KR20230085763A - 랄스토니아 시지키의 특이적 프라이머 세트 및 이를 이용한 랄스토니아 시지키의 검출방법 - Google Patents
랄스토니아 시지키의 특이적 프라이머 세트 및 이를 이용한 랄스토니아 시지키의 검출방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출용 프라이머 세트; 이를 포함하는 조성물; 이를 포함하는 키트; 및 이를 이용한 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출용 프라이머 세트; 이를 포함하는 조성물; 이를 포함하는 키트; 및 이를 이용한 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출 방법에 관한 것이다.
풋마름병(청고병, wilting)은 급격한 시들음(위조) 증상이 나타나는 병으로 식물 세균병원성 세균 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에 의해 발생한다. 풋마름병은 전 세계적으로 분포하는 토양병으로, 토마토, 감자, 고추, 가지, 담배 등 주요 가지과 작물을 포함한 200종 이상의 식물을 가해함으로써, 농업 및 원예 생산에 있어 심각한 경제적 손실을 일으킨다. 처음에는 생장점 부근의 잎이 시들고, 수일간은 야간과 비오는 날에 회복되다가 전신이 시들고, 결국에는 식물 전체가 파랗게 마른다. 줄기를 절단하거나 표피를 깍아보면 유관속이 갈변해 있으며, 줄기를 잘라 물에 띄우면 오백색의 세균액이 흘러내리는 것을 볼 수 있다. 고온다습한 환경의 포장에서 발병율이 증가하는 고온성병으로, 시설재배에서 많이 발생한다. 일단 발생하면 접촉 전염이 심하므로, 병에 걸린 포기는 모두 제거하고 온도와 습도를 낮춰주어야 한다. 하지만 이를 농가에서 실천하기에는 매우 어렵다.
일반적으로 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)은 자연상태에서 유전적 다양성이 높아 RSSC(Ralstonia solanacearum species complex)로 불린다. RSSC를 분류하는 기존의 몇 가지 분류체계를 거쳐, 현재는 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)(Phylotype IIa 및 IIb의 조합), 랄스토니아 슈도솔라나세아룸(Ralstonia pseudosolanacearum)(Phylotype I 및 III), 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)(Phylotype IV)의 3가지 종으로 나누는 분류체계를 따르고 있다.
문헌 Xiaoman She et al., "Identification and Genetic Characterization of Ralstonia solanacearum Species Complex Isolates from Cucurbita maxima in China" Frontiers in Plant Science, vol.8, October 2017에서는 서양 호박(Cucurbita maxima)으로부터 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) Phylotype I-IV 균주들을 검출하기 위한 일부 프라이머 세트를 개시하고 있다.
그러나 현행 기술은 풋마름병 원인 세균인 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)(Ralstonia solanacearum Phylotype IV)를 검체에서 직접 검출 시 유전적으로 가까우며 병징도 유사한 랄스토니아(Ralstonia) 속 세균도 같이 검출되어 진단하는 데 어려움이 있다.
병원성 미생물 진단을 위해 PCR, SYBR Green 또는 TaqMan 프로브를 이용한 real-time(실시간) PCR, LAMP(Loop Mediated Isothermal Amplification) 기술들이 개발되어 이용되고 있으며, 이 중 고효율(high-throughput) 진단 시스템으로 전환이 가능하고 신속 정확한 진단 결과를 얻을 수 있는 real-time PCR을 이용한 바이오마커 개발이 발전되어 왔다.
그러나 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 종에만 특이적이고 real-time PCR에 적합한 프라이머 세트에 대해서는 현재까지 공개된 바가 없다.
이에, 본 발명은 장미 풋마름병의 원인 세균인 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)(Ralstonia solanacearum Phylotype IV)를 고특이도 및 고민감도로 검출할 수 있고, real-time PCR에 적합하여 검체로부터 DNA 추출 없이 감염 여부 확인 및 직접 정량(밀도 측정)이 가능한 프라이머 세트를 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.
본 발명자들은 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) NCPPB3727의 유전체 정보(GenBank accession NZ_JACWNE010000002.1, 228797-229180, protein ID WP_172840133.1)의 가상(hypothetical) 단백질 유전자를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하였다.
