CN115992270A

CN115992270A - 一种用于呼吸道细菌病原体检测的引物探针组合物、试剂及试剂盒

Info

Publication number: CN115992270A
Application number: CN202211055168.3A
Authority: CN
Inventors: 刘亚宝; 储倩
Original assignee: Sichuan Yazhong Gene Technology Co ltd
Current assignee: Sichuan Yazhong Gene Technology Co ltd
Priority date: 2022-08-30
Filing date: 2022-08-30
Publication date: 2023-04-21

Abstract

本发明公开了一种用于呼吸道细菌病原体检测的引物探针组合物、试剂及试剂盒，涉及呼吸道病原体检测技术领域。本发明提供的引物探针组合物具有检测呼吸道病原体的种类多，范围广，准确度高的优势。可以在肺部感染、血液感染等多种细菌病原体感染的场景中使用，包含社区获得性肺炎检测和院内病原体感染检测。

Description

一种用于呼吸道细菌病原体检测的引物探针组合物、试剂及试剂盒

技术领域

本发明涉及呼吸道病原体检测技术领域，具体而言，涉及一种用于呼吸道细菌病原体检测的引物探针组合物、试剂及试剂盒。

背景技术

全国细菌耐药监测报告显示，2018年革兰阳性菌分离率第一为金黄色葡萄球菌(32.5％)，革兰阴性菌分离率由高到低分别为大肠埃希(28.9％)、肺炎克雷伯菌(20.4％)、铜绿假单胞菌(12.4％)、鲍曼不动杆菌(9.9％)和阴沟肠杆菌(4.0％)。依据标本来源数量，其中痰标本占41.5％、尿标本占18.8％、血标本占9.2％。感染性疾病需要及时准确地明确病原菌种类，并针对性应用敏感抗菌药物。而相较于传统检验方法，定量PCR在病原菌感染检测方面具有明显的优势。

目前，我国呼吸道病原体的传统检测方法主要包括以下几种：

(1)病原体检查：即直接做影像及活组织检查，或病原体分离培养，之后在显微镜、电镜下观察，做出诊断。优点是成本低。但存在如下缺点:耗时长，一般需3-5天或更长；诊断效率低，每次只能每个菌单独培养；假阴性结果高，由于抗生素的滥用，细菌在检测过程中生长受到抑制导致假阴性。

(2)免疫学检查：应用最广泛的是酶联免疫技术(ELISA)。一般先用一抗与抗原发生特异性结合，然后用通用的酶标记的二抗与一抗发生特异性结合，再将酶显色，之后观察结果。有通量高、敏感、快速等优点。但存在如下缺点：易出现假阳性；灵敏度低；无法检测多变异的病毒。

(3)分子生物学——PCR检测方法：目前经常应用的有实时荧光定量PCR、免疫PCR、反转录PCR等，都是针对病原体的特异性靶基因进行检测。其中，荧光定量PCR检测方法最为成熟。荧光定量PCR技术的优点：灵敏性高，准确度高。但目前尚不能解决同时快速检测出多种肺炎病原菌问题。

目前已有多个与细菌分子检测相关的专利：专利CN 112481398 A采用PCR-探针法检测肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌共九种细菌；专利CN 111349708 A采用量子点核酸检测方法对11种细菌和病毒进行检测；专利CN 108588246 A采用PCR-探针法对鲍曼不动杆菌bfs基因、绿脓杆菌toxR基因、念珠菌ITS基因、曲霉菌mot1基因、表皮葡萄球菌gseA基因、军团菌mip基因、肺炎支原体23S基因、肺炎衣原体Cpn0308基因进行检测；专利CN108384867 A分别针对分枝杆菌16S基因、金黄色葡萄球菌fem A基因、肺炎克雷伯菌phoE基因、肺炎链球菌ply基因、嗜麦芽寡养单胞菌Sm16S基因、枸橼酸菌cfa基因、阴沟肠杆菌ampC基因、流感嗜血杆菌ompP6基因进行检测；专利201711116382.4采用PCR-探针法检测肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、卡他莫拉菌的特异性序列。目前，现有细菌检测专利的缺点是检测细菌的种类相对有限，缺乏一种针对广泛的呼吸道细菌的准确检测方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于呼吸道细菌病原体检测的引物探针组合物、试剂及试剂盒以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种用于呼吸道细菌病原体检测的引物探针组合物，其包括如下引物探针组合中的至少一种：

