CN107523622A - 一种粘质沙雷氏菌的检测引物及荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

一种粘质沙雷氏菌的检测引物及荧光定量pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测引物和方法。该引物核苷酸序列分别为：TGCCTGGAAAGCGGCGATGG和CGCCAGCTCGTCGTTGTGGT；该检测方法包括：1)提取待测样品DNA；2)以该DNA为模板，使用上述引物，采用荧光定量PCR方法扩增粘质沙雷氏菌，且在61℃退火阶段收集荧光值Ct样品值；3)根据模式细菌浓度为×102、×103、×104、×105、×106、×107时对应的Ct标准值，建立粘质沙雷氏菌的细菌数lg标准与Ct标准值的标准曲线，并根据Ct样品值，在标准曲线上确定样品中的粘质沙雷氏菌的数量。本发明提供的引物特异性强、灵敏度高，其检测限可达到×102cfu/mL，检测方法快速准确、耗时短。

Description

一种粘质沙雷氏菌的检测引物及荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种检测原料乳中粘质沙雷氏菌的实时荧光定量PCR方法。
背景技术
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，是革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，亦称灵杆菌、神灵杆菌，属于肠杆菌科。菌体较小，约0.7um。菌株呈球形的短杆状，无荚膜，无芽孢，周边有鞭毛，具有一定运动能力。菌落整齐，一般为易流动的粘稠液体状，且多为血红色，有恶臭味。S.marcescens广泛存在于水、土壤和食品中，是一种弱毒力机会致病菌，当机体免疫功能低下时就会引起肺炎、败血症、脑膜炎等各种疾病，并且能对很多抗生素产生耐药性。作为原料乳中常见的嗜冷菌，S.marcescens能产生耐热水解酶，将原料乳进行常规热处理后，这些酶仍然能够保持很高的活性。S.marcescens分泌的蛋白酶可以分解酪蛋白，产生凝胶结构，进而导致原料乳变质。蛋白水解产物会导致原料乳变味，产生苦味、异味、酵母味等。此外S.marcescens分泌的脂肪酶最适反应温度为40-45℃，最适pH为7.0-7.5。在50℃保温1h仍能保持80％的酶活力。脂肪酶在分解原料乳脂肪的同时，会释放出一些游离脂肪酸，进而导致乳制品腐臭等不洁味。由此可见，粘质沙雷氏菌是影响食品工业发展的重要因素之一，快速、准确地检测食品中粘质沙雷氏菌含量对提高乳制品品质，加强企业经济效益有战略意义。
由于嗜冷菌的耐冷机制很复杂，所以对嗜冷菌的检测与计数还有一定困难。目前，嗜冷菌计数最常用的方法是低温培养法(李琳,冷凝,杜明等.嗜冷菌快速检测方法研究进展[J].中国乳品工业,2013,41(1):25-31.)。该方法只能对总菌数计数或者使用选择培养基对某种特定菌计数，缺少针对性和全面性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种粘质沙雷氏菌荧光定量PCR引物及检测方法，以灵敏度高、特异性强、快速准确地定量检测食品中的粘质沙雷氏菌，如原料乳中、乳制品中的粘质沙雷氏菌，为食品厂在生产上有效控制粘质沙雷氏菌的数量，减少其对产品品质的危害，提高产品质量提供理论依据，对保障食品安全具有重要意义。
本发明的基本原理是，通过基因组比对，寻找粘质沙雷氏菌中的特异性识别序列，以此设计引物，进行荧光定量PCR检测食品中的粘质沙雷氏菌。采用SYBRGreenⅠ嵌合荧光法进行检测，灵敏度及特异性好。
为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测引物，其核苷酸序列如下：
SM-F：TGCCTGGAAAGCGGCGATGG；
SM-R：CGCCAGCTCGTCGTTGTGGT。
本发明提供了一种粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，采用荧光定量PCR方法扩增粘质沙雷氏菌，其中所使用的引物的核苷酸序列如下：
SM-F：TGCCTGGAAAGCGGCGATGG；
SM-R：CGCCAGCTCGTCGTTGTGGT；
在61℃退火阶段收集荧光值，即Ct样品值，并在上述扩增条件后增加60℃至95℃的融解曲线分析，以确定产物是否单一，进而反映引物的特异性；
可选地，所述的荧光定量PCR方法中使用的荧光染料为SYBR Green I。
3)标准曲线的绘制与检测结果判定：根据所选用的模式细菌在其浓度为×102、×103、×104、×105、×106、×107时对应的Ct标准值，建立粘质沙雷氏菌的细菌数lg标准(cfu/mL)与Ct标准值的标准曲线，并且将步骤2)所得的待测样本Ct样品值，在标准曲线上确定样品中的粘质沙雷氏菌的数量。
