JPH0638758B2 - 核酸試験片及び所定の核酸を検出するためのその使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 関連出願についての言及 本願は、JohnＢ．Findlay等による、1989年２月３日出
願の米国特許出願第306,954号の一部継続出願である。

発明の分野 本発明は診断操作、詳細には、核酸の検出のための診断
操作に関する。本発明はまたそのような操作に有用な試
験片に関する。

発明の背景 核酸のハイブリッド形成は、核酸の同定を研究するため
の周知操作である。ハイブリッド形成は相補的塩基の対
合に基づいている。１本鎖核酸を溶液中でインキュベー
トすると相補的塩基配列が対合して２本鎖ハイブリッド
分子を形成する。これらの分子は所望の場合には変性に
より分離することができる。

疾病の診断、遺伝的欠陥、遺伝子工学もしくは遺伝子の
特性決定のために、所定の（ターゲットとしてもまた知
られている）核酸の存在についての被検体のアッセイに
使用することができるか、または汚染物又は他に医学上
もしくは研究上の目的のために、血液、食品又は他の物
を試験するための核酸プローブアッセイもまた知られて
いる〔例えば、米国特許第4,358,535号（Falkow等に対
して1982年11月９日発行）、国際公開第88／01302号（1
988年２月25日公告）及びその中に述べられている引例
を参照されたい。〕 核酸プローブアッセイの中には、２個のプローブを使用
して、３部分ハイブリッド化生成物の状態で２個のプロ
ーブの間に問題の核酸を挟みこむ、当該技術分野におい
て“サンドウイッチ・アッセイ”として知られているも
のがある。一般に、一方のプローブは“捕捉（captur
e）”プローブであり、これは固体表面上に、固定化さ
れているか又はそのようになることができるものであ
り、他方のプローブは検出可能に標識化されるか又はそ
のようになることができるものである。サンドウイッチ
・アッセイは、所定の核酸を固体状支持体上に直接固定
化する必要がなく、かつ１つではなく２つのハイブリッ
ド形成反応が検出のために必要なのでより高い特異性の
可能性を提供するという利点を有する。

プローブ・アッセイに用いられる、ほとんどの“捕捉”
プローブは、一般に、検出される所定の核酸の少くとも
１つの核酸配列と相補的であるオリゴヌクレオチドを形
成するヌクレオチド配列から構成される。核酸のアフィ
ニティ・クロマトグラフィ分離用及びプローブ・アッセ
イ用に、オリゴヌクレオチドを固体状支持体へ結合させ
るための様々の方法が知られている。かかる方法を述べ
ているかなりの数の文献の中には、国際公開第88／0130
2号（上述）、ヨーロッパ特許第0235726号（1987年９月
９日公告）及び米国特許第4,673,657号（Christianに対
して1987年６月16日発行）がある。

当該技術分野における有意な進展は、米国特許第4,683,
195号（Mullis等に対して1987年７月28日発行）及び米
国特許第4,683,202号（Mullisに対して1987年７月28日
発行）明細書に記載されている。広範囲にわたり詳細に
論ずることなく、これらの特許は、プライマーが重合剤
（例えば、ポリメラーゼ）と４種のデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸の存在下で核酸の鋳型にハイブリッド形
成し、次いでこらのプライマー類からエクステンション
産物が生成される増幅方法を記載している。これらの産
物は変性され、次いでそれらのその後の検出を容易にす
るための、所定の核酸の数および量を増幅する周期的な
反応の鋳型として使用される。この増幅方法は、少量の
所定の核酸から大量の検出可能な物質を生成するため
に、望ましいだけ多数回、周期的に実施することができ
る。

標的配列が検出可能量まで十分に増幅されさえすれば、
検出方法は限定的ではない。放射性同位体、ビチオンも
しくは酵素（ビチオン−アビジン結合を介してプローブ
に結合された）で標識化したプローブ又はゲル電気泳動
の使用を含む、多くの検出技法が当該技術分野において
記載されている。他のプローブは支持体上に増幅された
産物を捕捉するのに使用される。

米国特許第4,727,019号（Valkirs等に対して1988年２月
23日の）は、直接、多孔質基板（例えば、膜）に局所領
域中において固定化されたプローブを使用して核酸を検
出することができる分析法及び分析装置について記載し
ている。あるいは、プローブを多孔質マトリックス内に
埋め込むこともできる。プローブをかえる支持体に直接
結合すること又それらをその中に埋め込むことは、所定
の核酸の被検体中に一般に高濃度存在する場合には精確
なしかも高感度のアッセイを提供するであろうが、その
濃度が非常に低い場合には限度がある。この技術分野に
おいては研究が進行しているので、より少量（単一分子
であったとしても）を検出する必要性は極めて重要であ
る。従って、多くの従来の、核酸試験方法及び装置は不
十分である。

同様に、多孔質膜のマトリックス内に埋め込まれたポリ
マー粒子に結合した核酸を利用する分析方法がヨーロッ
パ特許第0200381号（1986年11５日に公告）に記載され
ている。更に、複数個の核酸が同時に検出できるように
いくつかのプローブをマトリックスの区隔域に埋め込む
こともできる。

１種又はそれ以上の核酸を同時に検出するという欲求が
当該技術分野においては残っている。ししながら、上述
したように、ますます低濃度のこれらの核酸を検出する
必要性もまたある。このことはプローブ及び分析操作に
関して高感度を必要とするものである。

発明の要約 上記課題は、少くとも第１対向面及び第２対向面を有
し、かつ前記対向面のうち少くとも１つの対向面の少く
とも１つの区隔ゾーン中に水不溶性核酸プローブを付着
せしめている支持体を含んでなる核酸試験片であって、 前記プローブは、所定の核酸に対して相補的なオリゴヌ
クレオチドを含んでなり、このオリゴヌクレオチドは水
不溶性粒子に共有結合しており、かつ実質的にいずれの
前記プローブも前記対向面内に埋め込まれていない、 核酸試験片により克服される。

更に、所定の核酸の検出方法は、 Ａ．所定の核酸を含有すると推定される被検体を、上記
核酸試験片と接触させて、 所定の核酸及び前記水不溶性プローブのハイブリッド形
成化産物を形成し、 Ｂ．工程Ａに先立って、と同時に又はに続いて、前記被
検体を、前記所定の核酸に対して相補的な、検出可能に
標識化されたプローブと接触させて、前記水不溶性プロ
ーブ及び前記標識化プローブの両者とハイブリッド形成
した前記所定の核酸の固定化サンドウィッチ産物を形成
し、 Ｃ．前記固定化サンドウィッチ産物を非固定化物質から
分離し、そして Ｄ．前記固定化サンドウィッチ産物を、被検体中の所定
の核酸の量の指標として検出する、 ことを含んでなる。

更に詳細には、所定の核酸の検出方法は、 Ａ．被検体中に見出される所定の核酸を、相補的プライ
マー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び重合剤の
存在下で増幅させ、 Ｂ．前記増幅された所定の核酸を、上記核酸試験片と接
触させて、 所定の核酸及び前記水不溶性プローブの固定化されたハ
イブリッド形成化産物を形成し、 Ｃ．前記固定化産物を非固定化物質から分離し、そして Ｄ．前記固定化産物を、被検体中の所定の核酸の量の指
標として検出する、 ことを含んでなる。

本発明は、被検体、例えば生物学的被検体中の１種又は
それ以上の核酸の迅速かつ精確な検出を達成するための
手段を提供する。本発においては、標的核酸が極めて低
濃度で存在する場合に高感度のアッセイが可能であると
いうことが特に有利である。更に、本発明の試験片は容
易に製造されかつ有意の製造上の有効性を有する。プロ
ーブが水不溶性粒子から構成されているので、それらは
後の使用のために、適切な支持体上に容易に付着される
か又は試験具中に包含される。従って、プローブ溶液の
使用及びそれに伴う不利益が回避される。

