NO166543B - Nukleinsyrereagenser og fremgangsmaate til deres fremstilling. - Google Patents

Nukleinsyrereagenser og fremgangsmaate til deres fremstilling. Download PDF

Info

Publication number
NO166543B
NO166543B NO850554A NO850554A NO166543B NO 166543 B NO166543 B NO 166543B NO 850554 A NO850554 A NO 850554A NO 850554 A NO850554 A NO 850554A NO 166543 B NO166543 B NO 166543B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
nucleic acid
fragments
arrangements
reagents
series
Prior art date
Application number
NO850554A
Other languages
English (en)
Other versions
NO166543C (no
NO850554L (no
Inventor
Airi Marjatta Palva
Tuula Marjut Ranki
Hans Erik Soederlund
Original Assignee
Orion Yhtymae Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orion Yhtymae Oy filed Critical Orion Yhtymae Oy
Publication of NO850554L publication Critical patent/NO850554L/no
Publication of NO166543B publication Critical patent/NO166543B/no
Publication of NO166543C publication Critical patent/NO166543C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Oppfinnelsen angår nukleinsyrereagenser, omfattende
et arrangement av nukleinsyrefragmenter og kombinasjoner av slike reagenser. Oppfinnelsen angår også fremgangsmåter til fremstilling av nukleinsyrereagenser som består av et arrangement av kloner og kombinasjoner av slike nukleinsyrereagenser ved anvendelse av rekombinant DNA-teknikker.
Det har vært vanlig å anvende forskjellige hybridiseringsmetoder til identifikasjon og undersøkelse av nukleinsyrer.
Noen eksempler på dette er de direkte hybridiseringsmetoder
i hvilke prøven inneholdende nukleinsyren som skal identifiseres, er enten i en oppløsning (Brautigam et al., J. Clin. Microbiol., 1980, V2, 226-234 og GB-PS 2.019.408) eller festet til en fast bærer (US-PS 4.139.346, 4.302.204, 4.358.535, 4.395.486, GB-PS 2.034.323, 2.095.833, EPO publikasjonsnr. 62.286, 62.237 og 61.740) og påvises ved bruk av en merket nukleinsyrereagens som hybridiserer med nukleinsyren som skal identifiseres.
Andre kjente hybridiseringsmetoder omfatter to-trinns sandwich-hybridiseringsmetoden presentert av Dunn og Hassell i Cell., V2, 23-36, 1977 og en-trinns sandwich-hybridiseringsmetode presentert i EPO publikasjonsnr. 79.139. For identifisering av nukleinsyrene ved sandwichmetodene er to separate nukleinsyrereagenser nødvendige for påvisning av nukleinsyrene som foreligger i prøveoppløsningen. En av disse reagenser er festet til en fast bærer, og den andre er merket.
Nukleinsyrereagenser, både de som er festet til en fast bærer og de som er merket, er karakterisert ved at deres basesekvens er komplementær eller nesten komplementær til nukleinsyren som skal identifiseres, dvs. homolog. Nukleinsyrereagensene som anvendes er enten naturlige nukleinsyrer som sådanne eller som fragmenter av dem. Fragmentene produseres f.eks. ved bruk av restriksjonsenzymer. Nukleinsyrereagenser er også blitt fremstilt syntetisk eller ved rekombinant DNA-teknikker. Naturlige plasmider (US-PS 4.358.535), nuklein-
syrer fra bakteriofager (US-PS 4.543.535), ribosomal-RNA
og budbringer-RNA (US-PS 4.302.204) eller nukleinsyre fra
forskjellige viruser (Stålhandske et; al., Curr. Top.Microbiol. Virol. 104, 1983) er blitt brukt som! nukleinsyrereagensene. Hele virusgenomet er blitt anvendt til identifisering, f.eks. av deler som tilhører forskjellige viruser i budbringer-RNA
av et hybrid virus (Dunn og Hassell,, Cell. J_2 , 23-36 , 1 977 ). Nukleinsyrereagenser er også blitt fremstilt ved bruk av rekombinant DNA-teknikker (US-PS 4.395.486 og 4.359.535,
EPO publikasjonsnr. 79.139 og GB-PS 2.034.323 og EPO publikasjonsnr. 62.286). Nukleinsyrereagenser fremstilt ved rekombinant DNA-teknikker er blitt brukt enten på en slik måte at det kopierte (replicated) avgrensede DNA-fragment er blitt renset ut fra vektorens DNA, eller som rekombinant DNA-molekyler bundet til forskjellige vektorer. De tidligere anvendte nukleinsyrereagenser fremstilt ved rekombinant DNA-teknikker utgjøres av ett kontinuerlig identifiserende nukleinsyrefragment eller av flere separate kloner.
Det er nå utviklet nye, mer følsomme nukleinsyrereagenser omfattende minst to serier alternerende arrangementer av nukleinsyrefragmenter fremstilt frai enten en eller flere segmenter som er homologe med nukleinsyren som skal identifiseres .
Nukleinsyrereagenser som omfatter slike arrangementer
av nukleinsyref ragmenter er i sandw.ich-hybridiseringsf orsøk minst dobbelt så følsomme som de tidlligere anvendte nukleinsyrereagenser. Ved anvendelse av nukleinsyrereagenser i henhold til oppfinnelsen eller deres kombinasjoner er det mulig å identifisere mindre mengder av nukleinsyrer enn tidligere,
og de er særlig vel anvendelige for sandwich-hybridiseringsmetoder
Den høyere følsomhet av nukleinsyrereagenser i henhold til oppfinnelsen i sandwich-hybridiseringsmetoder er delvis basert på det faktum at bruken av forskjellige sonder øker mengden av.merkede hybrider på den faste bærer. Der kan fore-ligge merket vektor-avledet nukleinsyre sammen med hver hybri-diseringssonde (fig. 1 og 2). På fig;.. 1 og 2 er v vektor-avledet DNA, x er nukleinsyren som ska,l identifiseres, b den merkede sonde, a den identifiserende nukleinsyrereagens festet på den faste bærer og F er filteret. Når flere sonder anvendes,
øker mengden av merkede, vektor-avledede nukleinsyredeler,
og mer merkestoff bindes til hybridene som dannes. Hybridene er således lettere å oppdage.
Når arrangementet av nukleinsyrefragmenter i henhold
til oppfinnelsen anvendes i sandwich-hybridiseringsmetoder, blir i det minste to, eller som vist på fig. 1, tre identifiserende nukleinsyrefragmenter festet til den faste bærer. I dette tilfelle kan de forskjellige områder av nukleinsyre-tråden x som skal påvises, hybridisere til nukleinsyrefragmentene festet på den faste bærer, f.eks. a^, og a^ ved ett eller flere punkter, avhengig av graden av reaksjon.
Når reaksjonen når sitt endelige stadium, kan en situasjon
i henhold til fig. 1 frembringes, i hvilken prøvetråden danner en løkke eller løkker til hvilken sonden eller sondene, f.eks. b1 og b2 på fig. 1 hybridiserer. På dette tidspunkt minsker avstanden av de vektor-avledede nukleinsyredeler fra hybridi-serings-tilføyelsespunktet (1) (fig. 1), og hybridet er mer stabilt enn det hybrid som dannes ved ett reagenspar (tidligere kjent teknikk) vist på fig. 2, hvilket hybrid er av samme størrelse som det samlede areal av arrangementet av nukleinsyref ragmenter . De vektor-avledede deler av et hybrid dannet fra ett reagenspar brytes lett ved f.eks. mekanisk belastning såsom risting. I et slikt tilfelle unnslipper merkestoffet som allerede er bundet til hybridet.
Da de forbedrede nukleinsyrereagenser i henhold til oppfinnelsen er mer følsomme enn tidligere anvendte nukleinsyrereagenser, er de egnet til å påvise kromosomelle rearrangementer og arvelige sykdommer.
Oppfinnelsen angår nukleinsyrereagenser som omfatter
et arrangement av nukleinsyrefragmenter, deres kombinasjoner og deres fremstilling.
Det karakteristiske ved oppfinnelsen er vist i de spesi-elle trekk i kravene, og oppfinnelsen er beskrevet i større detalj nedenunder og ved de ledsagende tegninger, hvor:
Fig. 1 viser et arrangement av sandwichhybrider.
Fig. 2 viser et sandwichhybrid ifølge tidligere kjent teknikk. Fig. 3 viser setene av to alternerende rekker nukleinsyref ragmenter i en nukleinsyre som er blitt valgt for fremstillingen av et arrangement av nukleinsyrereagenser i henhold til oppfinnelsen.
Fig . 4 - utgår.
Fig. 5 viser et arrangement av nukleinsyrefragmenter
i henhold til fig. 3 separat (a), føyet sammen (b) og både separat og føyet sammen (c).
Fig. 6 viser et arrangement av sandwichhybrider.
Fig. 6a viser et arrangement av sandwichhybrider som
er dannet når separate fragmenter anvendes.