用于检测金黄色葡萄球菌的如SEQ ID NO.1-3所示的第一引物探针组合，用于检测肺炎链球菌的如SEQ ID NO.4-6所示的第二引物探针组合，用于检测卡他莫拉菌的如SEQID NO.7-9所示的第三引物探针组合，用于检测军团菌的如SEQ ID NO.10-12所示的第四引物探针组合，用于检测大肠杆菌的如SEQ ID NO.13-15所示的第五引物探针组合，用于检测阴沟肠杆菌的如SEQ ID NO.16-18所示的第六引物探针组合，用于检测嗜麦芽窄食单胞菌的如SEQ ID NO.19-21所示的第七引物探针组合，用于检测肠球菌的如SEQ ID NO.22-24所示的第八引物探针组合，用于检测沙雷氏菌属的如SEQ ID NO.25-27所示的第九引物探针组合，用于检测表皮葡萄球菌的如SEQ ID NO.28-30所示的第十引物探针组合，用于检测鲍曼不动杆菌的如SEQ ID NO.31-33所示的第十一引物探针组合，用于检测流感嗜血杆菌的如SEQ ID NO.34-36所示的第十二引物探针组合，用于检测铜绿假单胞菌的如SEQ IDNO.37-39所示的第十三引物探针组合，用于检测肺炎克雷伯菌的如SEQ ID NO.40-42所示的第十四引物探针组合。各引物探针组合的序列如下表1所示。

表1细菌检测的引物和寡核苷酸探针序列

发明人发现，采用上述检测引物探针组合物可以快速准确地实现呼吸道细菌病原体的检出。而且采用多种引物探针组合通过多重荧光PCR-探针法可同时检测金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、军团菌、卡他莫拉菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肠球菌、沙雷氏菌属、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌。本发明提供的引物探针组合物具有检测呼吸道病原体的种类多，范围广，准确度高的优势。可以在肺部感染、血液感染等多种细菌病原体感染的场景中使用，包含社区获得性肺炎检测和院内病原体感染检测。

本发明提供的引物探针组合物可以消除由于多种引物探针的相互作用所产生的非特异性扩增。与细菌培养法相比较，本发明提供的引物探针组合物的检测敏感性大于99％，特异性大于85.71％，总体符合性大于92.06％，可以满足临床检测的需求。具有较高的检测灵敏度和特异性，细菌检测限最低为50copies/反应。本发明提供的引物探针组合物扩增后的产物，经PCR+Sanger测序法进行验证，正确率100％。

第一引物探针组合针对的靶基因是金黄色葡萄球菌的nuc基因；第二引物探针组合针对的靶基因是肺炎链球菌的lytA基因；第三引物探针组合针对的靶基因是卡他莫拉菌copB基因；第四引物探针组合针对的靶基因是军团菌mip基因；第五引物探针组合针对的靶基因是大肠杆菌uidA基因；第六引物探针组合针对的靶基因是阴沟肠杆菌dnaJ基因；第七引物探针组合针对的靶基因是嗜麦芽窄食单胞菌fdnG基因；第八引物探针组合针对的靶基因是肠球菌ddl基因；第九引物探针组合针对的靶基因是沙雷氏菌属luxS基因；第十引物探针组合针对的靶基因是表皮葡萄球菌gseA基因；第十一引物探针组合针对的靶基因是鲍曼不动杆菌secE基因；第十二引物探针组合针对的靶基因是流感嗜血杆菌phd3基因；第十三引物探针组合针对的靶基因是铜绿假单胞菌pyrB基因；第十四引物探针组合针对的靶基因是肺炎克雷伯菌gltA基因。

为了方便病原体检测，在引物探针组合中的探针在5’端均标记有荧光报告基团，在探针的3’端均标记有荧光淬灭基团。探针可以采用不同的荧光标记，也可采用相同的荧光标记。当使用不同荧光标记时，检测结果可以对细菌进行分型；当使用相同荧光标记时，检测结果不分型。