可选地，上述检测方法具体包括以下步骤：
1)提取待测样品中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，采用基于SYBR Green I的荧光定量PCR方法扩增粘质沙雷氏菌，其中所使用的引物的核苷酸序列如下：
SM-F：TGCCTGGAAAGCGGCGATGG(SEQ ID No:1)
SM-R：CGCCAGCTCGTCGTTGTGGT(SEQ ID No:2)
在61℃退火阶段收集荧光值，即Ct样品值，并在上述扩增条件后增加60℃至95℃的融解曲线分析；
进一步地，当使用SYBR Green I荧光定量测试方法时，所述的PCR扩增反应体系为20μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，AL-F 0.8μL，AL-R 0.8μL，DNA模板2.0μL，ddH2O 6.0μL，Rox Reference DyeⅡ0.4μL；
进一步地，所述的荧光定量PCR方法中，PCR反应条件为：95℃30s；95℃5s，55℃34s，40个循环；
3)标准曲线的绘制：选用S.marcescens ATCC14756为模式细菌，根据其浓度为6.9×102、6.9×103、6.9×104、6.9×105、6.9×106、6.9×107时对应的Ct标准值，建立粘质沙雷氏菌的细菌数lg标准(cfu/mL)与Ct标准值的标准曲线为y＝-1.864x+31.32，R2＝0.999；
4)检测结果判定：将步骤2)所得的待测样本Ct样品值，在标准曲线上确定样品中的粘质沙雷氏菌的数量。
本发明还提供了上述粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测引物，以及粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测方法在检测食品粘质沙雷氏菌方面的应用。
本发明的技术方案达到的有益效果是：
1)本发明根据沙雷氏菌属微生物的基因组比对，确定S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因作为粘质沙雷氏菌的特异性保守基因序列，以此设计一对特异性引物，成功建立了粘质沙雷氏菌的荧光定量PCR检测方法。该方法特异性强，对食品中常见的微生物均检测不到荧光信号，仅对粘质沙雷氏菌检测为阳性，可以快速准确地检测食品中是否存在粘质沙雷氏菌，整个检测耗时短，与常规培养检测法相比大大提高了检测效率；
2)本发明的粘质沙雷氏菌的荧光定量PCR检测方法的灵敏度较高，其灵敏度可达到6.9×102cfu/mL，可用于食品中粘质沙雷氏菌的定量检测，对保障食品安全具有重要意义。
附图说明
图1是荧光定量PCR产物琼脂糖凝胶电泳。M:1000bp Marker，1.luxS基因PCR产物，2.Control。
图2是粘质沙雷氏菌荧光定量PCR扩增标准曲线。
图3是荧光定量PCR检测粘质沙雷氏菌luxS基因的敏感性实验。其中，1-7：6.9×107～6.9×101cfu/mL。
图4是常规PCR检测粘质沙雷氏菌luxS基因的敏感性实验。其中，1-7：6.9×107～6.9×101cfu/mL。
图5是粘质沙雷氏菌luxS基因荧光定量PCR扩增特异性实验。
具体实施方式
为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。
实施例1
1.引物的设计与合成：
通过比对粘质沙雷氏菌及其相近菌种的基因组序列，如液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)、普城沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)等，找出粘质沙雷氏菌的种间特异性序列，然后将此序列进行BLAST比对，分析其与非沙雷氏菌属微生物的同源性，最终确定S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因为粘质沙雷氏菌的特异性保守基因序列。根据此基因设计特异性引物进行分析。
设计引物时，首先根据S.marcescens ATCC14756的S-核糖基高半胱氨酸酶氨基酸序列(GenBank登录号：EF164926.1)，比对数据库中的各种粘质沙雷氏菌，S.marcescensWW4(GenBank：CP003959.1)、S.marcescens strain CAV1492(GenBank：CP011642.1)和S.marcescens SM39(GenBank：AP013063.1)，找出种间保守序列区段；再对该段氨基酸序列的编码区序列进行DNAMAN软件同源比对，设计引物SM-F和SM-R如下：
SM-F：TGCCTGGAAAGCGGCGATGG
SM-R：CGCCAGCTCGTCGTTGTGGT
2.通过S.marcescens ATCC14756S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因序列的克隆，实现所设计引物的正确性的检测：
利用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取S.marcescens ATCC14756的总DNA，使用上述引物序列SM-F和SM-R进行PCR扩增：
PCR扩增反应体系为20μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL；SM-F 0.8μL，SM-R 0.8μL；DNA模板2.0μL；ddH2O 6.0μL；Rox Reference DyeⅡ50x 0.4μL；
PCR反应条件为：95℃30s；95℃5s，55℃34s，40个循环；61℃退火。
将所获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果(见图1)显示，扩增粘质沙雷氏菌S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因部分片段175bp。回收目的条带并与pUCm-T连接，转化JM109，鉴定正确后送上海生工测序。经测序分析发现，与拟克隆的基因序列一致，说明S.marcescens ATCC14756 S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因序列扩增正确。
3.荧光定量PCR标准曲线的绘制：
a)使用S.marcescens ATCC14756为绘制荧光定量PCR标准曲线的模式细菌，它可代表其它粘质沙雷氏菌。将S.marcescens ATCC14756在脑心浸液培养基(BHI)培养基中过夜培养，根据GB 4789.2-2010食品微生物学检验--菌落总数测定中的方法定量菌液，经10倍梯度稀释，得到不同浓度菌液：6.9×102、6.9×103、6.9×104、6.9×105、6.9×106、6.9×107cfu/mL。
b)采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取不同浓度菌液的基因组DNA；
c)使用SYBR Green I实时定量PCR试剂盒进行PCR扩增，扩增体系和反应条件如上面2中所述；此外，在61℃退火阶段收集荧光值，即Ct标准值，并在上述扩增条件后增加60℃至95℃的融解曲线分析，每个样本3个平行；
d)进行荧光定量PCR后得到每个浓度的Ct标准值，这个值对应荧光信号初次被检测到时的循环数，可以反映模板初始量，以细菌数的lg标准值和Ct标准值制作细菌悬液的标准曲线y＝-1.864x+31.32，相关系数为0.999(图2)，说明本发明建立的检测方法可以准确定量检测食品中的S.marcescens；且其检测限为×102cfu/mL。
实施例2
在实施例2中，使用本发明提供的检测粘质沙雷氏菌的实时荧光定量PCR方法检测不同月份(11、12、1、2月)从江苏省扬州市8个奶牛场中取样的原料乳，以确定每个牧场的原料乳是否污染了粘质沙雷氏菌(S.marcescens)，以此监控每个牧场的奶源质量。
具体方法如下：
(1)提取待测原料乳样品中的DNA：
取1mL原料乳，12000g/min离心5min，弃上层脂肪，无菌生理盐水洗涤两次，12000g/min离心2min，然后采用专利《从牛奶中提取总DNA的方法》(专利申请号：200810115822.9)中的方法提取下层沉淀中的DNA。
(2)以步骤(1)中所提取的DNA为模板，荧光定量PCR扩增粘质沙雷氏菌S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因部分片段；
PCR扩增反应体系为20μL，包括：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL、上游引物SM-F 0.8μL、下游引物SM-R 0.8μL、DNA模板2.0μL、ddH2O 6.0μL和RoxReference DyeⅡ0.4μL；其中，所述的上游引物SM-F与下游引物SM-R的核苷酸序列见实施例1的步骤1)引物的设计与合成。
PCR反应条件为：95℃30s；95℃5s，55℃34s，40个循环；在61℃退火阶段收集荧光值Ct样品，并在上述扩增条件后增加60℃至95℃的融解曲线分析。
(3)检测结果判定：参照实施例1中3d)所建立的粘质沙雷氏菌的细菌数lg标准(cfu/mL)与Ct标准值的标准曲线，确定细菌浓度为6.9×102、6.9×103、6.9×104、6.9×105、6.9×106、6.9×107、6.9×108、6.9×109时对应的Ct标准值。根据步骤(2)所得的待测样本Ct样品值，对照标准曲线(y＝-1.864x+31.32，R2＝0.999)，确定原料乳中的粘质沙雷氏菌的数量。
在对32份原料乳样品进行的检测中，常规PCR并未检测出S.marcescens阳性样品，而荧光定量PCR方法检测出S.marcescens阳性样品1份，Ct值介于24-25之间，阳性率为3.13％。由此可见，本发明可用于原料乳中粘质沙雷氏菌的定量检测，对保障乳制品的安全具有重要意义。
实施例3
本实施例3中比较了本发明荧光定量PCR检测方法与常规PCR的敏感性。
以实例1中步骤4)所获得的不同浓度菌液的基因组DNA为模板，SM-F和SM-R为引物进行常规PCR扩增，其反应条件为：95℃3min，30个循环(95℃30s，55℃30s，72℃30s)，72℃10min。由图4可见，常规PCR检测S.marcescens的灵敏度是6.9×103cfu/mL；将其与图3所示的本发明荧光定量PCR检测的最低菌落数(6.9×102cfu/mL)相比，本发明的灵敏度明显高于普通PCR检测。
实施例4
本实施例4中，利用本发明提供的引物及荧光定量PCR方法(见实施例2)对8种乳中的常见微生物(鲁氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、阪崎杆菌、荧光假单胞菌)进行扩增，并选取S.marcescens ATCC14756作为阳性对照，检测本发明方法的特异性。
结果(见图5)显示只有S.marcescens ATCC14756样品出现了较强的荧光信号，而其余8个样品未出现相应的荧光信号，由此可见本发明的特异性强。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种粘质沙雷氏菌的检测引物及荧光定量PCR检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
tgcctggaaa gcggcgatgg 20
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cgccagctcg tcgttgtggt 20

Claims (6)

1.一种粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：
SM-F：TGCCTGGAAAGCGGCGATGG；
SM-R：CGCCAGCTCGTCGTTGTGGT。
2.一种粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样品中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，采用荧光定量PCR方法扩增粘质沙雷氏菌，其中所使用引物的核苷酸序列如下：
SM-F：TGCCTGGAAAGCGGCGATGG；
SM-R：CGCCAGCTCGTCGTTGTGGT；
在61℃退火阶段收集荧光值，即Ct样品值，并在上述扩增条件后增加60℃至95℃的融解曲线分析；
3)标准曲线的绘制与检测结果判定：根据所选用的模式细菌在其浓度为×102、×103、×104、×105、×106、×107时对应的Ct标准值，建立粘质沙雷氏菌的细菌数lg标准与Ct标准值的标准曲线，并且将步骤2)所得的待测样本Ct样品值，在标准曲线上确定样品中的粘质沙雷氏菌的数量。
3.如权利要求2所述的一种粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述的荧光定量PCR方法中使用的荧光染料为SYBR Green I。
4.如权利要求3所述的一种粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测方法，其特征在于：步骤3)中，所述的模式细菌为S.marcescens ATCC14756，根据其浓度为6.9×102、6.9×103、6.9×104、6.9×105、6.9×106、6.9×107时对应的Ct标准值，建立粘质沙雷氏菌的细菌数lg标准与Ct标准值的标准曲线为y＝-1.864x+31.32，R2＝0.999。
5.如权利要求1所述的一种粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测引物在检测食品粘质沙雷氏菌方面的应用。
6.如权利要求2-4中任意一项所述的一种粘质沙雷氏菌荧光定量PCR检测方法在检测食品粘质沙雷氏菌方面的应用。
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