Fig. 6b viser et arrangement av sandwichhybrid som er dannet når sammenføyde b-fragmenter anvendes.
Fig. 6c viser et arrangement av sandwichhybrider som
er dannet når både separate og sammenføyde b-fragmenter anvendes.
Fig. 7 viser et arrangement av nukleinsyrereagenser
som identifiserer forskjellige nukleinsyrer.
Fig. 8 viser et arrangement av sandwichhybrider som
er dannet når arrangementet av nukleinsyrereagenser i henhold til fig. 7 som identifiserer forskjellige nukleinsyrer, anvendes. Fig. 9 viser et arrangement av hybrider dannet ved en direkte hybridiseringsmetode.
Fig. 10 viser det rekombinante plasmid pKTH1220.
Fig. 11 viser et arrangement av sandwichhybrider som dannes når et arrangement av nukleinsyrefragmenter fremstilt fra det rekombinante plasmid pKTH1220 anvendes.
Fig. 12 viser det rekombinante plasmid pKTH1271.
Fig. 13 viser et arrangement av sandwichhybrider som dannes når arrangementer av nukleinsyrefragmenter fremstilt fra det rekombinante plasmid pKTH1271 anvendes.
Oppfinnelsen angår nukleinsyrereagenser sammensatt av
et arrangement av nukleinsyrefragmenter. Disse arrangementer av nukleinsyrereagenser omfatter minst to, men fortrinnsvis flere alternerende nukleinsyrefragmenter, inntil 20 fragmenter,
som er avledet fra en eller flere nukleinsyrer tilstrekkelig homologe med nukleinsyren som skal identifiseres. Derved fås minst to serier alternerende arrangementer av nukleinsyrefragmenter som ikke må være homologe med hverandre.
Arrangementet av nukleinsyrereagenser kan fremstilles syntetisk. I dette tilfelle må fragmentene fra de to alternerende serier av arrangementer av nukleinsyrefragmenter ikke være homologe med hverandre. De må imidlertid være tilstrekkelig homologe med alternerende seter i nukleinsyrene som skal identifiseres. Disse fragmenter kan lett fremstilles ved helautomatiske maskiner etter karakterisering av nuklein-syresekvensen av nukleinsyren som skal identifiseres.
Nukieinsyrereagensene i henhold til oppfinnelsen er sammensatt av separate eller sammenføyde eller både separate og sammenføyde arrangementer av nukleinsyrefragmenter.
Arrangementene av nukleinsyrefragmenter kan være føyet til en vektor, inneholde deler av vektoren eller være full-stendig frie for vektordeler.
Nukleinsyrefragmentene som anvendes, har en minste lengde på 15 nukleotider. Der er ingen øvre begrensning for lengden, men det er fordelaktig å anvende fragmenter med en lengde på 20-5000 nukleotider. Nukleinsyrefragmentene i henhold til oppfinnelsen avledes enten fra genomet som skal identifiseres eller fra en del av genomet, f.eks. fra en forholdsvis stor klon som representerer en bestemt del av genomet. Arrangementene av nukleinsyrefragmenter ifølge oppfinnelsen kan således fremstilles fra flere uavhengige genomområder som ikke ligger direkte opptil hverandre. Arrangementene av nukleinsyrefragmenter som således fremstilles, kombineres og anvendes for den samme reagens. Arrangementene av nukleinsyref ragmenter kan også isoleres fra et DNA som ikke er iden-tisk med nukleinsyren som skal identifiseres, men tilstrekkelig homolog slik at et stabilt hybrid dannes mellom reagensen og nukleinsyren som skal identifiseres. Fremstillingen av egnede arrangementer av nukleinsyrefragmenter er på ingen måte begrenset til isoleringen av egnede nukleinsyrefragmenter fra genomet. Der er tilgjengelig mange like nyttige metoder til fremstilling av slike arrangementer av fragmenter. Fagfolk kan fremstille arrangementer av nukleinsyrefragmenter ved syntetiske eller halv-syntetiske metoder.
Reagensene isoleres på en slik måte at minst to serier
av alternerende nukleinsyref ragmenter a.^ , a^ r a^ etc, og , , b.j etc, fås. Nukleinsyref ragmentene som tilhører serien a ^ , a^, a^ etc, er sammensatt aw fragmenter som er anordnet nær men ikke i tilslutning til hverandre. Nukleinsyrefragmentene som tilhører serien b^ , b2». b^ etc, er også sammensatt av nukleinsyrefragmenter som er anordnet nær men
ikke i tilslutning til hverandre. Nukleinsyrefragmentene
som tilhører serien a^, a^, a_ etc. og de som tilhører serien b^ , b^, b^, etc, må ikke være homologe med hverandre. Det foretrekkes at nukleinsyrene som hører til serien a ^ , a^ >
a^ etc. og de som hører til serien b^ , b^, b^ etc, isoleres på en slik måte at hvert annet fragment tilhører a-serien og hvert annet tilhører b-serien som vist på fig. 3. På fig.
3 er a i, a^, a^ og b^, b^, b^ arrangementer av nukleinsyrefragmenter tilstrekkelig homologe med nukleinsyren som skal identifiseres. Det foretrekkes at de alternerende to nukleinsyrereagenser følger hverandre direkte, men dette er ingen absolutt forutsetning for oppfinnelsen.. Nukleinsyrefragment-seriene beskrevet ovenfor kan anvendes enten som separate fragmenter a^, a^, a^ etc. og b^, b^, b^ etc. (fig. 5a) eller føyet sammen til lange tråder a ^-a^-a^ etc og b^- b2~ b^ etc. (fig. 5b). Det er selvsagt mulig å fremstille alle typer mellomliggende former, f.eks. en a-serie i hvilken a^ er et separat fragment og a2~a.j er føyet sammet, og i b-serien f.eks. kan b^-b2 være føyet sammen og b, separat etc, som vist på fig. 5c Fig. 6 viser forskjellige arrangementer av sandwichhybrider. Fig. 6a viser et arrangement, av sandwichhybrider hvor arrangementene av nukleinsyrefragmenter er separate. Fig. 6b viser et arrangement av hybrider hvor det merkede arrangement av nukleinsyrefragmenter er føyet sammen. Fig. 6c viser et tilfelle hvor et arrangement av sandwichhybrider er dannet fra både sammenføyde og separate merkede arrangementer av nukleinsyrefragmenter. På fig. 6 er x nukleinsyren
som skal identifiseres, b^ , og b^ representerer den merkede sonde, og a^, a^ og a^ representerer arrangementer av nukleinsyref ragmenter festet til en fast bærer.
Nukleinsyrefragmenter som tilhører b-serien, kan f.eks. være merket på en slik måte at en merket nukleinsyrereagens fås, dvs. sonden B. Nukleinsyrereagensene som hører til a-serien, kan festes til en fast bærer på en slik måte at en nukleinsyrereagens A bundet til en fast bærer fås. Det er selvagt som et alternativ mulig å fremstille en merket nukleinsyrereagens A og en tilsvarende nukleinsyrereagens B bundet til en fast bærer.
Slike nukleinsyrepar A og B, eller B og A, henholdsvis merket og festet til en fast bærer, kan fremstilles for en rekke forskjellige nukleinsyrer som skal identifiseres.
De kan kombineres til egnede nukleinsyrereagens-kombinasjoner som er sammensatt av forskjellige nukleinsyrereagens-par A1 og B1 , A2 og B,,, A^ og B3 etc, eller B- og A1 , B2 og & 2> B3 °9 A3 etc Reagenser inneholdende arrangementer av nukleinsyrefragmenter som identifiserer forskjellige nukleinsyrer, kan også kombineres slik at en sonde A^- A^- A^ fås,
som f.eks. omfatter et arrangement av nukleinsyrefragmenter (a.-a.-a,) -(a,-a„-a,) -(a,-a.-aj , som vist på fig. 7,
1 2 3 x 1 2 3 y123z
hvor 3lx» a~ °<9> a3x er arran9ementer av nukleinsyrefragmenter A^ som identifiserer nukleinsyre x; a-|y» a2y °9 a3y er a^range-menter av nukleinsyrefragmenter A^ som identifiserer nukleinsyre y; a ^ r,, a^ z og a^z er arrangementer av nukleinsyref ragmenter Az som identifiserer nukleinsyre z, og v er en vektor-avledet nukleinsyredel. Sammenføyde arrangementer av nukleinsyref ragmenter kan selvsagt også anvendes som separate fragmenter, som egnede blandinger.
Arrangementene av sandwichhybrider i henhold til fig.