在本发明应用较佳的实施方式中，荧光报告基团选自HEX、FAM、5-FAM、6-FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Texas Red、NED、Alexa Flour、TET、Quasar670和VIC等，淬灭基团选自MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和QSY等。

在本发明应用较佳的实施方式中，引物探针组合还包括用于检测内标基因的如SEQ ID NO.43-45所示的引物探针组合。

本发明提供了一种较优的引物探针组合方式，具体如下：

引物探针组合物包括如下至少一种的引物探针集合：集合1、集合2和集合3。

集合1包括：用于检测金黄色葡萄球菌的如SEQ ID NO.1-3所示的第一引物探针组合，用于检测肺炎链球菌的如SEQ ID NO.4-6所示的第二引物探针组合，用于检测卡他莫拉菌的如SEQ ID NO.7-9所示的第三引物探针组合，用于检测军团菌的如SEQ ID NO.10-12所示的第四引物探针组合和用于检测大肠杆菌的如SEQ ID NO.13-15所示的第五引物探针组合；

集合2包括：用于检测阴沟肠杆菌的如SEQ ID NO.16-18所示的第六引物探针组合，用于检测嗜麦芽窄食单胞菌的如SEQ ID NO.19-21所示的第七引物探针组合，用于检测肠球菌的如SEQ ID NO.22-24所示的第八引物探针组合，用于检测沙雷氏菌属的如SEQ IDNO.25-27所示的第九引物探针组合和用于检测表皮葡萄球菌的如SEQ ID NO.28-30所示的第十引物探针组合；

集合3包括：用于检测鲍曼不动杆菌的如SEQ ID NO.31-33所示的第十一引物探针组合，用于检测流感嗜血杆菌的如SEQ ID NO.34-36所示的第十二引物探针组合，用于检测铜绿假单胞菌的如SEQ ID NO.37-39所示的第十三引物探针组合和用于检测肺炎克雷伯菌的如SEQ ID NO.40-42所示的第十四引物探针组合。

采用上述组合体系经优化，可以在一个反应体系中实现最多五个靶标的核酸检测，且消除了因为引物探针间相互作用所产生的非特异性扩增显现。

对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡是以本发明涉及的引物探针序列进行部分修改的，或改变引物探针组合方式的，或改变探针荧光标记的，或使用探针互补序列等，均应视为本发明的精神和原则之内。

例如任意选择6-8个引物探针组合作为集合1，任意6-8个引物探针组合作为集合2。

在本发明应用较佳的实施方式中，集合3还包括用于检测内标基因的如SEQ IDNO.43-45所示的引物探针组合。

本发明还提供了一种用于呼吸道细菌病原体检测的试剂，其包括上述的引物探针组合物。

在本发明应用较佳的实施方式中，试剂还包括如下物质中的至少一种：聚合酶、UDG酶、dNTP、dUTP、PCR缓冲剂和水。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂中，聚合酶选自Taq DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶为1U～5U/反应，UNG酶为1U～5U/反应，dNTP的终反应浓度为0.1mmol/L～0.5mmol/L，dUTP的终反应浓度为0.1mmol/L～0.5mmol/L。

本发明还提供了一种用于呼吸道细菌病原体检测的试剂盒，试剂盒包括上述的引物探针组合物或上述的试剂。

本发明还提供了一种引物探针组合物或试剂在制备呼吸道细菌病原体检测试剂盒中的应用；

在本发明应用较佳的实施方式中，应用中，引物的终浓度为0.2μmol/L～0.6μmol/L，探针的终浓度为0.1μmol/L～0.4μmol/L。

在本发明应用较佳的实施方式中，应用中，扩增程序包括：25℃10min；95℃-98℃1-5min；95℃-98℃5-10s，55℃-60℃18-20s，循环38-42次。

本发明提供的引物探针组合物或试剂可以用于人肺部感染、血液感染等细菌病原体检测中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种引物探针组合物，采用上述检测引物探针组合物可以快速准确地实现呼吸道细菌病原体的检出。而且采用多种引物探针组合通过多重荧光PCR-探针法可同时检测金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、军团菌、卡他莫拉菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肠球菌、沙雷氏菌属、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌。本发明提供的引物探针组合物具有检测呼吸道病原体的种类多，范围广，准确度高的优势。可以在肺部感染、血液感染等多种细菌病原体感染的场景中使用，包含社区获得性肺炎检测和院内病原体感染检测。

