。R代表耐药。

结论

本发明提供了一种新颖、快速且易于使用的平台，用于不依赖资源、高通量的现场AST。该平台可以作为一种具有成本效益的样品筛选工具，快速检测任何潜在的耐药细菌，然后可以将其送去进行后续的高级分析。除了本公开中提供的环境AST外，该通用AST平台还适用于资源有限条件下或迫切需要大规模筛选的临床AST，例如，在疾病爆发或流行病的情况下。该功能由本发明的自适应线性过滤器实现，该过滤器在末端封闭的通道的侧面包含纳米通道。当细菌悬浮液通过该过滤器时，细菌细胞将积聚在通道的一端并形成微型条，其长度与悬浮液中的细胞数量成正比。当这些过滤器连接到微流体药物梯度片上培养通道系统的出口时，可以通过比较形成的条的长度来获得快速AST结果，这些条形成了条形码样细胞传感器。本公开提供了一种用于智能手机的应用程序，以捕获条形码的图像并自动分析测试结果。模式菌株和实际样品测试显示该系统性能可靠；典型的测试可以在2至3小时内完成(图1)。本系统有望成为在如食品工业、公共场所和医疗机构等不同情况下常规筛选耐药菌的有用工具，无需先进的临床测定设施和操作技能即可使用。

工业应用

本发明涉及一种用于基于自适应线性过滤器阵列对体积非常小的细胞进行计数的细胞传感器。更具体地，本发明涉及一种使用结合自适应线性过滤器阵列(或在本公开中可互换地称为条形码细胞传感器)的全自动和无显微镜的细胞传感器的方法，其中悬浮细胞集中到微型条中，该微型条具有与细胞数量成正比的不同长度，从而提供定量分析平台，其结果可以容易地通过安装有相应软件程序的便携式设备进行评估。

Claims (23)

1.一种基于微流体的平台，所述基于微流体的平台用于实施一锅法抗微生物剂敏感性测试，所述基于微流体的平台包括细胞培养、药物-细胞孵育和通过一种或更多种化合物处理后的活细胞无显微镜定量分析，所述基于微流体的平台包括：

热载物台；

光源；和

目视检查窗，

所述热载物台包括细胞培养区和细胞传感区，

所述细胞培养区包括至少三个流体入口和相对于所述至少三个流体入口位于下游的药物浓度梯度发生器，以及多个微室，所述药物浓度梯度发生器包括多个分流流体通道，所述多个分流流体通道将所述流体入口中的至少两个下游的流体进行分流，所述多个微室各自具有一个或更多个用于细胞培养的加深微孔；

所述细胞传感区包括多个自适应线性过滤器通道，所述多个自适应线性过滤器通道经由一体式连接器连接至所述细胞培养区的多个流体出口，所述自适应线性过滤器通道中的每一个配置为接收来自所述细胞培养区的培养细胞，并且随后所接收的培养细胞将积聚在所述自适应线性过滤器通道中的每一个的下游末端，

所述光源设置在所述自适应线性过滤器通道的下游末端的附近或近端，用于向在所述自适应线性过滤器通道中的每一个的下游末端处积聚的培养细胞照射一定波长的光，以便通过设置在所述多个自适应线性过滤器通道的外壳上方的目视检查窗可视化所述积聚的培养细胞，并且来源于其的图像信号能够被配备有成像功能的便携式设备直接捕获。

2.根据权利要求1所述的基于微流体的平台，其中所述自适应线性过滤器通道中的每一个包括至少一个主通道和在与所述至少一个主通道平行的方向上设置的至少两个侧通道，并且所述至少一个主通道通过相对于所述至少一个主通道和所述至少两个侧通道在正交方向上设置的多个纳米级通道化通道与所述至少两个侧通道连通，使得流经所述自适应线性过滤器通道的所述至少一个主通道的含有培养细胞的流体基于过滤作用通过所述多个纳米级通道化通道被引导至所述至少两个侧通道。