8 fås ved anvendelse av reagensene vist på fig. 7. Dersom samtidig identifisering av flere forskjellige nukleinsyrer er ønsket, er det selvsagt nødvendig å anvende separate filtre, som vist på fig. 8. Fig. 8a viser en fast bærer som identifiserer nukleinsyren x, fig. 8b en fast bærer som identifiserer nukleinsyren y, og fig. 8c en fast bærer som identifiserer nukleinsyren z. På fig. 8a, 8b og 8c er b-jxr b_ 0<^ ^3x arran9e~ menter av nukleinsyrefragmenter som er festet til en fast
bærer og som identifiserer nukleinsyren x; b-jy' ^y oc? ^
er arrangementer av nukleinsyrefragmenter festet til en fast bærer og som identifiserer nukleinsyren y; og b-^, ] °2z °^
b^z er arrangementer av nukleinsyrefragmenter festet til en fast bærer og som identifiserer nukleinsyren z; og x,
y og z nukleinsyrene som skal identifiseres. F^, F og F
er de resp^ ektive faste bærere eller filtere, A x -A y -A z er en sonde som identifiserer alle de tre nukleinsyrene på samme tid dersom separate faste bærere anvendes.
De ovenfor beskrevne nukleinsyrefragment-serier, -reagenser og -reagenskombinasjoner kan fremstilles ved rekombinant DNA-teknikker som i og for seg er kjent. En rekke nukleinsyrefragmenter av forskjellig lengde dannes ved anvendelse av restriksjonsenzymer, fra nukleinsyren som skal identifiseres eller fra en del som representerer den. Dersom restriksjonskartet av genomet som skal identifiseres er kjent, er det mulig å velge fra genomet de passende tilstøtende fragmenter generert ved bruk av restriksjonsenzymer, og fragmentene isoleres og forstørres ved bruk av rekombinant DNA-teknikker.
Når et ukjent genom er involvert, kan et mellomliggende trinn anvendes i fremstillingen av reagenser på en slik måte at et forholdsvis stort restriksjonsfragment klones, dette fragment kartlegges, og arrangementene av nukleinsyrefragment-serier a^, a^, a^ etc. og by b^, b^ etc. fremstilles på basis av den informasjon som således fås.
Det er selvsagt mulig å anvende kombinasjoner av de ovenfor angitte metoder og å anvende flere store separate klonede restriksjonsfragmenter som startmateriale og å fremstille flere separate serier som kombineres for dannelse av egnede kombinasjoner.
Det er en fordel å fremstille nukleinsyrefragment-seriene a^, a^, a^ etc. og b^, b^, b^ etc. i henhold til oppfinnelsen ved anvendelse av rekombinant DNA-teknikker på en slik måte at serien a klones inn i én vektor, f.eks. inn i plasmidet pBR322, og serien b klones inn i en annen egnet vektor som ikke har sekvenser til felles med den foregående vektor. Bakteriofagen M13 er et eksempel på en slik andre fordelaktig vektor. Fragmentene som tilhører serie a, kan føyes til hverandre og den sammenføyde serie kan klones inn i én vektor. F.eks. a^-a^ føyet sammen kan klones som en kontinuerlig innføyelse inn i den samme pBR322-vektor. På tilsvarende måte er det mulig å fremstille en reagensserie b^-b2« I kloningen foretrekkes det å anvende vektorer til hvilke meget store innføyelser av fremmed DNA kan føyes til. F.eks. er lambdafage og kosmide vektorer egnet til dette formål.
Det er således nødvendig med to reagenspar omfattende arrangementer av nukleinsyrefragmenter i sandwich-hybridiseringsmetoden ifølge oppfinnelsen, en reagens merket med merkestoffet som skal identifiseres, dvs. en sonde, og en såkalt filterreagens, festet til en fast bærer.
Det vanligste er å anvende radioaktive isotoper for merking av sondene. F.eks. blir ifølge GB-PS 2.034.323, US-32
PS 4.358.535 og 4.302.204 de følgende isotoper anvendt: P, 125 131 3
I, I og H. I europapatent nr. 79.139 blir isotopen
125
I anvendt. Nukleinsyresonder er ogsa blitt modifisert
på forskjellige måter og merket med f.eks. fluorescente merkestoffer (FR-PS 2.518.755). Videre blir enzymatiske eller enzymatisk målbare merkestoffer anvendt (GB-PS 2.019.408,
EPO publikasjonsnr. 63.879 og FR-PS 2.519.005. EPO publikasjonsnr. 70.685 og 70.687 beskriver et lysemitterende merkestoff og merkemetode, og FR-PS 2.518.755 beskriver et immunologisk målbart merkestoff. Lantanidchelatene beskrevet i US-PS 4.374.120, særlig europium, kan anvendes som merkestoffer. Videre er merkestoffet biotin-avidin beskrevet av Leary et al. (PNAS £0, 4045-4049, 1983) egnet som merkestoff. Noen eksempler på merkestoffer som kan anvendes til merking av nukleinsyrereagenser i henhold til oppfinnelsen er angitt ovenfor, men det tør være åpenbart at nye, forbedrede merkestoffer vil bli utviklet som også er egnet til merking av arrangementer av nukleinsyrefragmenter i henhold til oppfinnelsen.
Bærerne egnet til filterreagenser omfatter forskjellige nitrocellulosefiltere (US-PS 4.358.535 og GB-PS 2.095.833). DDR-PS 148.955 beskriver en fremgangsmåte til å binde nukleinsyrene kjemisk til bæreren (papir). US-PS 4.359.535 og 4.302.204 beskriver kjemisk modifiserte papirer som kan anvendes som faste bærere. Andre alternativer omfatter nylon-membraner og modifiserte nitrocellulosefiltere. Men det tør være åpenbart at der vil bli utviklet nye materialer som vil være enda mer egnet til bruk som faste bærere i henhold til oppfinnelsen. Det er selvfølgelig mulig å anvende også andre faste bærere såsom forskjellige kromatografi-matriser, f.eks. triazin- eller epoksy-aktivert cellulose, lateks etc.
I prinsippet er der ingen andre begrensninger til valget
av den faste bærer enn de som skal beskrives nedenunder.
Det må være mulig å feste nukleinsyren i en enkelttråd-form til den faste bærer slik at disse enkelttråd-nukleinsyrer kan hybridiseres med komplementærnukleinsyren. Den faste bærer må også være lett å fjerne fra hybridiseringsoppløsningen eller hybridiseringsoppløsningen må være lett å fjerne fra den faste bærer. Videre må sonden ikke hefte ved selve bærer-materialet slik at den ikke kan vaskes bort.
De ovenfor beskrevne kombinasjoner av arrangementer av nukleinsyre gir reagenspar A og B, eller B og A, henholdsvis merket og festet til en fast bærer, og fra slike nukleinsyrepar fremstilt for identifisering av forskjellige nukleinsyrer, er det mulig å sette sammen en kombinasjon A^ og B^, A^ og B , A og ^ B . Disse kombinasjoner kan anvendes til den sam-tidige identifisering av nukleinsyrene x, y og z ved sandwich-hybr id i ser ingsmetoder .
Prøven anvendes på en slik måte at nukleinsyrene slippes ut i hybridiseringsoppløsningen, og de forblir enkelttrådet. Hybridiseringen utføres i en hybridiseringsoppløsning til hvilken både de nukleinsyrereagenser som er festet på en fast bærer og de som er merket, blir tilsatt. Når hybridiseringen har funnet sted, blir filtrene løftet ut av hybridi-seringsoppløsningen dersom filtrene er blitt brukt som faste bærere. Dersom kromatografimatriser, lateks e.l. er blitt brukt, blir hybridiseringsoppløsningen fjernet. De faste bærere renses med en egnet vaskeoppløsning. Arrangementene av sandwichhybrider som dannes (fig. 8a, 8b, 8c) påvises
ved kjente metoder. Den radioaktive merkelapp måles f.eks.
ved autoradiografi, ved en scintillasjonsteller eller ved en gammateller. En enzymatisk, merkelapp identifiseres etter f.eks. en fargereaksjon, ved fotometri eller på basis av en bunnfelling. Lantanidchelater kan påvises ved en såkalt "tidsoppløst fluorescence"-metode. En immunologisk merkelapp påvises ved immunologiske metoder egnet til formålet.
Flere forskjellige blandinger kan anvendes som hybridi-seringsoppløsningen, de alternativer som er angitt i EPO publikasjonsnr. 79.139 og US-PS 4.302.204 er nevnt som eksempler. Det er selvsagt også mulig å anvende andre hybridiserings-blandinger. Hybridiseringen finner sted ved en temperatur på 0-80°C, men det er fordelaktig å anvende f.eks. en temperatur på 65°C. Tilstrekkelig hybridisering kan finne sted i løpet av en meget kort periode, men det er fordelaktig å anvende hybridiseringsperioder på f.eks. 12-20 timer.
Totrinns sandwich-hybridiseringsmetoden utføres i prinsippet på samme måte, men i dette tilfelle blir nukleinsyre-reagensen som er festet til en fast bærer, først satt til hybridiseringsoppløsningen. Når hybridiseringen har funnet sted, blir den faste bærer vasket, og en andre hybridisering utføres, i hvilken den merkede nukleinsyrereagens foreligger.