この利点は、支持体上の特定位置において支持体に付着
している水不溶性プローブを使用することにより達成さ
れる。更に、このプローブは当該技術分野において教示
されているようには、支持体内に埋め込まれていないの
で、プローブのより多くの表面積が被検体に露され、従
ってアッセイ感度が高められる。本発明の重要な利点
は、個々の位置において支持体に付着した複数個の水不
溶性プローブを使用して、複数個の所定の核酸を同時に
検出できることである。好ましい実施態様においては、
本発明の試験片は、アッセイ用のすべての試薬を含んで
もよい、自蔵式試験具内に組み入れられる。いくつかの
試薬が予め組み入れられていない場合は、この試験具は
試薬添加後のアッセイ用の容器になりうる。

図面の簡単な説明 第１図は、支持体の局所区域に水不溶性プローブを固定
化せしめた、本発明の試験片の平面図である。

第２図は、第１図の線II−IIに沿った断面図である。

第３図は、支持体に局所的に配置されたプローブを複数
個有する、本発明の別の試験片についての第２図と同様
の断面図である。

第４図は、試験ウェルの底部に位置した膜上に、水不溶
性プローブを局所的に配置した、本発明の更に別の実施
態様の断面図である。

発明の詳細な記載 核酸の検出において検出されもしくは使用されるプライ
マー、プローブ又はオリゴマーフラグメントに言及する
際、本明細書において使用されるものとして、用語“オ
リゴヌクレオチド”は２個もしくはそれ以上の好ましく
は３個より多いデオキシリボヌクレオチド又はリボヌク
レオチドからなる分子を指す。その正確な大きさは限定
的ではないが、しかしオリゴヌクレオチドの最終的な用
途又は機能を含む多くの要因に左右される。このオリゴ
ヌクレオチドは合成により又はクローニングにより誘導
されてもよい。

用語“プライマー”は、天然に存在するにせよ合成によ
り製造されるにせよ、核酸鎖に対して相補的なプライマ
ーのエクステンション産物の合成が誘発される条件に付
された際に、合成に開始点として作用することができる
オリゴヌクレオチドを指す。このような条件としては、
ヌクレオチド（例えば、４本鎖のデオキシリボヌクレオ
チド三リン酸）及び重合剤、例えば、DNAポリメラーゼ
の存在、並びに適切な温度及びpHが挙げられる。

一実施態様においては、このプライマーは１本鎖領域に
隣接した、２本鎖の標識化核酸領域を含む。この１本鎖
領域は、核酸配列を含み、この核酸配列はそれとハイブ
リッド形成する鋳型鎖に対して十分に相補的である。こ
のプライマーの２本鎖領域、又は尾部を、検出可能なシ
グナルを発生させることができるか又はそのエクステン
ション産物を捕捉もしくは固定化するのに有用な検出可
能な部分で標識化することができる。

他のそして好ましい実施態様において、プライマーは全
体的に一体鎖である。好ましくは、プライマーは１本鎖
のオリゴデオキシリボヌクレオチドである。それは、重
合剤の存在下でエクステンション産物の合成を始動させ
るのに十分な長さでなければならないが、その正確な大
きさは、意図する用途、標的配列の複雑さ、反応温度及
びプライマー源次第で変動するであろう。一般に、本発
明に用いられる各プライマーは約15〜約50個のヌクレオ
チドを、好ましくは約20〜約30個のヌクレオチドを有す
るであろう。

本発明において用いられるプライマーは、増幅されるべ
き各特定配列の各種鎖に対して“実質的に”相補的であ
るように選択される。このことは、それらが、それらの
各鎖とハイブリッド形成して所望のハイブリッド形成化
産物を形成するのに十分なほど相補的でなければならな
いということを意味する。非相補性塩基は、それらがハ
イブリッド形成及びエクステンション産物の形成を阻害
しない限り、その中に含まれていてもよい。プライマー
は、増幅効率において最良の結果が得られるように確か
な相補性を有することが好ましい。

本明細書において有用なプライマーは、多くの原料から
得ることができ、又は、例えば、ABI DNA合成機｛アプ
ライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）か
ら入手可能）もしくはSAM−Ｉ合成機｛バイオサーチ・
インコーポレィティッド（Biosearch，Inc．）から入手
可能）｝をはじめとする公知技法及び装置並びにそれら
を使用するための公知方法を用いて製造することができ
る。生物学的原料から単離される、天然に存在するプラ
イマーもまた有用である（例えば、制限エンドヌクレア
ーゼ消化物）。

本明細書において用いられるものとして、用語“プロー
ブ”は天然に存在する又は合成により製造されるオリゴ
ヌクレオチドを指し、これはプライマーとしては使用さ
れないが、しかしハイブリッド形成化産物を形成するよ
うに核酸の１種又はそれ以上の配列に対して実質的に相
補的であるように設計されている。更に、プローブは一
般に得られるハイブリッド形成化産物の“補捉（captur
e）”または“検出（detection）”のいずれかのために
設計されている。捕捉プローブは、例えば、特定の結合
リガンド（例えば、アビジン−ビオチン複合体）を介し
て吸収又は複合化することにより、ある形で不溶性物質
に結合されるか、または分析中のある時点で結合される
ようになることができるものである。検出プローブはそ
の中に検出可能な標識を包含せしめているか、又は検出
可能な部分と、例えば、アビジン−ビオチン複合体を介
して反応することができる部分を有する。捕捉プローブ
及び検出プローブの他の具体例は当該技術分野において
公知である。

本発明は、同一の又は異なる被検体中に存在する１種又
はそれ以上の所定の核酸の検出に向けられている。かか
る被検体としては細胞質もしくはウィルス性物質、毛
髪、体液、又は検出可能の遺伝子ウィルスもしくは細菌
DNAもしくはRNAを含む他の物質を挙げることができる。
かかる検出の主な目的は事実上は、診断ということであ
ろうが、本発明はまた、組織の分類のための、又は化学
的合成から得られる核酸の混合物から所望の核酸を大量
に得るための、DNA又はメッセンジャーRNAのクローニン
グの効率を改良するのにも用いることができるであろ
う。

本発明は、適切な方法で１種又はそれ以上の捕捉プロー
ブが付着している支持体を有する試験片を用いて行うの
が有利である。各プローブは、１種又それ以上のオリゴ
ヌクレオチド分子を共有結合でそれに付着せしめてい
る、あるタイプの水不溶性粒子からなるので、水不溶性
である。このオリゴヌクレオチドは、それらが分析の過
程でハイブリッド形成化産物を形成するのに十分な程度
まで、問題の核酸に対して相補的である。

本試験片についてここで更に詳細に検討するが、しかし
更なる実施態様は当業者にとって容易に明らかになるで
あろうことが理解されるべきである。

試験片の支持体は、プローブを容易に付着させることが
できかつ所定の核酸を含む溶液がプローブに容易に接近
することが可能であるような、任意の多孔質面又は非多
孔質面であってよい。製造及び保存の際、及びある場合
には分析の際、プローブを適所に保持するためには、プ
ローブと支持体間にあるタイプの結合が存在しなければ
ならない。しかしながら、試験片の使用の際に望まれる
感度にとっては、支持体が多孔質であろうと又は非多孔
質であろうと、プローブが圧倒的に支持体の外側面（又
は表面）上に存在するということが重要である。このこ
とは、プローブがかなりの程度まで支持体中に埋め込ま
れていないことを意味する。多孔質支持体を用いる試験
片の製造の過程では、プローブのあるものは支持体内に
埋め込まれるかもしくははめ込まれるようになるかもし
れないことが理解されるが、しかし本発明においては、
20％未満のプローブがそのような状態に置かれることが
予測される。好ましい実施態様においては、支持体は非
多孔質物質であり、かつ１種又はそれ以上のプローブが
１個又はそれ以上の外側面上に完全な形で存在する。

支持体は、少くとも２つの対向外側面を有する形状（下
記）を有するものとして更に明瞭に定義される。かかる
表面一般に平行であるが、しかし完全に平行である必要
はない（例えば、試験管のカーブした底部の内側面及び
外側面）。一般に、支持体は、プローブを保持するため
の僅少の厚さ及び外側面を有する平坦なシート、膜又は
フィルムである。試験片の一実施態様の詳細な記載は同
時係属米国特許出願第339,923号（Schnipelsky等により
1989年４月17日出願）明細書に与えられている。

本明細書中において有用な支持体材料としては、フィル
ム、膜、箔、紙（例えば、いかなる方法でも処理、仕上
げ、サイジング又は被覆されていない原料表材紙をはじ
めとする写真用又は感熱印刷用紙、又は例えばポリマー
ラテックスで処理、仕上げ、サイジング又は被覆された
紙）、キュベット、試験管、試験スライドもしくは試験
細片をはじめとする、任意の有用な形に形状化されたセ
ルロース性物質、金属、ポリマー、セラミックス、ガラ
ス又は繊維が挙げられるが、これらに限定されるもので
はない。特に有用な支持体としては、ポリマー性フィル
ム、ポリマー性もしくはセルロース性微孔性膜、例え
ば、ポール・コーポレーション（Pall Corp．）製のも
の｛例えば、Biodyne（商標）又はLoprodyne（商標）
膜｝、又はポリマーラテックス−被覆、もしくは非被覆
セルロース紙が挙げられる。最も有用な支持体は、実質
的に非多孔質のかつ被覆された紙、例えば、感熱印刷用
紙である。

試験具のいくつかの実施態様が、添付図面に示されてい
る。

第１図及び第２図を見ると、試験具10は、上部及び下部
対向面14及び16を有する、単一片のポリマーフィルム支
持体として示されている。水不溶性核酸プローブ18は、
支持体12の対向面14の中心に付着物として固定される。

試験具の別の実施態様は、第３図の断面図に示されてい
る。試験具20は、上部及び下部対向面24及び26を有する
多孔質支持体22を含んでなる。水不溶性プローブ付着物
28，30及び32は対向面24の区隔域に位置し、これらは同
一の又は異るプローブを含有することができる。

更に別の実施態様は、第４図の断面図に示された使い捨
て試験具（下記）の試験ウエルである。試験ウエル40
は、円錐状の壁42及びその底部に多孔質膜46を有する。
膜46は対向する上部面及び下部面48及び50を有し、対向
面48上には水不溶性プローブ付着物52を有する。

プローブは支持体上に任意の適切な技法を用いて付着さ
せることができる。一般に、プローブを適切な方法で付
着させそして乾燥させて、支持体上にプローブの塗布域
を形成し、そして付着は物理的手段による。あるいは、
望ましいならば、支持体及びプローブのいずれかのもし
くは両者上の反応性基を用いる化学反応を介して、又は
反応性連結基を介して、付着させることができる。プロ
ーブは、支持体の１個又はそれ以上の区隔域（例えば、
点、細片又は他のパターン、各々の区隔域は一般に約１
〜約30mm²の表面積を有する）において単に乾燥される
だけであるのが好ましい。ある場合には、プローブはア
ッセイに用いられる液体と接触した際、再懸濁されても
よい。

プローブそれ自身は、規則的な又は不規則的な形状の水
不溶性粒子を用いて製造される。円形の場合は、それら
は一般に約０．１〜約10μｍの平均直径を有する。好ま
しくは、粒子は円形でありかつ約５μｍ未満の平均直径
を有する。粒子は、ガラス、セラミックス、金属、磁化
性材料、ポリマー材料、ゾル、ゲル及び当業者に容易に
わかる他材料（それらに限定されないが、）をはじめと
する、オリゴヌクレオチドが共有結合することができる
適切な材料から製造することができる。好ましくは、粒
子は、共有結合によるオリゴヌクレオチドの結合のため
の活性基を有するポリマーから製造される。有用な活性
基としては、カルボキシ、アミノ、スルフヒドリル、ア
ルデヒド、活性化２−置換エチルスルホニル、ビニルス
ルホニル、活性ハロゲン原子、ニトロアリール及び当業
者に容易にわかる他のものが挙げられる。特に有用な粒
子は、次の反応性基：カルボキシ、活性化２−置換エチ
ルスルホニル、ビニルスルホニル又は活性ハロゲンを１
個又はそれ以上有するエチレン性不飽和重合性モノマー
の１種又はそれ以上から誘導されるポリマー性粒子であ
る。有用なモノマー、それらの製造方法及びオリゴヌク
レオチドの結合をはじめとする、このような粒子につい
ての更に詳細なことは当該技術分野において知られてい
る（例えば、1989年２月８日公告されたヨーロッパ特許
第0302715号明細書中に）。

オリゴヌクレオチドの粒子への結合は、標準操作を用い
て達成することができるが、粒子のタイプ（すなわち、
反応性基）及びオリゴヌクレオチドのどの反応性基が用
いられるか（例えば、ピリミジンもしくはプリン塩基部
分上の反応性基、又は末端ヌクレオチドの部分、５′又
は３′）に依存するであろう。種々の操作が例えば、国
際公開第88／01302号（前述）明細書に記載されてい
る。

オリゴヌクレオチドの粒子上への被覆量はある種のアッ
セイにおいては感度を改善するために重要であるかもし
れない。一般には、粒子上にできるだけ多くのオリゴヌ
クレオチド分子を結合させることが望ましい。粒子は他
の支持体と比較して、体積に対する表面積比が高いの
で、高密度が有利である。好ましくは、被覆量は一般に
粒子１mg当り約100〜約3000ピロモル（pmol）のオリゴ
ヌクレオチドである。

上記したように、水不溶性プローブを、支持体の１個又
はそれ以上の表面の区隔域に付着させる。各区域の大き
さ及び形状は同一であっても又は異っていてもよい。同
一の又は異なるプローブを有する複数個の区隔域が存在
する、好ましい実施態様においては、これらの区域は各
区域を別々に検出できるように十分に離して保持され
る。この実施態様においては、同一又は異なる被検体か
ら種々の所定の核酸を検出するために、様々のプローブ
を使用することができるし、又それらは同一の核酸を検
出するためにしかし対照として役立てるだけに使用する
ことができる。

本発明は、また所定の核酸を検出するための、本明細書
中に記載された試験片の使用方法も包含する。前記方法
の一般的な記述は上記されている。一実施態様において
は、この試験片は、得られた３部分ハイブリッドの検出
を行うために第２のプローブを使用するサンドウイッチ
・ハイブリッド形成アッセイにおいて使用される。この
第２プローブもまた所定の核酸と相補的であり、かつあ
る方法（上に検討したように）で検出を可能にする１つ
の部分を含有する。好ましくは、第２プローブはアビジ
ン、ビオチン、抗体、抗原、ハプテン、レクチン、糖
（又は別の特異的結合部分）、又は後述の他の検出可能
な部分で標識化される。最も好ましくは、標識は酵素で
あり、酵素は適切な基質又は色素形成性試薬と接触する
と試験片上に検出可能な色素を生じるであろう。

標識を結合させそしてプローブを製造する操作は、例え
ば、Agrawal等による、Nucleic Acid Res．14巻、622
7−45頁（1986年）に記載されているように、当該技術
分野において周知である。有用な標識としては、放射線
同位体、高電子密度試薬、色原体、フルオロゲン（蛍光
助剤）、燐光性部分、着色粒子、フエリチン並びに他の
磁性粒子、化学ルミネッセンス性部分、及び酵素が挙げ
られる。有用な酵素としてはグルコースオキシダーゼ、
ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリ性ホスファタ
ーゼ及び他の当該技術分野において公知のものが挙げら
れる。かかる酵素についての基質及び色素形成性組成物
は周知である。

