FR2559783A1 - Reactifs d'acide nucleique perfectionnes et procedes pour leur preparation - Google Patents
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Abstract
REACTIFS D'ACIDE NUCLEIQUE CARACTERISES EN CE QU'ILS COMPRENNENT DES CHAINES DE FRAGMENTS ALTERNES D'ACIDE NUCLEIQUE, ET AVANTAGEUSEMENT PLUSIEURS SERIES D'AU MOINS DEUX CHAINES DE TELS FRAGMENTS ALTERNES, LESQUELLES CHAINES PEUVENT EVENTUELLEMENT ETRE FIXEES A UN SUPPORT SOLIDE. SELON UN MODE DE REALISATION DE CES REACTIFS, LES FRAGMENTS DONT ILS SONT FORMES COMPRENNENT LE PLASMIDE RECOMBINANT PKTH 1220 ETOU LE PLASMIDE RECOMBINANT PKTH 1271 QUI ONT ETE DEPOSES RESPECTIVEMENT SOUS LES N DSM 2825 ET DSM 2826 AUPRES DE LA DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN. PROCEDE DE PREPARATION DES REACTIFS D'ACIDE NUCLEIQUE CONFORMES A L'INVENTION. APPLICATION DE CES REACTIFS POUR L'IDENTIFICATION D'ACIDES NUCLEIQUES PAR DES METHODES D'HYBRIDATION EN SANDWICH.
Description
La présente invention est relative à des réactifs
d'acide nucléique perfectionnés comprenant une chaîne de frag-
ments d'acide nucléique et à des combinaisons de ces réactifs perfectionnés. L'invention concerne aussi des procédés de préparation de réactifs d'acide nucléique composé d'une chaînede clones et de combinaisons de ces réactifs d'acide nucléique par des techniques d'ADN recombinant et leur utilisation pour
identifier des acides nucléiques par des méthodes d'hybridation.
Diverses méthodes d'hybridation ont été couramment
utilisées pour identifier et étudier des acides nucléiques.
Certains exemples sont constitués par les méthodes d'hybridation directes, dans lesquelles l'échantillon contenant l'acide nucléique à identifier est soit en solution (Brautigam et coll., J. Clin. Microbiol., 1980, 12, 226-234 et la Publication du brevet britannique n 2 019 408) soit fixé à un support solide (brevets U.S. N 4 139 346, 4 302 204, 4 358 535 et 4 395 486,
de brevet britannique N 2 034 323 et 2 095 833, les Publica-
tions de brevetseuropéens N 62 286, 62 237 et 61 740) et est détecté à l'aide d'un réactif d'agent nucléique marqué, qui
s'hybride avec l'acide nucléique à identifier.
D'autres méthodes d'hybridation connues comprennent la méthode d'hybridation en sandwich à deux étapes, présentée par Dunn et Hassell dans Cell, 12, 23-36, 1977 et les méthodes
d'hybridation en sandwich à une étape présentées dans la publi-
cation du brevet européen N 79 139. Pour réaliser l'identifi-
cation des acides nucléiques par les méthodes en sandwich, il faut deux réactifs d'acide nucléique distincts pour détecter les acides nucléiques présents dans la solution d'échantillon. L'un
des réactifs est fixé à un support solide et l'autre est marque.
Des réactifs d'acide nucléique, à la fois ceux qui sont fixés à un support solide et ceux qui sont marqués, sont caractérisés en ce que leur séquence de base est complémentaire ou pratiquement complémentaire de celle de l'acide nucléique à
identifier, c'est-à-dire homologue. Les réactifs d'acide nuclé-
ique utilisés sont, soit des acides nucléiques naturels tels que ou des fragments de ceux-ci. Les fragments sont produits, par exemple, à l'aide d'enzymes de restriction. Des réactifs d'acide nucléique ont aussi été préparés par synthèse ou par des techniques d'ADN recombinant. Des plasmides naturels (brevet U.S. N 4 358 535), des acides nucléiques provenant de
bactériophages (brevet U.S. N 4 543 535), de i'ARN riboso-
mique et de I'ARN messager (brevet U.S. N 4 302 204) ou un acide nucléique provenant de différents virus (Stâlhandske et
coll., Curr. Top. Microbiol. Virol, 104, 1983) ont été utili-
sés comme réactifs d'acide nucléique. Le génome viral entier
a été utilisé pour identifier, par exemple, des parties appar-
tenant aux différents virus dans i'ARN messager d'un virus hybride (Dunn et Hassell, Cell, 12, 23-36, 1977). On a aussi préparé des réactifs d'acide nucléique en utilisant des techniques d'ADN recombinant (brevets U.S. N 4 395 486, et
4 359 535, la demande de brevet européenN 79 139, la publi-
cation du brevet britannique N 2 034 323, ainsi que la demande de brevet européen N 62 286). Des réactifs d'acide nucléique produits par des techniques d'ADN recombinant ont été utilisés, soit de telle façon que le fragment d'ADN défini répliqué a été purifié à partir de l'ADN du vecteur, soit sous forme de molécules d'ADN recombinant liées à différents vecteurs. Les réactifs d'acide nucléique utilisé auparavant, produits par des techniques d'ADN recombinant, sont constitués d'un fragment continu d'acide nucléique d'identification ou
de plusieurs clones distincts.
La demanderesse a mis au point de nouveaux réactifs d'acide nucléique plus sensibles, comprenant au moins deux séries de chaînes alternées de fragments d'acide nucléique, préparés à partir d'un ou de plusieurs segments homologues de
l'acide nucléique à identifier.
Dans des tests d'hybridation en sandwich, des réactifs
d'acide nucléique qui comprennent de telles chaînes de frag-
ments d'acide nucléique, sont au moins deux fois plus sensible!
que les réactifs d'acide nucléique utilisés antérieurement.
En utilisant les réactifs d'acide nucléique conformes à la présente invention ou leurs combinaisons, il est possible d'identifier de plus petites quantités d'acides nucléiques qu'auparavant, et ils sont particulièrement bien appropriés aux méthodes d'hybridation en sandwich. La plus grande sensibilité des réactifs d'acide nucléique conformes à la présente invention manifestée dans des méthodes d'hybridation en sandwich, repose en partie sur le
fait que l'utilisation de plusieurs sondes augmente la quan-
tité d'hybrides marqués sur le support solide. Il peut y avoir un acide nucléique marqué dérivé d'un vecteur avec chaque sonde hybridante (Figures 1 et 2). Dans les Figuresl1 et 2
v représente l'ADN dérivé d'un vecteur, x est l'acide nucléi-
que à identifier, b la sonde marquée, a le réactif d'acide nucléique d'identification fixé à un support solide et F est le filtre. Lorsqu'on utilise plusieurs sondes, la quantité de parties marquées d'acide nucléique dérivées du vecteur, augmente et davantage de substance de marquage est fixée aux hybrides formés. Les hybrides sont ainsi plus facilement
détectables.