De ovenfor beskrevne merkede nukleinsyrereagenser eller
-reagenskombinasjoner A^, A^, Az etc. og B^, B^, B^ etc.
kan selvsagt anvendes i direkte hybridiseringsmetoder. I
et slikt tilfelle må nukleinsyreprøven i en oppløsning deles opp for hver nukleinsyre x, y og z som skal identifiseres, eller dersom prøven er festet til en fast bærer, må en separat prøve festet til en bærer fremstilles for hver prøve. Det arrangement av hybrider som dannes (fig,. 9) påvises ved kjente metoder. På fig. 9 representerer F den faste bærer, dvs. filteret, x nukleinsyren som skal identifiseres og v de vektor-avledede deler. De merkede sonder som anvendes, er a^, a^.
og a^ (fig. 9a), b1 og b2 (fig. 9b) og a^, b^, a2, b2, a^
(fig. 9c).
Som beskrevet ovenfor kan forskjellige kombinasjoner
av nukleinsyrereagenser fremstilles fra arrangementene av
nukleinsyrefragmenter i henhold til oppfinnelsen. Det er mulig ved anvendelse av disse kombinasjoner å identifisere flere forskjellige nukleinsyrer på; samme tid. Arrangementer av nukleinsyrefragmenter homologe med de forskjellige nukleinsyrer som skal identifiseres, kan anvendes som separate fragmenter i blandingene eller føyet sammen på en slik måte at én sonde som identifiserer flere forskjellige nukleinsyrer, fås. Nukleinsyrereagenser festet til en fast bærer må selvsagt holdes fra hverandre for at identifikasjonen skal være vel-lykket.
Hybridisering ved bruk av arrangementer av nukleinsyrefragmenter kan anvendes til identifikasjon av forskjellige patogene mikroorganismer hos mennesker, dyr og planter. Ved fremgangsmåten er det mulig å identifisere mikroorganismer som foreligger i matvarer, f.eks. klostridia, salmonella, stafylokokker som forårsaker matforgiftninger. Fremgangsmåten er egnet til identifisering av forurensninger som foreligger i vann såsom tarmbakterier og tarmviruser.
Da sandwich-hybridiseringsforsøket som anvender arrangementer av nukleinsyrefragmenter er en kvantitativ metode,
er den anvendelig til f.eks. påvisning og måling av gen-forstørrelse. Dette trekk er av betydning i f.eks.
påvisning og behandling av kreft. Dannelsen av et stabilt arrangement av hybrider krever at den homologe sekvens av sondereagensen og filterreagensen er anordnet innenfor en moderat avstand, fortrinnsvis mindre enn 5 kilobase.(kb)
fra hverandre i prøvetråden. Dersom forandringer med hensyn til avstanden mellom disse to områder finner sted, er for-andringen lett observerbar ved denne fremgangsmåte. Derfor er metoden også egnet til påvisning av forandret mRNA, kromosomelle rearrangementer, rearrangementet av immunoglobulin-gener for ekspresjon samt til arvelige sykdommer. Det er således mulig å konstruere forskjellige reagenskombinasjoner fra arrangementene av nukleinsyrefragmenter. F.eks. for identifikasjonen av de kausatlve agenter for veneriske sykdommer er det mulig å fremstille pakker som omfatter en sonde som inneholder arrangementer av nukleinsyrefragmenter som identi-
fiserer gonoré, syfilis, herpes og chlamydia. Identifikasj<on >i dette tilfelle er mulig ved bruk av separate filtrer for gonoré, syfilis, herpes og chlamydia.
Oppfinnelsen angår særlig arrangementer av nukleinsyrefragmenter som omfatter de rekombinante plasmider pKTH1220
og pKTH1271. Det rekombinante plasmid pKTH1220 omfatter i plasmid-vektoren pBR322, DNA av Chlamydia trachomatis L2
som er spesiell for Chlamydiae. Dette rekombinante plasmid klones inn i verten Escherichia coli K12 HB101. Det rekombinante plasmid 1271 omfatter i plasmid-vektoren pBR325 DNA
fra cytomegalovirus AD169. Dette rekombinante plasmid klones inn i verten Escherichia coli K12 HB101. Vertene inneholdende de rekombinante plasmider pKTH1220 og pKTH1271 er blitt deponert ved kultursamlingen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Gottingen, Vest-Tyskland. Nummeret på den deponerte prøve inneholdende det rekombinante plasmid pKTH1220 er DSM 2825 og nummeret på den deponerte prøve inneholdende det rekombinante plasmid pKTH1271 er DSM 2826. De deponerte prøver vil være fritt tilgjengelige straks patentsøknaden er blitt offentliggjort.
Oppfinnelsen er beskrevet i nærmere detalj i de følgende eksempler. Disse eksempler må imidlertid ikke oppfattes som noen begrensning av beskyttelsesområdet for oppfinnelsen. Strukturen av nukleinsyren (DNA og RNA) er lik, enten det
gjelder en nukleinsyre fra en eukaryot eller prokaryot celle.
Av denne grunn er de prinsipper som er angitt i eksemplene
like anvendelige på nukleinsyrer fra dyr (inklusiv menneske), planter og mikrober eller viruser; Således kan reagensene anvendes til å påvise nukleinsyrene fra menneske, dyr, planter, mikrober og viruser. Arrangementene av nukleinsyrefragmenter kan fremstilles syntetisk også.
Sekvensen av nukleinsyrer som skal identifiseres, kan karakteriseres og homologe arrangementer av fragmenter fremstilles av maskiner til automatisk fremstilling av nukleinsyre.
Eksempel 1
a) Arrangementer av nukleinsyrereagenser fra Chlamydia trachomatis og deres fremstilling
DNA-fragmenter egnet til diagnose av Chlamydia trachomatis-gruppen ble fremstilt fra DNA av Chlamydia trachomatis serotype L2. DNA ble isolert og fragmentert: ved kjente metoder, og de resulterende DNA-fragmenter ble; klonet inn i plasmidet pBR322 og overført til vertsorganismen Escherichia coli K12 HB101 ved kjente metoder. En genebank av Chlamydia trachomatis L2-bakterie ble oppnådd som et resultat av kloningen, dvs.
et stort antall rekombinante plasmider som hver hadde et separat BamHI-restriksjonsfragment av DNA avledet fra chlamydia. For reagensproduksjon Me rekombinante plasmider inneholdende maksimalt store DNA-innføyelser avledet fra chlamydialt DNA valgt fra genebanken. Ett slikt plasmid er det som er betegnet som pKTH1220 som er blitt deponert i kultursamlingen Deutsche Sammlung von Microorganismen under be-tegnelsesnummeret (DSM 2825) og hvis velegnethet til bruk som en reagens ble vist ved et direkte hybridiseringsforsøk. Forsøket viste at pKTH1220 identifiserte alle nukleinsyrene avledet fra forskjellige Chlamydia trachomatis-serotyper,
men ingen andre nukleinsyrer.
De anvendelige fragmenter som fås ved anvendelse av forskjellige restriksjonsenzymer, ble valgt fra pKTHl220-plasmid-DNA, og noen av disse fra.gmenter ble overført ved ytterligere kloning inn i pATI53-plasmid (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold String Harbor Laboratory, p.6, 1982) og noentil. Ml3-fage. Fig. 10 viser
det rekombinante plasmid pKTH1220. som har en molekylær lengde på 14 kb. På fig. 10 representerer BamHI, Sali og Clal de anvendte restriksjonsenzymer og a^, a2, by og b^ viser størrelsen og den innbyrdes anordning av fragmentene produsert ved hjelp av disse restriksjonsenzymer. Fragmentene som til-hører serie b, er i form av merkede sonder. Tabell 1 viser størrelsen av fragmentene og vektorene anvendt til ytterligere kloning, navnene på de rekombinante plasmider og deres anvendelse.
Fragmentene angitt i tabell 1 ble isolert fra en agarosegel ved elektroeluering og ble klonet inn i de riktige re-striks jonsenzym-identifiseringsseter på vektorene angitt i tabell 1 ved kjente metoder.