3.根据权利要求2所述的基于微流体的平台，其中所述至少一个主通道和所述至少两个侧通道具有相同的横截面积，其中通道高度与通道宽度的纵横比小于1。

4.根据权利要求3所述的基于微流体的平台，其中所述至少一个主通道和所述至少两个侧通道具有约8μm的平均通道高度。

5.根据权利要求3所述的基于微流体的平台，其中所述至少一个主通道和所述至少两个侧通道具有约16μm的平均通道宽度。

6.根据权利要求5所述的基于微流体的平台，其中所述纳米级通道化通道具有与所述至少一个主通道和所述至少两个侧通道相同的通道宽度，和约800nm的平均通道高度。

7.根据权利要求1所述的基于微流体的平台，其中所述细胞传感区包括至少八个自适应线性过滤器通道，以形成具有不同长度的可见微型条的自适应线性过滤器通道的阵列，所述不同长度的可见微型条对应于用根据所述细胞培养区的所述药物浓度梯度发生器的所述分流流体通道的不同流体通道的不同浓度的所述一种或更多种化合物处理后，在所述自适应线性过滤器通道中的每一个通道处积聚的细胞的不同数量。

8.根据权利要求7所述的基于微流体的平台，其中所述可见微型条的长度与用来自所述细胞培养区处的所述药物浓度梯度发生器的所述分流流体通道之一的特定浓度的所述一种或更多种化合物处理细胞后积聚在相应的自适应线性过滤器通道处的活细胞的增殖速率成正比。

9.根据权利要求1所述的基于微流体的平台，其中含有药物的流体被加载到相对于所述药物浓度梯度发生器设置在上游的所述流体入口中的一个中，而纯流体被加载到同样相对于所述药物浓度梯度发生器设置在上游的另一个流体入口中。

10.根据权利要求2所述的基于微流体的平台，其中所述含有细胞的流体被加载到相对于所述微室设置在上游的所述流体入口中。

11.根据权利要求1所述的基于微流体的平台，其中对在所述自适应线性过滤器通道处积聚的细胞进行革兰氏染色，使得在所述光源的照射下，来源于经革兰氏染色的细胞的图像信号被所述配备有成像功能的便携式设备直接捕获，并且其中由所述光源照射的光的波长在可见光范围内。

12.根据权利要求1所述的基于微流体的平台，其中至少所述热载物台的所述细胞培养区和所述细胞传感区由一种或更多种生物相容的热塑性材料制成，而当纯流体被加载到所述流体入口之一中以相对于所述细胞培养区的所述流体出口向下游方向冲洗所述培养细胞时，在所述细胞培养区培养的所述细胞不会黏附在所述细胞培养区的所述微流体通道的内表面上。

13.根据权利要求12所述的基于微流体的平台，其中所述热塑性材料包含聚丙烯。

14.一种用于筛选或评估潜在候选药物对一种或更多种微生物的抗微生物剂活性的系统，所述系统包括容纳根据权利要求1所述的基于微流体的平台的外壳、全自动流体泵、用于控制将不同流体加载到所述平台的所述流体入口的主电路板和多个控制组件、连接到所述基于微流体的平台的一个或更多个流体入口的试剂室、带有恒温器的药物-细胞孵育室和无影灯面板，所述恒温器用于控制其中所述一种或更多种微生物与不同浓度的所述潜在候选药物一起孵育的所述细胞培养区的温度，所述无影灯面板用于通过配备到便携式设备的微距镜头从所述可见检查窗捕获所述基于微流体的平台的所述细胞传感区处可视化的积聚细胞的图像。

15.一种用于筛选或评估潜在候选药物对感兴趣的一种或更多种微生物的抗微生物剂活性的方法，所述方法包括：

将所述潜在候选药物加载到根据权利要求14所述的系统的所述试剂室中；

使用安装在配对工作站或便携式设备中的相应软件程序来控制所述系统的所述自动流体泵的电源开/关和由所述自动流体泵生成的流体的流量；

将所述感兴趣的一种或更多种微生物加载到所述基于微流体的平台的相应流体入口；

在所述系统的所述药物-细胞孵育室中，在由所述恒温器控制的恒温下，用在所述基于微流体的平台的所述细胞培养区中的不同浓度的所述潜在候选药物处理所述一种或更多种微生物，持续足够的时间；

通过所述配对工作站或便携式设备的所述软件程序激活所述系统的抗微生物剂敏感性测试功能，在用不同浓度的所述潜在候选药物处理之后，将所述一种或更多种微生物的细胞培养物经由所述一体式连接器从所述细胞培养区冲洗到所述基于微流体的平台的所述细胞传感区；

