CN111057776B - 李斯特属和6种常见李斯特菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 - Google Patents
李斯特属和6种常见李斯特菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了李斯特属和6种常见李斯特菌特异性新分子靶标及其快速检测方法，本发明方法提供了用于李斯特属以及6种常见李斯特菌——单核增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、威尔氏李斯特菌、西式李斯特菌和格氏李斯特菌的，共16个新特异性分子检测靶标以及对应的PCR引物组和PCR快速检测方法。本发明方法无需经过生理生化鉴别即可检测到李斯特菌，具有检测时间短、成本低、操作简单、特异性强的优点；同时本发明的检测方法可弥补生化试验鉴别李斯特菌时反应不稳定的缺陷，检测结果更准确，结果判定更简单，实用性更强。
Description
技术领域
本发明属于微生物检验技术领域，涉及一种鉴别李斯特菌的方法，具体涉及李斯特属和6种常见李斯特菌特异性新分子靶标及其快速检测方法。
背景技术
李斯特菌(Listeria)是最常见的食源性致病菌之一，广泛分布于环境、食品、人和动物宿主体内。其中单核增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西式李斯特菌、威尔氏李斯特菌和格氏李斯特菌是最常见的从食品、病人和环境中分离得到的6个种，与人类和动物的致病性密切相关。人类感染李斯特菌可引起的李斯特菌病，如脑膜炎、心内膜炎、胸肌炎、孕妇流产和败血症等，敏感人群主要有老人、新生儿、孕妇和免疫力低下的人群，而感染单核增生李斯特菌的发病者致死率可达20％-30％。近年来，我国部分城市有报道偶发李斯特菌病病例，主要人群为孕妇、新生儿等，对我国居民的身心健康造成一定的威胁。作为重要的食源性致病菌，如何鉴定和防控李斯特菌污染食品是降低李斯特菌感染的关键之一。
目前，李斯特菌检测主要利用国标规定的传统培养方法(GB 4789.30-2016)，该方法需要两步预增菌培养，一次选择性培养，然后对单克隆菌落进行生化鉴定，所获结果较为准确，但检测时间较长(5d以上)、操作复杂、成本高，不利于快速检测。此外，应用生化试验鉴别李斯特菌时，生化反应不稳定，结果获取依赖主观判断，导致生化鉴定结果重复性差，容易误判。以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。
分子生物学检测方法的关键是其目的基因或序列是否具有待检细菌的特异性。自上世纪90年代来，用于检测食品和加工环境中李斯特属和6种常见李斯特菌的靶标基因已有研究报道，包括：李斯特属特异性基因prs；单核增生李斯特菌特异性基因hly、actA、inlA、inl、prfA、plcA、ssrA；英诺克李斯特菌特异性基因lin0464、lin2483；威尔氏李斯特菌特异性基因scrA；绵羊李斯特菌特异性基因iactA、nameA、16S rRNA；西式李斯特菌特异性基因lmo0333、Lse24；格氏李斯特菌特异性基因Oxidoreductase等。但近年来在实际应用中发现已报道的靶标基因数量有限，且大部分已报道基因虽然在其种属特异性相对保守，但将这些传统靶标基因进行BLAST比对分析时发现与属内或属外菌株也具有较高的同源性，靶标特异性较差，会增加检测过程中的假阳性误检和假阴性漏检的概率。此外在细菌的遗传进化过程中，某些靶标如毒力因子受到环境胁迫或发生突变或发生缺失，若仅从该基因来判断致病菌的存在，容易造成误判，影响食品安全和人民群众的生命健康。因此，发掘李斯特属和常见李斯特菌种特异性新分子靶标，并在此基础上建立相应的PCR检测方法是非常必要的。
过去研究者寻找致病菌的特异性基因通常利用诱变技术、差异表达和基因芯片来筛选，尤其是毒力基因、耐药基因、种代谢和结构特殊基因。随着生物信息学的发展，其检索、储存和分析功能不断完善，通过基因组序列在数据库中大规模比对、搜寻可靠的同源功能基因序列和预测候选特异性基因功能及作用位点筛选特异性基因，具有以上传统分子生物学无法比拟的优势，通过生物信息学方法挖掘和筛选新型的特异性靶点分子不仅可弥补现有靶标的不足，而且有助于解决食源性致病微生物快速检测方法存在滞后、准确度差等问题，对食品卫生检验行业的发展与保障食品安全方面具有重要的意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是克服现有技术的不足，提供用于鉴别李斯特属(Listeria spp.)，以及常见的6种李斯特菌，即单核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)、绵羊李斯特菌(Listeriaivanovii)、威尔氏李斯特菌(Listeria welshimeri)、西式李斯特菌(Listeriaseeligeri)和格氏李斯特菌(Listeria grayi)的特异性新分子靶标及相应的检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：本发明要求保护一组用于鉴别李斯特菌的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1～16所示。
通过生物信息学分析得到李斯特属以及其中6个种(单核增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、威尔氏李斯特菌、西式李斯特菌和格氏李斯特菌)基因组的特异性序列片段；所述片段可作为鉴别李斯特属和这6个种的特异性新分子靶标，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.16所示。通过检测待检测物是否含有相应的序列即可得到待检测物是否含有属于李斯特属的菌株，并进一步鉴别其是否含有单核增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、威尔氏李斯特菌、西式李斯特菌和格氏李斯特菌中的至少一种。
进一步地，所述序列SEQ ID NO.1用于鉴别李斯特属；所述序列SEQ ID NO.2用于鉴别单核细胞增生李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.3～5用于鉴别英诺克李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.6～8用于鉴别绵羊李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.9～13用于鉴别西式李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.14用于鉴别威尔氏李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.15、16用于鉴别格氏李斯特菌。
进一步地，本发明还要求保护用于鉴别李斯特菌的引物组，所述引物组为根据如SEQ ID NO：1～16所示核苷酸序列设计得到。
通过根据相应的核苷酸序列涉及对应的用于PCR的引物组，每一个引物组包括一条正向引物和一条反向引物，对应检测一个核苷酸序列。所述引物组扩增产物对应如SEQID NO：1～16所示核苷酸序列的全部或部分序列。
作为本发明的优选实施方式，所述引物组的核苷酸序列按5’到3’如SEQ ID NO.17～48所示；其中：
SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18为对应SEQ ID NO.1序列的引物组；
SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20为对应SEQ ID NO.2序列的引物组；
SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22为对应SEQ ID NO.3序列的引物组；
SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24为对应SEQ ID NO.4序列的引物组；
SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26为对应SEQ ID NO.5序列的引物组；
SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28为对应SEQ ID NO.6序列的引物组；
SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30为对应SEQ ID NO.7序列的引物组；
SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32为对应SEQ ID NO.8序列的引物组；
SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34为对应SEQ ID NO.9序列的引物组；
SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36为对应SEQ ID NO.10序列的引物组；
SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38为对应SEQ ID NO.11序列的引物组；
SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40为对应SEQ ID NO.12序列的引物组；
SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42为对应SEQ ID NO.13序列的引物组；
SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44为对应SEQ ID NO.14序列的引物组；
SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46为对应SEQ ID NO.15序列的引物组；
SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48为对应SEQ ID NO.16序列的引物组。
进一步地，本发明还要求保护所述引物组在鉴别李斯特菌中的用途。
SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18可鉴别待测物是否含有李斯特属；SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20用于鉴别单核细胞增生李斯特菌；SEQ ID NO.21～26；所述序列SEQ IDNO.27～32用于鉴别绵羊李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.33～42用于鉴别西式李斯特菌；SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44用于鉴别威尔氏李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.45～48用于鉴别格氏李斯特菌。
本发明还提供了用于鉴别李斯特菌的方法，包括如下步骤：
S1：使用所述的引物组中的其中一种对待测样品DNA进行PCR扩增；
S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；
S3：观察扩增产物是否符合预期。
作为本发明的优选实施方式，所述S1中的PCR扩增体系包括1×PCR Mix、模板DNA、引物组和灭菌双蒸水。
作为本发明的优选实施方式，所述PCR扩增体系为10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mMMgCl2 2.0μL，2.5mM dNTP 1.0μL，模板DNA 1～2μL，5μM引物各1μL.，Taq酶1U，灭菌双蒸水补足体积至25μL。
作为本发明的优选实施方式，所述S1中的PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55～60℃退火30s；72℃延伸30s；变性、退火、延伸共进行35个循环；最后72℃延伸10min。
本发明公开了用于鉴别李斯特属和6种常见李斯特菌(单核增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、威尔氏李斯特菌、西式李斯特菌和格氏李斯特菌)的，共16个特异性分子靶标，并提供了相关的引物组，以及对应的PCR检测方法。与现有技术相比，本发明无需经过生理生化鉴别，具有检测时间短、成本低、操作简单、特异性强的优点；同时本发明的检测方法可弥补生化试验鉴别李斯特菌时反应不稳定的缺陷，检测结果更准确，结果判定更简单，实用性更强。
附图说明
图1为实施例3中李斯特属PCR检测方法特异性评价电泳结果。
图2为实施例4中单核增生李斯特菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。
图3为实施例5中英诺克李斯特菌PCR检测方法特异性评价电泳结果
图4为实施例6中绵羊李斯特菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。
图5为实施例7中西式李斯特菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。
图6为实施例8中威尔氏李斯特菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。
图7为实施例9中威尔氏李斯特菌PCR检测方法特异性评价电泳结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1李斯特属和6种常见李斯特菌特异性新分子靶标的挖掘
根据GenBank数据库及本团队自测的李斯特菌全基因组DNA序列，进行生物信息学分析；筛选得到李斯特属和6种常见李斯特菌(单核增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、威尔氏李斯特菌、西式李斯特菌和格氏李斯特菌)的特异性基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.16所示。
其中，所述序列SEQ ID NO.1用于鉴别李斯特属；所述序列SEQ ID NO.2用于鉴别单核细胞增生李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.3～5用于鉴别英诺克李斯特菌；所述序列SEQID NO.6～8用于鉴别绵羊李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.9～13用于鉴别西式李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.14用于鉴别威尔氏李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.15、16用于鉴别格氏李斯特菌。
实施例2引物有效性快速检测
1)引物设计
根据实施例1中的所述序列SEQ ID NO.1～16设计特异性PCR扩增引物组(包括正向引物和反向引物)，引物组序列如下表1。
表1特异性PCR检测引物组
2)鉴别李斯特菌的方法，步骤如下：
S1 DNA模板制备：将待测菌菌株分别在LB液体培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取其细菌基因组DNA，作为待检模板；
S2 PCR扩增：使用所述引物组1～16中的其中一种对待测样品DNA进行PCR扩增；
①PCR检测体系：
其中：
当模板DNA用于鉴别是否存在李斯特属时，引物为引物组1中的引物；
当模板DNA用于鉴别是否存在单核增生李斯特菌时，引物为引物组2的引物；
当模板DNA用于鉴别是否存在英诺克李斯特菌时，引物为引物组3～5任一组引物；