Fragmentet BamHI-BamHI 2,1kb ble produsert som følger: Fragmentene BamHI-Sall 1,4kb og SlI-BamHI 0,7kb av plasmidet pKTH1220 ble separert ved gelelektroforese i agarosegel,
fra hvilken de ble isolert. De rensede fragmenter ble føyet til hverandre ved hjelp av T4-ligaseenzym, og av de 2,1kb DNA-fragmenter som ble fremstilt i reaksjonen, ble de som hadde frie ender som ble identifisert ved BamHI-enzymet, ytterligere føyet til BamHI-restriksjonssetet av den dobbelt-trådede form av M13mp8-fage-DNA. Således ble der fremstilt et rekombinant fage-DNA (mKTH1245) som inneholder Chlamydia trachomatis-DNA omfattende to separate DNA-fragmenter som ikke er anordnet ved siden av hverandre i genomet. I genomet er de imidlertid anordnet slik at de støter opp til DNA-reagensene pKTH1250 og pKTH1252 som festes til filteret (fig. 11). Fig. 11 viser et arrangement av sandwichhybrider som er dannet når de rekombinante plasmider og rekombinante fager angitt i tabell 1 anvendes som arrangementer av nukleinsyrereagenser .
b) Demonstrasjon av følsomheten av et arrangement av nukleinsyrereagenser fra Chlamydia trachomatis ved anvendelse
av sandwich- hybridiseringsmetoden
Følsomheten av et arrangement av nukleinsyrereagenser sammenlignet med et enkelt kontinuerlig reagenspar ble under-søkt ved sandwich-hybridiseringsmetoden. Forsøket ble utført ved bruk av filtere som alle inneholdt 10 1 1 molekyler av både pKTH1250 (a2)- og pKTH1252 ()-DNA i enkelttrådet form. Prøven som skulle undersøkes var plasmidet pKTH122'0 som i forsøket ble gjort enkelttrådet ved koking i 5 min i 0,17 M NaOH, hvoretter det ble overført til 0°C og nøytralisert
med en ekvimolar mengde eddiksyre.. De følgende sonder merket
1 25
med J angitt i tabell 1 ble brukt i forsøkene: mKTH1242 (b.j), mKTH1 239 (b2) , mKTH1 248 ( b^) og mKTH1 245 (b-j-b^.
Hybridiseringen ble utført ved +65 Ci 17 h i en hybri-diseringsoppløsning som hadde følgende sammensetning: 4 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,2% SDS og 200 ug/ml sildesperm-DNA. Filtrene ble vasket i 2 h ved 50°C med en vaskeoppløsning som hadde følgende sammensetning: 0,1 x SSC, 0,2% SDS og ble talt ved bruk av en gammateller. Resultatene er vist i tabell 2 og er de midlere verdier av fem parallelle forsøk.
Statistisk beregnet ble 95%'s: tillittsgrensen for for-søkene som ble utført uten en prøve (= negative kontrollprøver) betraktet som den nedre grense for positivitet. Disse verdier var 52-54 cpm når sonden var b1 , b>2 eller b^, 58 cpm når sonden var b1, b2, 56 cpm når sonden var b^- b2, og 65 cpm når sonden var b^-b2, b^.
c) Chlamydia-diagnose ved bruk av sandwichhybridisering med arrangementer av nukleinsyrefragmenter
Prøver tatt fra tre menn som led av uretritt og tre kvinner som led av betennelse i livmorhalsen, ble valgt for forsøket. Chlamydia trachomatis var blitt isolert fra de mannlige urinrørsprøver og de kvinnelige prøver tatt fra livmorhalsen. Dessuten ble et tilsvarende antall av lignende pasientprøver fra hvilke chlamydia ikke var blitt isolert, undersøkt. Prøvene som skulle undersøkes, ble tatt med pinner med bomullstipper som ble neddykket i en chlamydia-prøvetak-ningsbuffer inneholdende 0,2 M sakkarose, 20 mM fosfatbuffer, 3% kalvefosterserum, 10 ug/ml gentamicin, 100 ug/ml'vancomycin og 25 IU/ml nystatin.
Chlamydia ble dyrket fra prøvene. De opprinnelige prøver ble også analysert ved sandwichhybridisering ved anvendelse av et arrangement av nukleinsyrefragmenter. Prøvene ble konsen-trert ved bruk av 2-butanol for å fjerne væske fra dem på en slik måte at det endelige volum var ca. 80 ul» idet deres konsentrasjon for forsøket således var øket 3-7 ganger. Deretter ble 70 mM EDTA; 0,7% SDS, 20.0 yg/ml proteinase-K-enzym satt til prøven og den ble behandlet i 15 min ved 55°C og i 45 min ved 37°C. Deretter ble prøven kokt i 5 min i 0,175 M NaOH. Den kokte prøve ble overført til 0°C og nøytralisert med en ekvimolar mengde eddiksyre og testet. Filtrene og hybr idiser ingsbetingelsene som angjitt i eksempel 1b, ble brukt i forsøket. Den anvendte sonde var mKTH1245 (b^-b2), 300.000 cpm/400 yl hybridiseringsreaksjon. Resultatene er angitt i tabell 3.
Resultatene i tabell 3 viser at sandwichhybridisering
ved anvendelse av et arrangement av nukleinsyrefragmenter er egnet til diagnose av veneriske sykdommer. Prøvene som var negative i dyrkningsforsøkene, var negative også i sandwich-hybr idi ser ings forsøket .
Eksempel 2
a) Et arrangement av nukleinsyrereagenser fra Cytomegalovirus og deres fremstilling
DNA-fragmenter egnet til diagnose av Cytomegalovirus
ble fremstilt fra Cytomegalovirus (AD 169, ATCC VR-538)-(CMV). DNA ble isolert og fragmentert ved kjente metoder. EcoRI-fragment I på ca. 9 kb definert i Spector et al., J. Virol.
42, 558-582, 1982, ble isolert fra agarosegel ved elektroeluering etter EcoRI-restriksjonsfragmenter var blitt separert på basis av deres størrelse. Det eluerte DNA ble ekstrahert med fenol, hvoretter det ble utfelt med etanol. Det DNA som var blitt renset på denne måte, ble føyet sammen ved hjelp av T4-ligase til pBR325-plasmidvektoren åpnet ved bruk av EcoRI-enzymet, og det produserte rekombinante DNA ble overført til E.coli K12 HB101 vertsbakterier. Fra ampicillin- og tetra-cyklin-resistente men kloramfenikol-følsomme kloner ble der valgt en som inneholdt en cytomegalovirus-spesifikk DNA-inn-føyelse av den rette størrelse. Karakteren av det klonede cytomegalovirus-DNA ble fastslått ved Southern oppsugnings-metode (Southern blot method). Dette forsøk sikret at det beskrevne 9 kb EcoRI-DNA-fragment var avledet fra DNA av Cytomegalovirus, og nærmere bestemt var innlemmet i dets HindIII-D-fragment (Oram et al., J. Gen. Virol., 59, 111-
129, 1982). Det rekombinante plasmid således beskrevet ble betegnet pKTH1271, og det ble deponert i kultursamlingen Deutsche Sammlung von Microorganismen under deponeringsbetegnelsen DSM 2826. Det rekombinante plasmid ble dyrket og renset ved kjente teknikker.
De ytterligere kloninger ble utført ved bruk av kjente teknikker, idet der som vektorer ble anvendt pBR322-plasmidet og M13mp7- og M13mp8-fagene. Fig. 12 viser det hybride plasmid PKTH1271 som har en molekylær lengde på ca. 9 kb. Arrangementet av nukleinsyrefragmenter vist på fig. 12 ble fremstilt ved bruk av restriksjonsenzymene EcoRI, BamHI, Clal og Pstl.
Fig. 12 viser fragmentene oppnådd ved bruk av restriksjonsenzymer samt deres relative størrelse og plassering. Tabell 4 viser størrelsene' av de aktuelle fragmenter, og vektorene brukt til ytterligere kloning, navnene på de således oppnådde rekombinante plasmrder og deres anvendelse enten som filterreagenser eller som merkede sonder. Fig. 13 viser et arrangement av sandwichhybrider som dannes når arrangementet av nukleinsyrefragmenter angitt i tabell 4, anvendes.
Følsomheten av et arrangement av nukleinsyrereagenser sammenlignet med et kontinuerlig reagenspar ble utprøvet ved sandwich-hybriidiseringsmetoden. Prøven i forsøket var CMV-DNA som ble kokt i 0,17 M NaOH i 5 min og deretter nøy-tralisert som i eksempel 1b. Filtere som alle inneholdt 10^ molekyler av både pKTH1 273 (a -)-DNA og pKTH1274 (a )-DNA, 125 i enkelttrad-form,, og de følgende sonder merket med I som angitt i tabell 4: mKTH1277 (b.,), mKTH1278 (b2) og mKTH1279 (b,) ble anvendt i forsøket. Sondene inneholdt hver 10 8 cpm/ug DNA. Hybridiseringen ble utført som beskrevet i eksempel 1b. Resultatene er vist i tabell 5.
I forsøkene var verdien av den nedre grense for positiv 51-55 cpm når sonden var by b^ eller b^, 59 cpm når sonden var b^, b^ og 63 cpm når sonden var by b^, b^.
Resultatene i tabell 5 viser at. sandwichhybridisering hvor en enkelt sondereagens anvendes (. by b^ eller b^) påviser i hvert tilfelle 4x10^ CMV-DNA-molekyler. På den annen side avslører hybridisering med en reagens av b., b„ eller b^, b^, b^ så få som 10 6 molekyler av CMV-DNA. Resultatene viser at arrangementet av nukleinsyrereagenser er fire ganger så følsomt som individuelle nukleinsyrereagenser.
c) CMV-diagnose ved bruk av sandwichhybridisering med et arrangement av nukleinsyrereagenser
Kliniske prøver ble undersøkt ved bruk av sandwichhybridi-ser ing med et arrangement av reagenser. Disse prøver innbe-fattet to urinprøver fra barn mindre enn 1 år gamle. Disse barn mistenkte man led av en medfødt cytomegalosykdom. En lunge-biopsiprøve fra en pasient med CMV-lungeinfeksjon ble også undersøkt ved den foreliggende sandwichhybridisering. Både cytomegalovirus-infiserte og -ikke-infiserte celler av menne-skefoster ble også brukt som prøver i forsøkene.