Lorsque la chaîne de fragments d'acide nucléique conforme à la présente invention, est utilisée dans des méthodes d'hybridation en sandwich, on fixe au moins deux, ou comme
cela est montré dans la Figure 1, trois fragments d'acide-
nucléique d'identification sur le support solide. Dans ce cas, les différentes zones du brin x d'acide nucléique à détecter, peuvent s'hybrider avec les fragments d'acide nucléique fixes en support solide, par exemple a1, a2 eta3 en un ou plusieurs points, en fonction du degré de réaction. Lorsque la réaction atteint son stade final, il peut se présenter une
situation selon la Figure 1, dans laquelle le brin d'échantil-
lon forme une ou des boucles auxquelles s'hybrident la ou les sondes, par exemple b1 et b2 dans la Figure 1. A ce moment, la distance entre les parties d'acide nucléique dérivées du vecteur et le point de jonction de l'hybridation (1) diminue :(Fig. 1) et l'hybride est plus stable que l'hybride formé par une paire de réactifs (art antérieur) montré sur la Figure 2, cet hybride étant de la même dimension que la surface totale de la chaîne des fragments d'acide nucléique. Les parties dérivées du vecteur d'un hybride formé à partir d'une paire de réactifs sont facilement rompus, par exemple par une tension mécanique, comme les secousses. Dans un tel cas, la marque déjà
liée à l'hybride, s'échappe.
Comme les réactifs d'acide nucléique perfectionnés, conformes à la présente invention, sont plus sensibles que des réactifs d'acide nucléique utilisés antérieurement, ils
connennent pour mettre en évidence des réarrangements chromo-
somiques et des maladies héréditaires.
La présente invention concerne des réactifs d'acide nucléique comprenant une chaîne de fragments d'acide nucléique leur combinaison, leur préparation et leur utilisation pour détecter des acides nucléiques dans des méthodes d'hybridation Les caractéristiques de la présente invention sont
rapportées dans les revendications et l'invention est décrite
en détail dans la description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complé-
ment de description qui va suivre, qui se réfère aux dessins
annexes dans lesquels:
- la Figure 1 montre une chaîne d'hybrides en sand-
wich, - la Figure 2 montre un hybride en sandwich de l'art antérieur,
- la Figure 3 montre les sites de deux séries alter-
nées de fragments d'acide nucléique dans un acide nucléique qui a été choisi pour la préparation d'une chaîne de réactifs d'acide nucléique selon la présente invention, - la Figure 4 montre les sites correspondants de
trois séries alternées de chaînes de fragments d'acide nuclé-
ique, - la Figure 5 montre une chaîne de fragments d'acide nucléique selon la Figure 3, distincts (a), réunis (b) et à la fois distincts et réunis (c), - la Figure 6 montre une chaîne d'hybrides en sandwich, - la Figure 6a montre une chaîne d'hybrides en
sandwich qui est formée dans le cas de l'utilisation de frag-
ments distincts, - la Figure 6b montre une chaîne d'hybrides en
sandwich qui est formée dans le cas de l'utilisation de frag-
ments b réunis,
- la Figure 6c montre une chaîne d'hybrides en sand-
wich qui est formée dans le cas o l'on utilise à la fois des fragments b distincts et des fragments b -réunis, - la Figure 7 montre une chaîne de réactifs d'acide nucléique, qui identifie différents acides nucléiques,
- la Figure 8 montre une chaîne d'hybrides en sand-
wich qui est formée dans le cas o l'on utilise la chaîne de réactifs d'acide nucléique suivant la Figure 7, identifiant différents acides nucléiques, - la Figure 9, montre une chaine d'hybrides formée par un procédé d'hybridation directe,
- la Figure 10 montre le plasmide recombinantp11220;.
- la Figure 11 montre une chaîne d'hybrides en sand-
wich qui est formée lorsqu'on utilise une chaîne de fragments d'acide nucléique préparée à partir du plasmide recombinant pKTH1220, - la Figure 12 montre le plasmide recombinant pKTH1271,
- la Figure 13 montre une chaîne d'hybrides en sand-
wich qui est formée lorsqu'on utilise des chaînes de fragments d'acide nucléique, préparées à partir du plasmide recombinant pKTH1271. Il doit être bien entendu, toutefois, que ces dessins et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention,
dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
La présente invention est relative à des réactifs d'acide nucléique composés d'une chaine de fragments d'acide
nucléique. Ces chaînes de réactifs d'acide nucléique compren-
nent au moins deux, mais de preférence plusieurs fragments d'acide nucléique alternés et jusqu'à 20 fragments, qui dérivent d'un ou de plusieurs acides nucléiques suffisamment homologués de l'acide nucléique devant être identifié. On obtient ainsi au moins deux séries de chaînes alternées de fragments d'acide nucléique, qui ne doivent pas nécessairement
être homologués les uns des autres.
Les chaînes de réactifs d'acide nucléique peuvent être préparées par synthèse. Dans ce cas, les fragments provenant des deux séries alternées de chaînes de fragments d'acide nucléique ne doivent pas nécessairement être homologués
les uns des autres. Mais, ils doivent être suffisamment homo-
logués des sites alternés dans les acides nucléiques à identifier. Ces fragments peuvent facilement être préparés
avec des machines complètement automatiques, après caractéri-
sation de la séquence d'acides nucléiques de l'acide nucléique
à identifier.
Les chaînes d'acide nucléique conformes à la présenta invention sont composés de chaines séparées, réunies ou à la
fois séparées et réunies de fragments d'acide nucléique.
Les chaînes de fragments d'acide nucléique peuvent être réunies à un vecteur, contenir des parties de vecteurs ou
être totalement dépourvus de parties de vecteurs.
Les fragments d'acide nucléique utilisés ont une longueur minimum de 15 nucléotides. Il n'y a aucune limite supérieure réelle quant à la longueur, mais il est avantageux
d'utiliser des fragments ayant une longueur de 20 à 5000 nuclé-
otides. Les fragments d'acide nucléique conformes à la présente invention sont dérivés, soit du g énome à identifier, soit d'une partie du génome par exemple, d'un clone relativement important représentant une certaine partie du génome. Les chaines de fragments d'acide nucléique conformes à la présente invention, peuvent ainsi être préparés à partir de plusieurs zones de génome indépendantes, qui ne sont pas directement adjacentes. Les chaînes de fragments d'acide nucléique ainsi préparées sont combinées et utilisées pour le même réactif. Les chaînes de fragments d'acide nucléique peuvent aussi être isolées à partir d'un ADN qui n'est pas identique à l'acide nucléique à identifier, mais suffisamment homologue pour qu'il se forme un hybride stable entre le réactif et l'acide nucléique
à identifier. La préparation de chaines appropriées de frag-
ments d'acide nucléique n'est, en aucun cas, limitée à l'isolation des fragments convenables d'acide nucléique à partir du génome. Il existe de nombreuses méthodes également utiles pour préparer ces chaînes de fragments. Le spécialiste peut préparer des chaines de fragments d'acide nucléique selon
des méthodes synthétiques ou semisynthétiques.
Les réactifs sont isolés de manière telle qu'on obtient au moins deux séries de fragments d'acide nucléique alternés a1, a2, a3 etc.., et b1, b2, b3, etc.. Les fragments d'acide nucléique appartenant à la série al, a2, a3, etc.. sont composés de fragments situés près l'un de l'autre, mais non adjacents l'un à l'autre. Les fragments d'acide nucléique appartenant à la série b1, b2, b3 etc.. sont aussi composés de fragments d'acide nucléique situés au voisinage, mais non
l'un à côté de l'autre. Les fragments d'acide nucléique appar-
tenant à la série a1, a2, a3, etc; et ceux de la série bl, b2,
b3 etc.. ne doivent pas nécessairement être homologués les -
uns des autres. Il est préférable que les acides nucléiques
appartenant à la série al, a2, a3 etc.. et ceux qui appartien-
nent à la série b1, b2, b3 etc.. soient isolés de manière telle qu'un fragment sur deux soit de la série a et l'autre fragment
soit de la série b, comme cela est illustré par la Figure 3.