特に好ましい実施態様においては、標識はペルオキシダ
ーゼであり、分析のある時点で過酸化水素及び適切な色
素形成性組成物を添加して検出可能な色素を生じさせ
る。例えば、有用な色素−生成試薬としては、テトラメ
チルベンジジン及びその誘導体、並びにロイコ染料、例
えば、トリアリールイミダゾールロイコ染料（Bruschi
に対して1978年５月16日に発行された米国特許第4,089,
747号明細書に記載されているような）、又は反応して
ペルオキシダーゼ及び過酸化水素の存在下で色素を生じ
る他の化合物が挙げられる。特に有用な色素−生成組成
物は以下の例に記載されている。

得られたハイブリッド形成化産物中にあるプローブの存
在の検出は、適切かつ公知の検出装置及び操作を用いて
達成することができる。あるプローブは検出装置を使用
することなく目視で見えるかもしれない。この方法を適
切な容器（下記）の中で行うのもまた有用である。

上記のような、所定の核酸のプローブとのハイブリッド
形成に先立って、所定の核酸を増幅して、検出に用いる
ことができる分子数を増加させることが好ましい。

米国特許第4,683,202号（前記）明細書に更に詳細に記
載されているように、増幅は、含まれる反応の工程の数
に対して指数的量の少くとも１種の所定核酸を生成する
ための連鎖反応を包含する。この産物は、用いた特定プ
ライマーの末端に対応する末端との別個の核酸重複物で
あるだろう。精製されていてもいなくても、任意の核酸
原料を、もしそれが検出の標的である核酸を含有するか
又は含有すると推定されるならば、出発原料として利用
することができる。望ましい場合には、核酸混合物を用
いることができる。所定の核酸はフラグメントであって
も又は完全な酸であってよい。更に、増幅されるべき各
核酸について特異的な一組のプライマー及びプローブを
用いることにより、１種以上の核酸を同時に増幅するこ
とができる。

本発明は、２本の相補的鎖を有する核酸の検出に有用で
ある。すでに問題となっている核酸の大部分は、DNAに
おいて見出されるもののように２本鎖である。しかしな
がら、１本鎖核酸、例えば、mRNAは、逆転写酵素を用い
てそれを２本鎖配列に転化した後に、同様に検出するこ
とができる。

複製されるべき特定の核酸は鋳型として使用される。も
しこの酸が２本鎖を含むならば、別の工程として又はプ
ライマーのエクステンション産物の形成と同時に、鎖の
分離（変性と呼ぶ）を行う必要がある。変性は、先行技
術に記載されているような、任意の適切な物理的、化学
的又は酵素的手段を用いて達成することができる。適切
な温度まで加熱することが好ましい手段である。

分離された鎖が使用できるようになれば、追加の核酸鎖
の合成は、２種又はそれ以上のプライマー（そのうちの
少くとも１種は上記のような標識化されている）を用い
て、緩衝水溶液中で約７〜約９のpHで行うことができ
る。好ましくは、過剰のモル濃度で、２種のプライマー
を緩衝溶液に添加するが、具体的な量は先行技術におい
て教示されている。デオキシリボヌクレオシド三リン酸
dATP，dCTP，dGTP及びdTTPもまた、合成混合物に適量添
加し、そして得られた溶液を約90〜100℃まで10分間、
好ましくは約１〜約４分間加熱する。この加熱後、この
溶液を好ましくは室温まで冷却し、次いでプライマーエ
クステンション産物の形成を誘発するための適切な剤を
導入する。この誘発剤は重合剤として当該技術分野にお
いて一般に知られている。これらの産物を形成する反応
は公知の条件（一般に、室温から、重合がもはやおこら
ない温度まで）下で行われる。

一実施態様においては、用いるプライマーは標識化され
ず、かつ増幅産物の検出は、エクステンション産物を形
成するための、１種又はそれ以上の放射線標識化デオキ
シリボヌクレオチド三リン酸を用いて達成される。

重合剤は、プライマーエクステンション産物の合成を達
成するように機能するであろう、任意の試薬、又は試薬
の組合せであってもよく、酵素（例えば、大腸菌 DNA
ポリメラーゼＩ、T4 DNAポリメラーゼ、クレノウポリ
メラーゼ、逆転写酵素及び当該技術分野において公知の
他のもの）が挙げられる、特に有用な酵素は、クローニ
ングされたもの又は天然に存在するもので熱安定性酵
素、例えば、種々のサーマス（Thermus）属の細菌種で
ある。他の重合剤は米国特許第 4,683,202号（前述）明
細書に記載されている。

好ましい熱安定性酵素は、サーマス・アクアティカス
（Thermus aquaticus）から単離された又はそのゲノム
から単離されたDNAポリメラーゼ、例えばヨーロッパ特
許公開第0258017号（1988年３月２日公開）公報に記載
されているものである。他の有用な酵素はRossi等よ
る、Syst．Appl． Microbiol、７（２〜３）、337〜34
1頁、1986年に記載されている。多くの有用なポリメラ
ーゼが市販されている。一般に、エクステンション産物
の合成は各プライマーの３′末端で開始しそして合成が
終了するまで鋳型に沿って５′から３′方向へ進行す
る。ある重合剤（例えば、逆転写酵素）は鋳型に沿って
３′から５′方向へ進行するかもしれない。

新規に合成された鎖及びそれらの各々のプライマーを含
んでなる新規に形成されたプライマーエクステンション
産物は、この方法の次の工程において用いられる初期標
的鎖と２本鎖分子を形成する。これらの鎖は次に変性に
より分離されて１本鎖分子を生成し、上述したように、
この１本鎖上に新しい核酸が合成される。増幅操作の進
行を続けるためには更なる試薬を必要とするかもしれ
ず、この後ほとんどのエクステンション産物は、２個の
プライマー（すなわち、相補的産物としての）とハイブ
リッド形成された所定の核酸からなるであろう。

鎖分離及びエクステンション産物合成の工程は必要なだ
け繰り返されて、検出に必要な所望量の所定の核酸を生
成する。一般に、一連の工程は少くとも１回、好ましく
は少くとも10〜30回繰り返される。

少くとも１個のプライマーエクステンション産物の発生
の後の、本発明方法における任意の時点で、エクステン
ション産物は、本明細書において記載したような、捕捉
プローブ又は検出可能な標識化プローブのいずれかのプ
ローブとハイブリッド形成することができる。プローブ
とエクステンション産物とこの接触は、この分析中の他
のハイブリッド形成反応と同時に又は引き続いておこな
うことができる。

この増幅方法は適切な容器中で行うことも有用である。
最も簡単な容器は試験管、フラスコ又はビーカーである
が、しかし更に精巧な容器が自動操作を容易にするため
に造られてきた。例えば、この方法を実施する際にある
温度特性を与えるように構成されたキュベットが米国特
許出願第273,781号（Burdick等により1987年11月21日出
願）明細書に記載されている。この方法を遂行するため
の、そして本発明の試験片を包含する特に有用な容器が
米国特許出願第 339,923号（上記）明細書に記載されて
いる。他の有用な容器は、本発明方法の自動による使用
又は手動による使用のために適宜作成することができる
であろう。

検出されるべき相補的産物にとっては、水不溶性産物が
反応媒体中で非固定化物質から分離されることは重要で
ある。このことは、濾過、洗浄、遠心又は他の適切な分
離技法により行うことができる。

特に有用な分離手段は、微孔質の濾過膜、例えば、Pall
Corp．により市販されているポリアミド膜｛例えば、
Loprodyne^TM（商標）又はBiodyne^TM（商標）膜｝であ
る。そらは、界面活性剤もしくは分析操作を容易にする
他の物質で被覆されずに用いられても又は予め被覆され
て用いられてもよい。一実施態様においては、検出方法
が行われるキュベット中に膜をとり込んでいる。一般
に、かかる膜は実質的にすべてのプローブがその面上に
残留するような平均孔寸法を有する。好ましくは、この
孔寸法は約１〜約10μｍである。

膜は、分析の他の工程を実施するための適切な容器を有
する別の支持体として使用することができる。しかしな
がら、好ましくは、膜は使い捨て試験片の一部としてと
り付られる。様々な試験片が米国特許第3,825,410（Bag
shaweに対して1974年７月23日発行）、米国特許第3,88
8,629号（Bagshaweに対して1975年６月10日発行）、米
国特許第3,970,429号（Updikeに対して1976年７月20日
発行）及び米国特許第4,446,232号（Liottaに対して198
4年５月１日発行）明細書に記載されているようなもの
をはじめとする従来技術において公知である。特に有用
な試験片は米国特許出願第98,248号（Hinckley等による
1987年９月18日出願）及び米国特許出願第339,923号
（上述）明細書に記載されている。微孔質膜を含む有用
な使い捨て試験片はEastman Kodak CompanyによりSur
ecell^TM（商標）試験片として市販されている。

本明細書に記載された方法は、感染性疾病、遺伝性障害
又は癌のような細胞障害と関連した、所定の核酸の検出
又は特性決定を行うのに使用することができる。この方
法はまた法医学的研究及びDNA組織の類型化にも使用さ
れる。本発明の目的のためには、遺伝的疾病としては任
意の生体由来の染色体DNAの特異的欠失又は突然変異、
例えば鎌状赤血球細胞貧血、嚢胞性線維症、α−サラセ
ミア、β−サラセミア及び当該技術分野における当業者
に容易に明らかである他のものが挙げられる。様々な感
染性疾病は、臨床サンプル中の少量の、生体（それが酵
母、バクテリア又はウィルスのいずれであっても）特有
の特異的DNA配列の存在により診断することができる。
検出可能なこのようなバクテリアとしては、ストレプト
コッカス（Streptococcus）、サルモネラ（Salmonell
a）、クラミジア（Chlamydia）、ゴノレア（Gonorrhe
a）、シゲラ（Shigella）及びリステリア（Listeria）
が挙げられるが、しかしこれらに限定されない。検出可
能なウィルスとしてはヘルペス、風疹、ヒト乳頭腫ウィ
ルス、サイトメガロウィルス、エプスタインバールウィ
ルス、肝炎、HTLV−Ｉ及びHIV−Ｉのようなレトロウィ
ルスが挙げられるがこれらに限定されない。鎌状赤球細
胞貧血の診断のためのβ−グロビンDNAの検出もまた本
発明を用いて遂行することもできる。他の検出可能種は
当業者には容易に明らかであろう。本発明は、試験試料
中の、レトロウィルス、例えば、HIV−Ｉの存在の検出
に特に有用である。かかるアッセイにおいては、HIV−
Ｉ DNAの核酸配列、例えば、ギャグ（gag）域の配列に
対して相補的なオリゴヌクレオチドを有するプローブを
使用する。

次の例は本発明の実施を具体的に説明するために提供さ
れるものであり、本発明を限定するものではない。すべ
てのパーセントは他に断らない限り重量パーセントであ
る。

例１及び例２は、フロー．スルー（flow through）操
作と云われるものを用いる、HIV−Ｉ DNAの分析を具体
的に説明するものであり、この操作により水不溶性プロ
ーブを使い捨て試験片中のフィルター膜上に固定化する
ものである。HIV−Ｉ DNA標的核酸とのハイブリッド形
成がおこって水不溶性産物を形成し、続いてフィルター
膜を介して水溶性物質を洗浄する。膜上に残留する水不
溶性産物をその表面上で検出する。

例３はフロー．バイ（flow by）操作と云われるものを
用いるHIV−Ｉ DNA及びβ−グロビンDNAの分析として
具体的に説明するものであり、この操作により２種の水
不溶性プローブを、多孔性を実質的に全く有さない固体
上支持体上に固定化する。HIV−Ｉ DNA及びβ−グロビ
ンDNA標的核酸とのプローブのハイブリッド形成がおこ
って水不溶性産物を形成する。水溶性物質は支持体から
洗い流されそして残留する水不溶性ハイブリッド産物が
次に支持体表面上で検出される。

例１：HIV−Ｉ DNAフラグメントの検出における核酸試
験片の製造及びその使用 材料： ２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
−４，５−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾール
を含有するロイコ染料溶液を次のように調製した： 固体状ロイコ染料（０．１％溶液を調製するように）
を、リン酸ナトリウム緩衝液（５ミリモル濃度）中の20
重量％のポリ（ビニルピロリドン）溶液に溶解した。こ
の溶液を次に、リン酸ナトリウム緩衝液中に過酸化水素
（10ミリモル濃度）、４′−ヒドロキシアセトアニリド
電子移動剤（５ミリモル濃度）及びジエチレントリアミ
ン五酢酸キレート剤（10μモル濃度）を含有する溶液に
添加して、10％のポリ（ビニルピロリドン）及び0.005
％のロイコ染料の最終濃度とした。

カゼインを同重量のコハク酸無水物と４時間25℃で反応
させ、次に透析により生成物を精製することによりコハ
ク酸エステル化カゼインを製造した。

この例において検出された所定のDNAフラグメントをＭ1
3ベクターの誘導体にクローニングされかつ標準操作を
用いて調製されたHIV−Ｉゲノムのgag域（コア蛋白）の
180ヌクレオチドセグメントであった。

所定のDNAの増幅に用いられたプライマーは、アデニン
（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びチトシン
（Ｃ）という標準的な省略を用いると次のヌクレオチド
配列を有した： ５′−Ｘ−TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC−３′及び ５′−ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT−３′ 前記式中、Ｘは、引用することにより本明細書中に包含
されている、国際公開第88／02931 号明細書中に記載さ
れている操作により調製されかつ結合されたビオチンテ
トラエチレングリコール分子を表す。

DNAポリメラーゼをサーマス・アクアティカス（Termus
aquaticus）から、ヨーロッパ特許公開第0258017号公
報に記載されている操作（１単位は、プライマー・エク
ステンション産物中に30分間37℃で包含されたdNTP10ミ
リモルに相当する）に従って単離した。

ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合
体をZymed Labs（サンフランシスコ）から得、そして
カゼイン（０．５％）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロ
パンスルホン酸緩衝液（100ミリモル濃度、pH７．５）
及び保存剤（0.01％）を含有するリン酸緩衝液で１：80
00に希釈した。最終の複合体濃度は156ng／mlであっ
た。リン酸緩衝溶液はリン酸ナトリウム（25ミリモル濃
度、pH７．３）及び塩化ナトリウム（75ミリモル濃度）
を含有した。

プローブの調製： 例に使用された水不溶性プローブは次の方法で調製し
た。

ポリマー粒子（２μｍ）は、標準ラテックス重合操作を
用いてポリ（スチレン−コ−アクリル酸）（97.5：２．
５モル濃度比）から構成されており、次にグリシン緩衝
液（０．１モル濃度、pH８．５）中に懸濁物（0.45％固
体）として保存した。

所定のHIV−Ｉ DNA標的配列に対し相補的なオリゴヌク
レオチドを用いてプローブを調製した。このプローブは
次の配列を有した： ５′−Ｘ−ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGT−−３′ 前記式中、Ｘは、引用することにより本明細書中に包含
されている、国際公開第88／02932号明細書に記載され
ているような、ポリエチレングリコールスペーサーを介
してプローブに結合したアミノ基を表す。

ポリマー粒子の懸濁物を２回、２−（Ｎ−モルホリン）
エタンスルホン酸緩衝液（０．１モル濃度、pH６）で洗
浄した。２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝
液（１ml）中の粒子試料（30μｇ）を１−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
（同一の緩衝液中に100mg／mlの濃度のもの0.15ml）及
び前記オリゴヌクレオチド（57.3OD／mlのナノ純度の水
0.0288ml、1.65 OD単位）と混合した。得られた混合物
を回転しながら20〜25℃で15時間回転し、遠心分離し次
いで粒子を３回ナノ純度水で洗浄し次いでその中に再懸
濁（0.45％固体）した。

得られた水不溶性プローブを、３つの異なる濃度に調製
した： プローブＡ：334 ピコモルのプローブ／mg粒子、 プローブＢ：835 ピコモルのプローブ／mg粒子、 及び プローブＣ：1670ピコモルのプローブ／mg粒子。

上記の水不溶性プローブ（0.45％懸濁物１μ）を、Su
recell^TM（商標名）使い捨て試験具（Eastman Kodak
Co．）の試験ウェル中に位置するいくつかの多孔質膜
（Biodyne^TM、商標名、１ｇ／m²のコハク酸エステル化
カゼインを被覆したナイロン膜）の各々の規定区域（約
２mm²未満）中に付着させた。このプローブ懸濁物を約3
0分室温で乾燥させた。次に、得られた試験片を以下に
述べるアッセイに使用した。

アッセイ操作： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（10ミ
リモル濃度、pH８）、塩化カリウム（50ミリモル濃
度）、塩化マグネシウム（10ミリモル濃度）及びゼラチ
ン（10μｇ）を含有する緩衝溶液に、上記プライマー
（各々100pmole）、dNTP（各々１．５ミリモル濃度）、
上記ポリメラーゼ（７．５単位）及びヒト胎盤DNA（Sig
ma、１μｇ）を添加した。更に、上記DNA標的（10
^−１６モル濃度）を添加したが、全量は100μであっ
た。

標的としてβ−グロビン遺伝子を含むヒト胎盤DNA（10
μｇ／ml）、及び当該技術分野において公知の、β−グ
ロビンDNAに対して特異的であり、その１つのプライマ
ーはビオチン化されている適切なプライマーを含有する
対照（100μ）を調製した。

上記の各溶液をポリプロピレン製微量遠心分離管中に入
れ、プライマーエクステンション産物を形成し、ついで
増幅を次のように30連続熱サイクルを用いて促進した。

70℃から95℃まで昇温 １分 95℃ ０．５分（変性） 95℃から55℃まで降温 1.25分 55℃ ０．５分（ハイブリッド形成） 55℃から70℃まで昇温 0.75分 70℃ １分（エクステンション） 30熱サイクルによる増幅の後、各混合物の５μ分別量
を、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液
（10ミリモル濃度、pH８）、塩化カリウム（50ミリモル
濃度）、塩化マグネシウム（10ミリモル濃度）及びゼラ
チン（１μｇ／10ml溶液）を含有する溶液95μに添加
し、熱変性し（95℃で５分間）、次に上記したSurecell
^TM（商標）試験具の試験ウェルに添加した（各ウェル中
に各溶液を約95μ）。

テープを各ウェル上にかぶせてそれらを密封し、次いで
試験具を42℃で５分間インキュベートして、増幅HIV−
Ｉ DNAフラグメントを試験ウェル中に固定化された水
不溶性プローブにハイブリッド形成された、テープを次
に各試験ウェルから取りはずし、次にリン酸緩衝剤（10
ミリモル濃度、pH７．４）、塩化ナトリウム（150ミリ
モル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（１ミリモル濃度
及びデシル硫酸ナトリウム（１％）を含有する緩衝溶液
（250μ）を用いて55℃で洗浄した。

上記ペルオキシダーゼ複合体（50μ、７．８ng）を各
試験ウェルに添加し、次いで試験具を室温で２分間イン
キュベートした。上記緩衝溶液を用いて第２回目の洗浄
（250μ）を行った。ロイコ染料溶液（100μ）を各
試験ウェルに添加し、続いて室温で２分間更にインキュ
ベートした。結果としておこる色素形成反応をナトリウ
ムアジド（０．１％のものを100μ）を添加すること
により停止し、次いで得られた色素を膜上で観察した。

結果を目視により、ゼロは濃度なし及び５は最高濃度で
あるとした０〜５のスケールを用いて等級づけした。次
表の結果は、各プローブ濃度について２回別々に読取っ
たものの平均である。

対照溶液を添加した試験具ではシグナルは全く観察され
なかった。バックグラウンド値は水不溶性プローブが存
在しない膜上の区域での濃度読取りから得られた。

例２：HIV−Ｉ DNAの検出 本例は、プローブをその上に固定化した基板として微孔
質濾過膜を用いる、HIV−Ｉ DNA検出を実証するもので
ある。

材料及び方法： ポリ〔スチレン−コ−ｍ及びｐ−（２−クロロエチルス
ルホニルメチル）スチレン〕（95.5：４．５モル濃度
比、２．２μｍの平均寸法）を含んでなるポリマー粒子
を、引用することにより本明細書中に包含されている米
国特許出願第 081,206号（Sutton等により1987年８月３
日出願）明細書に記載されている方法により製造した。

カゼインをこれらの粒子に次の方法で結合した：カゼイ
ン（Sigma Chemical、0.05モル濃度のホウ酸塩緩衝液
中に2.57mg／mlのものを4.94ml、pH８．５）、メチロサ
ール（0.01％）及び上記のポリマー粒子の懸濁物（ホウ
酸塩緩衝液中に17.7ml、0.0637ｇ／ml）の溶液を回転さ
せながら16時間室温で回転させた。この混合物を次に遠
心分離にかけ次いで緩衝溶液を除去した。得られたペレ
ットをグリシン緩衝液（0.1モル濃度、50ml、pH８．
５）及びメチロサール（0.01％）中に再懸濁した。この
混合物を遠心分離にかけ、次いで得られたペレツトを0.
45％の固体含有量になるようにグリシン緩衝液（250m
l）中に再懸濁した。

粒子2.54ｇを含有する粒子懸濁物（50ml）の試料を３回
ホウ酸塩緩衝液（10ml、0.05モル濃度、pH８．５）で洗
浄し、ジメチルスルホキシドの溶液（10mg／ml）中のコ
ハク酸無水物（Sigma Chemical、0.762ml）と混合し次
いで４時間室温で反応させた。この混合物を遠心分離に
かけ次いで溶液を除去した。得られたペレットを３回グ
リシン緩衝液（50ml、0.01モル濃度、pH８．５）で洗浄
し、次いでグリシン緩衝液中で0.45％の固体含有量にな
るように再懸濁した。

グリシン緩衝液中の粒子懸濁物（15ml、0.0045ｇ／ml）
を遠心分離し、次いでこのペレットを２−（Ｎ−モルホ
リノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．１モル濃度、pH
６）中に再懸濁した。この操作を２回繰り返し次いで得
られたペレットを、１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（同一の緩衝液
中に100mg／mlの溶液を0.338ml）及び以下の配列を有す
るオリゴヌクレオチド（5.73OD／mlの緩衝液0.654μ
）と混合した。この懸濁物を回転させながら16時間室
温で回転させ次いで遠心分離にかけ、そしてペレットを
ナノ純度の水（15ml）中に再懸濁した。この遠心分離操
作を３回繰り返し、次いで得られたペレットを水に懸濁
させて水不溶性プローブの0.45％固体含有の懸濁物を得
た。

このオリゴヌクレオチドは次の配列（塩基について標準
の省略形を用いて）を有した： ５′−ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGT−３′ アッセイ： HIV−Ｉ DNAのアッセイは、例１に記載した操作に従っ
て行った。水不溶性プローブを微孔質膜の規定区域中に
付着させ次いで例１において述べたように乾燥させた。

アッセイ中に膜上に生成された色素量は目視により０〜
５のスケールを用いて等級づけした（ゼロは濃度なし及
び５は最高濃度である）。バックグラウンド値は水不溶
性プローブが存在しない膜域上の濃度読取りから得られ
た。この分析についての色素濃度の読取りは約４．８と
測定され、一方バックグランド濃度は約０．５であっ
た。

例３：HIV−Ｉ DNA及びβ−グロブリンDNAの測定 本例は、２つの水不溶性プローブがその上に固定化され
ている基材として、実質的に非多孔質の、非被覆紙を用
いる、HIV−Ｉ DNA及びβ−グロビンDNAについてのア
ッセイを実証するものである。

材料： エッペンドルフ（Eppendorf）管及びヒーターをEppendo
rf Corporationから得た。

Ektamate^TM（商標）感熱印刷紙（非被覆）をEastman K
odak Companyから得て、実質的に非多孔質の非被覆紙
基板として使用した。

HIV−Ｉプライマーは、上記例１において記載したもの
と同じであった。

β−グロビンDNAプライマーは次の配列を有した： ５′−Ｘ−ACACAACTGTGTTCACTAGC−３′及び ５′−CAACTTCATCCACGTTCACC−３′ 上記式中、Ｘは、HIV−Ｉプライマーについて例１にお
いて述べたようにして製造しかつ結合させたビオチン分
子である。

β−グロビンDNAプローブは次の配列を有した： ５′−Ｘ−CTCAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTC−３′ 前記式中、ＸはHIV−Ｉ DNAプローブについて述べたも
のと同じである。

プローブ及びプライマーは標準ホスホアミダイト化学を
用いて製造し、高圧液体クロマトグラフィにより精製し
そして標準配列操作より特性決定された。

HIV−Ｉ DNAについての水不溶性プローブは上記例１に
おいて述べたように、ポリ（スチレン−コ−アクリル
酸）（95：５モル濃度比、２μｍ）からなる粒子を用い
て製造した。このプローブ（0.45％の懸濁液２μ）を
Ektamate^TM（商標）感熱印刷紙（大きさが約19×８mm）
の規定区域（直径２mmの点）上に付着させ、室温で乾燥
させた。β−グロビンプローブDNAを同様に調製しそし
て同一の紙基材の別の区域（直径２mm）に付着させた。

この紙支持体を次にプラスチック材（ポリエステルとポ
リエチレン又はポリプロピレンのいずれかとの積層物）
の一方の面に貼り付けた。プラスチック材の他の面を第
１の面上に熱を用いてシールして囲りをとじたパウチを
形成した。このパウチは、その中のプローブとのおこり
得る接触のために、液体をパウチ内に注入するための流
入ピペット口、及び液体をパウチから流出させる流出手
段を含有した。流体試薬を次にパウチ内に入れてプロー
ブと接触させてその後パウチから流出させた。

ポリメラーゼ連鎖反応のための反応混合物（全容量100
μ）は： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（10ミ
リモル濃度、pH８．３）、 塩化カリウム（50ミリモル濃度）、 塩化マグネシウム（10ミリモル濃度）、 dNTPs（各々１．５ミリモル濃度）、 プライマー（１μモル濃度）、 ゼラチン（0.01％）及び サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）から
単離したDNAポリメラーゼ（７．５単位） から構成された。

HIV−Ｉ DNA標的核酸は、M13／HIV（M13 DNAファージ
中にクローニングにされたHIV−Ｉの180塩基対セグメン
ト）又はHUT細胞系DNA（HIV−Ｉゲノムの単一にまとま
ったコピーを含む細胞系）であった。β−グロブリン標
的核酸は、１細胞当りβ−グロブリン遺伝子の２コピー
を含むと推定されるヒト胎盤DNAであった。

アッセイ： HIV−Ｉ及びβ−グロブリン標的の両者の溶液（10μ
、各々約10^-16モル濃度）及びポリメラーゼ連鎖反応
混合物（100μ）をエッペンドルフ加熱ユニットのエ
ッペンドルフ管に添加し、次いで次のプロトコールを用
いて30〜33サイクルの、ポリメラーゼ連鎖反応に付し
た：95℃で30秒間のインキュベーション（変性）、55℃
で30秒間のインキューション（ハイブリッド形成）及び
70℃で１分間のインキュベーション（重合）。

増幅された標的核酸を含む溶液の一部（10μ）を、次
にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（10
ミリモル濃度、pH８．３）、塩化カリウム（50ミリモル
濃度）、塩化マグネシウム（10ミリモル濃度）及びゼラ
チン（0.01％）を含んでなる緩衝溶液（130μ）で希
釈した。得られた溶液を次にエッペンドルフ管中で95℃
で５分間加熱して２本鎖標的核酸を変性した。この加熱
溶液をピペットに移し、次いでプローブを固定化せしめ
ている感熱印刷の表面のおおいを確保するような方法
で、上記パウチ中へ注入した。このパウチを次に42℃で
５分間インキュベートして、対応するプローブをそれぞ
れの１本鎖HIV−Ｉ及びβ−グロビンの核酸標的に結合
させた。液体を空気圧で押し出すか又は液体を注射器を
用いて吸い出すことによりパウチから液体を除去した。

洗浄溶液をパウチ中へ２回注入した。この溶液は、リン
酸二水素ナトリウム（10ミリモル濃度、pH７．４）、塩
化ナトリウム（150ミリモル濃度）及びエチレンジアミ
ン四酢酸（１ミリモル濃度）を含んでなる緩衝溶液250
μ、並びにデシルサルフェート（１％）からなり、55
℃まで予備加熱した。第２回目の洗浄後、液体を除去
し、次いで例１のストレプトアビジン−西洋ワサビペル
オキシダーゼ複合体（200μ）を次にパウチ中に注
し、これを次に室温で２分間インキュベートした。この
液体を次に除去し、次いで上記のロイコ染料溶液（200
μ）をパウチ中に注入し、続いて室温で１〜２分間更
にインキュベートした。最後にこの液体を除去した。ア
ジ化ナトリウムの溶液（０．１％溶液200μ）をパウ
チ中に注入して反応を停止し次いで感熱印刷紙上にある
色素を目視により、５が最高色素濃度を表す、０〜５ま
でのスケールを用いて等級づけした。バックグラウンド
は、プローブを固定化していない感熱印刷紙の区域から
読取った。HIV−Ｉ DNA及びβ−グロビンDNA標的につ
いての色素濃度はそれぞれ３．８及び４．２であり、一
方バックグラウンドの読取りは０．５であった。

本発明を、その好ましい実施態様を特に参考にして詳細
に述べてきたが、変更及び修正を本発明の精神及び範囲
の中で行うことができることが理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 メイヤー，ジャニス マリー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14615, ロチェスター，パークウッド ロード 142 (72)発明者 キング，マーレン マリー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14526, ペンフィールド，ジェブハード ロード 28 (72)発明者 オークス，フレッド テリィ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14617, ロチェスター，スタントン レーン 216 (72)発明者 チャン，チュ‐アン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94530, エル セリット，リッチモンド ストリー ト 936 (72)発明者 レベンソン，コレィ ハワード アメリカ合衆国，カリフォルニア 94618, オークランド，マンダレィ ロード 311

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】少くとも第１対向面及び第２対向面を有
   し、かつ前記対向面のうち少くとも１つの対向面の少く
   とも１つの個別ゾーン中に水不溶性核酸プローブを付着
   せしめている支持体を含んでなる核酸試験片であって、 前記プローブは、所定の核酸に対して相補的なオリゴヌ
   クレオチドを含んでなり、このオリゴヌクレオチドは水
   不溶性粒子に共有結合しており、かつ実質的にいずれの
   前記プローブも前記対向面内に埋め込まれていない、核
   酸試験片。
2. 【請求項２】前記支持体が、実質的にすべての前記プロ
   ーブがその表面上に残留するような平均孔寸法を有する
   多孔質膜である請求項１記載の試験片。
3. 【請求項３】前記支持体が、実質的に非多孔質の、非被
   覆紙である請求項１記載の試験片。
4. 【請求項４】前記基板がポリマーフィルムである請求項
   １記載の試験片。
5. 【請求項５】複数の水不溶性プローブを有し、各プロー
   ブが前記対向面上の区隔ゾーンに付着されており、かつ
   各プローブが別個の所定の核酸に対して相補的なオリゴ
   ヌクレオチドを含んでなる請求項１記載の試験片。
6. 【請求項６】自蔵式試験具中に配備された請求項１記載
   の試験片。
7. 【請求項７】前記水不溶性粒子が、約０．１〜約10μｍ
   の直径を有するポリマー粒子である請求項１記載の試験
   片。
8. 【請求項８】前記固定化プローブが、HIV−Ｉ DNAに対
   して相補的なオリゴヌクレオチドを含んでなる請求項１
   記載の試験片。
9. 【請求項９】前記の区隔ゾーンの各々が約１〜約30mm²
   の面積を占める請求項１記載の試験片。
10. 【請求項１０】膜の一方の面の少くとも１つの区隔ゾー
    ン中に水不溶性核酸プローブを付着せしめている多孔質
    膜を含んでなる試験片であって、 前記プローブが、HIV−Ｉ DNAに対して相補的なオリゴ
    ヌクレオチドを含んでなり、このオリゴヌクレオチドは
    約０．１〜約10ｍμの平均直径を有するポリマー粒子に
    共有結合しており、実質的にいずれの前記プローブも前
    記膜表面内に埋め込まれていない試験片。
11. 【請求項１１】前記プローブが、前記膜表面に、膜表面
    の１つ以上の区隔ゾーンにおいて付着されている請求項
    10記載の試験片。
12. 【請求項１２】前記膜がコハク酸エステル化カゼインで
    予め被覆されている請求項10記載の試験片。
13. 【請求項１３】前記プローブのオリゴヌクレオチドが、
    HIV−Ｉゲノムのgag領域のヌクレオチド・セグメントに
    対して相補的である請求項10記載の試験片。
14. 【請求項１４】所定核酸の検出方法であって、前記方法
    が、 Ａ．所定の核酸を含有すると推定される被検体を、少く
    とも第１対向面及び第２対向面を有し、かつ前記対向面
    のうち少くとも１つの対向面の少くとも１つの区隔ゾー
    ン中に水不溶性核酸プローブを付着せしめている支持体
    を含んでなる核酸試験片であって、 前記プローブは、前記の所定の核酸の第１の核酸配列に
    対して相補的なオリゴヌクレオチドを含んでなり、この
    オリゴヌクレオチドは水不溶性粒子に共有結合してお
    り、かつ実質的にいずれの前記プローブも前記対向面内
    に埋め込まれていない、核酸試験片と接触させて、 所定の核酸及び前記水不溶性プローブのハイブリッド形
    成化産物を形成し、 Ｂ．工程Ａに先立って、と同時に又はに続いて、前記被
    検体を、前記所定の核酸に対して相補的な、検出可能に
    標識化されたプローブと接触させて、前記水不溶性プロ
    ーブ及び前記標識化プローブの両者とハイブリッド形成
    した前記所定の核酸の固定化サンドウィッチ産物を形成
    し、 Ｃ．前記固定化サンドウィッチ産物を非固定化物質から
    分離し、そして Ｄ．前記固定化サンドウィッチ産物を、前記被検体中の
    所定の核酸の量の指標として検出する ことを含んでなる検出方法。
15. 【請求項１５】複数個の所定の核酸の検出方法であっ
    て、前記試験片が、複数個の水不溶性プローブを含んで
    なり、各プローブが前記対向面上の区隔ゾーン中に付着
    されており、かつ各プローブが別個の所定の核酸に対し
    て相補的なオリゴヌクレオチドを含んでなる請求項14記
    載の方法。
16. 【請求項１６】前記水不溶性プローブが、HIV−Ｉ DNA
    に対して相補的なオリゴヌクレオチドを含んでなるもの
    である請求項14記載の方法。
17. 【請求項１７】前記試験片上の前記区隔ゾーンの各々が
    約１〜約30mm²の面積を有する請求項14記載の方法。
18. 【請求項１８】所定の核酸の検出方法であって、前記方
    法が、 Ａ．被検体中に見出される所定核酸を、相補的プライマ
    ー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸及び重合剤の存
    在下で増幅させ、 Ｂ．前記の増幅した所定の核酸を、少くとも第１対向面
    及び第２対向面を有し、かつ前記対向面のうち少くとも
    １つの対向面の少くとも１つの区隔ゾーン中に水不溶性
    核酸プローブを付着せしめている支持体を含んでなる核
    酸試験片であって、 前記プローブは、前記の所定の核酸に対して相補的なオ
    リゴヌクレオチドを含んでなり、このオリゴヌクレオチ
    ドは水不溶性粒子に共有結合しており、かつ実質的にい
    ずれの前記プローブも前記対向面内に埋め込まれていな
    い、試験片と接触させて、 所定核酸及び前記水不溶性プローブの固定化されたハイ
    ブリッド形成化産物を形成し、 Ｃ．前記固定化産物を非固定化物質から分離し、そして Ｄ．前記固定化産物を、前記被検体中の所定の核酸の量
    の指標として検出する、 ことを含んでなる方法。
19. 【請求項１９】工程Ａにおいて使用した前記プライマー
    の少くとも１つが検出可能に標識化されている請求項18
    記載の方法。
20. 【請求項２０】前記固定化産物が、検出可能に標識化さ
    れている第２プローブを用いて検出される請求項18記載
    の方法。
21. 【請求項２１】自蔵式試験具によって行われる請求項18
    記載の方法。
22. 【請求項２２】前記支持体が微孔質濾過膜である請求項
    18記載の方法。
23. 【請求項２３】前記支持体が実質的に非多孔質の、非被
    覆紙である請求項18記載の方法。
24. 【請求項２４】前記水不溶性粒子が、約５μｍ未満の直
    径を有するポリマー粒子である請求項18記載の方法。
25. 【請求項２５】HIV−Ｉ DNAの検出方法であって、前記
    方法が、 Ａ．生物学的被検体中に見出されるHIV−Ｉ DNAを、相
    補的プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸及
    びサーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）か
    ら誘導されたポリメラーゼの存在下で増幅させ、 Ｂ．前記の増幅HIV−Ｉ DNAを、膜の一方の面の少くと
    も１つの区隔ゾーンに水不溶性核酸プローブを付着せし
    めた微孔質膜を含んでなり、 前記プローブがHIV−Ｉ DNAに対して相補的なオリゴヌ
    クレオチドであり、このオリゴヌクレオチドは約０．１
    〜約５μｍの平均直径を有するポリマー粒子に共有結合
    しており、実質的にいずれの前記プローブも前記膜表面
    内に埋め込まれていない、核酸試験片と接触させて、 HIV−Ｉ DNA及び前記水不溶性プローブの固定化された
    ハイブリッド形成化産物を形成し、 Ｃ．前記固定化産物を非固定化物質から分離し、そして Ｄ．前記固定化産物を、前記被検体中の、HIV−Ｉ DNA
    の量の指標として検出する ことを含んでなる方法。
26. 【請求項２６】少くとも１つのプライマーがビオチン化
    され、かつ前記固定化産物の検出が、それを、アビジン
    及び酵素の複合体と接触させることにより遂行される請
    求項25記載の方法。
27. 【請求項２７】前記複合体がペルオキシダーゼを含んで
    なり、かつ前記複合体及び前記産物の接触に続いて、前
    記産物を過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在下で色
    素を生じるロイコ染料組成物と接触させる請求項26記載
    の方法。