当模板DNA用于鉴别是否存在绵羊李斯特菌时，引物为引物组6～8任一组引物；
当模板DNA用于鉴别是否存在西式李斯特菌时，引物为引物组9～13任一组引物；
当模板DNA用于鉴别是否存在威尔氏李斯特菌时，引物为引物组14的引物；
当模板DNA用于鉴别是否存在格氏李斯特菌时，引物为引物组15或16的引物；
②PCR扩增程序：
其中，使用引物组4时，退火温度为58℃；使用引物组5时，退火温度为60℃；其余引物组退火温度为55℃。
S3：取PCR扩增产物进行凝胶电泳，观察各引物组对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带。如果存在，说明样品中含有对应的李斯特菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则说明样品中不含有对应的李斯特菌。
实施例3李斯特属PCR检测方法的特异性评价
取94株单核增生李斯特菌、2株英诺克李斯特菌、1株绵羊李斯特菌、1株西式李斯特菌、2株威尔氏李斯特菌、1株格氏李斯特菌共101株李斯特菌，以及16株非李斯特菌(包括阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组1中的引物。
PCR扩增产物凝胶结果如图1，M为DL2000 DNA标准marker，1～101为李斯特菌菌株，102～117为非李斯特菌菌株，C为阴性对照。
各菌株及检测结果如下表2所示；表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表2本发明李斯特属检测特异性评价试验结果
由图1和表2可得，利用所述引物组对所有李斯特菌均显示出特异性扩增条带，非李斯特菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。
实施例4单核增生李斯特菌PCR检测方法的特异性评价
取101株单核增生李斯特菌，8株非目标李斯特菌(包括英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌等)，16株非李斯特菌(阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组2中的引物。设置对照组，对照组的模板为不含基因组的水溶液。
PCR扩增产物凝胶结果如图2所示；其中，M为DL2000 DNA标准marker，1～101为单核细胞增生李斯特菌不同血清型菌株，102～109为非目标李斯特菌菌株，110～125为非李斯特菌菌株，C为阴性对照。
所用菌株及检测结果如下表3所示；表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表3本发明单核增生李斯特菌检测特异性评价试验结果
由图2和表3可得，所述引物组2的检测结果均只有单核增生李斯特菌显示出特异性扩增条带，非单核增生李斯特菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。
实施例5英诺克李斯特菌PCR检测方法的特异性评价
取23株英诺克李斯特菌，8株非目标李斯特菌(包括单核增生李斯特菌、绵羊李斯特菌等)，16株非李斯特菌(包括阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组3～5中任一组的引物。设置对照组，对照组的模板为不含基因组的水溶液。
PCR扩增产物凝胶结果如图3；其中，a～c分别为使用引物组3～5的扩增结果；M为DL2000 DNA标准marker，1～23为英诺克李斯特菌菌株，24～31为非目标李斯特菌菌株，32～47为非李斯特菌菌株，C为阴性对照。
所用菌株及检测结果如下表4所示；表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表4本发明英诺克李斯特菌检测特异性评价试验结果
由图3和表4可得，3种引物组的检测结果均只有英诺克李斯特菌均显示出特异性扩增条带，非英诺克李斯特菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。
实施例6绵羊李斯特菌PCR检测方法的特异性评价
取1株绵羊李斯特菌，9株非目标李斯特菌(包括单核增生李斯特菌、英诺克李斯特菌等)，16株非李斯特菌(包括阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组6～8中任一组的引物。设置对照组，对照组的模板为不含基因组的水溶液。
PCR扩增产物凝胶结果如图4所示；其中，M为DL2000 DNA标准marker，9为绵羊李斯特菌菌株，1～8和10为非目标李斯特菌菌株，11～26为非李斯特菌菌株，C为阴性对照。
所用菌株及检测结果如下表5所示；表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表5本发明绵羊李斯特菌检测特异性评价试验结果
由图4和表5可得，3种引物组的检测结果均只有绵羊李斯特菌均显示出特异性扩增条带，非绵羊李斯特菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。
实施例7西式李斯特菌PCR检测方法的特异性评价
取1株西式李斯特菌，9株非目标李斯特菌(包括单核增生李斯特菌、英诺克李斯特菌等)，16株非李斯特菌(包括阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组9～13中任一组的引物。设置对照组，对照组的模板为不含基因组的水溶液。
PCR扩增产物凝胶结果如图5所示；其中，a～e分别对应引物组9～13的扩增产物；M为DL2000 DNA标准marker，10为西式李斯特菌菌株，1～9为非目标李斯特菌菌株，11～26为非李斯特菌菌株，C为阴性对照。
所用菌株及检测结果如下表6所示；表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表6本发明西式李斯特菌检测特异性评价试验结果
由图5和表6可得，5种引物组的检测结果均只有西式李斯特菌均显示出特异性扩增条带，非西式李斯特菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。
实施例8威尔氏李斯特菌PCR检测方法的特异性评价
取2株威尔氏李斯特菌，8株非目标李斯特菌(包括单核增生李斯特菌、英诺克李斯特菌等)，16株非李斯特菌(包括阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组14中的引物。设置对照组，对照组的模板为不含基因组的水溶液。
PCR扩增产物凝胶结果如图6所示；其中，7～8为威尔氏李斯特菌菌株，1～6和9～10为非目标李斯特菌菌株，11～26为非李斯特菌菌株，C为阴性对照。
所用菌株及检测结果如下表7所示；表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表7本发明威尔氏李斯特菌检测特异性评价试验结果
由图6和表7可得，所述引物组的检测结果均只有威尔氏李斯特菌均显示出特异性扩增条带，非威尔氏李斯特菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。
实施例9格氏李斯特菌PCR检测方法的特异性评价
取1株格氏李斯特菌，8株非目标李斯特菌(包括单核增生李斯特菌、英诺克李斯特菌等)，16株非李斯特菌(包括阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌等)，按照实施例2的方法进行PCR检测。其中，S1 DNA模板制备为分别提取各细菌的基因组DNA；S2 PCR扩增时，使用的引物为引物组15或16中的引物。设置对照组，对照组的模板为不含基因组的水溶液。
PCR扩增产物凝胶结果如图7所示；其中，a～b分别对应引物组15或16的扩增产物；M为DL2000 DNA标准marker，5为格氏李斯特菌菌株，1～4和6～9为非目标李斯特菌菌株，10～25为非李斯特菌菌株，C为阴性对照。
所用菌株及检测结果如下表8所示；表中，检测结果栏目中“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表8本发明格氏李斯特菌检测特异性评价试验结果
由图7和表8可得，所述引物组的检测结果均只有格氏李斯特菌均显示出特异性扩增条带，非格氏李斯特菌菌株均无特异性条带，说明本发明方法特异性高。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
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ttctacgaaa aagaaggctt aataacccct gaccgcgaca agaataattt gcgcacatac 120
agcgaagaag acgccaattg gctaaaattt ttactgcact taaaaggcgc cgggttatcg 180
gtagaagaat taaagcagta cacaatttgg cgcgcagcag gagacagcac catttccgaa 240
cgattaaata tgttaaaaaa gaagaaggtt attttggagc aagagattga agacttgcag 300
aagaatttgg atacagtggt taggaagatt gggatttatg aggagaaggt taagactaga 360
cgagtttag 369
<210> 3
<211> 906
<212> DNA
<213> Listeria innocua
<400> 3
gtgacaacga gcaaatatga aaacgaatat tggaaacata ttttcgcctt acaagattat 60
attgaagctc atccagcaga gaattttaca tccgaacaat tagcaaaaat tgctggatta 120
tccaaatacc actttcatag aatttttaaa gcgttaacaa atgagtcgat atttcaatat 180
acaacaagaa taaaaatgga atgggctctt ggcttactaa tgaatcgaaa ggatttaaca 240
ataacagatg tagcatatga acttggcttc agcgattctt ctgttttttc tagggcattc 300
aagaaatatt tcgatgtgtc tcctatagaa attagaaaac aaaatagcaa caattgcaaa 360
gagaattttc ttacttcccg ctataataag cctgtagatg aaaaacaata taatattcaa 420
ggcaaagtaa ccattactac gctacagaat atacctgtca tctataagag aatagtaggt 480
tcttacaagg aattagaact caccaaccct ttgagtgagc tctttcaata tggcatggag 540
catgatttac ttgataaaga ttcctctttt ccgttgacaa tttaccatag ccatcccgat 600
ataacaacag ctgataatca gagagctagt agttgtatta ttattaaaca taatgttaaa 660
aagttagaca gtgaggaaat cgggcttatg gagatacctt ctgggttata cggcgtcatt 720
cattttgaaa tacgtcaaaa agagtatcca gatgcttggg attttgttta cggaaagtgg 780
cttccttcta gtggttattt gccagcaaac tcatttccat ttgaggtata tttaaacaat 840
ccactggaag acccacttca aaaacatatt gtggatatct atattcctat tgaaccaata 900
aactaa 906
<210> 4
<211> 969
<212> DNA
<213> Listeria innocua
<400> 4
ttgacgcaat taaagtttat aaacatacga gataatcaga tagatgatat taccggatta 60
actaatctaa ctaatttaac caatctacat ttaggtggaa atgaaatatc agatctaacg 120
ccacttgcga atttgactaa tttaaacctt ttggatttaa ctaataacca aataagtgag 180
gttatacctt tagctaattt aacgaatcta tccaatcttt ggttaaatgg aaacaatata 240
atcgatatta gtccattgaa agatttaaag gggttaaaaa atttaagttt gtctgatcag 300
cgaatacaga aaaatcctga gttgtttaaa accaatttta ccttaactaa caatataaaa 360
gatttagacg gcggattagt tgaaataacg gatattagtc ataatgggac ctacgataac 420
ccgattgtta cttgggagtt gcctagatat gtaaatgaaa ttagttataa atatacacaa 480
catgtgaagc tggggaatgc tacgactgat catgatgtta cggttacaca gccacttata 540
ttaccatcgc atactgtgaa ctttatagta gacgatgttt taaaaacaag tttagaagta 600
aaggaagaag cgttgattac acaaccagcc gcgccgaaaa aagcagggta cacatttact 660
ggatggtatg acgcgaaaac aggcggaaac aaatgggatt ttgaaacagc tgaaatgccg 720
agaaatgata tgactttata tgcgcagttt agcgaaaatg aagttatccc agttgatgaa 780
gacgtggatc ttattgttga agaaagcgga ccagtgcaag aaagtaatga tgaggtacca 840
ccagttactg aaccgacaaa aaatatcgta atgcttccga aaacaggaga cagtaacaac 900
atgttatttg ttggattagg tttattattg ttcggaacag gggttgttat tagtaaaaaa 960
ctccgctaa 969
<210> 5
<211> 378
<212> DNA
<213> Listeria innocua
<400> 5
atggaatgga aacaaataaa aaacgaaacc gatattgtaa aattaatgga ctcattaaat 60
tattttcatg atagttgcat tactggttta acttactcaa gtagcacata tgtagacgaa 120
actgacttat caatggtgat gggcacgaat ccagtagtta aattaattat tcaaagacaa 180
gccgattcat taacgaccct agaattttgt ttagaaggag ttactcattt atgcattcat 240
aacgattcaa acacgtcgtc agaaatccaa gaagcaaacc tttgctataa aaacggtaac 300
tttcattgga atgttgatga tgaaatgaca agttttaaat gtaagaaagt atcgtggaga 360
gaaattcaaa ggaaatag 378
<210> 6
<211> 483
<212> DNA
<213> Listeria ivanovii
<400> 6
ttggctattt ttatcgcaat tttatctttc atgagtatca acttttcttt tatagctgta 60
ccgagtttaa ttggtattat ttggttaact actagtatta tagtattagt ggtaatgatt 120
attctactca ttctacttaa taaacaagct aaaaacgaca tagaggcagc ctcaattccc 180
ttagaggcaa ccatcacgtg gtgggaaaca agtggtagtg cagaaagagg aatcatgttc 240
tatttagtat tatctattcc tcgaaaagga aaacaaatag aacgtgctta ttctacttct 300
gggggcattg gtatcgttga actaacacaa tttttaaatc agcatccatt tggttcaaaa 360
ctaactattt taacaaatgg caaagactta aaagtgattg tgttagaaga gatacaactt 420
gttatgtcga atcatggaga aaagctgata ttagaacgtt ttcacaaatc taaaaaacgt 480
taa 483
<210> 7
<211> 516
<212> DNA
<213> Listeria ivanovii
<400> 7
atggataaaa ctaaaagtga ttatcaagtg attgagttag ctcagatggc gctggtaaca 60
agtttatata tcgtagtaac ttttctgttg aatcctatca gctatggagc catccaacta 120
cgaatatccg aaatgtttaa cttattagta gtttttgata ggaaatatat ttggagtata 180
actatgggag tggtaatttc taatttatat tctccattag gtgttataga tgcttttata 240
ggcggtgggt ctagttttct tgctctagca ctaactttta tgattacatc aagcataaaa 300
agatggagta ttaaattaat tgtagcaagt tttattgtga gtttatctat gtttacggtg 360
gctgcagaat taaaatgggt actaggattt ccatttttag aaacctattt atttgtaggg 420
attggggaag tattaacgat gcttttagga acgataatca tcttagctat caatagtaaa 480
gttgatttga aaagaatctt aagtaagaaa tggtag 516
<210> 8
<211> 684
<212> DNA
<213> Listeria ivanovii
<400> 8
atgctacaat ttaacattac agaaataatg agagatgtta tgagcccaat ctttagtgga 60
acggataata ttttcgtatt tacattttat ggattcttta caaaattact ttgggctttt 120
ggtattcacg ccgactccct ctttcaaggt atttttgacc cactcaaatt aacttggatt 180
gccgaaaata gtgcagcaaa aattgccggc gacccattac cccatatttg gaccaccgca 240
ttagaaagaa cttgcttgtg gacaggacca gtattgggac tattaacagt attaatgttt 300
tcaagggtta agcatttaaa aaccttttct ttcgctgccc ttccagctgc ctttttctcc 360
attgccgaac cggtagtttt tgggttacct attgtgatga accctatgtt acttatccca 420
tttattctta gtggaacatt aggagctttt ctaacttatg gtgcttgcca aattgctata 480
cttgcaagac cctttttaga attaccatgg gcaacccccc ctgttcttat aggctttatt 540
gcatctggtg actggaaata tattctggca gcaattttca acattgtttt aggagctttg 600
atttattacc catttgtgaa agcatttgaa cgggaagagt taaaaagaat caatacaagt 660
gaagatgttc ctgctacaga ataa 684
<210> 9
<211> 849
<212> DNA
<213> Listeria seeligeri
<400> 9
ttgcaaatta aaaaatatat gatgattttg gtaatatttt tcagcatttt ggttttatca 60
ccattaactt caatggctac tggggagaac cctgaggaat ctaatgttgt ttatactgat 120
gaagatgaag acccggattt aagctgggat taccgatctg gtactggttg ggatgattgg 180
ttaaattccg actgggatac taactgttct agctggacta atagacagta taatgaattg 240
gagccagtag aagaagtaga aattgaacat tctgagaaaa acgaagatac cgtggattct 300
tctccaacaa acaatagttg gttggatgat aataatctaa ctactgacca caacacaaat 360
atcgaaacta acgctaaact tgtttttaaa ccaaataata attccgacgt cgtgcctgac 420
actaaaccta gttctaattc caatgtcagc tctgatacta aatctagcac taactccaat 480
gtcagctctg atactaaatc tagtactaac tccaatgtca gctccgatac taaatctatt 540
agcaaactta ataatactcc cgacacaaaa actagttcta aacccactac caaactacct 600
ataaagtcag ctaaagttga taattccgat attaacgcca aagatagctt tgtaacatct 660
aaacaagttt atgaaaaacc aaattcaata catataaatt taaaattggg agctacaaaa 720
aataacaaca actacaaaat ctcgtctttg cacccaacta ctggggattc agaaatgcct 780
gtattaccaa tatttggtgg tgtactgttt gcaggaagta ttctttatct aaccaaaaga 840
aagtactaa 849
<210> 10
<211> 1023
<212> DNA
<213> Listeria seeligeri
<400> 10
atgaaattgc gaaaattatt ttttgttttg gggtgtttat tccttctttt ggttatttgg 60
agtcagaaag ataacgggaa agatagttat tttgagttga aggaaataaa tgacgatttc 120
tcgcaagatg aagtatataa agtggataaa aaagaagctg aaaatactgc taaattaata 180
gggaatctat ataaaacgaa tgatgggaat ttggataata tggtggatta tgccaatgaa 240
ctaatacaag atcgtgctaa attagaacaa gaaaaagcta atttgaagta tttgatagag 300
aatcaagctt tttcagataa agaacaacaa agaacgcaat taactacttt ttattatttg 360
cttattcaac tacaggaaag taaaagtaat gtaagcccgg taactgacgg cgaaaatttc 420
caagtgaatc aaattgaagt agttgaaaat gaacggtttt gtacagtgtt aaatatttcc 480
tatcagtgta tgagtaagac agaattcgaa aaatattaca ccaaatatgt gaatccgaat 540
aacggcacca aaaaagcgga acaaaagcga tatttagata atacatttac cataaagaat 600
tttgatgagg atattcgcgc cagcatacaa gctgaagaat ataaagagta tcaggagcat 660
aagaaagaaa atagagttag cccttatgac aaagcagtaa tggggctgac aaaaaaacca 720
gttactccgg cttatttaga agagaaagtt aaaaaagatg caaaggaaaa tacagcagaa 780
aaattcgata tgaccagtac aataatcacg aatactacag aattatttga tacaaagagc 840
atgacaatta ccccaacgca agaaacgcaa gaaattttga accgttggga agaaagagca 900
aaagttagta aaaatgttac gtttccaaaa ggggaaaact acattcaatt gtatgaatct 960
tatatgaatc aagttgaaaa ttggacagat gcagatgaac gatatgtttt tgaagggggg 1020
tga 1023
<210> 11
<211> 348
<212> DNA
<213> Listeria seeligeri
<400> 11
atgtatatga aggggaaatt gattgctgtt ctcgttatcc ttgcgatttt gctatgctcg 60
ttattacttt tttttatagt aaaagtaaat atttggaaag aaaatactat taaacaaaat 120
gactcggcac aaatacaatc agttaaatat ataggaactt gcaaggcagt agatagaaaa 180
atggaaatta agcttttttc tgcgaagacg aacttgtttc tggaatctgc tgaacgaaac 240
gaaattattg atggaacaga aatagatagt aacaacagag aagtattcat tatcattatg 300
agtgaaaagg aaagtggcat attccaaaag aatggtttaa aatattag 348
<210> 12
<211> 411
<212> DNA
<213> Listeria seeligeri
<400> 12
atgagaaagt atcacataaa gagaatcggt atcactattc ttctaacttt ctattttttt 60
atgctcacac caattatgca aggagagaag ccttttagta cttctgctga ttacttcgca 120
ttgattttag ccattattgt tggtgtgtta gcctctttat tcatatttga tgagcgaata 180
aagaaggaat acgaacagga taaagtagaa aaagatgaaa gataccttaa aaatagggcc 240
atttttaatt tttattttat tgttgcttta ggattagtca taccagttgt gtttgcattc 300
atgagtatct ctgatatgga acaattatct cttatatttt tggctaaaag ctttatattt 360
gtttcgctag cctatacaat cttattagaa attgtcaaaa agaaagcata a 411
<210> 13
<211> 486
<212> DNA
<213> Listeria seeligeri
<400> 13
atggaaatta atgatatgat taaaaacttt gctaataaaa gagataatca agtccggggg 60
atttttgcga gtatttttat tctcgaaaat cgtttgcaaa ctgtttttga taaagcggat 120
gagtatctca ctttaaaaca atttatgttg cttacgatga ttcgatattc gcatgatgaa 180
aaaaccactt ttacgcaact tgggaaattg cttggttctt cgcggcaaaa tgtaaaaaaa 240
ttagcattat cacttgaaca gaaaggattt attcgtatca cacatgaacc aaataacaaa 300
agaaatactt tgcttacaat gacagcaaaa gcagatgaat atttagaaat tgttttagag 360
atgcataatc aaaagttagc aagtattttt aatgattata cagatgagga aatcaaattg 420
ttttatggga tgattaccaa attatatgca ggcgttgagc gagaggagca aacagaagat 480
gaataa 486
<210> 14
<211> 675
<212> DNA
<213> Listeria welshimeri
<400> 14
atgaatttaa ataaatacaa ttttcgtagc atattttcat cagctttagg aataatcatt 60
ttatcattag ggatttctat taataaaggt tcagtcttag gaatggatac gtatacagga 120
atgaatacaa cagtagctga ttactttaat atgtcactcg gtaatttcca actgatttta 180
aatgttattc tgttgttatc tatgtttgta tttggaagat atctcttagg tttaggtacg 240
gttttaaaca tggtttttgt aggttatcta gttgatttct ttttgaaaat gtttgatggt 300
acgattttat cttttgatgt agaaaaatca ctttggatta gatttttatt attagtaatt 360
ggtacgatta ttctttgttt aggggcatct ttatatatga ctgctgattt gggtgttgct 420
ccttatgatg ctctagcgat tatgatgtct gatcatattg aaaaactttc atttagtgtc 480
gctagaatta tcactgatgt ggtgtgtgtt attgtaggat tgatttttgg gacagtatta 540
ggttcttacc catttggaac aattatagga attggtacgg ttctaacagc ttttggtacg 600
ggtccattta tcggtttctt taataaaaca atatcagctt ggattgttgg taaaggtaat 660
aaggaggctg agtga 675
<210> 15
<211> 756
<212> DNA
<213> Listeria grayi
<400> 15
atgctgttcc tgaattataa tccagaatta agcaatattg atgtggaaat atataaatat 60