이에, 상기 가상 단백질 유전자에 기초하여 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)에서 208bp 크기의 단편을 증폭시키는 신규의 프라이머 세트를 제작하고 이를 사용하여 여러 미생물 균주를 대상으로 PCR 및 real-time PCR 증폭 시험을 수행한 결과 상기 프라이머 세트가 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)에서만 특이적으로 증폭 산물을 생성함을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
이상에 기초하여, 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (i) 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 의심 시료에 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 DNA 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 (ii) DNA 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 의심 시료에 대해서 real-time PCR을 수행하는 단계; 및 상기 real-time PCR에 의한 유전자 증폭 결과를 분석하는 단계를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)를 특이적으로 우수한 효율로 단시간 내에 검출할 수 있다.
특히 본 발명에 따른 프라이머 세트는 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)에 대해 검출 민감도가 높아 시료의 양이 적은 경우에도 우수한 효율로 검출할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 real-time PCR은 검체로부터 DNA 추출과정 없이 직접적으로 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)의 감염 여부를 확인할 수 있고, 병원균 개체를 정량적으로 분석하여 해당 병원균의 검체 내 밀도를 확인할 수 있다.
도 1a 및 1b는 본 발명에 따른 프라이머 세트로 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 균주의 증폭되는 부위를 blast한 결과를 나타낸 것으로, 도 1a는 검색되는 모든 균주의 리스트를 나타낸 것이고 도 1b는 해당 균주의 매치되는 부위를 그림으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 프라미어 세트를 사용하여 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)를 포함한 여러 세균 균주의 게놈 DNA를 PCR 증폭시킨 후 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
M 레인은 크기 마커로서 1 kb DNA plus ladder(Gibco BRL)이고, 레인 1은 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 균주에 해당하고, 레인 2 내지 22는 다른 랄스토니아(Ralstonia) 종 균주 및 슈도모나스(Pseudomonas), 펙토박테리움(Pectobacterium), 딕케야(Dickeya), 판토에아(Pantoea), 잔토모나스(Xanthomonas) 속 균주에 해당하며(표 1 참조), 레인 23은 음성 대조군(증류수)이다. 구체적으로, 레인 2 내지 22는 다음과 같다: 레인 2: Ralstonia pseudosolanacearum; 레인 3: Ralstonia pseudosolanacearum; 레인 4: Ralstonia mannitolilytica; 레인 5: Ralstonia pickettii; 레인 6: Burkholderia gladioli; 레인 7: Pseudomonas syringae pv. tomato; 레인 8: Pseudomonas putida; 레인 9: Pseudomonas glycinea; 레인 10: Pseudomonas tabaci; 레인 11: Pseudomonas fluorescens; 레인 12: Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum; 레인 13: Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum; 레인 14: Pectobacterium carotovorum subsp. odoriferum; 레인 15: Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense; 레인 16: Pectobacterium wasabiae; 레인 17: Pectobacterium atrosepticum; 레인 18: Dickeya chrysanthemi; 레인 19: Pantoea agglomerans; 레인 20: Pantoea stewartii; 레인 21: Pantoea ananatis; 레인 22: Xanthomonas axonopodis.
도 3은 본 발명의 프라미어 세트를 사용하여 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)를 포함한 여러 세균 균주의 게놈 DNA를 real-time PCR 수행한 결과를 나타낸 것이다. 가장 위에서부터 증폭 그래프(상단), 용해 곡선 그래프(중간), 용해 피크 그래프(하단)를 나타낸다. 레인 1은 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 균주에 해당하고, 레인 2 내지 22는 다른 랄스토니아(Ralstonia) 종 균주 및 슈도모나스(Pseudomonas), 펙토박테리움(Pectobacterium), 딕케야(Dickeya), 판토에아(Pantoea), 잔토모나스(Xanthomonas) 속 균주에 해당하고(표 1 참조), 레인 23은 음성 대조군에 해당한다. 용해 피크 그래프(하단)는 약 85℃의 용해 온도(Tm)에서 증폭된 생성물을 나타낸 것이다.
도 4는 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)의 복제(cloned) DNA, 게놈 DNA 및 세포 현탁액 각각의 10배 연속 희석액의 real-time PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. 표준 곡선은 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) TS3175 표준 희석액의 Ct(threshold cycle)(또는 "교차점(crossing point)라고도 함)에서 생성되었다. 모든 곡선은 R2>0.99를 나타내었다. (A)는 복제 DNA, (B)는 게놈 DNA, (C)는 세균 세포 현탁액에 해당한다.
도 5는 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) TS3175를 토마토 뿌리 시료에 접종 후 본 발명의 프라미어 세트를 사용하여 real-time PCR 기법으로 근권(rhizosphere) 내 해당 병원균의 검출 여부 및 밀도 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 프라미어 세트를 사용하여 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)를 포함한 여러 세균 균주의 게놈 DNA를 PCR 증폭시킨 후 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
M 레인은 크기 마커로서 1 kb DNA plus ladder(Gibco BRL)이고, 레인 1은 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 균주에 해당하고, 레인 2 내지 22는 다른 랄스토니아(Ralstonia) 종 균주 및 슈도모나스(Pseudomonas), 펙토박테리움(Pectobacterium), 딕케야(Dickeya), 판토에아(Pantoea), 잔토모나스(Xanthomonas) 속 균주에 해당하며(표 1 참조), 레인 23은 음성 대조군(증류수)이다. 구체적으로, 레인 2 내지 22는 다음과 같다: 레인 2: Ralstonia pseudosolanacearum; 레인 3: Ralstonia pseudosolanacearum; 레인 4: Ralstonia mannitolilytica; 레인 5: Ralstonia pickettii; 레인 6: Burkholderia gladioli; 레인 7: Pseudomonas syringae pv. tomato; 레인 8: Pseudomonas putida; 레인 9: Pseudomonas glycinea; 레인 10: Pseudomonas tabaci; 레인 11: Pseudomonas fluorescens; 레인 12: Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum; 레인 13: Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum; 레인 14: Pectobacterium carotovorum subsp. odoriferum; 레인 15: Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense; 레인 16: Pectobacterium wasabiae; 레인 17: Pectobacterium atrosepticum; 레인 18: Dickeya chrysanthemi; 레인 19: Pantoea agglomerans; 레인 20: Pantoea stewartii; 레인 21: Pantoea ananatis; 레인 22: Xanthomonas axonopodis.
도 3은 본 발명의 프라미어 세트를 사용하여 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)를 포함한 여러 세균 균주의 게놈 DNA를 real-time PCR 수행한 결과를 나타낸 것이다. 가장 위에서부터 증폭 그래프(상단), 용해 곡선 그래프(중간), 용해 피크 그래프(하단)를 나타낸다. 레인 1은 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 균주에 해당하고, 레인 2 내지 22는 다른 랄스토니아(Ralstonia) 종 균주 및 슈도모나스(Pseudomonas), 펙토박테리움(Pectobacterium), 딕케야(Dickeya), 판토에아(Pantoea), 잔토모나스(Xanthomonas) 속 균주에 해당하고(표 1 참조), 레인 23은 음성 대조군에 해당한다. 용해 피크 그래프(하단)는 약 85℃의 용해 온도(Tm)에서 증폭된 생성물을 나타낸 것이다.
도 4는 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)의 복제(cloned) DNA, 게놈 DNA 및 세포 현탁액 각각의 10배 연속 희석액의 real-time PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. 표준 곡선은 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) TS3175 표준 희석액의 Ct(threshold cycle)(또는 "교차점(crossing point)라고도 함)에서 생성되었다. 모든 곡선은 R2>0.99를 나타내었다. (A)는 복제 DNA, (B)는 게놈 DNA, (C)는 세균 세포 현탁액에 해당한다.
도 5는 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) TS3175를 토마토 뿌리 시료에 접종 후 본 발명의 프라미어 세트를 사용하여 real-time PCR 기법으로 근권(rhizosphere) 내 해당 병원균의 검출 여부 및 밀도 변화를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) NCPPB3727의 유전체 정보(GenBank accession NZ_JACWNE010000002.1, 228797-229180, protein ID WP_172840133.1)의 가상(hypothetical) 단백질 유전자를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하였다.
이에, 상기 가상 단백질 유전자에 기초하여 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)에서 208bp 크기의 단편을 증폭시키는 신규의 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머 세트의 염기서열은 아래와 같다.
● RS02500-208F : 5'-GGA ATC CGC GCC TAA ACA ACT T-3' (22mer, 서열번호 1)
● RS02500-208R : 5'-CAA TGC GCT CGG GTC AAA ATC-3' (21mer, 서열번호 2)
본 발명자들은 상기 프라이머 세트를 사용하여 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)를 포함하여 다른 랄스토니아(Ralstonia) 종 및 슈도모나스(Pseudomonas), 펙토박테리움(Pectobacterium), 딕케야(Dickeya), 판토에아(Pantoea), 잔토모나스(Xanthomonas) 속 등을 포함한 여러 미생물 균주를 대상으로 PCR 및 real-time PCR 증폭 시험을 수행한 결과 상기 프라이머 세트가 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)에서만 특이적으로 증폭 산물을 생성함을 확인하였다.
이에, 일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 RS02500-208F 프라이머는 정방향(forward) 프라이머이고, 상기 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 RS02500-208R 프라이머는 역방향(reverse) 프라이머이다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 DNA 증폭시 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 외의 다른 세균은 증폭되지 않으며, 약 208bp의 밴드(band)가 뚜렷하게 검출되므로 정확하고 용이한 검출이 가능하다.
본 명세서에 있어서 용어 "프라이머(primer)"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열에 대하여 1개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기서열도 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 포함할 수 있다. 즉, 염기서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡핑화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트의 염기서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머 세트는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol.68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국특허 제4,458,066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열-기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사-기반 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 레플리카제(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 가능하다.
이 중에서, "중합효소 연쇄반응(PCR)"이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 본 발명의 PCR은 일반(비정량) PCR 및 정량 PCR을 포괄하는 것으로서, 예를 들어, 일반 PCR, real-time PCR을 포함한다. PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, real-time PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있다.
Real-time PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다. PCR 생산물의 증가가 표적 주형(template)의 초기 양과 비례하는 지수(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값(threshold cycle)을 가지게 된다. PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 cycle 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준 시료를 사용하여 real-time PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 PCR에 사용되는 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 real-time PCR에 사용되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭 반응을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 증폭 반응 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 형광 측정, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출용 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 PCR용 키트일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 키트는 real-time PCR용 키트일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 프라이머 세트 외에 핵산 추출, 증폭 및 생성물 검출용 시약과 이에 대한 지시사항을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 핵산 추출용 시약, 데옥시뉴클레오티드, 핵산 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정 핵산 중합효소, 완충액(버퍼) 및 dNTP 등이 포함될 수 있다. 상기 프라이머 세트 및 핵산 추출, 증폭 및 생성물 검출용 시약은 동결 건조된 상태로 플라스틱 튜브에 담아 제공될 수 있으며, 상기 핵산은 바람직하게 DNA일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, (i) 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)) 감염 의심 시료에 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 DNA 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 (ii) DNA 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출 방법에 관한 것이다.
상기 (i) 단계의 시료는 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염이 의심되는 것은 모두 포함될 수 있으며, 예컨대 이들 병균 자체, 또는 이들 병균이 감염된 것으로 예상되는 식물체의 잎, 가지, 줄기, 뿌리, 꽃 등일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (i) 단계의 DNA 증폭 반응은 real-time PCR일 수 있다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 real-time PCR에 적합하여, 검체로부터 DNA 추출과정 없이 직접적으로 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)의 감염 여부를 확인할 수 있고, 병원균 개체를 정량적으로 분석하여 해당 병원균의 검체 내 밀도를 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (i) 단계에 있어서, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다.
일 구현예에서, 상기 (i) 단계에 있어서, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 경우, DNA 증폭 반응은 PCR에 의해 수행될 수 있다. PCR 반응은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 가지 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다.
상기 (ii) 단계의 DNA 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정에 의해 수행될 수 있으며, 이를 통해 표적 유전자의 증폭 여부를 확인할 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (ii) 단계의 DNA 증폭 산물의 검출은 전기영동에 의해 수행될 수 있으며, 이때 표적 유전자의 증폭 여부는 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)의 가상 단백질 유전자의 208bp 크기의 단편의 증폭 여부를 통해 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 의심 시료에 대해서 real-time PCR을 수행하는 단계; 및 상기 real-time PCR에 의한 유전자 증폭 결과를 분석하는 단계를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 진단 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 진단 방법은 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 의심 시료로부터 게놈 DNA의 분리 과정 없이 시료 자체에 real-time PCR이 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 real-time PCR 진단 방법은 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 의심 시료로부터 DNA 추출과정 없이 시료에서 직접적으로 해당 균의 검출이 가능하다. 또한 상기 real-time PCR 진단 방법은 검체로부터 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 개체를 정량적으로 분석하여 해당 병원균의 검체 내 밀도를 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 세균 균주 배양 및 총 DNA 추출
(1) 세균 균주 및 배양 조건
본 발명에서 사용된 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)를 포함한 기타 미생물은 벨기에의 the Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms(BCCMTM)와 Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea(KACC)에서 분양 받았으며, 이들의 출처는 표 1에 정리하였다. 랄스토니아(Ralstonia), 슈도모나스(Pseudomonas), 펙토박테리움(Pectobacterium), 딕케야(Dickeya), 판토에아(Pantoea), 잔토모나스(Xanthomonas) 균주들은 TSA배지로 27℃에서 각각 이틀 배양하였다.
[표 1] PCR 특이도(specificity) 시험에 사용된 세균 균주
KACC: Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea
LMG: The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms(BCCMTM), Belgium
a Superscript "T" indicates type strain.
b N.D., Not determined.
(2) 총 DNA의 추출
배양된 균주의 총 DNA는 Promega (Madison, USA)사의 게놈 DNA 추출 키트(Wizard® Genomic DNA Purification Kit)를 이용하여 추출하였다.
실시예 2: 특이 프라이머 세트 제작
(1) 특이 염기서열 정보 탐색을 위한 blastn 프로그램 이용 분석
랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) NCPPB3727의 유전체 정보(GenBank accession NZ_JACWNE010000002.1, 228797-229180, protein ID WP_172840133.1)의 가상(hypothetical) 단백질 유전자를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하였다(도 1).
도 1a 및 1b는 본 발명에 따른 프라이머 세트로 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 균주의 증폭되는 부위를 blast한 결과를 나타낸 것으로, 도 1a는 검색되는 모든 균주의 리스트를 나타낸 것이고, 도 1b는 해당 균주의 매치되는 부위를 그림으로 나타낸 것으로, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 유전체에서만 대부분의 유전자 서열에서 높은 유사도(붉은 막대)로 나타났으며, 이외의 랄스토니아 종은 유사성이 낮게 나타나는 것(녹색 막대)을 확인할 수 있었다.
(2) 특이 프라이머 제작
랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)에서 208bp 크기의 단편을 증폭하는 RS02500-208F와 RS02500-208R 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
● RS02500-208F : 5'- GGA ATC CGC GCC TAA ACA ACT T-3' (22mer, 서열번호 1)
● RS02500-208R : 5'-CAA TGC GCT CGG GTC AAA ATC-3' (21mer, 서열번호 2)
실시예 3: PCR 증폭 반응
PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermocycler(MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 1X reaction buffer, dNTP 각각 0.2 mM, RS02500-208F/R 프라이머 각각 10 pM, GoTaq® Flexi DNA 중합효소 1.25 unit (Promega Madison, WI, USA)을 함유하는 PCR 혼합액으로 총 25 μl의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 몇몇 미생물의 게놈 DNA 양은 약 25 ng이었다. 반응은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 60초, 63℃ 60초, 72℃ 60초로 35회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 증폭반응 후 10 μl의 PCR 산물을 LoadingStar 염색약(DYNEBIO, Republic of Korea)으로 착색시켜 1.5% 농도의 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기영동한 후 UV transilluminator에서 증폭된 DNA 밴드(band)를 확인하였다. 전기영동 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 레인 1은 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 균주에 해당하고, 레인 2 내지 22는 다른 랄스토니아(Ralstonia) 종 균주 및 슈도모나스(Pseudomonas), 펙토박테리움(Pectobacterium), 딕케야(Dickeya), 판토에아(Pantoea), 잔토모나스(Xanthomonas) 속 균주에 해당하고(표 1 참조), 레인 23은 음성 대조군에 해당한다. 도 2의 레인 1에 나타난 바와 같이, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)에서만 208bp 크기의 핵산 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 그 외 레인 2 내지 23에서는 어떠한 밴드도 관찰되지 않았다.