在所述系统的所述无影灯面板的照射下，通过与所述工作站或所述便携式设备配对的成像模块，捕获来源于所述细胞传感区的所述自适应线性过滤器的阵列处积聚的所述一种或更多种微生物的培养细胞的可见条的图像；

将捕获的图像转换为所述可见条的不同长度的图像数据；

将所述可见条的不同长度的所述图像数据与参考图像数据进行比较，以确定所述潜在候选药物对所述感兴趣的一种或更多种微生物的抗微生物剂活性。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述在由所述恒温器控制的恒温下，在所述基于微流体的平台的所述细胞培养区中，用不同浓度的所述潜在候选药物处理所述一种或更多种微生物的持续时间为约1-3小时。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述一种或更多种微生物包含抗微生物剂耐药性微生物。

18.一种用于评估微生物对化合物的抗微生物剂耐药性的方法，所述方法包括：

将所述化合物加载到根据权利要求14所述的系统的所述试剂室中；

使用安装在配对工作站或便携式设备中的相应软件程序来控制所述系统的所述自动流体泵的电源开/关和由所述自动流体泵生成的流体的流量；

将所述微生物加载到所述基于微流体的平台的相应流体入口；

在所述系统的所述药物-细胞孵育室中，在由所述恒温器控制的恒温下，用在所述基于微流体的平台的所述细胞培养区中的不同浓度的所述化合物处理所述微生物，持续足够的时间；

通过所述配对工作站或便携式设备的所述软件程序激活所述系统的抗微生物剂敏感性测试功能，在用不同浓度的所述化合物处理之后，将所述微生物的细胞培养物经由所述一体式连接器从所述细胞培养区冲洗到所述基于微流体的平台的所述细胞传感区；

在所述系统的所述无影灯面板的照射下，通过与所述工作站或所述便携式设备配对的成像模块，捕获来源于所述细胞传感区的所述自适应线性过滤器的阵列处积聚的所述微生物的培养细胞的可见条的图像；

将捕获的图像转换为所述可见条的不同长度的图像数据；

将所述可见条的不同长度的所述图像数据与参考图像数据进行比较，以确定所述微生物对所述化合物的所述抗微生物剂耐药性。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述在由所述恒温器控制的恒温下，在所述基于微流体的平台的所述细胞培养区中，用不同浓度的所述化合物处理所述微生物的持续时间为约1-3小时。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述化合物是包含庆大霉素、氨苄青霉素、四环素和红霉素的一种或更多种抗微生物剂；所述微生物包含一种或更多种细菌菌株。

21.一种用于评估流体样品中抗微生物剂耐药性微生物的方法，所述方法包括：

将一种或更多种已知抗微生物剂加载到根据权利要求14所述的系统的所述试剂室中；

使用安装在配对工作站或便携式设备中的相应软件程序来控制所述系统的所述自动流体泵的电源开/关和由所述自动流体泵生成的流体的流量；

将所述流体样品加载到所述基于微流体的平台的相应流体入口；

在所述系统的所述药物-细胞孵育室中，在由所述恒温器控制的恒温下，用在所述基于微流体的平台的所述细胞培养区中的不同浓度的所述一种或更多种已知化合物处理所述流体样品，持续足够的时间；

通过所述配对工作站或便携式设备的所述软件程序激活所述系统的抗微生物剂敏感性测试功能，在用不同浓度的所述一种或更多种已知化合物处理之后，将所述流体样品中的微生物的细胞培养物经由所述一体式连接器从所述细胞培养区冲洗到所述基于微流体的平台的所述细胞传感区；

在所述系统的所述无影灯面板的照射下，通过与所述工作站或所述便携式设备配对的成像模块，捕获来源于所述细胞传感区的所述自适应线性过滤器的阵列处积聚的所述微生物的培养细胞的可见条的图像；

将捕获的图像转换为所述可见条的不同长度的图像数据；

将所述可见条的不同长度的所述图像数据与参考图像数据进行比较，以确定所述流体样品中的所述微生物的身份及其对所述已知化合物的抗微生物剂耐药性。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述一种或更多种已知抗微生物剂包含庆大霉素、氨苄青霉素、四环素和红霉素；所述流体样品中的所述微生物包含抗微生物剂耐药性微生物。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述在由所述恒温器控制的恒温下，在所述基于微流体的平台的所述细胞培养区中，用不同浓度的所述一种或更多种已知化合物处理所述流体样品的持续时间为约1-3小时。