En oppløsning som inneholdt 1% sarcosyl og 5 mM EDTA
og 200 yg kalvethymus-DNA ble satt til en 10 ml urinprøve, hvoretter det DNA som ble utløst fra viruset, sammen med bæreren, ble utfelt ved bruk av 10 ml isopropanol ved værelse-temperatur. DNA-utfell ingen ble oppløst i 200 ul TE-buffer og bragt på enkelttrådet form ved koking i 5 min, hvoretter DNA-oppløsningen ble avkjølt til 0°C og satt til hybridi-seringsoppløsningen .
Lungebiopsiprøven (noen fa mm 3) ble hakket opp mekanisk med en kniv, 200 ul TE-buffer inneholdende 1% SDS-oppløsning og 1 mg/ml av proteinase-K-enzym ble satt til denne. En di-gestion ble utført ved +37°C i 1 h, hvoretter prøven ble trukket inn i en injeksjonssprøyte to ganger gjennom en tynn sprøytespiss. Prøven som var homogenisert på denne måte,
ble kokt, hvoretter den ble satt til prøveoppløsningen.
Cellene infisert med cytomegalovirus og de ikke-infiserte celler ble brutt op ved en SDS, proteinase-K-behandling, homogenisert og kokt, som ovenfor.
Reagensene i hybridiseringsforsøket var pKTH1273 (a^ og pKTH1274 (a2) på filtere og mKTH1 277 (b^, mKTH1 278 (b2) og mKTH1279 (b^) som sonder, hver i 200.000 cpm/reaksjon.
I andre henseender ble hybridiseringen, vasking av filtrene og telling av resultatene utført som beskrevet i eksempel lb.
Resultatene av den foreliggende hybridisering er vist
i tabell 6.
Resultatene i tabell 6 viser at det er mulig ved anvendelse av et arrangement av nukleinsyrereagenser å påvise CMV i forskjellige kliniske prøver såsom urin, lungebiopsiprøver og celler.
Forsøket er spesifikt for cytomegalovirus. Det identifiserer ikke menneske-DNA, dvs. forsøket forstyrres ikke ved tilstedeværelsen av menneske-DNA i prøven. Typen av prøve-eksemplar virker ikke forstyrrende inn på spesifisiteten av forsøket på noen som helst måte.

Claims (6)

1. Nukleinsyrereagenser, karakterisert ved at de omfatter to serier av arrangementer av hovedsakelig alternerende nukleinsyrefragmenter som er tilstrekkelig homologe med den nukleinsyre som skal identifiseres men ikke homologe med hverandre, og at den ene av seriene omfatter merkede nukleinsyrefragmenter og den andre er festet til en fast bærer og hvor serien omfatter minst to, men fortrinnsvis flere, fragmenter.
2. Nukleinsyrereagenser som angitt i krav 1, karakterisert ved at de omfatter enten separate eller forenede arrangementer av alternerende nukleinsyref ragmenter .
3. Nukleinsyrereagenser som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at de omfatter arrangementer av nukleinsyrefragmenter som enten har eller ikke har vektoravledede deler.
4. Nukleinsyrereagenser som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at de omfatter det rekombinante plasmid pKTH1220 eller derivater derav idet det rekombinante plasmid inneholder DNA av Chlamydia trachomatis L2 bakterien, og er klonet inn i verten Escherichia coli K12 HB101, og deponeringsbetegnelsen av denne vert inneholdende det rekombinante plasmid pKTH.1220 er DSM 2825.
5. Nukleinsyrereagenser som angitt i kravene 1-3, karakterisert ved at de omfatter det rekombinante plasmid pKHT1271 eller derivater derav idet det rekombinante plasmid inneholder DNA av Cytomegalovirus AD 169 og er klonet inn i verten Escherichia coli K12 HB101, og deponeringsbetegnelsen av denne vert inneholdende det rekombinante plasmid pKTH1271 er DSM 2826.
6. Fremgangsmåte for fremstilling av nukleinsyrereagenser som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at fremstillingen av arrangementene av nukleinsyrefragmenter omfatter: a) isolering av valgte nukleinsyrer av passende lengde som kan identifisere nukleinsyren som skal påvises, b) kloning av de valgte nukleinsyrer inn i egnede vektorer, c) fragmentering av nukleinsyrene ved bruk av restriksjonsenzymer, d) kombinering av de egnede arrangementer av fragmenter til to serier ved bruk av egnede ligaser, e) kloning av arrangementene av fragmenter inn i egnede vektorer, fortrinnsvis fragmenter som tilhører forskjellige serier inn i forskjellige vektorer, f) merking av de enten separate eller forenede nukleinsyref ragmenter som tilhører én serie, og g) festing til en fast bærer av de enten separate eller forenede nukleinsyrefragmenter som hører til den andre serie.
NO850554A 1984-02-17 1985-02-13 Nukleinsyrereagenser og fremgangsmaate til deres fremstilling. NO166543C (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI840655A FI71768C (fi) 1984-02-17 1984-02-17 Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO850554L NO850554L (no) 1985-08-19
NO166543B true NO166543B (no) 1991-04-29
NO166543C NO166543C (no) 1991-08-07

Family

ID=8518568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO850554A NO166543C (no) 1984-02-17 1985-02-13 Nukleinsyrereagenser og fremgangsmaate til deres fremstilling.

Country Status (22)

Country Link
US (1) US4731325A (no)
JP (1) JPS60188100A (no)
AT (1) AT394578B (no)
AU (1) AU577568B2 (no)
BE (1) BE901671A (no)
CA (1) CA1248895A (no)
CH (1) CH671778A5 (no)
DE (1) DE3505287C2 (no)
DK (1) DK174675B1 (no)
FI (1) FI71768C (no)
FR (1) FR2559783B1 (no)
GB (1) GB2156074B (no)
HU (1) HU194938B (no)
IE (1) IE57652B1 (no)
IT (1) IT1183184B (no)
LU (1) LU85768A1 (no)
NL (1) NL193663C (no)
NO (1) NO166543C (no)
RO (1) RO92633B (no)
SE (1) SE463103B (no)
SU (1) SU1523053A3 (no)
ZA (1) ZA85511B (no)

Families Citing this family (151)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1260372A (en) * 1984-04-27 1989-09-26 Elazar Rabbani Hybridization method for the detection of genetic materials
US4725536A (en) * 1985-09-19 1988-02-16 Genetics Institute, Inc. Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods
US4876187A (en) * 1985-12-05 1989-10-24 Meiogenics, Inc. Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4910300A (en) * 1985-12-11 1990-03-20 Chiron Corporation Method for making nucleic acid probes
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
FI76119C (fi) * 1986-02-27 1988-09-09 Orion Yhtymae Oy Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet.
US4925785A (en) * 1986-03-07 1990-05-15 Biotechnica Diagnostics, Inc. Nucleic acid hybridization assays
US5281518A (en) * 1986-05-01 1994-01-25 Washington Research Foundation Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease
CA1341065C (en) * 1986-05-01 2000-08-01 J. Thomas Grayston Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US6270961B1 (en) * 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
CA1339351C (en) * 1987-10-15 1997-08-26 Michael S. Urdea Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5359100A (en) * 1987-10-15 1994-10-25 Chiron Corporation Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
AU622426B2 (en) * 1987-12-11 1992-04-09 Abbott Laboratories Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
GB8810400D0 (en) * 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US7811751B2 (en) * 1988-05-03 2010-10-12 Oxford Gene Technology Limited Analysing polynucleotide sequences
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US6054270A (en) * 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
ATE144556T1 (de) * 1988-06-24 1996-11-15 Amgen Inc Verfahren und mittel zum nachweis von nukleinsäuresequenzen
US5185243A (en) * 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
JPH0638758B2 (ja) * 1989-02-03 1994-05-25 イーストマン コダック カンパニー 核酸試験片及び所定の核酸を検出するためのその使用
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5925525A (en) * 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
US6406844B1 (en) 1989-06-07 2002-06-18 Affymetrix, Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6040138A (en) * 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6346413B1 (en) 1989-06-07 2002-02-12 Affymetrix, Inc. Polymer arrays
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6919211B1 (en) * 1989-06-07 2005-07-19 Affymetrix, Inc. Polypeptide arrays
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US6955915B2 (en) * 1989-06-07 2005-10-18 Affymetrix, Inc. Apparatus comprising polymers
US6416952B1 (en) 1989-06-07 2002-07-09 Affymetrix, Inc. Photolithographic and other means for manufacturing arrays
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
US6506558B1 (en) 1990-03-07 2003-01-14 Affymetrix Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
CA2039517C (en) * 1990-04-03 2006-11-07 David Segev Dna probe signal amplification
US5071962A (en) * 1990-05-31 1991-12-10 The United State Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide, deduced amino acid sequence, isolation and purification of heat-shock chlamydial proteins
DE69112309T2 (de) * 1990-06-28 1996-01-25 Wakunaga Seiyaku Kk Verfahren zum Nukleinsäurenachweis.