本发明提供的引物探针组合物可以消除由于多种引物探针的相互作用所产生的非特异性扩增。与细菌培养法相比较，本发明提供的引物探针组合物的检测敏感性大于99％，特异性大于85.71％，总体符合性大于92.06％，可以满足临床检测的需求。具有较高的检测灵敏度和特异性，细菌检测限最低为50copies/反应。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1A为采用PCR体系1检测金黄色葡萄球菌的FAM通道多重荧光PCR结果图；

图1B为采用PCR体系1检测军团菌的ROX通道多重荧光PCR结果图；

图1C为采用PCR体系1检测卡他莫拉菌的CY5通道多重荧光PCR结果图；

图1D为采用PCR体系1检测肺炎链球菌的NED通道多重荧光PCR结果图；

图1E为采用PCR体系1检测大肠杆菌的HEX通道多重荧光PCR结果图；

图1F为采用PCR体系1检测金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、军团菌、卡他莫拉菌和大肠杆菌的FAM，NED，ROX，CY5和HEX通道多重荧光PCR结果图；

图2A为采用PCR体系2检测表皮葡萄球菌的FAM通道多重荧光PCR结果图；

图2B为采用PCR体系2检测阴沟肠杆菌的ROX通道多重荧光PCR结果图；

图2C为采用PCR体系2检测嗜麦芽窄食单胞菌的CY5通道多重荧光PCR结果图；

图2D为采用PCR体系2检测肠球菌的NED通道多重荧光PCR结果图；

图2E为采用PCR体系2检测沙雷氏菌的HEX通道多重荧光PCR结果图；

图2F为采用PCR体系2检测阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肠球菌、沙雷氏菌属和表皮葡萄球菌的ROX，CY5，NED，HEX和FAM通道多重荧光PCR结果图；

图3A为采用PCR体系3检测鲍曼不动杆菌的FAM通道多重荧光PCR结果图；

图3B为采用PCR体系3检测肺炎克雷伯菌的ROX通道多重荧光PCR结果图；

图3C为采用PCR体系3检测铜绿假单胞菌的CY5通道多重荧光PCR结果图；

图3D为采用PCR体系3检测流感嗜血杆菌的HEX通道多重荧光PCR结果图；

图3E为采用PCR体系3检测鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的FAM，HEX，CY5和ROX通道多重荧光PCR结果图；

图4为采用PCR体系3检测肺炎克雷伯菌的灵敏度实验结果图；

图5为将培养法和核酸检测法检测结果差异的鲍曼不动杆菌阳性样本进行测序结果图；

图6为将培养法和核酸检测法检测结果差异的肺炎克雷伯菌阳性样本进行测序结果图；

图7为将培养法和核酸检测法检测结果差异的金黄色葡萄球菌阳性样本进行测序结果图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratoryManual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种包括不同引物探针组合的细菌核酸检测PCR试剂，其包括：PCR反应液1、PCR反应液2和PCR反应液3。

1.PCR反应液1中的引物/探针组合：

2.PCR反应液2中的引物/探针组合：

3.PCR反应液3中的引物/探针组合：

4.PCR反应液包含：PCR反应缓冲液，DNA聚合酶1U～5U Taq/反应，UNG酶1U～5U/反应，脱氧核糖核苷三磷酸0.1mmol/L～0.5mmol/L，dUTP 0.1mmol/L～0.5mmol/L，靶标基因的上游引物以及下游引物0.2μmol/L～0.6μmol/L，靶标基因的探针0.1μmol/L～0.4μmol/L用，内标基因的上游引物以及下游引物0.1μmol/L～0.3μmol/L，内标的探针0.05μmol/L～0.2μmol/L。

5.该组合可检测出金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、军团菌、卡他莫拉菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肠球菌、沙雷氏菌属、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌细菌。