Dans la Figure 3, al, a2, a3 et bl, b2, b3 sont des chaînes de fragments d'acide nucléique suffisamment homologués de l'acide nucléique à identifier. Il est évidemment possible qu'une troisième série de fragments d'acide nucléique, cl, c2, c3, etc.. soit même isolée à partir du même acide nucléique, comme cela est représenté par la Figure 4. On préfère que
les deux réactifs d'acide nucléique alternés se suivent direc-
tement l'un l'autre, mais ceci ne constitue pas une condition
préalable indispensable pour la présente invention.
Les séries de fragments d'acide nucléique décrites ci-dessus peuvent être utilisées, soit sous forme de fragments séparés a1, a2, a3, etc.. et b1, b2, b3, etc.. (Fig. 5a) soit
réunis en brins plus longs al-a2-a3, etc.. et bl-b2-b3 etc..
(Figure 5b). Il est bien sr possible de préparer toutes les sortes de formes intermédiaires, comme par exemple, une série a dans laquelle a est un fragment distinct et a2-a3 sont réunis et dans la série b, par exemple bl-b2 sont réunis et
b3 est séparé etc.. comme cela est illustré par la Figure 5c.
La Figure 6 illustre diverses chaînes d'hybrides en sandwich. La Figure 6a montre une chaîne d'hybrides en sandwich, dans laquelle les chaînes de fragments d'acide nuclé ique sont séparées. La Figure 6b montre une chaîne d'hybrides dans laquelle les chaînes marquées de fragments d'acide nucléique sont réunies. La Figure 6c montre un cas dans lequel une chaîne d'hybrides en sandwich est formée à partir de chaînes marquées, à la fois réunies et séparées de fragments d'acide nucléique.Dans la Figure 6, x représente l'acide nuclé ique à identifier; bl, b2 et b3 représentent la sonde marquée et a1, a2 et a3 représentent des chaînes de fragments d'acide
nucléique fixés à un support solide.
Des fragments d'acide nucléique qui appartiennent à la série b, pouveit par exemple, être marqués de manière telle qu'on obtienne un réactif d'acide nucléique marqué, c'est-à-di3 la sonde B. Les réactifs d'acide nucléique qui appartiennent à la série a peuvent être attachés à un support solide,de telle sorte qu'un réactif A d'acide nucléique lié à un support
solide soit obtenu. Dans une variante, il est évidemment possi-
ble de préparer un réactif A d'acide nucléique marqué et un réactif B d'acide nucléique correspondant lié à un support solide. Ces paires A et B d'acides nucléiques, ou B et A,
marquées ou fixées respectivement à un support solide, peu-
vent être préparées pour plusieurs acides nucléiques diffé-
rents à identifier. Elles peuvent être associées en combinai-
sons convenables de réactif d'acide nucléique, qui sont compo-
sées de différentes paires de réactifs d'acide nucléique A1 et B1, A2 et B2, A3 et B3, etc.. ou B1 et A1, B2 et A2, B3 et A3, etc.. Des réactifs contenant des chaines de fragments d'acide nucléique qui identifient différents acides nucléiques, peuvent aussi être combinés de façon à obtenir une sonde Ax-Ay-Az, qui, par exemple, comprend une chaine de fragments d'acide nucléique (a-a2-a3)x-(al-a2-a3)y-(a-a2-a3)z comme cela est indiqué dans la Figure 7, dans laquelle alx, a2x et a3x sont des chaînes de fragments Ax d'acide nucléique, qui identifient l'acide nucléique x; aly; a2y et a3y sont des chaînes de fragments Ay d'acide nucléique qui identifient l'acide nucléique y; alz, a2z, et a3z sont des chaînes de
fragments A d'acide nucléique qui identifient l'acide nuclé-
ique z et v est une partie d'acide nucléique dérivée d'un vecteur. Des chaines réunies de fragments d'acide nucléique peuvent évidemment aussi être utilisées, en tant que fragments
séparés, sous forme de mélanges appropriés.
Les chaînes d'hybrides en sandwich suivant la Figure 8 sont obtenues avec les réactifs représentés dans la Figure 7. Si l'on désire effectuer une identification simultanée de plusieurs acides nucléiques différents, il est bien sur nécessaire d'utiliser des filtres séparés, comme cela est représenté dans la Figure 8. La Figure 8a montre un support
solide identifiant l'acide nucléique x, la Figure 8b un sup-
port solide identifiant l'acide nucléique y et la Figure 8c un support solide identifiant l'acide nucléique z. Dans les
Figures 8a, 8b, et 8c, blx, b2K et b3x sontdes chaînes defrag-
ments d'acide nucléique fixes à un support solide et identi-
fiant l'acide nucléique x; bly, b2y et b3y sont des chaînes de fragments d'acide nucléique fixes à un support solide et identifiant l'acide nucléique y; et blz, b2z et b3z sont des chaînes de fragments d'acide nucléique fixés à un support solide et identifiant l'acide nucléique z; et x, y et z sont les acides nucléiques à identifier. Fx, Fy et Pz sont les filtres ou supports solides respectifs, Ax-Ay-Az est une sonde qui identifie simultanément les trois acides nucléiques, dans le cas ou des supports solides séparés sont mis en cause Les séries de fragments, réactifs et combinaisons de réactifs d'acide nucléique décrits ci-dessus, peuvent
être prépares par des techniques connues en elles-mêmes, im-
pliquant l'ADN recombinant. On produit un certain nombre de fragments d'acide nucléique de différentes longueurs, en utilisant des enzymes de restriction, à partir de l'acide nucléique à identifier ou d'une partie le représentant. Si la carte de restriction du génome à identifier est connue, il est possible de choisir à partir du génome, les fragments
adjacents convenables, engendrés par les enzymes de restric-
tion, puis d'isoler les fragments et de les amplifier en
mettant en oeuvre des techniques d'ADN recombinant.
Lorsqu'un génome inconnu est impliqué, on peut utiliser une étape intermédiaire dans la préparation des
réactifs de façon à cloner un fragment de restriction rela-
tivement important, on dresse la carte de ce fragment et
on produit les chaînes de séries de fragments d'acide nuclé-
ique a1, a2, a3 etc.. et b1, b2, b3, etc.. sur la base de
l'information ainsi obtenue.
Il est bien sûr possible d'utiliser des combinai-
sons des méthodes ci-dessus et d'employer plusieurs gros fragments de restriction clones séparés, à titre de matières de départ, puis de préparer plusieurs séries distinctes qui
sont associées en combinaisons convenables.