US5645994A (en) * 1990-07-05 1997-07-08 University Of Utah Research Foundation Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences
GB9020621D0 (en) * 1990-09-21 1990-10-31 Imp Cancer Res Tech Identification of organisms
GB2262987A (en) * 1990-09-21 1993-07-07 Imp Cancer Res Tech Identification of organisms
DE69132905T2 (de) * 1990-12-06 2002-08-01 Affymetrix Inc N D Ges D Staat Detektion von Nukleinsäuresequenzen
US5437976A (en) * 1991-08-08 1995-08-01 Arizona Board Of Regents, The University Of Arizona Multi-domain DNA ligands bound to a solid matrix for protein and nucleic acid affinity chromatography and processing of solid-phase DNA
US6048690A (en) * 1991-11-07 2000-04-11 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
US6652808B1 (en) * 1991-11-07 2003-11-25 Nanotronics, Inc. Methods for the electronic assembly and fabrication of devices
US6569382B1 (en) 1991-11-07 2003-05-27 Nanogen, Inc. Methods apparatus for the electronic, homogeneous assembly and fabrication of devices
US5849486A (en) * 1993-11-01 1998-12-15 Nanogen, Inc. Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization
US6051380A (en) * 1993-11-01 2000-04-18 Nanogen, Inc. Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
US6017696A (en) 1993-11-01 2000-01-25 Nanogen, Inc. Methods for electronic stringency control for molecular biological analysis and diagnostics
US5605662A (en) 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US5556961A (en) * 1991-11-15 1996-09-17 Foote; Robert S. Nucleosides with 5'-O-photolabile protecting groups
US6468740B1 (en) 1992-11-05 2002-10-22 Affymetrix, Inc. Cyclic and substituted immobilized molecular synthesis
US6943034B1 (en) 1991-11-22 2005-09-13 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
EP1588761A3 (en) * 1991-11-22 2005-11-23 Affymetrix, Inc. Method of forming arrays of polymers
US6849462B1 (en) 1991-11-22 2005-02-01 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
JPH07502655A (ja) * 1991-12-23 1995-03-23 バイエル　コーポレイション 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのｃｍｖプローブ
CA2124795A1 (en) * 1991-12-23 1993-07-08 Ray Sanchez-Pescador Chlamydiae probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
US5583211A (en) * 1992-10-29 1996-12-10 Beckman Instruments, Inc. Surface activated organic polymers useful for location - specific attachment of nucleic acids, peptides, proteins and oligosaccharides
US7713528B1 (en) 1993-02-18 2010-05-11 Enzo Therapeutics, Inc. Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate
EP0787183A4 (en) 1993-07-23 1998-05-27 Hyseq Inc METHOD FOR DETECTION OF UNKNOWN ORGANISMS
FR2710075B1 (fr) * 1993-09-15 1995-10-27 Bio Merieux Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal.
US6225059B1 (en) 1993-11-01 2001-05-01 Nanogen, Inc. Advanced active electronic devices including collection electrodes for molecular biological analysis and diagnostics
US20040077074A1 (en) * 1993-11-01 2004-04-22 Nanogen, Inc. Multi-chambered analysis device
US6254827B1 (en) 1993-11-01 2001-07-03 Nanogen, Inc. Methods for fabricating multi-component devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6309602B1 (en) 1993-11-01 2001-10-30 Nanogen, Inc. Stacked, reconfigurable system for electrophoretic transport of charged materials
US7582421B2 (en) * 1993-11-01 2009-09-01 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using a bioelectronic microchip
US7101661B1 (en) 1993-11-01 2006-09-05 Nanogen, Inc. Apparatus for active programmable matrix devices
US6315953B1 (en) 1993-11-01 2001-11-13 Nanogen, Inc. Devices for molecular biological analysis and diagnostics including waveguides
US6375899B1 (en) 1993-11-01 2002-04-23 Nanogen, Inc. Electrophoretic buss for transport of charged materials in a multi-chamber system
US6319472B1 (en) 1993-11-01 2001-11-20 Nanogen, Inc. System including functionally separated regions in electrophoretic system
US6726880B1 (en) 1993-11-01 2004-04-27 Nanogen, Inc. Electronic device for performing active biological operations and method of using same
US6638482B1 (en) 1993-11-01 2003-10-28 Nanogen, Inc. Reconfigurable detection and analysis apparatus and method
US7172864B1 (en) 1993-11-01 2007-02-06 Nanogen Methods for electronically-controlled enzymatic reactions
US6331274B1 (en) 1993-11-01 2001-12-18 Nanogen, Inc. Advanced active circuits and devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6287517B1 (en) 1993-11-01 2001-09-11 Nanogen, Inc. Laminated assembly for active bioelectronic devices
US6068818A (en) * 1993-11-01 2000-05-30 Nanogen, Inc. Multicomponent devices for molecular biological analysis and diagnostics
US7314708B1 (en) * 1998-08-04 2008-01-01 Nanogen, Inc. Method and apparatus for electronic synthesis of molecular structures
US6287850B1 (en) * 1995-06-07 2001-09-11 Affymetrix, Inc. Bioarray chip reaction apparatus and its manufacture
EP0695941B1 (en) * 1994-06-08 2002-07-31 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for packaging a chip
US7378236B1 (en) 1994-06-17 2008-05-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for analyzing gene expression patterns
US7323298B1 (en) 1994-06-17 2008-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences
US5807522A (en) * 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US6306657B1 (en) * 1994-06-28 2001-10-23 Kalyx Biosciences, Inc. Polynucleotide probe and kit for amplifying signal detection in hybridization assays
US7857957B2 (en) * 1994-07-07 2010-12-28 Gamida For Life B.V. Integrated portable biological detection system
US6403367B1 (en) 1994-07-07 2002-06-11 Nanogen, Inc. Integrated portable biological detection system
US6121048A (en) * 1994-10-18 2000-09-19 Zaffaroni; Alejandro C. Method of conducting a plurality of reactions
US8236493B2 (en) * 1994-10-21 2012-08-07 Affymetrix, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US6720149B1 (en) * 1995-06-07 2004-04-13 Affymetrix, Inc. Methods for concurrently processing multiple biological chip assays
US20040086917A1 (en) * 1995-09-27 2004-05-06 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
EP0880598A4 (en) * 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US6706473B1 (en) 1996-12-06 2004-03-16 Nanogen, Inc. Systems and devices for photoelectrophoretic transport and hybridization of oligonucleotides
US20020042048A1 (en) 1997-01-16 2002-04-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
US6297006B1 (en) 1997-01-16 2001-10-02 Hyseq, Inc. Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments
US6326489B1 (en) 1997-08-05 2001-12-04 Howard Hughes Medical Institute Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays
DE19741715A1 (de) 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung
EP1028970A1 (en) 1997-10-10 2000-08-23 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6548021B1 (en) 1997-10-10 2003-04-15 President And Fellows Of Harvard College Surface-bound, double-stranded DNA protein arrays
US6511803B1 (en) * 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6485944B1 (en) 1997-10-10 2002-11-26 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
AU748022B2 (en) * 1997-12-12 2002-05-30 Digene Corporation Universal collection medium
US6355419B1 (en) 1998-04-27 2002-03-12 Hyseq, Inc. Preparation of pools of nucleic acids based on representation in a sample
US6232067B1 (en) * 1998-08-17 2001-05-15 The Perkin-Elmer Corporation Adapter directed expression analysis
US6545264B1 (en) 1998-10-30 2003-04-08 Affymetrix, Inc. Systems and methods for high performance scanning
US7612020B2 (en) 1998-12-28 2009-11-03 Illumina, Inc. Composite arrays utilizing microspheres with a hybridization chamber
WO2000056934A1 (en) * 1999-03-24 2000-09-28 Packard Bioscience Company Continuous porous matrix arrays
CN1192116C (zh) * 1999-03-30 2005-03-09 内诺金有限公司 通过在半导体微芯片上进行电斑点印迹检测法分辩单核苷酸多态性
WO2000066265A2 (en) 1999-04-27 2000-11-09 Ciphergen Biosystems, Inc. Probes for a gas phase ion spectrometer
US20030096321A1 (en) * 1999-05-19 2003-05-22 Jose Remacle Method for the identification and/or the quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips
EP1054259A1 (en) * 1999-05-19 2000-11-22 Remacle, José Method for the identification of a target compound