实施例2

本实施例提供实施例1所示的PCR检测试剂的使用方法。

其包括如下步骤：

1.样本采集：

1.1适用样本：痰液样本。

1.2样本采集方法：将患者的深肺痰液收集到一次性痰杯中，盖紧杯盖。

1.3采集的标本应及时送检，24小时内检测的应4℃保存。

1.4样本运输应采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

2.样本前处理：

2.1痰液液化。

取500ul痰液，加入Qiagen DNA Mini Kit推荐液化剂500ul混合，涡旋混匀后液化30min(期间涡旋3-4次)后取400ul上清到1.5mlEP管中，涡旋震荡5min。

2.2痰液样本的核酸提取。

可使用商业化痰液核酸DNA提取试剂盒(如Qiagen DNA Mini Kit等)，提取过程应按照商业试剂盒的说明书进行操作，纯化后的核酸可用于后续PCR扩增。

本实施例采用Qiagen DNA Mini Kit，具体操作步骤如下：

2.2.1向已装有痰液处理液400ul的1.5mlEP管中加入180μl buffer ATL和20ul蛋白酶K,涡旋震荡10s后孵育10min。

2.2.2前述EP管中加入200ul buffer AL。混合均匀涡旋振荡15s。

2.2.4 70℃孵育10min。加入200ul酒精(96％-100％)涡旋振荡15s。短暂离心后，将上清移至QIAamp微型柱中，并将微型柱置于2ml收集管中,盖上盖子。

2.2.5将上述收集管6000x g离心1min。将旧的收集管与滤液一起丢弃。

2.2.6将QIAamp微型柱置于新的2ml收集管中。向QIAamp微型柱中加500μl缓冲液AW1。盖上盖子，6000x g离心1min。将旧的收集管与滤液一起丢弃。

2.2.7将QIAamp微型柱置于新的2mL收集管中。向QIAamp微型柱中加500μl缓冲液AW2。盖上盖子，20000x g离心3min。

2.2.8将QIAamp微型柱放入一个新的2毫升收集管，并将旧的收集管与滤液一起丢弃。以6000x g离心1分钟。

2.2.9将QIAamp微型柱置于干净的1.5ml EP管中。丢弃含有滤液的旧收集管。小心打开盖子并添加200μl缓冲液AE。盖上盖子，然后室温静置1分钟。

2.2.10以8000rpm离心1分钟。丢弃QIAamp微型柱，保留含有洗脱液的EP管，后续可用于PCR扩增。

3.试剂加样：

3.1取15μL不同引物/探针组合的细菌核酸检测PCR反应液1、PCR反应液2、PCR反应液3分别加入到3个不同PCR管中；

3.2取5μL处理后样本(或质控品)的核酸(2.2提取的核酸)分别加入到PCR反应液1、PCR反应液2和PCR反应液3中。盖上PCR管盖子，待上机。

3.3加样方式举例

注:NC-阴性质控；PC-阳性质控。

4.PCR扩增程序设置及运行：

4.1在荧光定量PCR仪器如ABI7500,Bio-Rad CFX96,Roche LightCycler 480,SLAN-96S上进行PCR扩增。

4.2打开仪器，放入待检测的PCR管。

4.3设置扩增程序。选择相应的荧光通道FAM通道(Reporter:FAM，Quencher:None)、HEX通道(Reporter:HEX，Quencher:None)、NED通道(Reporter:NED，Quencher:None)、ROX通道(Reporter:ROX，Quencher:None)、CY5通道(Reporter:CY5，Quencher:None)。进行样本编辑。

4.4运行扩增程序。

4.5具体扩增程序如下：

5.结果分析：

5.1反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(cycle threshold)；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。

5.2对于测定Ct值≤40的样本，报告为阳性(POS)；对于测定无Ct值或Ct值>40的样本，报告为阴性(NEG)。若内标Ct值>38或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。

6.结果判读：

6.1PCR体系1的细菌检测试剂结果判读如下：

6.2PCR体系2的细菌检测试剂结果判读如下：

6.3PCR体系3的细菌检测试剂结果判读如下：

实验例1

本实验例采用实施例2中的试剂针对细菌、真菌菌株进行检测，验证其特异性。

在国家微生物保藏中心和四川省抗菌素研究所获得的细菌和真菌培养物，培养物用对应培养基稀释到1×10⁶拷贝/ml浓度。

按照实施例2中的检测方法，对上述不同细菌和真菌培养物进行检测，结果统计如下(“+”表示有扩增信号，“-”表示无扩增信号，编号1-20为细菌，编号21-36为真菌)：

