JP2005095184A - 似通った融点を有する2つ以上のdnaを増幅及び検出するための診断用組成物、要素、方法並びに試験キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 各標的核酸に対するプライマーの長さは、ヌクレオチド数が5個以下しか異ならず、そしてそれらのプライマーは65〜74℃の範囲内のTm を有すると同時に、Tm 'sは互いに約5℃の範囲内である。そのような組成物は、複数の捕捉プローブを用いる「多重的」な、診断試験キット並びに複数の核酸の増幅及び検出方法に有用である。すべての捕捉プローブが、50℃を越え、且つ互いに15℃の範囲内であるTm 'sを有する。
【選択図】 なし
Description
ポリメラーゼ連鎖反応が「繰越し(carry-over) 」という課題を受けやすいために、或る反応により増幅された核酸が、「新たな」ポリメラーゼ連鎖反応の反応混合物を用いる次の反応に繰り越され、それによって後に被検体を試験する際に「偽」陽性を生ぜしめる可能性がある。
ポリメラーゼ連鎖反応の或る態様では、プライマー及び捕捉プローブの特別なセット(3つのオリゴヌクレオチド全部)が、増幅及び検出しようとする各標的核酸について必要である。従って、3つのオリゴヌクレオチドはその標的核酸に対して相補的且つ特異的である。例えば、多重化するに際しては、3つの標的核酸を増幅及び検出しようとする場合、典型的には3セットのプライマー及びプローブが必要とされるが、各標的核酸に特異的な1セットのプライマー及びプローブが必要とされる。通常、複数の核酸の検出には複数の試験デバイス、恐らく各標的核酸を効率よく増幅するために、異なるセットのポリメラーゼ連鎖反応条件(即ち、温度及び時間条件)が必要とされる。
a)それぞれ、第1標的DNAの反対鎖中の配列であり且つ互いに反対鎖に沿ってヌクレオチド数90から 400個分ほど離れている第1及び第2核酸配列に対して、特異的であり且つそれらとハイブリッド可能である第1及び第2プライマー、並びに
b)それぞれ、第2標的DNAの反対鎖中の配列であって、第1及び第2核酸配列とは異なり且つ互いに反対鎖に沿ってヌクレオチド数90から 400個分ほど離れている第3及び第4核酸配列に対して、特異的であり且つそれらとハイブリッド可能である第3及び第4プライマー、
を含んでなる水性組成物であって、
第1、第2、第3及び第4プライマーが65℃〜74℃の範囲内のTm を有し、すべてのプライマーのTm 'sが互いに約5℃の範囲内であり、第1及び第2プライマーはヌクレオチド数が5個以下しか互いに異ならないヌクレオチド長さを有し、そして第3及び第4プライマーはヌクレオチド数が5個以下しか互いに異ならないヌクレオチド長さを有することを特徴とする水性組成物を用いることにより解決される。
本発明の、第1標的DNA及び第2標的DNAの同時増幅及び検出方法は、
A)上記水性組成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応により第1標的DNA及び第2標的DNAを同時に増幅すること、そして
B)少なくとも1つの増幅した第1標的DNA鎖及び少なくとも1つの増幅した第2標的DNA鎖を同時に検出すること、
を含んでなる。
捕捉試薬の各々が、40〜55℃の温度で感染性病原体と関連付けられる別個の標的DNAについて特異的であり且つそれらとハイブリダイズ可能である捕捉プローブを有し、各捕捉プローブが10〜40個のヌクレオチド及び50℃を越えるTm を有し、そしてすべての捕捉プローブのTm 'sが15℃以下しか異ならないことを特徴とする。
配列番号:26 5′-GAGATGGGAA TCCATATGCT GTATGTGAT- 3′、
配列番号:27 5′-GGACACAGTG GCTTTTGACA GTTAATACA- 3′、
配列番号:28 5′-GATGGTCCAG CTGGACAAGC AGAAC- 3′、
配列番号:29 5′-CCTAGTGTGC CCATTAACAG GTCTTC-3′、
配列番号:30 5′-GACACAGAAA ATGCTAGTGC TTATGCAGC- 3′、
配列番号:31 5′-GGTGGACAAT CACCTGGATT TACTGCAAC- 3′、
配列番号:32 5′-CCTGATCTGT GCACGGAACT GAACACT- 3′、
配列番号:33 5′-CCCAGTGTTA GTTAGTTTTT CCAATGTGTC TG- 3′、
配列番号:34 5′-TGCCTGCGGT GCCAGAAACC GTTGAAT- 3′、