US6465183B2 (en) 1999-07-01 2002-10-15 Agilent Technologies, Inc. Multidentate arrays
JP2001017166A (ja) * 1999-07-02 2001-01-23 Fuji Photo Film Co Ltd Ｄｎａチップ、ｄｎａチップの検定キットおよびｄｎａチップの検定法
US6428957B1 (en) * 1999-11-08 2002-08-06 Agilent Technologies, Inc. Systems tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US8076063B2 (en) 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6455007B1 (en) * 2000-06-13 2002-09-24 Symyx Technologies, Inc. Apparatus and method for testing compositions in contact with a porous medium
US7601497B2 (en) 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US6905816B2 (en) * 2000-11-27 2005-06-14 Intelligent Medical Devices, Inc. Clinically intelligent diagnostic devices and methods
AU2002255699A1 (en) * 2001-03-09 2002-09-24 Apollo Biotechnology, Inc. Conjugate probes and optical detection of analytes
EP1481076A4 (en) 2001-07-12 2005-05-11 Illumina Inc MULTIPLEX NUCLEIC REACTIONS
US6893822B2 (en) 2001-07-19 2005-05-17 Nanogen Recognomics Gmbh Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate
US7601493B2 (en) * 2002-07-26 2009-10-13 Nanogen, Inc. Methods and apparatus for screening and detecting multiple genetic mutations
US20040241659A1 (en) * 2003-05-30 2004-12-02 Applera Corporation Apparatus and method for hybridization and SPR detection
US7622281B2 (en) 2004-05-20 2009-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid
US7828954B2 (en) * 2004-09-21 2010-11-09 Gamida For Life B.V. Electrode based patterning of thin film self-assembled nanoparticles
US7314542B2 (en) * 2004-09-23 2008-01-01 Nanogen, Inc. Methods and materials for optimization of electronic transportation and hybridization reactions
US20060246576A1 (en) * 2005-04-06 2006-11-02 Affymetrix, Inc. Fluidic system and method for processing biological microarrays in personal instrumentation
US7993853B2 (en) 2005-05-06 2011-08-09 Gen-Probe Incorporated Methods of nucleic acid target capture
WO2007070553A2 (en) * 2005-12-12 2007-06-21 The Johns Hopkins University Double-tiled and multi-tiled arrays and methods thereof
NZ569883A (en) 2005-12-28 2011-12-22 Translational Therapeutics Inc Use of triazole containing compounds for inhibiting 4E activity and proliferation of a cell
US20080003667A1 (en) * 2006-05-19 2008-01-03 Affymetrix, Inc. Consumable elements for use with fluid processing and detection systems
EP2067034B1 (en) 2006-09-29 2018-08-08 Translational Therapeutics, Inc. Eif4e regulon-based diagnostics
EP1912067A1 (en) * 2006-10-12 2008-04-16 Eppendorf Array Technologies S.A. Method for quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
WO2008085777A2 (en) * 2007-01-03 2008-07-17 Xgenetics Inc. A method for early detection of cancer
ES2622062T3 (es) * 2008-10-27 2017-07-05 Qiagen Gaithersburg, Inc. Ensayo y sistema de captura de híbrido de resultados rápidos
ES2644516T3 (es) * 2009-01-28 2017-11-29 Qiagen Gaithersburg, Inc. Método y ensayo de preparación de muestras de gran volumen específico de secuencia
JP5738278B2 (ja) * 2009-05-01 2015-06-24 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 試料中のｒｎａスプライシング形態を検出するための非標的増幅法
EP2478087B1 (en) 2009-09-14 2017-01-18 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media
JP6103941B2 (ja) 2010-01-29 2017-03-29 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 核酸の配列特異的精製および多重分析のための方法および組成物
US9605303B2 (en) 2010-01-29 2017-03-28 Qiagen Gaithersburg, Inc. Method of determining and confirming the presence of an HPV in a sample
JP2013528049A (ja) 2010-05-19 2013-07-08 キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． 核酸の配列特異的な精製及び多重分析のための方法及び組成物
JP6153866B2 (ja) 2010-05-25 2017-06-28 キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． 迅速なハイブリッド捕捉アッセイ、及び関連する戦略的に切断されたプローブ
JP2014511182A (ja) 2011-02-24 2014-05-15 キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． Ｈｐｖ核酸を検出するための材料及び方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) * 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
US4293652A (en) * 1979-05-25 1981-10-06 Cetus Corporation Method for synthesizing DNA sequentially
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
GB8306426D0 (en) * 1983-03-09 1983-04-13 Malcolm A D B Detecting polynucleotide sequence
CA1260372A (en) * 1984-04-27 1989-09-26 Elazar Rabbani Hybridization method for the detection of genetic materials
US4563417A (en) * 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes

Also Published As

Publication number Publication date
NL193663B (nl) 2000-02-01
GB8503900D0 (en) 1985-03-20
SE8500733L (sv) 1985-08-18
DK58985A (da) 1985-08-18
RO92633B (ro) 1987-10-31
AU3842285A (en) 1985-08-22
HUT37459A (en) 1985-12-28
SE463103B (sv) 1990-10-08
ATA44185A (de) 1991-10-15
IT1183184B (it) 1987-10-05
FI840655A0 (fi) 1984-02-17
NO166543C (no) 1991-08-07
DE3505287C2 (de) 1994-01-20
CA1248895A (en) 1989-01-17
US4731325A (en) 1988-03-15
IT8519432A0 (it) 1985-02-07
DK58985D0 (da) 1985-02-08
AU577568B2 (en) 1988-09-29
CH671778A5 (no) 1989-09-29
AT394578B (de) 1992-05-11
LU85768A1 (fr) 1985-07-24
NL8500424A (nl) 1985-09-16
IE850202L (en) 1985-08-17
BE901671A (fr) 1985-05-29
NL193663C (nl) 2000-06-06
IE57652B1 (en) 1993-02-10
DE3505287A1 (de) 1985-09-05
FR2559783A1 (fr) 1985-08-23
GB2156074B (en) 1988-03-16
DK174675B1 (da) 2003-08-25
JPH0463679B2 (no) 1992-10-12
RO92633A (ro) 1987-10-30
FR2559783B1 (fr) 1990-03-02
SU1523053A3 (ru) 1989-11-15
NO850554L (no) 1985-08-19
HU194938B (en) 1988-03-28
JPS60188100A (ja) 1985-09-25
GB2156074A (en) 1985-10-02
SE8500733D0 (sv) 1985-02-15
FI840655A (fi) 1985-08-18
FI71768C (fi) 1987-02-09
FI71768B (fi) 1986-10-31
ZA85511B (en) 1985-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO166543B (no) Nukleinsyrereagenser og fremgangsmaate til deres fremstilling.
Marriott et al. Indirect binding of human T-cell leukemia virus type I tax1 to a responsive element in the viral long terminal repeat
JP3532045B2 (ja) 淋菌を検出するためのヌクレオチド配列
Mirault et al. Organization of the multiple genes for the 70,000-dalton heat-shock protein in Drosophila melanogaster.
WO1986005816A1 (en) Type-specific papillomavirus dna sequences and peptides
DK164932B (da) Fremgangsmaade til identificering af nukleinsyrer ved en hybridiseringsmetode, hvor mindst to sonder er i samme oploesningsfase, idet den ene, detektorsonden, er maerket med en egnet detekterbar markoer
Clancy et al. Isolation of genes expressed preferentially during sporulation in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
Chay et al. Diversity among isolates within the PAV serotype of barley yellow dwarf virus
Kinchington et al. Use of polymerase chain amplification reaction for the detection of adenoviruses in ocular swab specimens.
EP0232085A2 (en) Campylobacter probe
EP0672186A1 (en) Improved strand displacement assay and complex useful therefor
Hanafusa et al. Genetic control of expression of endogenous virus genes in chicken cells
ODell et al. The classification of isolates of Gaeumannomyces graminis from wheat, rye and oats using restriction fragment length polymorphisms in families of repeated DNA sequences
JPH08501220A (ja) Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ同定用の単離されたヌクレオチド配列
Laffler et al. Viability of Physarum polycephalum spores and ploidy of plasmodial nuclei
Judelson et al. Temperature and genotype interactions in the expression of host resistance in lettuce downy mildew
JP3434818B2 (ja) 赤痢菌同定用核酸プローブ
WO1990001560A1 (en) Bacterial dna probe
CN102719519B (zh) 用于检测Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶基因的组合物和试剂盒
EP0623177B1 (en) Reversibly bound in dessicated form to a solid support nucleid acid hydridisation probe, method using the same and kit therefor
WO2007119557A1 (ja) コイヘルペスウイルス（ｋｈｖ）の検出方法
Ansaruzzaman et al. Differentiation of Vibrio cholerae O1 isolates with biochemical fingerprinting and comparison with ribotyping
KR20230085755A (ko) 랄스토니아 슈도솔라나세아룸의 특이적 프라이머 세트 및 이를 이용한 랄스토니아 슈도솔라나세아룸의 검출방법
KR20230085763A (ko) 랄스토니아 시지키의 특이적 프라이머 세트 및 이를 이용한 랄스토니아 시지키의 검출방법
Ishihara et al. Increase in telomerase activity in citrus inoculated with Xanthomonas axonopodis pv. citri

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired