CN112011636A - 一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒及方法 - Google Patents

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江玉凤
张宁
李仁哲
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Abstract

本发明涉及一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒及方法；本发明所述的一种检测外周血真菌感染的试剂盒，由a：2×ddPCR Suppermix、b：无RNA酶超纯水、c：阳性对照和阴性对照、d：全血真菌总DNA提取试剂(OMEGA)组成；本发明所述的一种检测外周血真菌感染的方法，包括以下步骤：1)提取全血DNA；2)ddPCR检测；3)结果判定。所述的一种检测外周血真菌感染的试剂盒及方法能够定性定量的检测真菌DNA拷贝，检测血液真菌具有高灵敏度及特异性。

Description

一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及系统性真菌感染外周血真菌感染检测技术领域，尤其涉及一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒及方法。
背景技术
随着免疫受损人群不断扩大，广谱抗生素的大量应用，侵入性技术的开展，系统性真菌感染的发病率持续增加，已引起临床高度重视。其中，对于一些高危人群的系统性真菌感染，病程进展迅速，延误诊断会贻误治疗机会，大大增加患者死亡率。因此，早期快速明确系统性真菌感染对临床医生病情诊断及治疗策略制定具有极为重要的价值。
目前，外周血培养法是系统性真菌感染的传统检测方法。但，外周血培养法耗时长、灵敏度低，仅有20-30％病例能通过外周血真菌学培养法得到诊断。外周血培养法在系统性真菌感染早期诊断中存在局限性，严重耽误疑似系统性真菌感染患者病情的诊断，因此，亟需研发快速、高灵敏度、高特异性的外周血真菌诊断技术。
数字PCR(digital PCR,ddPCR)是第三代PCR技术，其通过将PCR反应体系微滴化处理形成微滴，保证每个微滴里面包含一个或者不含有核酸模板，经过PCR扩增，利用荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数。最后根据泊松分布院里计算核酸模板的初始拷贝数。该方法比传统荧光定量方法，具有灵敏度高、精准、不易受PCR抑制物影响的有点。目前，在临床上尚未有针对外周血真菌感染的数字PCR技术方法的应用。因此，开发基于数字PCR技术快速诊断外周血真菌感染试剂盒及方法，不仅能解决现有技术的局限性，而且对外周血真菌感染患者诊断具有重要的临床价值。
为此，设计一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒及方法，解决以上问题。
发明内容
本发明为克服以上不足，提供一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒及方法。
一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒，由a：2×ddPCR Suppermix、b：无RNA酶超纯水、c：阳性对照和阴性对照、d：全血真菌总DNA提取试剂(OMEGA)组成；
其中：
a：2×ddPCR Suppermix包括：Suppermix(Bio-Rad)、FP(18um)、BP(18um)、Probe(5um)；
上游引物FP、下游引物BP、探针Probe，其核苷酸序列分布如下：
FP：5'-TTGGTGGAGTGATTTGTCTGCT-3'
BP：5'-TCTAAGGGCATCACAGACCTG-3'
Probe：FAM-TTAACCTACTAAATAGTGCTGCTAGC-BHQ1；
c：阳性对照为5314白念珠菌标准菌株，阴性对照为去离子水。
一种系统性真菌感染外周血检测的方法，包括以下步骤：
1)提取全血DNA
①吸取250ul全血转移至离心管；加入25ul蛋白酶A和250uL Buffer；
②65℃水浴10min；
加入260μl无水乙醇；
将溶液转移至吸附柱，进行10000g离心去滤液；
吸附柱转移到新的离心管中，添加500uL Buffer；
③10000g离心1min，弃滤液；
将吸附柱转移至新的离心管，用700ul Wash Buffer进行洗涤2次；
用100ul 65℃预热去离子水，洗脱收集DNA；
2)ddPCR检测
①将待检测样品、阴性对照和阳性对照每个组添加2×ddPCR Suppermix 14uL，分别取66ng模版DNA，用无RNA酶超纯水补齐20uL体系；
②将20uL体系转移到微滴发生卡内，制备微滴；
③将微滴转移至96孔板，进行封膜；
④将样本放入PCR仪中进行扩增，扩增条件为：
95℃反应10min、
95℃反应30s、
57℃反应1min，40个循环；
98℃反应10min；
每个步骤设置2℃/s的升降速度。
⑤将扩增完的PCR放入微滴分析仪中，检测微滴荧光信号，分析数据；
3)结果判定
利用QuantaSoft1.7.4对荧光信号进行而分析处理，划定阈值线区分阳性微球/阴性微球进行区分，其中：阳性微球指含有真菌DNA，阴性微球指不含有真菌DNA。
4)特异性验证
为验证本发明试剂盒检测外周血真菌感染的特异性，利用本试剂盒对血液感染铜绿杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、白色念珠菌标准菌株标本进行特异性检测，结果显示，本试剂盒检测白色念珠菌感染标本为阳性，而其它细菌感染标本均显示为阴性结果。
本发明的有益效果是：
本发明所述的一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒及方法能够定性并定量检测，在检测血液真菌感染方面具有高灵敏度及特异性。