I1 est avantageux de préparer les séries de frag-
l1
ments d'acide nucléique a1, a2, a3, etc.. et b1, b2, b3, etc..
selon la présente invention en utilisant des techniques d' ADN recombinant, par clonage de la série a dans un vecteur, par exemple, dans le plasmide pBR322, tandis que la série b est classée dans un autre vecteur convenable qui n'a pas
de séquences en commun avec le vecteur précédent. Le bacté-
riophage M13 est un exemple d'un tel second vecteur avanta-
geux. Les fragments appartenant à la série a, peuvent être réunis les uns aux autres, et la série réunie peut être clonée dans un vecteur. Par exemple, al-a2 réunis peuvent être clones en tant qu'élément d'insertion continu dans le même vecteur pBR322. De façon analogue, il est possible de préparer une série bl-b2 de réactif. On préfère utiliser dans le donage, des vecteurs auxquels peuvent être réunis de très larges inserts d'ADN étranger. Par exemple,des
vecteurs cosmidiques et lambdaphages conviennent à ce propos.
Il faut donc deux paires de réactifs comprenant des chaînes de fragments d'acide nucléique dans la méthode d'hybridation en sandwich conforme à la présente invention, un réactif marqué avec'la substance de marquage à identifier, c'est-à-dire une sonde et un réactif, dit filtre, fixé à
un support solide.
On utilise, le plus couramment, des radio isotopes pour marquer les sondes. Par exemple, on emploie les isotopes 32p, 125i 131I, et 3H dans le brevet britannique
N 2 034 323, les brevets US N 4 358 535 et 4 302 204.
L'isotope 125I est utilisé dans le brevet européen N 79 139.
Des sondes d'acide nucléique ont aussi été modifiées de diverses façons et marquées, par exemple, avec des traceurs fluorescents (brevet français N 2 518 755). On utilise aussi des marqueurs enzymatiques ou mesurables par voie enzymatique (le brevet britannique N 2 019 408, le brevet européen N 63 879 et le brevet français N 2 519 005). Les brevets européens N 70 685 et 70687 décrivent une substance de marquage émettant de la lumière et une méthode de marquage, et le brevet français N 2 518 755 décrit une substance de marquage mesurable par voie immunologique. Les chelates de lanthanides décrites dans le brevet US N 4 374 120, en particulier d'europium, peuvent être mis en oeuvre comme substances de marquage. La substance de marquage biotine- avidine décrite par Leary et al. (PNAS 80, 4045-4049, 1983), convient comme marqueur. Quelques exemples de substances de marquage utilisables pour effectuer le marquage des réactifs d'acide nucléique conformes à la présente invention, sont mentionnés ci-dessus, mais il est évident que de nouvelles substances de marquage améliorées vont être mises au point,
qui conviendront aussi pour le marquage de chaînes de frag-
ments d'acide nucléique conformes à la présente invention.
Les supports appropriés pour des réactifs-filtres comprennent divers filtres de nitrocellulose (brevet US N' 4 358 535 et brevet britannique N 2 095 833). Le brevet DDR N 148 955 décrit une méthode pour fixer chimiquement des acides nucléiques au support (papier). Les brevets US N 4 359 535 et 4 302 204 décrivent des papiers chimiquement
modifiés, qui peuvent être utilisés comme supports solides.
D'autres possibilités comprennent des membranes de nylon et des filtres de nitrocellulose modifiée. Mais il est bien
évident qu'il va appraître de nouveaux matériaux qui convien-
dront encore mieux en tant que supports solides conformes à la présente invention. Il est bien sûr possible d'utiliser aussi d'autres supports solides, comme diverses matrices de chromatographie, telles que de la cellulose activée par la triazine ou un époxy, du latex, etc.. En principe, il n'y a pas d'autres limitations quant au choix du support solide que celles qui sont indiquées ci-après. Il doit être possible de fixer l'acide nucléique en forme de brin unique sur le support solide, de manière telle que ces acides nucléiques à brin unique puissent s'hybrider avec l'acide nucléique complémentaire. Le support solide doit aussi être facile à enlever de la solution d'hybridation ou la solution
d'hybridation doit être facile à éliminer du support solide.
La sonde ne doit pas non plus adhérer au matériau support lui-même au point qu'elle ne puisse en être éliminée par lavage. Avec les combinaisons ci-dessus de chaînes de paires de réactifs d'acide nucléique A et B ou B et A, marqués et fixés à un support solide respectivement, il est possible d'assembler une combinaison Ax et Bx, Ay et By, Az et Bz à partir de ces paires d'acide nucléique préparées, pour identifier différents acides nucléiques. Ces combinaisons peuvent être utilisées pour l'identification simultanée des acides nucléiques x, y et z par des méthodes d'hybridation
en sandwich.
L'échantillon est traité de manière telle que les acides nucléiques sont libérés dans la solution d'hybridation et qu'ils sont mis sous forme de brin unique. L'hybridation est effectuée dans une solution d'hybridation dans laquelle sont ajoutés les réactifs d'acide nucléique fixes à un
support solide et les réactifs marqués. Lorsque l'hybrida-
tion a eu lieu, on sort les filtres de la solution d'hybri-
dation si des filtres ont été utilisés comme supports solides. Si des matrices de chromatographie, un latex ou similaires, ont été mis en oeuvre, on enlève la solution d'hybridation. Les supports solides sont rincés avec une solution de lavage appropriée. Les chaînes d'hybrides en sandwich formés (Figures 8a, 8b, 8c) sont détectées par des méthodes connues en elles-mêmes. Le traceur radioactif est mesuré, par exemple, par autoradiographie, par compteur de scintillations ou compteur de rayonnement gamma. Par exemple, on identifie une substance de marquage enzymatique, par exemple après une réaction colorée, par photométrie ou à partir d'un précipité. Des chélates de lanthanides peuvent être détectées par la méthode dite de "fluorescence dissipée dans le temps". Une substance de marquage inmunologique est
détectée par des méthodes immunologiques appropriées.
Plusieurs mélanges différents peuvent être uti-
lisés comme solution d'hybridation; les variantes décrites dans le brevet européen N 79 139 et le brevet US 4 302 204
sont cités à titre d'exemples. Il est bien sûr possible d'uti-
liser d'autres mélanges d'hybridation. L'hybridation a lieu à une température de 0 à 80 C, mais il est avantageux d'utiliser
par exemple, une température de 65 C. Une hybridation suffi-
sante peut apparaître en une très brève période, mais il est avantageux d'utiliser des périodes d'hybridation de, par
exemple, 12 à 20 heures.
Le procédé d'hybridation en sandwich à deux étapes est effectué en principe de la même façon, mais dans ce cas, on ajoute d'abord dans la solution d'hybridation, le réactif
d'acide nucléique fixé à un support solide. Lorsque l'hybri- dation a eu lieu, on lave le support solide et on effectue la seconde
hybridation, dans laquelle est présent le réactif
d'acide nucléique marque.
Les réactifs marqués d'acide nucléique ou combi-
naisons de réactifs: Ax, A y, Az etc.. et Bx, By, Bz, etc..
décrits plus haut, peuvent bien sûr être utilisés dans des
méthodes d'hybridation directe. Dans un tel cas, on doit répar-
tir l'échantillon d'acide nucléique en des solutions pour chacun des acides nucléiques x, y, et z à identifier ou, si l'échantillon est fixé à un support solide, on doit préparer
un échantillon séparé fixé à un support pour chaque échantillon.
La chaîne d'hybrides formée (Figure 9) est détectée par des
méthodes connues en elles-mêmes. Dans les Figures 9, F repré-
sente le support solide, c'est-à-dire le filtre, x est l'acide nucléique à identifier et v représente les parties dérivées d'un vecteur. Les sondes marquées utilisées sont a1, a2 et a3 (Figure 9a), b1 et b2 (Figure 9b) et a1, b1, a2, b2; a3
(Figure 9c).
Comme déjà décrit ci-dessus, on peut préparer diverses combinaisons de réactifs d'acide nucléique à partir des chaînes de fragments d'acide nucléique conformes à la présente invention. Il est possible d'identifier plusieurs différents acides nucléiques simultanément, en utilisant ces combinaisons. On peut utiliser des chaines de fragments d'acide nucléique homologues des différents acides nucléiques à identifier, sous forme de fragments séparés dans les mélan-
ges ou réunis ensemble, de façon à obtenir une sonde identi-
fiant plusieurs acides nucléiques différents. Des réactifs d'acide nucléique fixés à un support solide doivent évidemment
être maintenus séparés, pour réussir l'identification.
L'hybridation utilisant des chaînes de fragments
d'acide nucléique peut servir à identifier divers micro-
organismes pathogènes de l'homme, d'animaux ou de végétaux. Il
est possible avec cette méthode d'identifier des microorganis-
mes présents dans des denrées alimentaires, comme des clostri-
diales, des salmonelles, des staphylocoques qui provoquent des empoisonnements alimentaires. La méthode convient pour identifier des agents contaminants présents dans l'eau,
comme des entérobactéries et des entérovirus.
Comme le test d'hybridation en sandwich utilisant des chaines de fragments d'acide nucléiques est une méthode quantitative, il est également applicable par exemple, a la détection et à la mesure de l'amplification des gènes. Cette caractéristique est significative par exemple, dans le
domaine de la détection et du traitement du cancer. La forma-
tion d'une chaîne stable d'hybrides nécessite que les séquences homologues de l'agent sonde et de l'agent filtre soient
situées à une distance modérée l'une de l'autre, de prefée-
rence à moins de 5 kilobases (kb) dans le brin d'échantillon.
S'il apparaît effectivement des changements de distance entre ces deux régions, on peut nettement observer ce changement grâce à cette méthode. La méthode convient donc aussi pour la détection d'ARN messagère modifié, de réarrangements chromosomiques, de réarrangement des gènes d'immunoglobuline
d'expression et des maladies héréditaires. Il est ainsi pos-
sible de construire diverses combinaisons de réactifs à partir des chaînes de fragments d'acide nucléique. Par exemple, pour effectuer l'identification d'agents provoquant des
maladies vénériennes, il est possible de préparer des ensem-
bles comprenant une sonde qui contient des chaînes de frag-
ments d'acide nucléique capables d'identifier la gonorrhie, la syphilis, l'herpès et les chlamydias. Dans ce cas, on peut réaliser l'identification en utilisant des filtres distincts pour la gonorrhée, la syphilis, l'herpès et les chlamydiae. La présente invention concerne en particulier des
chaînes de fragments d'acide nucléique comprenant les plas-
mides recombinants pKTH1220 et pKTH1271. Le plasmide recom-
binant pKTH1220 comprend l'ADN de Chlamydia trachomatis L2 qui est spécifique des Chlamydiae, dans le vecteur constitué par le plasmide pBR322. Ce plasmide recombinant est cloné dans l'hôte Escherichia coli K12 HB101. Dans le vecteur plasmide pBR325, le plasmide recombinant 1271 comprend l'ADN provenant du cytomégalovirus AD169. Ce plasmide recombinant est cloné dans l'hôte Escherichia coli K12 HN101. Les hôtes contenant les plasmides recombinants pKTH1220 et pKTH1271 ont été déposés à la collection de cultures Deutsche Sammlung
von Mikrooganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Gbttin-
gen, R.F.A. Le numéro du dépôt contenant le plasmide recombi-
nant pKTH1220 est DSM2825 et le numéro du dépôt contenant le plasmide recombinant pKTH1271 est DMS2826. Les dépôts seront librement disponibles après publication de cette demande de brevet. La présente invention est davantage décrite dans les exemples suivants, qui ne sauraient en aucune manière
limiter la portée de celle-ci. La structure de l'acide nuclé-
ique (ADN et ARN) est semblable, qu'il s'agisse d'un acide
nucléique dérivé d'une cellule eucarystée ou procaryste.
Pour cette raison, les modes présentés dans les exemples sont également applicables aux acides nucléiques des animaux (l'homme compris), des plantes et des microbes ou virus. Ainsi, les réactifs conformes à la présente invention, peuvent être utilisés pour détecter les acides nucléiques de l'homme, des animaux, des végétaux, des microbes et de virus. Les chaînes de fragments d'acide nucléiques peuvent aussi être préparées par voie synthétique. La séquence des acides nucléiques à identifier peut être caractérisée et des chaînes homologues de fragments peuvent être préparées à l'aide de machines
automatiques de préparation d'acides nucléiques.
Exemple 1
a) Chaine de réactifs d'acide nucléique provenant
de Chlamydia trachomatis et leur préparation.
On prépare des fragments d'ADN convenables pour réaliser le diagnostic du groupe Chlamydia trachomatis à partir de l'ADN du Sérotype L2 de Chlamydia trachomatis L'ADN est isolé et fragmenté selon des méthodes connues, les fragments d'ADN résultants sont clonés dans le plasmide pBR322 et transférés dans l'organisme d'accueil Escherichia coli K12 HB101 selon des méthodes connues. On obtient une banque de gènes de la bactérie Chlamydia trachomatis L2 à la suite du clonage, c'est-à-dire un grand nombre de plasmides recombinants, ayant chacun un fragment de restriction distinct BamHI de l'ADN dérivé de chlamydia. Afin de produire un
réactif, on choisit dans la banque de gènes, des plasmides reccm-
binants contenant de plus grandes insertions d'ADN dérivés d'ADN chlamydiqcue.
Un tel plasmide est désigné sous le nom de pKTH1220; il a été
déposé à la collection de cultures Deutsche Sammlung von Micro-
organismen sous le numéro (DMS 2825) et l'on a mis en évi-
dence l'aptitude de celui-ci à être utilisé en tant que réactif par un test d'hybridation directe. Ce test a montré que le pKTH1220 a identifié tous les acides nucléiques dérivés des différents sérotypes de Chlamydia trachomatis, mais pas d'
autres acides nucléiques.
Les fragments applicables, pouvant être obtenus à l'aide de diverses enzymes de restrictions, sont choisis à
partir de l'ADN du plasmide pKTH1220 et certains de ces frag-
ments sont transférés au cours d'un clonage ultérieur dans le plasmide pAT153 (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold String Harbor Laboratory, p.6, 1982) et d'autres dans la phage M13. La Figure 10 montre le plasmide recombinant pKTH1220 ayant une longueur moléculaire de 14 kb. Dans la Figure 10, BamHI, SalI et ClaI représentent les enzymes de restriction mises en oeuvre et a1, a2, b1, b2 et b3 illustrent la dimension et les situations mutuelles des
fragments produits à l'aide de ces enzymes de restriction.
Les fragments appartenant à la série b servent de sondes marquées. Le Tableau I fournit les dimensions des fragments et les vecteurs utilisés pour un clonage ultérieur, le nom des
plasmides recombinants et leur utilisation.
Tableau I
__
* Fragment Dimension Vecteur -.Plasmide Utilisation Recombinant al ClaISalI 3,0kb pAT153 pKTH1252 Filtre a2 SalI-ClaI 2,9kb pAT153 pKTH1250 Filtre b SalI-BamHI 0,7kb M13mp8 mKTH1242 sonde marqué b2 BamHI-SalI 1, 4kb M13mp8 mKTH1239 " " b3 ClaI-ClaI 1,7kb M13mp8 mKTH1248 " " bl-b2 BamHI-BamHI 2,1kb M13mp8 mKTH1245 " Les fragments indiqués dans le Tableau I sont isolés à partir d'un gel d'agarose par électro-élution et sont clones dans les sites appropriés d'identification de l'enzyme de restriction des vecteurs énumérés dans le Tableau I, à
l'aide de méthodes connues.
Le fragment BamHI-BamHI 2,1 kb est produit de la façon suivante: les fragments BamHi-SalI 1,4kb et SalI-BamHi 0,7kb du plasmide pKTH1220 sont séparés par électrophorèse
sur gel, dans un gel d'agarose à partir duquel ils sont isolés.
Les fragments purifiés sont réunis à l'aide de l'enzyme ligase T4 et parmi les fragments d'ADN 2,1 kb produits dans la
réaction, ceux qui ont des extrémités libres qui sont iden-
tifiés par l'enzyme BamHI, sont ensuite réunis au site de restriction BamHI de la forme à double brin de l'ADN du phage M13mp8. On a ainsi fabriqué un ADN de phage recombinant
(mKTH1245), qui contient l'ADN de Chlamydia trachomatis compo-
sant deux fragments d'ADN distincts, qui ne sont pas situés de façon adjacente dans le génome. Cependant, ils sont situés dans le génome, à côté des réactifs d'ADN pKTH1250 et pKTH1252 devant être fixés au filtre (Figure 11). La Figure 1-1 montre une chaîne d'hybrides en sandwich, qui est formée lorsqu'on
utilise les plasmides recombinants et les phages recombi-
nants énumérés dans le Tableau I comme chaînes de réactifs
d'acide nucléique.
b) Démonstration de la sensibilité d'une chaîne de réactifs d'acide nucléique provenant de Chlamydia trachomatis
selon la méthode d'hybridation en sandwich.
La sensibilité d'une chaine de réactifs d'acide nucléique par rapport à celle d'une paire de réactifs continue
unique, a été étudiée selon la méthode d'hybridation en sand-
wich. On a effectué le test en utilisant des filtres qui contenaient tous 101l molécules à la fois d'ADN de pKTH1250
(a2) et de pKTH1252 (a1) mis sous la forme de brin unique.
L'échantillon étudié était le plasmide pKTH1220 que l'on a mis sous forme de brin unique, pour cette expérience en le faisant bouillir pendant 5 minutes dans de la NaOH 0,17M, puis on l'a porté à 0 C et neutralisé avec une quantité équimolaire
d'acide acétique. On a employé dans les tests, les sondes ci-
après, marquées avec 125 I et énumérés dans le Tableau I:
mKTH1242(bl), mKTH1239(b2), mKXTH1248(b3) et mKTH1245(bl1b2).
L'hybridation a été réalisée à + 65 C pendant 17 heures dans une solution d'hybridation ayant la composition suivante: 4 x SSC, 0,02 % de Ficoll, 0, 02 % de polyvinyl pyrrolidone, 0,2 % de SDS, et 200 pg/ml d'ADN de sperme de hareng. Les filtres ont été lavés pendant 2 heures à 50'C avec une solution de lavage ayant la composition suivante: 0,1 x SSC, 0,2 % de SDS et ont été soumis à un comptage avec un compteur de rayonnement gamma. Ls résultats sont rassemblés dans le Tableau II et sont la moyenne de cinq essais parallèles.
Tableau II
Molécules de Radioactivité hybridée, avec (b) comme sonde Spécimen/test b b Spécimen/test b b2 b3 bl,b2 (bl-b2) (bl_-b2)
2 32 2 2
0 37 37 33 49 39 52
i06 48 44 48 I 93 68 140
107 226 236 232 396 416 686
15108 1475 1415 1456 2912 2637 3580
b1 380 000 cpm/test; 5 x cpm/g d'ADN b2 340 000 cpm/test; 4 x 107 cpm/pg d'ADN b3 350 000 cpm/test; 5 x 7 cpm/g d'ADN b2- 340 000 cpm/test; 4 x 107 cpm/pg d'ADN b3 350 000 cpm/test; 5 x 10 7 cpm/-pg d'ADN b1-b2 310 000 cpm/test; 7 x 107 cpm/pg d'ADN bl, b2 700 000 cpm/test; (b1 b2),b3 700 000 cpm/test; On a considéré que la limite de confiance de 95 % calculée statistiquement pour des tests effectués sans échantillon (= témoinsnégatifs) était la limité inférieure pour le caractère positif. Ces valeurs étaient de 52-54 cpm lorsque la sonde était bl, b2 ou b3, de 58 cpm lorsque la sonde était bl, b2, de 56 cpm lorsque la sonde était blb2 et
de 65 cpm lorsque la sonde était bl-b2,b3.
c) Diagnostics du chlamydia à l'aide d'une hybri-
dation en sandwich avec des chaînes de fragments.
On a choisi pour cet essai, des spécimens prélevés chez trois hommes souffrant d'urétrite et chez trois femmes souffrant de cervicite. On a isolé le Chlamydia trachomatis
dans les spécimens urétraux masculins, tandis que les spéci-
mens féminins ont été prélevés dans le col de l'utérus. De
plus, on a étudié un nombre correspondant de spécimens analo-
gues de malades à partir desquels la chlamydia n'a pas été isolée. Les spécimens à étudier ont été prélevés avec des
écouvillons à bout de coton, qui ont été plongés dans une solu-
tion tampon de prélèvement d'échantillon de chlamydie, conte-
nant du saccharose 0,2 M, 20 mM de tampon au phosphate, 3 % de sérum de veau foetal, 10 pg/ml de gentamicine, 100 pg/ml de
vancomycine et 25 IU/ml de nystatine.
La chlamydia a été cultivée à partir des spécimens.
Les spécimens d'origine ont été aussi évalués par hybrida-
tion en sandwich avec une chaîne de fragments d'acide nucléique.
On a concentré les spéciments en utilisant du 2-butanol pour en éliminer le liquide, de manière telle que le volume final était d'environ 80 P1, leur concentration étant de 3 à 7 fois environ pour l'essai. On a ajouté ensuite au spécimen, 70 mM d'EDTA, 0,7 % de SDS, 200 pg/ml d'enzyme K protéinase et on l'a traité pendant 15 minutes à 55 C et pendant 45 minutes à 37 C. Le spécimen a ensuite été porté à ébullition pendant minutes avec de la NaOH, 0,175 M. Apres ébullition, le spéci- men a été mis à 00C et neutralisé avec une quantité équimolaire d'acide acétique, puis soumis au test. Les filtres et les conditions d'hybridation décrits dans l'exemple lb ont été mis en oeuvre dans le test. La sonde utilisée était le mKTH1245 (bl-b2), réaction d'hybridation: 300 000 cpm/400 pl. Les
résultats sont rassemblés dans le Tableau III.
-22
TABLEAU III
Spécimen Radioactivité Résultat de la culture hydridée de chlamydia Homme 1. 151 + Homme 2. 164 + Homme 3. 154 +
Homme 4. 61 -
Homme 5. 76
Homme 6. 55 -
Femme 1. 343 + Femme 2. 509 + Femme 3. 362 + Femme 4. 57 Femme 5. 58 Femme 6. 81 Tampon, X4 30-55 Bactérie Chl. trachomatis
L2, 106 419 +
Dans les tests, la limite était de 104 cpm pour
le caractère positif.
Les résultats du Tableau III montrent qu'une hybridation en sandwich utilisant une chaîne de fragments d'acide nucléique, convient pour réaliser le diagnostic de maladies vénériennes. Les échantillons qui étaient négatifs dans les tests de culture, étaient également négatifs dans
le test d'hybridation en sandwhich.
Exemple 2
a) Chaînes de fragments d'acide nucléique prove-
nant du Cytomegalovirus et leur préparation.
On a préparé des fragments d'ADN convenant pour réaliser le diagnostic du Cytomégalovirus à partir de Cytomegalovirus (AD 169, ATCC VR-538)-(CMV). On a isolé et fragmenté l'ADN selon des méthodes connues. On a isolé le fragment I EcoRI d'environ 9 kb, défini dans Spector et al., J. Virol. 42, 558-582, 1982 par électroélution à partir d'un gel d'agarose, après avoir séparé les fragments de restriction EcoRI en fonction de leur dimension. L'ADN élué a été extrait avec du phénol, puis précipité avec de l'éthanol. L'ADN, ainsi purifié, a été réuni au moyen de la ligase T4, au vecteur constitué par le plasme de pBR325 ouvert à l'aide de l'enzyme EcoRI et l'ADN recombinant produit a été transféré dans les bactéries hôtes E.coli K12 HB101. On a choisi parmi des clones
résitants à l'ampicilline et à la tétracycline mais sensi-
bles au chloramphénicol, un clone qui contient une insertion
d'ADN spécifique du cytomégalovirus de dimension correcte.
On a vérifié le caractère de l'ADN cloné de cytomegalovirus par la méthode de la tache Southern. On a ainsi constaté que le fragment d' ADN EcoRI 9 kb décrit dérivait de 1'ADN du Cytomegalovirus et, plus spécifiquement, était compris dans
son fragment HindIII-D (Oram et al., J. Gen.Virol., 59, 111-
129, 1982). On a dénommé pKTH1271 le plasmide recombinant ainsi décrit et on l'a déposé dans la collection de cultures
Deutsch Sammlung von Microorganismen sous le numéro DSM 2826.
On a développé et purifié le plasmide recombinant selon des
techniques connues.
Les clonages ultérieurs ont été effectués par des techniques connues, en utilisant comme vecteurs, le plasmide pBR322 et les phages M13mp7 et M13mp8. La Figure 12 montre le plasmide hybride pKTH1271 ayant une longueur moléculaire d'environ 9 kb. La chaîne de fragments d'acide nucléique
illustrée dans la Figure 12 a été préparée à l'aide des enzy-
mes de restriction EcoRI, BamHI, ClaI et PstI. La Figure 12 montre les fragments obtenus avec les enzymes de restriction, ainsi que leur situation et dimension relative. Le Tableau IV énumère les dimensions des fragments en question et les vecteurs utilisés pour le clonage ultérieur, les noms des plasmides recombinants ainsi obtenus et leur utilisation soit en tant que réactifs-filtre, soit comme sondes marquées. La Figure 13 montre une rangée d'hybrides en sandwich qui est
formée lorsque la chaine de fragments d'acide nucléique indi-
quée dans le Tableau IV est utilisée.
TABLEAU IV
_ Fragment de restriction Vecteur Désignation Utilisation a1 EcoRI-PstI (3,3kb) pBR322 pKTH1273 Filtre a2 ClaI-BamHI (3,0kb) pBR322 pKTF1274 Filtre b1 PstI-PstI (0,6kb) M13mp7 mKTH1277 sonde marqué, b2 PstI-ClaI (1, Okb) M13mp8 mKTH1278 sonde marqué b3 BamHO-EcoRI (1,Okb) M13mp8 mKTH1279 sonde marqué b) Démonstration de la sensibilité d'une chaîne de réactifs d'acide nucléique provenant du cytomégalovirus
selon la méthode d'hybridation en sandwich.
La sensibilité d'une chaIne de réactifs d'acide nucléique par rapport à celle d'une paire continue de réactifs, a été évalué par la méthode d'hybridation en sandwich. Dans les tests, on a utilisé comme spécimen de l'ADN de CMV que l'on a porté à ébullition dans de la NaOH 0,17 M pendant minutes, puis neutralisé de la façon indiquée dans l'exemple lb. On a mis en oeuvre dans le test, des filtres contenant tous 101 molécules à la fois d'ADN de pKTH1273 (a1) et d'ADN du pKTH1274 (a2) mis sous forme de brin unique et les sondes ci-après, marquées avec 125I et énumérées dans le Tableau IV: mKTH1277(bl), mKTH1278(b2) et mKTH1279(b3). Les sondes contenaient chacune 108 cpm/pg d'ADN. L'hybridation a
été effectuée selon la procédure de 1l exemple lb. Les résul-
tats sont rassemblés dans le Tableau V.
TABLEAU V
Molécules de Radioactivité hybridée avec (b) comme sonde spécimen test b1 b b3 b1ib - b b b1b2 b3 blb2,b3
0 35 33 38 45 53
106 38 44 46 95
6 125 4 x 106 85 135 142 205 292 1,6 x 107 203 254 265 415 645 bl. 310 000 cpm/test b2 320 000 cpm/test b3 300 000 cpm/test bl,b2 300 000 cpm de chaque test bl,b2,b3 300 000 cpm de chaque test Dans le test, la valeur de la limite inférieure du caractère positif étant de 51-55 cpm lorsque la sonde était bl, b2 ou b3, de 59 cpm lorsque la sonde était b1, b2 et de
63 cpm lorsque la sonde était b1, b2, b3.
Les résultats fournis dans le Tableau V montrent qu'une hybridation en sandwich réalisée avec un réactif-sonde individuel (blb2 ou b3), détecte dans chaque cas, 4.106 moles d'ADN de CMV. D'un autre côté, l'hybridation effectuée avec un réactif du type bl, b2 ou bl, b2, b3 ne détecte que molécules d'ADN de CMV. Les résultats indiquent que les chaines de réactifs d'acide nucléique sont quatre fois
plus sensibles que des réactifs individuels d'acide nucléique.
c) Diagnostic du CMV par hybridation en sandwich
avec une chaîne de réactifs d'acide nucléique.
On a dosé des spécimens cliniques en utilisant une méthode d'hybridation en sandwich avec une chaine de réactifs. Ces échantillons comprenaient deux spécimens d'urine provenant d'enfants de moins d'un an. On supposait que ces
enfants souffraient d'une maladie cytomégalovirale congé-
nitale. Un spécimen biopsique du poumon prélevé chez un malade atteint d'une infection pulmonaire par CMV, a aussi été dosé selon la méthode d'hybridation en sandwich conforme à la présente invention. Des cellules foetales humaines à la fois non-infectées et infectées par le cytomégalovirus ont
aussi été utilisées comme spécimens dans le test.