配列番号:35 5′-TGCTCGGTTG CAGCACGAAT GGCACT-3′、
配列番号:36 5′-GAGCCGAACC ACAACGTCAC ACAATGTT-3′、
配列番号:37 5′-GGACACACAA AGGACAGGGT GTTCAGAAA- 3′、
配列番号:39 5′-GCGACTCAGA GGAAGAAAAC GATG-3′、
配列番号:40 5′-GAGATCGAGC TGGAGGATCC GTACG- 3′、
配列番号:41 5′-AGCTGCAGCC CAAAGGTGTT GGACT- 3′、
配列番号:51 5′-GGAACAACAT TAGAACAGCA ATACAACAAA CCG-3′、
配列番号:52 5′-AATATTGTAA CCTTTTGTTG CAAGTGTGAC TC- 3′、
配列番号:53 5′-CCTATAGGTG GTTTGCAACC AATTAAACAC-3′、
配列番号:54 5′-GAGGTATTTG AATTTGCATT TAAAGATTTA TTTGT-3′、
配列番号:55 5′-GCAAGACAGT ATTGGAACTT ACAGAGG- 3′、
配列番号:56 5′-GTGTTGTAAG TGTGAAGCCA GATTTGA- 3′、
配列番号:57 5′-GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG-3′、
配列番号:63 5′-CCGGGAGATG GGGGAGGCTA ACTGA- 3′、
配列番号:64 5′-GGGGTGGGGA AAAGGAAGAA ACGCG- 3′、及び
配列番号:65 5′-AAAGACAGAA TAAAACGCAC GGGTGTTGGG TCG-3′
の配列を有する。
本発明は、試験被検体中の感染性病原体と関連付けられるDNA分子由来の2つ以上の特異的な核酸配列の増幅及び検出に向けられている。
「ポリメラーゼ連鎖反応試薬」は、ポリメラーゼ連鎖反応に必須であると見なされるいずれかの試薬、即ち、標的核酸のプライマー、熱安定性DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ・コファクター及びデオキシリボヌクレオシド−5′−三リン酸を称する。
本発明で用いられる全セットについて、セット中の各プライマーは、65〜74℃の範囲内のTm を有し、好ましくは67〜74℃の範囲内のTm を有する。更に、プライマーTm ′sは互いに5℃以内であり、好ましくはそれらが2℃以下しか異ならない。更にまた、各追加セット中のプライマーのTm ′sは、本方法に用いられる別のセットのプライマー中のすべての別のプライマーのTm ′sとは5℃以下しか、好ましくは2℃以下しか異ならない。
Tm (融解温度)は、本明細書では二本鎖DNA分子の1/2が変性される温度として定義される。Tm の測定は、紫外線淡色効果に基づいて、数種の標準方法を用いて、例えば、Biochemistry, The Molecular Basis of Cell Structure and Function, 2nd Edition, Lehninger, Worth Publishers, Inc., 1970, pp.876-7に記載されるように260nm でスペクトルをモニターすることにより達成できる。種々のTm 値測定方法は、同一のDNA分子についてわずかに異なる値を提供するかもしれないが、それらの値は互いに2又は3℃以上変動すべきではない。
(I) Tm (℃)=67.5+0.34(%G+C)− 395/N
上式中、「G」及び「C」は、それぞれ、グアニン及びシトシンヌクレオチドの数を表し、そして「N」は、オリゴヌクレオチド(即ち、プライマーもしくはプローブ)中のヌクレオチドの総数を表す。この計算により得られたTm 値は、1つ以上の無機もしくは有機塩、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム及び塩化ナトリウムにより提供される少なくとも60μモルのイオン強度を有する10μモルのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液(pH8.5 )中にオリゴヌクレオチド(プライマーもしくはプローブ)を含む溶液について、従来のUV淡色効果及び従来のヒューレット−パッカード・ダイオード・アレイ・分光光度計(Hewlett-Packard diode array spectrophotometer )(走査速度+1℃/min.)を用いて室温で経験的に決定された値と非常に良く相関する。前記式を決定するために用いられた溶液中のオリゴヌクレオチド及びその相補体の量は、光学濃度 0.5〜1.0 OD単位を提供するには十分であった。
プライマー・セット1:
配列番号:1 5′-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-3′
(72.8℃)
配列番号:2 5′-TTCCTGCTAT GTCACTTCCC CTTGGTTC-3′
(70.4℃)、
プライマー・セット2:
配列番号:3 5′-TAGCACCCAC CAGGGCAAAG AGAAGAGT-3′
(71.6℃)
配列番号:4 5′-AGATGCTGTT GCGCCTCAAT AGCCCTCA-3′
(72.1℃)、
プライマー・セット3:
配列番号:1 5′-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-3′
(72.8℃)
配列番号:5 5′-CTTGGTTCTC TCATCTGGCC TGGTGC-3′
(71.6℃)、
プライマー・セット4:
配列番号:1 5′-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-3′
(72.8℃)
配列番号:13 5′-CCTGCTATGT CACTTCCCCT TGGTTCTCTC-3′
(72.5℃)、
プライマー・セット5:
配列番号:20 5′-CGTCGTCGTA TAATCCACCT ATCCCAGTAG GAGAAAT-3′
(71.3℃)
配列番号:21 5′-CGTCGTCGTT TTGGTCCTTG TCTTATGTCC AGAATGC-3′
(73.4℃)、
プライマー・セット6:
配列番号:22 5′-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3′
(66.8℃)
配列番号:23 5′-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3′
(68.0℃)、及び
プライマー・セット7:
配列番号:24 5′-GATGGATGAC AAATAATCCA CCTATCCCAG TAGGAGAAAT- 3′
(71.2℃)
配列番号:25 5′-CTAAAGGGTT CCTTTGGTCC TTGTCTTATG TCCAGAATGC- 3′
(72.9℃)。
HIV-II DNAの反対鎖中の核酸配列の増幅に有用な2つのプライマー・セットは、以下の配列(及びTm ′s)を有する。
プライマー・セット8:
配列番号:14 5′-AAGTAGACCA ACAGCACCAC CTAGCGG- 3′
(71.8℃)
配列番号:15 5′-GCAGCCTTCT GAGAGTGCCT GAAATCCTG- 3′
(72.6℃)、及び
プライマー・セット9:
配列番号:16 5′-GGGATAGTGC AGCAACAGCA ACAGCTGT-3′
(71.6℃)
配列番号:17 5′-GTGGCAGACT TGTCTAAACG CACATCCCC- 3′
(72.6℃)。
プライマー・セット10:
配列番号:46 5′-GAGGCTATTG TAGCCTACAC TTTGG- 3′
(68.0℃)
配列番号:47 5′-CAGCACCATC CTCCTCTTCC TCTGG- 3′
(72.1℃)、
プライマー・セット11:
配列番号:38 5′-CATTCCCACT GACTTTCTGA CGCACGT- 3′
(70.5℃)
配列番号:48 5′-TGAGGTCGTG GAACTTGATG GCGT-3′
(69.4℃)、
プライマー・セット12:
配列番号:10 5′-TGCACTGCCA GGTGCTTCGG CTCAT- 3′
(72.1℃)
配列番号:11 5′-CACCACGCAG CGGCCCTTGA TGTTT- 3′
(72.1℃)、
プライマー・セット13:
配列番号:26 5′-GAGATGGGAA TCCATATGCT GTATGTGAT- 3′
(68℃)
配列番号:27 5′-GGACACAGTG GCTTTTGACA GTTAATACA- 3′
(68℃)、
プライマー・セット14:
配列番号:28 5′-GATGGTCCAG CTGGACAAGC AGAAC- 3′
(70.7℃)
配列番号:29 5′-CCTAGTGTGC CCATTAACAG GTCTTC-3′
(69.3℃)、
プライマー・セット15:
配列番号:30 5′-GACACAGAAA ATGCTAGTGC TTATGCAGC- 3′
(69.1℃)
配列番号:31 5′-GGTGGACAAT CACCTGGATT TACTGCAAC- 3′
(70.3℃)、
プライマー・セット16:
配列番号:32 5′-CCTGATCTGT GCACGGAACT GAACACT- 3′
(70.5℃)
配列番号:33 5′-CCCAGTGTTA GTTAGTTTTT CCAATGTGTC TG- 3′
(69℃)、
プライマー・セット17:
配列番号:34 5′-TGCCTGCGGT GCCAGAAACC GTTGAAT- 3′
(71.8℃)
配列番号:35 5′-TGCTCGGTTG CAGCACGAAT GGCACT-3′
(71.9℃)、
プライマー・セット18:
配列番号:36 5′-GAGCCGAACC ACAACGTCAC ACAATGTT-3′
(70.4℃)
配列番号:37 5′-GGACACACAA AGGACAGGGT GTTCAGAAA- 3′
(70.3℃)、及び
プライマー・セット19:
配列番号:37 5′-GGACACACAA AGGACAGGGT GTTCAGAAA- 3′
(70.3℃)
配列番号:39 5′-GCGACTCAGA GGAAGAAAAC GATG-3′
(68℃)。
プライマー・セット20:
配列番号:40 5′-GAGATCGAGC TGGAGGATCC GTACG- 3′
(72.1℃)
配列番号:41 5′-AGCTGCAGCC CAAAGGTGTT GGACT- 3′
(70.7℃)、及び
プライマー・セット21:
配列番号:42 5′-TCAGCCGCGT CCACGCCGCG A- 3′
(75℃)
配列番号:43 5′-CCTGCGAGCG TAGGCGTCGG- 3′
(73.3℃)。
配列番号:42は、似通ったプライマーについて特許請求した範囲からわずかに外れており、効率よく「多重性」であるとはいえないけれども、ポリメラーゼ連鎖反応はそれを用いても可能である。
プライマー・セット22:
配列番号:44 5′-GAGATCGCCA CCTTCGGCAA- 3′
(68.2℃)
配列番号:45 5′-GAGCAGTTCG GTGGCGTTCA- 3′
(68.2℃)。
プライマー・セット23:
配列番号:63 5′-CCGGGAGATG GGGGAGGCTA ACTGA- 3′
(73.5℃)
配列番号:64 5′-GGGGTGGGGA AAAGGAAGAA ACGCG- 3′
(72.1℃)。
配列番号:6 5′-GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAAT-3′
(69.2℃)、及び
配列番号:7 5′-GTGCAGCAGC AGAACAATTT GCTGAGGG-3′
(71.6℃)。
最初に列挙したプローブは、HIV-I DNAの「gag 」領域中の核酸配列に相補的であり、二番目に列挙したプローブは、HIV-I DNAの「env 」領域中の核酸配列に相補的である。
配列番号:18 5′-GAGGAAAAGA AGTTCGGGGC AGAAGT-3′
(69.3℃)、及び
配列番号:19 5′-CAACAAGAAA TGTTGCGACT GACCGTCT-3′
(69.2℃)。
配列番号:8 5′-GGTGTCACCC CCAGAGTCCC CTGTACCCGC-3′
(78.1℃)、
配列番号:49 5′-GACACAGTGT CCTCCCGCTC CTCCTGAGCA-3′
(75.9℃)、
配列番号:50 5′-GTGGAAGGCG GCTCGCTGGA AGCCGGTCGT-3′
(78.1℃)、
配列番号:12 5′-GAACCGAGGG CCGGCTCACC TCTATGTTGG-3′
(75.9℃)、及び
配列番号:62 5′-GGTCATCGCC GTAGTAGATG CGTAAGGCCT-3′
(73.6℃)。
配列番号:51 5′-GGAACAACAT TAGAACAGCA ATACAACAAA CCG-3′
(68.9℃)、
配列番号:52 5′-AATATTGTAA CCTTTTGTTG CAAGTGTGAC TC- 3′
(66.8℃)、
配列番号:53 5′-CCTATAGGTG GTTTGCAACC AATTAAACAC-3′
(67.9℃)、
配列番号:54 5′-GAGGTATTTG AATTTGCATT TAAAGATTTA TTTGT-3′
(63.8℃)、
配列番号:55 5′-GCAAGACAGT ATTGGAACTT ACAGAGG- 3′
(68℃)、及び
配列番号:56 5′-GTGTTGTAAG TGTGAAGCCA GATTTGA- 3′
(66.7℃)。
配列番号:57 5′-GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG-3′
(75.9℃)及び
配列番号:58 5′-CTCGTCCAGC GCCGCTTCGG- 3′
(73.3℃)。
配列番号:59 5′-TGGATCTCGT TGTTCGGGTC- 3′
(66.5℃)及び
配列番号:60 5′-GACCAGATCG CTGCCACCGC GGCCATCTCC-3′
(78.1℃)。
配列番号:61 5′-GAGCAGATCG CTGCCACCGC CGGTATCTCC-3′
(77℃)。
ヘルペス・シンプレックス.ウイルス1(Herpes simplex virus 1)(HSV-1 )DNAのチミジンキナーゼ遺伝子の検出に有用な捕捉プローブとしては、以下のものが挙げられる。
配列番号:65 5′-AAAGACAGAA TAAAACGCAC GGGTGTTGGG TCG-3′
(70.2℃)。
本発明の特に有用な組成物は、本明細書に記載したプライマー、前記マグネシウム・コファクター、前記dATP、dCTP、dGTP及びdTTPをそれぞれ、ゼラチンもしくは同様の親水性コロイド物質(少なくとも5重量%の量で)、並びに10〜100 μモルの量で存在するアルカリ金属塩(例えば、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム)の緩衝化混合物である。
A)各々異なる標的DNAに対するプライマーのセットを選択すること、
〔ここで、
各セットのプライマーは、異なる標的DNAの反対鎖中の配列であり且つ互いに異なる標的DNAの反対鎖に沿ってヌクレオチド数90から 400個分ほど離れている核酸配列に対して特異的であり且つそれらとハイブリッド可能であるように選択され、
各プライマー・セット中の各プライマーは65℃〜74℃の範囲内のTm を有し、すべてのプライマーのTm 'sは互いに5℃の範囲内であり、そして各セット中のプライマーはヌクレオチド数が5個以下しか互いに異ならないヌクレオチド長さを有し、
Tm 'sは、次式を用いて計算される
Tm (℃)=67.5+0.34(%G+C)− 395/N
(上式中、G及びCは、それぞれ、グアニン及びシトシンヌクレオチドの数を表し、そしてNは、ヌクレオチドの総数を表す)〕、そして
B)段階A)で選択されたプライマーのセットを、
0.1〜50単位/溶液 100μLの量の熱安定性DNAポリメラーゼ、
2〜15μモルの量のDNAポリメラーゼ・コファクター、及び
0.25〜3.5 μモルの量で存在するdATP、dCTP、dGTP及びdTTP、
と混合すること、
(ここで、各プライマーが、少なくとも 0.075μモルの濃度で混合物中に存在する)
を含んでなる。
増幅及び検出しようとする核酸は通常二本鎖型であるので、プライミングを行う前に2つの鎖を分離(即ち、変性)せねばならない。変性は、熱処理のみを用いて、又は従来技術文献に記載されているようないずれかの適当な別の物理的、化学的もしくは酵素的手段と組み合わせて用いて達成される。一般的には、初期変性処理は、85〜100 ℃の第1温度で適当な時間、例えば、1秒間〜3分間、標的核酸を含有すると予測される被検体を加熱することにより実施される。
一旦、変性した鎖が第2温度に冷却されると、ポリメラーゼ連鎖反応試薬を含有する反応混合物はプライマー伸長生成物の形成を行うのに適する温度でインキュベーションされる。一般的には、この温度は、少なくとも50℃であり、好ましくは62〜75℃の範囲内である。インキュベーション時間は、インキュベーション温度及び所望の伸長生成物の長さに依存して広範に変化できるが、好ましい態様では、1〜120 秒間である。即ち、幾つかのポリメラーゼ連鎖反応処理工程は、プライミング用の第2温度及びプライマー伸長用の第3温度を利用する。好ましくは、本発明の実施に際して、プライミング及びプライマー伸長用の両方について同じ温度が用いられる。
そのようなポリメラーゼ連鎖反応に有用な装置の1つが、米国特許第 4,965,188号明細書及びEP-A-0 236 069に記載されている。一般的には、この装置は、反応混合物を含有する多数の反応管を保持するための熱伝導性容器、加熱、冷却及び温度維持手段、並びに増幅処理、温度変化及びタイミングを調節するためのシグナルを発生させる計算手段(computing means)を含む。使い捨て化学試験パック中で増幅反応を行う際の好ましい装置は、米国特許第 5,089,233号明細書に幾らか詳細に記載されている。
検出しようとする増幅された標的核酸については、反応媒体中の別の物質からそれを分離することが有用であることが多い。これは、水不溶性支持体に共有結合される捕捉プローブを有する捕捉試薬を用いることを包含する多数の方法のいずれかにより行われる。
捕捉プローブもしくは捕捉試薬を、平らな支持体、例えば、上記微孔質濾過膜上に、又は薄いポリマーフィルム、非コーティング紙もしくはポリマー・コーティング紙(それらの多くは当該技術分野で既知である)の上に固定化することによっても検出が実施できる。
サーマス・アクアティクス由来の組換えDNAポリメラーゼは、EP-A-0 482 714に記載された方法のような既知方法を用いて調製したものであり、 250,000単位/タンパク質1mgの活性を有した。
洗浄溶液(pH 7.4)は、リン酸ナトリウム,一塩基性一水和物(25μモル)、塩化ナトリウム( 373μモル)、(エチレンジニトリロ)四酢酸二ナトリウム塩( 2.5μモル)、エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム塩(25μモル)及びデシル硫酸ナトリウム(38μモル)を含有するものであった。
配列番号:8 5′-GGTGTCACCC CCAGAGTCCC CTGTACCCGC-3′
配列番号:9 5′-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C- 3′
また、hCMV DNAのアッセイの際にも対照として同じプローブを使用した。
対照捕捉試薬は、上記プローブを用いて同時に調製した。
アッセイ流体及び試薬がすべての捕捉試薬とほぼ同時に接触するように、すべての捕捉試薬を、WO-A-92/16659 に記載のように製造した試験デバイス中のヒートシール可能なポリエチレン/ポリエステルの積層体(コロナ放電処理した)の上に置いた。米国特許第 5,089,233号明細書に詳細に記載されている自動化コダック(Kodak)ポリメラーゼ連鎖反応処理装置を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を実施した。
配列番号:10 5′-TGCACTGCCA GGTGCTTCGG CTCAT- 3′
(72.1℃)、及び
配列番号:11 5′-CACCACGCAG CGGCCCTTGA TGTTT- 3′
(72.1℃)。
hCMV DNAについての捕捉試薬は、以下の捕捉プローブ(Tm )を用いて上記のように調製した。
配列番号:12 5′-GAACCGAGGG CCGGCTCACC TCTATGTTGG-3′
(75.8℃)。
実施例1 HIV-I DNAのプライマーを含有する緩衝化組成物
プライマーと更なるポリメラーゼ連鎖反応試薬とを混合させることにより、本発明の組成物の1つを調製した。この組成物は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩緩衝液(10μモル,pH8)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液(6.86μモル)、塩化カリウム(50μモル)、エチレンジアミン四酢酸( 686μモル)、塩化マグネシウム(10μモル)、ゼラチン( 100μg/mL)、dATP、dCTP、dGTP及びdTTP(各々 1.5μモル)、グリセロール( 9.5%)、プライマー(各々 0.4μモル)、上記DNAポリメラーゼ(48単位/ 300μL)、並びに上記DNAポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体(DNAポリメラーゼに対するモル比 50:1)を含有するものであった。包含されるプライマーは、HIV-I DNAの「gag 」領域中の核酸配列に特異的である配列番号:1及び配列番号:5と同定されるもの、並びにHIV-I DNAの「env 」領域中の核酸配列に特異的である配列番号:3及び配列番号:4と同定されるものであった。また組成物には、ヒトの血液試料を模倣するためにフェノール/クロロホルム精製CEM細胞(正常非感染リンパ球、2.75又は6μg/ 300μL)も含有させた。
この実施例は、組成物が更に配列番号:10及び配列番号:11と先に同定したプライマーを各々 0.4μモル含むことを除いて、HIV-I DNAと共にhCMV DNAを同時に検出するために実施例1に記載の組成物を用いた本発明の実施を具体的に示すものである。
試料a)hCMV DNA 20,000コピー及びHIV-I DNA 20,000コピー、
試料b)hCMV DNA 500コピー及びHIV-I DNA 500コピー、
試料c)hCMV DNA 100コピー及びHIV-I DNA 100コピー、
試料d)hCMV DNA 100コピー及びHIV-I DNA 20,000 コピー、
試料e)hCMV DNA 20,000コピー及びHIV-I DNA 100コピー、及び
試料f)hCMV DNA 100コピー及びHIV-I DNA 500コピー。
アッセイについての増幅及び検出方法は以下のとおりであった。
増幅:
95℃で60秒間加熱することにより変性し、
68℃で30秒間プライミング及び伸長し、そして94℃で15秒間加熱するサイクルを40回行った。
検出:
増幅した鎖を97℃で 120秒間変性し、
増幅した生成物を50℃で5分間捕捉試薬で捕捉し、
捕捉した生成物を40℃で1分間アビジン−ペルオキシダーゼ接合体溶液と接触及びインキュベーションし、
捕捉生成物を40℃で1分間洗浄溶液を用いて洗浄し、
色素提供性組成物を添加し、そして40℃で2分間インキュベーションし、そして
色素シグナルを読み取った。
本例は、実施例1の組成物(CEM細胞6μgのみ)を用いて試料a)〜f)中のHIV-I DNAの2つの核酸配列(「gag 」及び「env 」領域)のみの増幅及び検出について、実施例2と同様に実施した。
図7は、試料a)〜c)の各々についての2回の反復実験のポリメラーゼ連鎖反応プロセスの色素シグナル結果を示し、そして図8は、試料d)〜f)の各々についての反復実験のポリメラーゼ連鎖反応プロセスの色素シグナル結果を示す。HIV-I DNAの存在に関する明瞭なシグナルが得られた(「2」及び「3」と示される棒)。わずかなバックグラウンド・シグナルも認められた(各セットの棒グラフ中「1」と示される)。
プライマーと更なるポリメラーゼ連鎖反応試薬とを混合させることにより、本発明の別の組成物を調製した。この組成物は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩緩衝液(10μモル,pH8)、塩化カリウム(50μモル)、塩化マグネシウム(10μモル)、ゼラチン( 100μg/mL)、dATP、dCTP、dGTP及びdTTP(各々 1.5μモル)、グリセロール( 7.5%)、プライマー(各々 0.4μモル)、上記DNAポリメラーゼ(48単位/ 300μL)、並びに上記DNAポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体(DNAポリメラーゼに対するモル比 50:1)を含有するものであった。包含されるプライマーは、hCMV DNAの核酸配列に特異的である配列番号:10及び配列番号:11と同定されるものであった。また組成物には、ヒトの血液試料を模倣するためにフェノール/クロロホルム精製CEM細胞(正常非感染リンパ球、2.75又は6μg/ 300μL)も含有させた。
本例は、実施例4の組成物(CEM細胞 2.75μgのみ)を用いて試料a)〜f)中のhCMV DNA(「後期抗原(late antigen) 」領域のみ)の増幅及び検出について、実施例2と同様に実施した。
図9は、試料a)〜c)の各々についての2回の反復実験のポリメラーゼ連鎖反応プロセスの色素シグナル結果を示し、そして図10は、試料d)〜f)の各々についての反復実験のポリメラーゼ連鎖反応プロセスの色素シグナル結果を示す。hCMV DNAの存在に関する明瞭なシグナルが得られた(「1」と示される棒)。HIV-I DNA(「gag 」及び「env 」領域)の存在に由来するわずかなバックグラウンド・シグナルも認められた(各セットの棒グラフ中、それぞれ「2」及び「3」と示される)。
これらの利点は、各標的核酸についてのポリメラーゼ連鎖反応に「似通った」プライマーのセットを用いることにより達成される。「似通った」プライマーとは、実質的に同じである融解温度(Tm 's)、即ち、それらが5℃以下しか異ならない融解温度を有する各セット中のプライマーを意味する。更に、各セットの2つのプライマーのTm 'sは、65〜74℃の範囲内であり、そして各プライマーセットの2つのプライマーは、ヌクレオチド数が5個以下しか互いに異ならないヌクレオチド長さを有する。更に、増幅方法に使用されるすべてのプライマーセットのすべてのプライマーも、「似通った」ものである、即ち、それらがすべて5℃以下しか異ならないTm 'sを有し、そしてすべて65〜74℃の範囲内である。好ましい態様では、捕捉プローブもTm 値が似通っており、15℃以下しか異ならない。
Claims (2)
- 支持体の別個の領域に複数の捕捉試薬を配置せしめた水不溶性支持体を含む診断要素であって、
上記捕捉試薬の各々が、40〜55℃の温度で感染性物質と関連付けられる別個の標的DNAに対して特異的であり且つそれらとハイブリダイズしうる捕捉プローブを有し、上記捕捉プローブの各々が10〜40個のヌクレオチド及び50℃を越えるTmを有し、そしてすべての捕捉プローブのTmが15℃以下しか異ならないことを特徴とする前記診断要素。 - 前記捕捉プローブが、以下のオリゴヌクレオチド:
配列番号:51 5′-GGAACAACAT TAGAACAGCA ATACAACAAA CCG-3′、
配列番号:52 5′-AATATTGTAA CCTTTTGTTG CAAGTGTGAC TC-3′、
配列番号:53 5′-CCTATAGGTG GTTTGCAACC AATTAAACAC-3′、
配列番号:54 5′-GAGGTATTTG AATTTGCATT TAAAGATTTA TTTGT-3′、
配列番号:55 5′-GCAAGACAGT ATTGGAACTT ACAGAGG-3′、
配列番号:56 5′-GTGTTGTAAG TGTGAAGCCA GATTTGA-3′、
配列番号:57 5′-GAGCAGATTG CGGCCACCGC AGCGATTTCG-3′、及び
配列番号:65 5′-AAAGACAGAA TAAAACGCAC GGGTGTTGGG TCG-3′
から成る群から選ばれる、請求項1に記載の診断要素。
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WO1991002091A1 (en) * | 1989-08-10 | 1991-02-21 | Northwestern University | Method of identifying herpesviruses and oligonucleotides for use therein |
US5231015A (en) * | 1989-10-18 | 1993-07-27 | Eastman Kodak Company | Methods of extracting nucleic acids and pcr amplification without using a proteolytic enzyme |
WO1992004458A1 (en) * | 1990-09-11 | 1992-03-19 | The Brookdale Hospital Medical Center | Drug resistance screening method |
FR2667079B1 (fr) * | 1990-09-26 | 1993-08-13 | Genset Sa | Procedes, oligonucleotides amorces et oligonucleotides sondes pour la detection de bacteries pathogenes de la cavite buccale. |
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CA2075493A1 (en) * | 1990-12-20 | 1992-06-21 | Teresa K. H. Picone | Pcr primers for detection of legionella species and methods for controlling visual intensity in hybridization assays |
DE69206080T2 (de) * | 1991-03-21 | 1996-06-13 | Johnson & Johnson Clin Diag | Element und verfahren für nuklein-säure amplifikation und nachweis unter verwendung von adhärierten sonden. |
JPH0549477A (ja) * | 1991-08-05 | 1993-03-02 | Wakunaga Pharmaceut Co Ltd | スタフイロコツカス属細菌類の検出 |
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