其中PCR体系1涉及五种荧光信号，以金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、军团菌、卡他莫拉菌和大肠杆菌为例，其对应的信号通道分别为FAM，NED，ROX，CY5和HEX。检测结果如图1A-F所示，图1A为FAM通道结果，图1B为ROX通道结果，图1C为CY5通道结果，图1D为NED通道的结果,图1E为HEX通道结果,图1F为五个通道结果。

PCR体系2涉及五种荧光信号，以阴沟肠杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肠球菌、沙雷氏菌属和表皮葡萄球菌为例，其对应的信号通道分别为ROX，CY5，NED，HEX和FAM。检测结果如图2A-F所示，图2A为FAM通道结果，图2B为ROX通道结果，图2C为CY5通道结果，图2D为NED通道的结果,图2E为HEX通道结果,图2F为五个通道结果。

PCR体系3涉及四种荧光信号，以鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌为例，其对应的信号通道分别为FAM，HEX，CY5和ROX。检测结果如图3A-E所示，图3A为FAM通道结果，图3B为ROX通道结果，图3C为CY5通道结果，图3D为HEX通道的结果，图3E为四个通道结果。

结果显示本发明针对的14种细菌的细菌检出率均为100％，其他6种细菌以及真菌均无法检出。

根据本发明提供的引物探针组合方式进行结果分析，各细菌菌种在对应的信号通道都有扩增信号，在其他信号通道则没有扩增信号，且各信号通道间互不影响。因此，本发明提供的试剂可以进行多种细菌的核酸检测，特异性好。

实验例2

本实验例进行引物探针组合的灵敏度验证。

以肺炎克雷伯菌为例，使用商业化DNA提取试剂盒(如Qiagen DNA Mini Kit等)提取细菌培养物的基因组DNA。使用Qubit核酸测定仪测定浓度值为2.8ng/ul，连续梯度稀释所提取的DNA:2.8*10^-1ng/ul～2.8*10^-6ng/ul，经实验该体系可检测的最低浓度为2.8*10^- ⁴ng/反应，典型的细菌基因组DNA大小为5*10⁶bp，经计算该体系检测的最低检测线为50copies/反应。最低检测限结果如图4所示。检测体系为实施例1中的PCR反应液3。

检测结果显示，本发明提供的引物探针组合具有较高的检测灵敏度。

实验例3

本实验例提供了一种肺部感染患者的细菌核酸检测的实例。

在四川省人民医院ICU科室收集感染患者的痰液共计63例，同时与培养法进行比较。

细菌核酸检测按照实施例2中的方法进行检测。检测结果如下：

本次收集的痰液样本共计63例，其中培养法细菌阳性样本为28例，细菌核酸检测33例，差异结果样本为5例。

将5份差异样本采用Sanger测序法进行验证，测序结果表明3例样本分别为：

鲍曼不动杆菌阳性样本1例，测序结果(图5)显示序列为GCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGAT；

肺炎克雷伯菌阳性样本2例，测序结果(图6)显示序列为GTAGCTAATACCGCATAATGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGG；

金黄色葡萄球菌阳性样本2例，测序结果(图7)显示序列为CGGAGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTCAAAAGTGAAAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGATGGATC。

测序结果与PCR结果吻合。结果差异的原因推测为厌氧菌培养困难导致。

临床样本检测结果统计如下表：

综上，本发明提供的方法与细菌培养法比较，敏感性及特异性更强，检出率更高，同时操作简单，耗时短，该方法可满足细菌感染在临床辅助诊断的要求。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于呼吸道细菌病原体检测的引物探针组合物，其特征在于，其包括如下引物探针组合中的至少一种：

用于检测金黄色葡萄球菌的如SEQ ID NO.1-3所示的第一引物探针组合，用于检测肺炎链球菌的如SEQ ID NO.4-6所示的第二引物探针组合，用于检测卡他莫拉菌的如SEQ IDNO.7-9所示的第三引物探针组合，用于检测军团菌的如SEQ ID NO.10-12所示的第四引物探针组合，用于检测大肠杆菌的如SEQ ID NO.13-15所示的第五引物探针组合，用于检测阴沟肠杆菌的如SEQ ID NO.16-18所示的第六引物探针组合，用于检测嗜麦芽窄食单胞菌的如SEQ ID NO.19-21所示的第七引物探针组合，用于检测肠球菌的如SEQ ID NO.22-24所示的第八引物探针组合，用于检测沙雷氏菌属的如SEQ ID NO.25-27所示的第九引物探针组合，用于检测表皮葡萄球菌的如SEQ ID NO.28-30所示的第十引物探针组合，用于检测鲍曼不动杆菌的如SEQ ID NO.31-33所示的第十一引物探针组合，用于检测流感嗜血杆菌的如SEQ ID NO.34-36所示的第十二引物探针组合，用于检测铜绿假单胞菌的如SEQ ID NO.37-39所示的第十三引物探针组合，用于检测肺炎克雷伯菌的如SEQ ID NO.40-42所示的第十四引物探针组合。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合中的探针在5’端均标记有荧光报告基团，在所述探针的3’端均标记有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自HEX、FAM、5-FAM、6-FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Texas Red、NED、Alexa Flour、TET、Quasar670和VIC，所述淬灭基团选自MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和QSY。

4.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合还包括用于检测内标基因的如SEQ ID NO.43-45所示的引物探针组合。

5.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括如下至少一种的引物探针集合：集合1、集合2和集合3；

所述集合1包括：用于检测金黄色葡萄球菌的如SEQ ID NO.1-3所示的第一引物探针组合，用于检测肺炎链球菌的如SEQ ID NO.4-6所示的第二引物探针组合，用于检测卡他莫拉菌的如SEQ ID NO.7-9所示的第三引物探针组合，用于检测军团菌的如SEQ ID NO.10-12所示的第四引物探针组合和用于检测大肠杆菌的如SEQ ID NO.13-15所示的第五引物探针组合；

所述集合2包括：用于检测阴沟肠杆菌的如SEQ ID NO.16-18所示的第六引物探针组合，用于检测嗜麦芽窄食单胞菌的如SEQ ID NO.19-21所示的第七引物探针组合，用于检测肠球菌的如SEQ ID NO.22-24所示的第八引物探针组合，用于检测沙雷氏菌属的如SEQ IDNO.25-27所示的第九引物探针组合和用于检测表皮葡萄球菌的如SEQ ID NO.28-30所示的第十引物探针组合；

所述集合3包括：用于检测鲍曼不动杆菌的如SEQ ID NO.31-33所示的第十一引物探针组合，用于检测流感嗜血杆菌的如SEQ ID NO.34-36所示的第十二引物探针组合，用于检测铜绿假单胞菌的如SEQ ID NO.37-39所示的第十三引物探针组合和用于检测肺炎克雷伯菌的如SEQ ID NO.40-42所示的第十四引物探针组合。

6.根据权利要求5所述的引物探针组合物，其特征在于，所述集合3还包括用于检测内标基因的如SEQ ID NO.43-45所示的引物探针组合。

7.一种用于呼吸道细菌病原体检测的试剂，其特征在于，其包括权利要求1-6任一项所述的引物探针组合物。

8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括如下物质中的至少一种：PCR缓冲剂、聚合酶、UDG酶、dNTP、dUTP和水；

优选地，所述试剂中，所述聚合酶为1U～5U/反应，UNG酶为1U～5U/反应，dNTP的终反应浓度为0.1mmol/L～0.5mmol/L，dUTP的终反应浓度为0.1mmol/L～0.5mmol/L。

9.一种用于呼吸道细菌病原体检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-6任一项所述的引物探针组合物或权利要求7-8任一项所述的试剂。

10.如权利要求1-6任一项所述的引物探针组合物或权利要求7-8任一项所述的试剂在制备呼吸道细菌病原体检测试剂盒中的应用；

优选地，所述应用中，所述引物的终浓度为0.2μmol/L～0.6μmol/L，所述探针的终浓度为0.1μmol/L～0.4μmol/L；

优选地，所述应用中，扩增程序包括：25℃10min；95℃-98℃1-5min；95℃-98℃5-10s，55℃-60℃18-20s，循环38-42次。