gtgacctctc atttagaaaa agtcgtactg atgcgaatcc gtgacttagc aaaagcaacc 120
cattgtagta cggcaagcat tcttaggttt tgtaaaaaat ttgattgtgc cggattttcc 180
gagtttaaaa tcaaactacg catctactta gaagaaatgg aagaaatccc gaaaacacat 240
accgtcgatg aatccgcctt tatgaatttt atccagcgaa gctctgaatc attttatcaa 300
gaacgaatcg atgctgcagc tgatctgcta gcggataaag atcttgtggt cttcattggc 360
tcaggttcct cgaacatcat tgccgaatac ggcgcgctgt atttttcttc tatcttcagt 420
atggctttca gtatcgaaga cccggagaac catcccgttt cctttttcaa taaaggattg 480
gccgaaaaaa cctgtgtgat cgccctttca gtaggtggga aaacgaaaag tatcacgaat 540
tatctcaatc attttattga gagcaacagc tcgatcattt cgatcaccaa tagtgccaat 600
tcgacgatcg cccgactttc cgatatcaat atcccttatt acatctcgac cgaaagtatc 660
ggcgacagtg acattacttc gcaagtgcca gcactttata cagtcgaata tttggcaaaa 720
gaagtgcgga aaaagaaagc agaatcagcg aaatga 756
<210> 16
<211> 570
<212> DNA
<213> Listeria grayi
<400> 16
atgaaattaa agcatctact gtacatatta gcagctagtt taatgttatt ttctgtaagt 60
gtatcagcga ctgtagcaat agcaaaagaa caaactgcta gccctgcggc aaatcagaca 120
gatgggagtg caccttcacc gggtgttgga gtaggacgtg cacatgcatc gggcggaggg 180
aatgcaaagc cagctccgaa accaaagcca aaaccaaaat cgaacaaagg aaaaaagaag 240
agtaaaaaga aaaagaagaa gaaaaagaaa aagactaaag ctcaaaaata caagtcagct 300
aagaaaaaag gtaaaaaggt taaggggaat aataagaaag tcacgagcga gaaaaacttt 360
ccgagaaagt ataaaaaata ttcttcaatt gattactata aaaatggcaa acttatgaag 420
aggcgttact atgggaaaaa tagagaagct caaacagaca tccattacac ggaccataat 480
aatcctaagc aacatccaaa agtaccgcat cggcacgatt ggtataagga taaaaaaggt 540
gaactgaaat tgaaaaagaa atggtactaa 570
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cagtagacac aaaggaat 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gctttgaaca tccagata 18
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gcttaataac ccctgaccg 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aatcccaatc ttcctaacca c 21
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
atggaatggg ctcttgg 17
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ataaccacta gaaggaagc 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ccacttatat taccatcgc 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctgggataac ttcattttcg 20
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gatagttgca ttactggt 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tcttggattt ctgacgac 18
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gctaaaaacg acatagagg 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ctcttctaac acaatcact 19
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
agccatccaa ctacgaat 18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gacccaccgc ctataaaa 18
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tatttggacc accgcatta 19
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tagcaggaac atcttcactt 20
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
atactgatga agatgaagac c 21
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
cgatatttgt gttgtggt 18
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
caactacagg aaagtaaaag 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tttgtcataa gggctaactc 20
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gtatatgaag gggaaattg 19
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acttctctgt tgttactatc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
aagagaatcg gtatcactat 20
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
acaactggta tgactaatc 19
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
cgatgattcg atattcgc 18
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tctgcttttg ctgtcatt 18
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
tactttaata tgtcactcgg 20
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
taagaaccta atactgtcc 19
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
acggcaagca ttcttagg 18
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
tgcgaagtaa tgtcactgtc 20
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
aatcagacag atgggagt 18
<210> 48
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
cttttggatg ttgcttagg 19
Claims (7)
1.核苷酸序列组合作为被检测靶标在鉴别李斯特菌中的应用，其特征在于，所述核苷酸序列组合如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.16所示，所述应用为非疾病诊断和治疗目的应用；
所述序列SEQIDNO.1用于鉴别李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.2用于鉴别单核细胞增生李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.3~5用于鉴别英诺克李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.6~8用于鉴别绵羊李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.9~13用于鉴别西式李斯特菌；所述序列SEQ IDNO.14用于鉴别威尔氏李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16用于鉴别格氏李斯特菌。
2.用于鉴别李斯特菌的引物组，其特征在于，所述引物组为根据如权利要求1所述核苷酸序列组合设计得到；
所述引物组的序列按5’到3’如SEQIDNO.17~48所示；其中：
SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18为对应SEQ ID NO.1序列的引物对；
SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20为对应SEQ ID NO.2序列的引物对；
SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22为对应SEQ ID NO.3序列的引物对；
SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24为对应SEQ ID NO.4序列的引物对；
SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26为对应SEQ ID NO.5序列的引物对；
SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28为对应SEQ ID NO.6序列的引物对；
SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30为对应SEQ ID NO.7序列的引物对；
SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32为对应SEQ ID NO.8序列的引物对；
SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34为对应SEQ ID NO.9序列的引物对；
SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36为对应SEQ ID NO.10序列的引物对；
SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38为对应SEQ ID NO.11序列的引物对；
SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40为对应SEQ ID NO.12序列的引物对；
SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42为对应SEQ ID NO.13序列的引物对；
SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44为对应SEQ ID NO.14序列的引物对；
SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46为对应SEQ ID NO.15序列的引物对；
SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48为对应SEQ ID NO.16序列的引物对；
所述序列SEQ ID NO.1用于鉴别李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.2用于鉴别单核细胞增生李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.3~5用于鉴别英诺克李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.6~8用于鉴别绵羊李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.9~13用于鉴别西式李斯特菌；所述序列SEQID NO.14用于鉴别威尔氏李斯特菌；所述序列SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16用于鉴别格氏李斯特菌。
3.如权利要求2所述引物组在鉴别李斯特菌中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的应用。
4.一种非疾病诊断和治疗目的的鉴别李斯特菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：使用如权利要求2所述引物组对待测样品DNA进行PCR扩增；
S2：进行凝胶电泳检测扩增产物；
S3：观察引物组中各引物对对应产物大小的位置是否存在单一扩增条带，如果存在，说明待测样品中含有对应的李斯特菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则说明待测样品中不含有对应的李斯特菌。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中的PCR扩增体系包括PCR反应缓冲液、模板DNA、PCR聚合酶、dNTP、MgCl2、引物组和灭菌双蒸水。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系为10×PCR反应缓冲液 2.5 μL，25 mM MgCl2 2.0 μL，2.5 mM dNTP 1.0 μL，模板DNA 1~2 μL，5 μM上下游引物各1 μL，Taq酶 1U，灭菌双蒸水补足体积至25 μL。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中的PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；55~60℃退火30 s；72℃延伸30 s；变性、退火、延伸共进行35个循环；最后72℃延伸10 min。
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