이와 같이 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트는 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)만 특이적으로 증폭시키고, 랄스토니아 시지키와 유전적으로 가까우며 병징도 유사한 Ralstonia pseudosolanacearum, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia pickettii 등 다른 랄스토니아(Ralstonia) 종은 증폭시키지 않음을 알 수 있었다. 또한 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트는 슈도모나스(Pseudomonas), 펙토박테리움(Pectobacterium), 딕케야(Dickeya), 판토에아(Pantoea), 잔토모나스(Xanthomonas) 속 균주도 증폭시키지 않았다. 따라서 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트는 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 종에만 특이적임을 알 수 있다.
실시예 4: Real-time PCR 특이성 분석
Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system(Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 TB greenTM Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus, 2X) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 RS02500-208F/R 프라이머 각각 5 pM을 함유하는 real-time PCR 혼합액으로 총 20 μl의 양으로 수행하였다.
Real-time PCR 혼합액에 첨가한 미생물의 게놈 DNA 양은 약 5 ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 63℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 용해 곡선(melting curve)과 용해 피크(melting peak)를 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다. Real-time PCR 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 가장 위에서부터 증폭 그래프(상단), 용해 곡선 그래프(중간), 용해 피크 그래프(하단)를 나타내며, 레인 1은 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 균주에 해당하고, 레인 2 내지 22는 다른 랄스토니아(Ralstonia) 종 균주 및 슈도모나스(Pseudomonas), 펙토박테리움(Pectobacterium), 딕케야(Dickeya), 판토에아(Pantoea), 잔토모나스(Xanthomonas) 속 균주에 해당하고(표 1 참조), 레인 23은 음성 대조군에 해당한다.
용해 피크 그래프(하단)는 약 85℃의 용해 온도(Tm)에서 증폭된 생성물을 나타낸 것이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 균주에서만 증폭 반응이 일어났고, 특정 온도(85℃)에서 용해 피크를 확인할 수 있었다.
실시예 5: Real-time PCR 민감도 분석
Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 Real-time PCR system(Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 RS02500-208F/R 프라이머 각각 5 pM을 함유하는 real-time PCR 혼합액으로 총 20 μl의 양으로 수행하였다. 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) TS3175 게놈 DNA는 5 ng에서부터 10배씩 희석하였고, 복제(cloned) DNA 양은 100 pg에서부터 10배씩 희석하였다. 그리고 미생물 현탁액은 O.D.600에서 0.1이 되게 맞춘 후 10배씩 희석하여 real-time PCR 혼합액에 첨가하였다. Real-time PCR 증폭반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 65℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 용해 곡선 및 용해 피크를 위해 65~95℃까지 5초마다 0.5℃씩 증가시켰다. Real-time PCR 민감도 분석 결과를 도 4 및 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2] Real-time PCR 분석으로 측정된 랄스토니아 시지키(
Ralstonia syzygii
) TS3175의 복제(cloned) DNA, 게놈 DNA 및 세포 현탁액의 10배 연속 희석액의 평균 Ct 종말점 형광
도 4의 표준 곡선(standard curve)은 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) TS3175 표준 희석액의 Ct(threshold cycle)(또는 "교차점(crossing point)"이라고도 함)에서 생성되었다. 모든 곡선은 R2>0.99를 나타내었다. 도 4의 표준 곡선의 R2값과 E값이 적정범위에 있는 것으로 보아 유효한 데이터로 판명할 수 있다. 도 4 및 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 복제 DNA의 경우에는 100 ag에서도, 게놈 DNA의 경우에는 500 fg에서도, 세균 세포 현탁액의 경우에는 O.D.600 = 0.0001에서도 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)를 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다
위 결과로부터, 본 발명의 RS02500-208F/R 프라이머 세트는 real-time PCR에서 고민감도로 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)를 검출할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6: 토마토 뿌리 시료를 이용한 real-time PCR 증폭
토마토 뿌리 시료에 대하여 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) TS3175의 접종 후 시간별 real-time PCR을 이용한 정량분석을 위하여, 감수성 품종인 머니메이커(Moneymaker)를 온실에서 재배하였다. 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) TS3175는 TSB배지에서 2일 동안 27℃에서 진탕배양하였고, O.D.600값 1.0에 맞추어 각각 5 ㎖씩 접종하였다. 접종 전 0 일차를 포함하여 4일차, 7일차, 10일차 간격으로 각 품종별로 뿌리를 채취하였다. 전처리로 뿌리에 붙어있는 토양을 최대한 제거한 후 50 ㎖ tube에 옮겨 담고 멸균수 30 ㎖을 첨가하여 voltexer를 이용하여 강하게 현탁하였으며, 10분간 침지시킨 후 현탁액을 사용하였다. 현탁액 1 ml을 1.5 ml 튜브에 담고 13,000 rpm으로 10분간 원심분리 한 다음 아래에 수집된 펠렛을 이용하여 MPbio (OH, USA)사의 Fast DNA® spin kit for soil을 이용하여 총 DNA를 추출한 후 real-time PCR을 실시하였다.
Real-time PCR 증폭반응은 CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR Premix Ex Taq (2x), RS02500-208F/R 프라이머 각각 5 pM을 함유하는 SYBR-Green PCR 혼합액으로 총 20 μl의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 토마토 뿌리 시료의 총 DNA 양은 약 5 ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 63℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 65℃에서부터 0.5℃씩 간격으로 5초간 반응 후 증가시키면서 95℃까지 반응시키면서 용해 커브와 용해 피크를 실시하였다. 그 결과 병든 토마토 뿌리 샘플 모두에서 특이 커브 및 특이 피크를 각각 확인하였고, 근권(rhizosphere) 내 해당 병원균의 검출 여부 및 밀도 변화를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) TS3175 접종 전에는 검출되지 않았다가 접종 4일째 Ct 값(threshold cycle)이 약 26.98로 검출된 후 7일째까지 유지되다가 10일째에 Ct 값이 약 25.43으로 증가되는 것을 확인하였다.
결론적으로, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)의 가상(hypothetical) 단백질 유전자의 특이 DNA 단편으로부터 제작된 RS02500-208F/R 프라이머는 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)의 특이적인 검출을 위한 PCR 프라이머 또는 real-time PCR 프라이머로 이용이 가능하다는 것을 알 수 있으며, 토마토 근권 내 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii)의 정성, 정량분석과 밀도변화의 모니터링에 적용 가능하다는 것이 확인되었다.
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<223> RS02500-208R reverse primer
<400> 2
caatgcgctc gggtcaaaat c 21
Claims (15)
- 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 프라이머 세트가 중합효소 연쇄반응(PCR)에 사용되는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 프라이머 세트가 real-time(실시간) PCR에 사용되는 것인, 프라이머 세트.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출용 키트.
- 제5항에 있어서, 키트가 PCR(중합효소 연쇄반응)용인, 키트.
- 제5항에 있어서, 키트가 real-time PCR용인, 키트.
- (i) 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 의심 시료에 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 DNA 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
(ii) DNA 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는,
랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 검출 방법. - 제8항에 있어서, (i) 단계의 DNA 증폭 반응이 real-time PCR인, 방법.
- 제8항에 있어서, (i) 단계에 있어서 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서, (i) 단계의 DNA 증폭 반응이 PCR인, 방법.
- 제8항에 있어서, (ii) 단계의 DNA 증폭 산물의 검출이 전기영동에 의해 수행되는, 방법.
- 제12항에 있어서, 표적 유전자의 증폭 여부는 208bp 크기의 단편의 증폭 여부를 통해 확인하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 의심 시료에 대해서 real-time PCR을 수행하는 단계; 및 상기 real-time PCR에 의한 유전자 증폭 결과를 분석하는 단계를 포함하는, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 진단 방법.
- 제14항에 있어서, 랄스토니아 시지키(Ralstonia syzygii) 감염 의심 시료로부터 게놈 DNA의 분리 과정 없이 시료 자체에 real-time PCR이 수행되는, 방법.
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| GRNT | Written decision to grant |