附图说明
图1为ddPCR检测外周血真菌感染特异性；
图2为ddPCR检测外周血不同浓度的白色念珠菌；
图3为ddPCR检测外周血不同浓度的热带念珠菌；
其中，图1中的A01为铜绿杆菌，B01和C01为金黄色葡萄球菌，D01为大肠埃希菌，E01为肺炎链球菌，F01和G01为白色念珠菌标准菌株，H01为阴性对照；
图2中的B07、C07、D07、E07、F07、G07、H07样品分别代表外周血含有热带念珠菌1×107个/mL、1×106个/mL、1×105个/mL、1×104个/mL、1×103个/mL、1×102个/mL、1×101个/mL，H08为阴性对照；
图3中的A07，B07，C07，D07，E07，F07，G07样品分别代表外周血含有热带念珠菌1×101个/mL、1×102个/mL、1×103个/mL、1×104个/mL、1×105个/mL、1×106个/mL、1×107个/mL，H07为阴性对照。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步详细说明。
实施例一：检测外周血白色念珠菌感染
为模拟系统性真菌感染血液样本的检测，首先将医学真菌实验室真菌保藏库中的白色念珠菌5314复苏，液体YPD过夜扩大培养计数，按照1×107个/mL、1×106个/mL、1×105个/mL、1×104个/mL、1×103个/mL、1×102个/mL、1×101个/mL的浓度梯度用全血进行倍比稀释，并设立阴性对照组；
通过本发明提供的所述试剂盒利用本发明提供的所述方法，首先，对DNA进行提取；然后，对模板DNA进行进行扩增；最后，利用ddPCR进行分析，其中上样量为66ng。
实验结果表明，在每个反应体系中，ddPCR可以在健康人全血中检测到11.2个拷贝数，能够快速、高灵敏的对血液中真菌进行诊断。
实施例二：检测外周血热带念珠菌感染
将医学真菌实验室真菌保藏库中的热带念珠菌复苏，液体YPD过夜扩大培养计数，按照1×107个/mL、1×106个/mL、1×105个/mL、1×104个/mL、1×103个/mL、1×102个/mL、1×101个/mL的浓度梯度用健康人全血进行倍比稀释，并设立阴性对照组；
通过本发明提供的所述试剂盒利用本发明提供的所述方法，首先，对DNA进行提取；然后，对模板DNA进行进行扩增；最后，利用ddPCR进行分析，其中上样量为66ng。
实验结果表明，在每个反应体系中，ddPCR可以在全血中检测到9个拷贝数，能够快速、高灵敏的对血液中真菌进行诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由a：2×ddPCRSuppermix、b：无RNA酶超纯水、c：阳性对照和阴性对照、d：全血真菌总DNA提取试剂(OMEGA)组成。
其中：
a：2×ddPCR Suppermix包括：Suppermix(Bio-Rad)、FP(18um)、BP(18um)、Probe(5um)；
上游引物FP、下游引物BP、探针Probe，其核苷酸序列分布如下：
FP：5'-TTGGTGGAGTGATTTGTCTGCT-3'
BP：5'-TCTAAGGGCATCACAGACCTG-3'
Probe：FAM-TTAACCTACTAAATAGTGCTGCTAGC-BHQ1；
c：阳性对照为5314白念珠菌标准菌株，阴性对照为去离子水。
2.一种利用权利要求1所述的一种系统性真菌感染外周血检测试剂盒进行的系统性真菌感染外周血检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取全血DNA
①吸取250ul全血转移至离心管；加入25ul蛋白酶A和250uL Buffer；
②65℃水浴10min；
加入260μl无水乙醇；
将溶液转移至吸附柱，进行10000g离心去滤液；
吸附柱转移到新的离心管中，添加500uL Buffer；
③10000g离心1min，弃滤液；
将吸附柱转移至新的离心管，用700ul Wash Buffer进行洗涤2次；
用100ul 65℃预热去离子水，洗脱收集DNA；
2)ddPCR检测
①将待检测样品、阴性对照和阳性对照每个组添加2×ddPCR Suppermix 14uL，分别取66ng模板DNA，用无RNA酶超纯水补齐20uL体系；
②将20uL体系转移到微滴发生卡内，制备微滴；
③将微滴转移至96孔板，进行封膜；
④将样本放入PCR仪中进行扩增，扩增条件为：
95℃反应10min、
95℃反应30s、
57℃反应1min，40个循环；
98℃反应10min；
每个步骤设置2℃/s的升降速度。
⑤将扩增完的PCR放入微滴分析仪中，检测微滴荧光信号，分析数据；
3)结果判定
利用QuantaSoft1.7.4对荧光信号进行而分析处理，划定阈值线区分阳性微球/阴性微球进行区分，其中：
阳性微球指含有真菌DNA，阴性微球指不含有真菌DNA；
4)特异性验证
为验证本发明试剂盒检测外周血真菌感染的特异性，利用本试剂盒对血液感染铜绿杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、白色念珠菌标准菌株标本进行特异性检测，结果显示，本试剂盒检测白色念珠菌感染标本为阳性，而其它细菌感染标本均显示为阴性结果。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110616253A (zh) * 2019-06-14 2019-12-27 深圳市妇幼保健院 一种基于微滴式数字pcr技术的检测真菌的试剂盒及方法
CN110628940A (zh) * 2019-11-08 2019-12-31 领航基因科技（杭州）有限公司 一种基于液滴数字pcr检测四种念珠菌的试剂盒

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李辉桃等: "应用微滴式数字PCR技术快速诊断新生儿侵袭性真菌病", 《中国当代儿科杂志》 *

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