On a ajouté une solution contenant 1 % de sar-
cosyle et 5 mM d'EDTA, et 200 pg d'ADN du thymus de veau, à un spécimen de 10 ml d'urine, puis on a fait précipiter l'ADN libéré à partir du virus, avec le support, en utilisant ml d'isopropanol à la température ambiante. Le précipité d'ADN a été dissous dans 200 pil de tampon TE et mis sous forme de brin unique par ébullition pendant 5 minutes, puis la solution d'ADN a été refroidie à 0 C et ajoutée à la solution d'hybridation. On a haché mécaniquement au couteau, le spécimen biopsique du poumon (quelques mm 3) et on y a ajouté 200 pl de tampon TE contenant une solution à 1 % de SDS et 1 mg/ml d'enzyme protéinase K. On a effectué une digestion à +37 C pendant une heure, puis on a soutiré le spécimen dans une
seringue à injection à travers une mince aiguille hypodermique.
Le spécimen ainsi homogénéisé a été porté à ébullition, puis
ajouté à la solution d'essai.
On a morcelé les cellules infectées avec le cytomégalovirus et les cellules non-infectées, grâce à un
traitement avec le SDS et la protéinase K, on les a homogé-
néisées et portées à ébullition, comme ci-dessus.
Les réactifs utilisés dans le test d'hybridation étaient pKTH1273(a1) et pKTH1274(a2) sur des filtres et mKTH1277(bl), mKTH1278(b2), mKTH1279(b3) comme sondes, chacun à raison de 200 000 cpm/réaction. Par ailleurs, on a effectué l'hybridation, le lavage des filtres et le comptage des résultats de la façon qui est décrite dans l'exemple lb. Les résultats de l'hybridation selon l'invention sont rassemblés
dans le Tableau VI.
TABLEAU VI
Radioactivité Spécimen hybridée Isolation du virus Cellules infectées (105) 3521 pas faite Urine 1(10 ml) 243 CMV Urine 2(10 ml) 3215 CMV Urine provenant d'une personne bien portante (10 ml) 52 pas faite Spécimen biopsique de poumon 535 CMV Cellules servant de témoin (105) 68 pas faite Pas de spécimen 65 pas faite Les résultats du Tableau VI montrent qu'il est
possible de mettre en évidence le CMV dans différents spéci-
mens cliniques, comme l'urine, des fragments biopsiques du poumon et des cellules, en utilisant une chaîne de réactifs
d'acide nucléique.
Le test est spécifique du cytomégalovirus; il n'identifie pas l'ADN humain, c'est-à-dire que le test n'est pas perturbé par l'ADN humain présent dans l'échantillon. En fait, le type de spécimen n'interfère en aucune manière avec la
spécificité du test.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'inven-
tion ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre de réalisation et d'application-qui viennent d'être décrits de façon plus explicite, elle en- embrasseau contraire:toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la
matière, sans s'écarter du cadre, ni de laportée de la présente invn-
tion.
Claims (13)
1. Réactifs d'acide nucléique, caractérisés en ce qu'ils comprennent des chaines de fragments alternés d'acide nucléique.
2. Réactifs d'acide nucléique suivant la reven- dication 1, caractérisés en ce qu'ils comprennent deux ou plusieurs séries d'au moins deux, mais de préférence plusieurs chaines de fragments alternés d'acide nucléique suffisamment homologues de l'acide nucléique à identifier, mais non
homologues les uns des autres.
3. Réactifs d'acide nucléique suivant les reven-
dications 1 et 2, caractérifés en ce qu'ils comprennent des chaines qui sont soit séparées, soit réunies, de fragments
alternés d'acide nucléique.
4. Réactifs d'acide nucléique suivant les reven-
dications 1, 2 ou 3, caractérisés en ce qu'ils comprennent des chaines de fragments d'acide nucléique, qui ont ou non des
parties dérivées d'un vecteur.
5. Réactifs d'acide nucléique suivant les reven-
dications 1,2,3 ou 4, caractérisés en ce qu'ils comprennent des
chaînes marquées de fragments d'acide nucléique.
6. Réactifs d'acide nucléique suivant les reven-
dications 1, 2, 3 ou 4, caractérisés en ce qu'ils comprennent des chaînes de fragments d'acide nucléique fixes à un support
solide.
7. Réactifs d'acide nucléique suivant les reven-
dications 1, 2, 3 ou 4, caractérisés en ce qu'ils comprennent le plasmide recombinant pKTH1220 ou des dérivés de celui-ci et en ce que ce plasmide recombinant contient l'ADN de la bactérie Chlamydia trachomatis L2 et est cloné dans l'hôte Escherichia coli K12 HB101, que le numéro de dépôt de cet hôte contenant le plasmide recombinant pKTH1220 auprès de la DEUTSCHE
SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN (Collection Allemande de Micro-
organismes) étant DSM 2825.
8. Réactifs d'acide nucléique suivant les reven-
dications 1,2,3, 4,5 ou 6, caractérisés en ce qu'ils compren-
nent le plasmide recombinant pKTH1271 ou des dérivés de celui-
ci et en ce que ce plasmide recombinant contient 1' ADN du Cytomegalovirus AD 169 et est cloné dans l'hôte Escherichia coli K12 HB101, le numéro de dépôt de cet hôte contenant le plasmide recombinant pKTH1271 auprès de la DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN (Collection Allemande de Micro-organismes)
étant DSM 2826.
9. Utilisation des réactifs d'acide nucléique
suivant l'une des revendications précédentes pour identifier
plusieurs acides nucléiques différents, caractérisée en ce que des combinaisons convenables de réactifs d'acide nucléique sont assemblées à partir de chaînes de fragments d'acide nucléique suffisamment homologues de ces différents acides
nucléiques.
10. Utilisation des réactifs d'acide nuclérique
suivant l'une des revendications 1 à 8 dans des méthodes
d'hybridation, caractérisée en ce que les chaînes d'hybrides formées dans la méthode d'hybridation sont mises en évidence
par des méthodes en soi connues.
11. Utilisation des réactifs d'acide nucléique
suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans des
méthodes d'hybridation en sandwich, caractérisée en ce que les chaînes d'hybrides en sandwich formes dans les méthodes d'hybridation en sandwich sont mises en évidence par des
méthodes en connues.
12. Procédé de préparation de réactifs d'acide
nucléique suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8,
caractérisé en ce que les chaînes de fragments d'acide nucléique sont préparées par des techniques utilisant l'ADN recombinant,
synthétiques ou semisynthétiques.
13. Procédé suivant la revendication 12, carac-
térisé en ce que la préparation des chaînes de fragments d'acide nucléique comprend:
a) l'isolation d'un acide nucléique choisi de lon-
gueur convenable,
2559?83
bile clonage de l'acide nucléique choisi dans des vecteurs convenables, c) la fragmentation des acides nucléiques à l'aide des enzymes de restriction, d) la combinaison de chaînes convenables de fragments en série, à l'aide de ligases appropriées,
e) le clonage des chaines de fragments dans des vec-
teurs convenables, en clonant de préférence des fragments appartenant à différentes séries dans différents vecteurs, f) le marquage des fragments d'acide nucléique, soit séparés, soit réunis et appartenant à une série, g) la fixation sur un support solide des fragments d'acide nucléique, soit séparés, soit réunis, appartenant à
l'autre série.
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