JPS61257200A - 核酸ハイブリダイゼ−シヨンによるヒト口腔細胞の検出 - Google Patents
核酸ハイブリダイゼ−シヨンによるヒト口腔細胞の検出Info
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- JPS61257200A JPS61257200A JP4513286A JP4513286A JPS61257200A JP S61257200 A JPS61257200 A JP S61257200A JP 4513286 A JP4513286 A JP 4513286A JP 4513286 A JP4513286 A JP 4513286A JP S61257200 A JPS61257200 A JP S61257200A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はヒトの歯の病気および症状を、微生物およびそ
れに伴なう細胞の検出番こより、診断することに関する
。
れに伴なう細胞の検出番こより、診断することに関する
。
歯の病気は米国および他の国において非常に多数の患者
がいる。おそらく、米国において４５００万人の成人が
破壊的な歯周の病気にかかっており、そしておそらく１
００万人の子供が、若年性歯周炎に罹患している。米国
の人口の９５％が一生のある時点で虫歯にかかると推定
される。これらの病気および症状の存在を迅速かつ効果
的に歯科医が発見して治療の助けとし、あるいは指標と
するための診断手段の必要性が大である。この必要性は
、より特別な処置を必要とする若年性歯周炎および虫歯
に関して特に大きい。
がいる。おそらく、米国において４５００万人の成人が
破壊的な歯周の病気にかかっており、そしておそらく１
００万人の子供が、若年性歯周炎に罹患している。米国
の人口の９５％が一生のある時点で虫歯にかかると推定
される。これらの病気および症状の存在を迅速かつ効果
的に歯科医が発見して治療の助けとし、あるいは指標と
するための診断手段の必要性が大である。この必要性は
、より特別な処置を必要とする若年性歯周炎および虫歯
に関して特に大きい。
（従来技術）
近年間らかにされたところでは、異なる症状の歯周の病
気は、夫々特定の微生物学的病因を有する。アクチノバ
チルス アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏ
ｂａｃｉＬｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｇｔａｔｎｃｏ
−ｍｉｔａｎｓ）は、若年性歯周炎の原因因子である
ことがはっきりと証明されている〔Ｊ、スロック（Ｆｌ
ｌｏｔｓ）ら、Ｉｎｆｇｃｔ、 Ｉｒｎｒｎｓｎ、
２９ ： ｌ ０１３−１０２０．１９８０；マンデル
ＣＭａｎｄｍｌＬ）およびツクランスキー（Ｊｏｅｒａ
ｎａｋｙ）、Ｊ、Ｐｇデ１ｏｄｏ−％ｇ、５２：５９３
−５９８．１９８１））。アクチノバチルス アクチノ
マイセテムコミタンス、ノイクテロイデス ギンギバリ
スＣＢａｃｔａｒｏｉｄａａｇｉ％ｇｉｖａｌ ｉｓ
）ｓ バクテロイデス インテルメジウスＣＢａｃｔ
ｅｒｏｉｄｇｓ ｉｎｔｇｒｒｎｅｄｉｕｓ）、フシバ
クテリウム ヌクレアツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｇｒｉｕ
ｍｎｕｃ１ｇαｔ ｕｓ ）、カブノントファガ オク
ラセアＣＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃ
ｇａ）、セレノモナススプチゲナ（Ｓｇｌｇｎｏｍｏｎ
ａｓ ｓｐｗｔｉｇｇｎａ）、 エイケネラ コロデン
ス（ＥｉｋｇｔｔａｌＬａ ｃｏｒｒｏｄｇ％ｇ）、ウ
オリネラ レクタ（ＷｏｌｉｎｇｌＬａ ｒｅｃｔａ）
、スピロヘータ類、および紡錘状バクテロイデスは、成
人の歯周の病気に伴い、その原因に関係する〔タナ−（
Ｔａｎｎｅｒ） ら、 Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｐｇｒｉｏｄｏ
ｎｔ、６ ：２７８−３０７．１９７９；ジンクＣＤｚ
ｉｎｋ）ら、Ｊ、 Ｃ１１ｎ、 Ｐ＃ｒｉｏｄｏｘｔ、
９ ： １９８５ 〕。さらに、リューコサイト（白
血球細胞）が、歯周の病気にかかった患者の歯周のポケ
ット中に存在することも知られている〔リストガルテン
ＣＬｉｓｔｇａｒｔｇ％〕およびヘルテン（ＲｇＨｄｇ
ｆｉ）、Ｊ、 ＣＬｉｎ、 Ｐａｒｉｏ−ｄｏｎｔ、
５ ： １１５．１９７９；ケイニス（Ｋｅｙａｓ）お
よびラムス（Ｒａｍｓ）、ＪＡＤＡ １０６二８０３
．１９８３）。唾液サンプル中のストレプトコッカス
ミュータンスＣ３ｔｒｍｐｔｏｃｏａｃｓｓ ｒｎｕｔ
ａｓｓ）の存在数の増加は、虫歯の可能性を示唆するも
のである〔Ｗ、Ｌ、ｏ−チェ（Ｌａｅｃｈｓ ）ら、Ｉ
ＴＬｆｅｃｔ。
気は、夫々特定の微生物学的病因を有する。アクチノバ
チルス アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏ
ｂａｃｉＬｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｇｔａｔｎｃｏ
−ｍｉｔａｎｓ）は、若年性歯周炎の原因因子である
ことがはっきりと証明されている〔Ｊ、スロック（Ｆｌ
ｌｏｔｓ）ら、Ｉｎｆｇｃｔ、 Ｉｒｎｒｎｓｎ、
２９ ： ｌ ０１３−１０２０．１９８０；マンデル
ＣＭａｎｄｍｌＬ）およびツクランスキー（Ｊｏｅｒａ
ｎａｋｙ）、Ｊ、Ｐｇデ１ｏｄｏ−％ｇ、５２：５９３
−５９８．１９８１））。アクチノバチルス アクチノ
マイセテムコミタンス、ノイクテロイデス ギンギバリ
スＣＢａｃｔａｒｏｉｄａａｇｉ％ｇｉｖａｌ ｉｓ
）ｓ バクテロイデス インテルメジウスＣＢａｃｔ
ｅｒｏｉｄｇｓ ｉｎｔｇｒｒｎｅｄｉｕｓ）、フシバ
クテリウム ヌクレアツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｇｒｉｕ
ｍｎｕｃ１ｇαｔ ｕｓ ）、カブノントファガ オク
ラセアＣＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃ
ｇａ）、セレノモナススプチゲナ（Ｓｇｌｇｎｏｍｏｎ
ａｓ ｓｐｗｔｉｇｇｎａ）、 エイケネラ コロデン
ス（ＥｉｋｇｔｔａｌＬａ ｃｏｒｒｏｄｇ％ｇ）、ウ
オリネラ レクタ（ＷｏｌｉｎｇｌＬａ ｒｅｃｔａ）
、スピロヘータ類、および紡錘状バクテロイデスは、成
人の歯周の病気に伴い、その原因に関係する〔タナ−（
Ｔａｎｎｅｒ） ら、 Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｐｇｒｉｏｄｏ
ｎｔ、６ ：２７８−３０７．１９７９；ジンクＣＤｚ
ｉｎｋ）ら、Ｊ、 Ｃ１１ｎ、 Ｐ＃ｒｉｏｄｏｘｔ、
９ ： １９８５ 〕。さらに、リューコサイト（白
血球細胞）が、歯周の病気にかかった患者の歯周のポケ
ット中に存在することも知られている〔リストガルテン
ＣＬｉｓｔｇａｒｔｇ％〕およびヘルテン（ＲｇＨｄｇ
ｆｉ）、Ｊ、 ＣＬｉｎ、 Ｐａｒｉｏ−ｄｏｎｔ、
５ ： １１５．１９７９；ケイニス（Ｋｅｙａｓ）お
よびラムス（Ｒａｍｓ）、ＪＡＤＡ １０６二８０３
．１９８３）。唾液サンプル中のストレプトコッカス
ミュータンスＣ３ｔｒｍｐｔｏｃｏａｃｓｓ ｒｎｕｔ
ａｓｓ）の存在数の増加は、虫歯の可能性を示唆するも
のである〔Ｗ、Ｌ、ｏ−チェ（Ｌａｅｃｈｓ ）ら、Ｉ
ＴＬｆｅｃｔ。
ｈ胤１Ｌ？Ｌ、２１：８３０．１９７８）。
これらの医学的病変を診断する一つの試みは、歯周のポ
ケットのサンプルからバクテリアを培養し、そして分類
学的に同定して、原因微生物を同定することである。こ
の方法は労力の集中を必要とし、サンプルの生存性を保
つためにサンプルを迅速かつ正確に取扱う必要がある。
ケットのサンプルからバクテリアを培養し、そして分類
学的に同定して、原因微生物を同定することである。こ
の方法は労力の集中を必要とし、サンプルの生存性を保
つためにサンプルを迅速かつ正確に取扱う必要がある。
別法として、原因微生物に伴なうと考えられる酵素活性
の検出を用いろことも出来る。ポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体を用いる糧々の検定も用いられている
。例えば、エベルンール（Ｅｂａｒｓｏｌ ｅ ）（Ｄ
米国特許Ａ４．４５８．０１４号は、口腔中の特定の微
生物、特に黒色色素を持つバクテロイデスの血清学的同
定法全開示している。この方法は、死滅させたバクテロ
イド細胞を家兎のよ５な哺乳動物に注射し、その血清か
ら抗体を回収することによる、これらのバクテロイドに
対するポリクローナル抗体の製造も含んでいる。このポ
リクローナル抗体は、微生物検出のための診断手段に使
用される。
の検出を用いろことも出来る。ポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体を用いる糧々の検定も用いられている
。例えば、エベルンール（Ｅｂａｒｓｏｌ ｅ ）（Ｄ
米国特許Ａ４．４５８．０１４号は、口腔中の特定の微
生物、特に黒色色素を持つバクテロイデスの血清学的同
定法全開示している。この方法は、死滅させたバクテロ
イド細胞を家兎のよ５な哺乳動物に注射し、その血清か
ら抗体を回収することによる、これらのバクテロイドに
対するポリクローナル抗体の製造も含んでいる。このポ
リクローナル抗体は、微生物検出のための診断手段に使
用される。
（発明の構成）
一般に本発明は、サンプル中のＤＮＡｆｆ性させ、変性
したＤＮＡをハイブリッド形成条件下で目的細胞の変性
ＤＮＡと特異的にハイブリッドを形成しつるプローブＲ
ＮＡまたはＤ Ｎ Ａと接触させ、ハイブリッド複会体
をサンプル中の目的細胞の存在の指標として検出するこ
とよＶなる。ヒトの患者の口か、ら得たサンプル（例え
ば、唾液、歯周炎のポケットから得た歯肉下の歯垢サン
プルまたは歯肉上の歯垢サンプル）中の、ヒトの口腔医
学病変に滲なう微生物細胞またはヒト細胞を検出するこ
とに関する。
したＤＮＡをハイブリッド形成条件下で目的細胞の変性
ＤＮＡと特異的にハイブリッドを形成しつるプローブＲ
ＮＡまたはＤ Ｎ Ａと接触させ、ハイブリッド複会体
をサンプル中の目的細胞の存在の指標として検出するこ
とよＶなる。ヒトの患者の口か、ら得たサンプル（例え
ば、唾液、歯周炎のポケットから得た歯肉下の歯垢サン
プルまたは歯肉上の歯垢サンプル）中の、ヒトの口腔医
学病変に滲なう微生物細胞またはヒト細胞を検出するこ
とに関する。
本発明は、若年性歯周炎の原因因子であるアクチノバチ
ルス アクチノマイセテムコミタンス〔近年へモフイラ
ス アクチノマイセテムコミタンス（Ｒａｇｔｎｏｐｈ
ｉｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙａｇｔｇｔｎｃｏｔｎｉｔ
ａｎｓ）ｃｏｍｂ、ｎｏτ・に分類変えすることが提唱
されている（ボツッ（Ｐｏｔｔｓ）ら、Ｊ、Ｓｙｓｔｅ
ｍ、 Ｂａｃｔ。
ルス アクチノマイセテムコミタンス〔近年へモフイラ
ス アクチノマイセテムコミタンス（Ｒａｇｔｎｏｐｈ
ｉｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙａｇｔｇｔｎｃｏｔｎｉｔ
ａｎｓ）ｃｏｍｂ、ｎｏτ・に分類変えすることが提唱
されている（ボツッ（Ｐｏｔｔｓ）ら、Ｊ、Ｓｙｓｔｅ
ｍ、 Ｂａｃｔ。
３５：３３７．１９８５）および虫歯の可能性に関連す
るストレプトコッカス ミュータンスの検出のために特
に有用である。本発明は、ヒトの口腔内の医学病変に伴
なう他の微生物細胞およびヒト細胞の検出にも使用でき
る。
るストレプトコッカス ミュータンスの検出のために特
に有用である。本発明は、ヒトの口腔内の医学病変に伴
なう他の微生物細胞およびヒト細胞の検出にも使用でき
る。
本発明の方法は非常に高感度であり、サンプル中の１０
３個の細胞でさえも検出可能であり、さらに非常に特異
性が高く、検出すべき細胞ＤＮＡに対するサンプル中の
他の細胞ＤＮＡに対する又又ハイブリッド形成は０．１
％以下である。そのうえ、検出は迅速で１〜２日で結果
が判明する。
３個の細胞でさえも検出可能であり、さらに非常に特異
性が高く、検出すべき細胞ＤＮＡに対するサンプル中の
他の細胞ＤＮＡに対する又又ハイブリッド形成は０．１
％以下である。そのうえ、検出は迅速で１〜２日で結果
が判明する。
本発明の他の態様および利点は、以下の好ましい態様の
説明および特許請求の範囲により明らかにされる。
説明および特許請求の範囲により明らかにされる。
（好ましい態様〕
プローブＤＮＡまたはＲＮＡは、検出すべき細胞の全細
胞ＤＮＡの純化および標識（「ホールゲノム法」）；検
出すべき細胞のＤＮＡライブラリーからの特異配列プロ
ーブの単離；または特異配列ＲＮＡプローブの構成を含
めて任意の数穐の技術で作成できる。
胞ＤＮＡの純化および標識（「ホールゲノム法」）；検
出すべき細胞のＤＮＡライブラリーからの特異配列プロ
ーブの単離；または特異配列ＲＮＡプローブの構成を含
めて任意の数穐の技術で作成できる。
本発明者らは、検出すべき細胞の全ＤＮＡを標識して、
口腔病変関連細胞の検出のプローブとじて使用できるこ
とを見出した。そのようなプローブは、口腔サンプル中
の診断の鍵になる微生物であるＡ、アクチノマイセテム
コミタンスおよびＳ。
口腔病変関連細胞の検出のプローブとじて使用できるこ
とを見出した。そのようなプローブは、口腔サンプル中
の診断の鍵になる微生物であるＡ、アクチノマイセテム
コミタンスおよびＳ。
ミュータンスの存在を検出し５ることが見出され、さら
にバクテロイデス インテルメデイウン、バクテロイデ
ス ギンギバリス、フシバクテリウムヌクレアツム、エ
イケネラ コロデンス、ウオリネラ レクタおよびセレ
ノモナス スブチゲナの検出にも成功した。
にバクテロイデス インテルメデイウン、バクテロイデ
ス ギンギバリス、フシバクテリウムヌクレアツム、エ
イケネラ コロデンス、ウオリネラ レクタおよびセレ
ノモナス スブチゲナの検出にも成功した。
細胞の調製
全ゲノムプローブを調製する第一ステップは、全ゲノム
プローブを得るための微生物細胞またはヒト細胞の純粋
培養物の調製である。その細胞は検出すべき細胞と同一
種もしくは同一タイプである。
プローブを得るための微生物細胞またはヒト細胞の純粋
培養物の調製である。その細胞は検出すべき細胞と同一
種もしくは同一タイプである。
任意の所望細胞は、標準的側生物学的方法で口腔サンプ
ルから単離訃よび純化して、次いで培養可能である。さ
らに、目的とする成る褌の菌は広く入手可能であり、例
えばＡ、アクチン・マイセテムコミタンスＣＡＴＣＣｙ
１６２９５２２．２９５２３．２９５２４ ） ； Ｂ
、インテルメデイウス（ＡＴＣＣ４２５６１１）；Ｗ、
レクタ（ＡＴＣＣ／１６３３２３８）”。
ルから単離訃よび純化して、次いで培養可能である。さ
らに、目的とする成る褌の菌は広く入手可能であり、例
えばＡ、アクチン・マイセテムコミタンスＣＡＴＣＣｙ
１６２９５２２．２９５２３．２９５２４ ） ； Ｂ
、インテルメデイウス（ＡＴＣＣ４２５６１１）；Ｗ、
レクタ（ＡＴＣＣ／１６３３２３８）”。
Ｓ、ミュータンスＣＡＴＣＣ／１６２５１７５．２７３
５１．２７３５２）；Ｂ、ギンギバリスＣＡＴＣＣ／１
６３３２７７）；Ｆ、、ヌクレアツム（ＡＴＣＣ鷹２５
５８６）；およびＥ、コロデンスＣＡＴＣＣ／１６２３
８３４）である。
５１．２７３５２）；Ｂ、ギンギバリスＣＡＴＣＣ／１
６３３２７７）；Ｆ、、ヌクレアツム（ＡＴＣＣ鷹２５
５８６）；およびＥ、コロデンスＣＡＴＣＣ／１６２３
８３４）である。
次の珈はマサチュセツツ州、ボストンの７オルシス デ
ンタル センターＣＦｏｒｓｙｔｈ ＤｅｎｔａｌＣｅ
％ｔｅｒ）のアンネ タナ−（Ａ％％ＩＩ Ｔａｎｎｅ
ｔ ） 博士およびジオアン ジンク（ＪｏＡｎｎ
Ｄｇｉｎｋ）嬢から入手した：アクチノバチルス アク
チノマイセテムコタンス ストレインＹ４；バクテロイ
デスインテルメデイウス５８１；バクテロイデス ギン
ギバリス３８１；７ゾバクテリウム ヌクレアツム３６
４；エイテネラコロデンス３フ３；ウオリネラ レジタ
３フ１；カプノシトフアガ オクラセア６；セレノモナ
ス スプチゲナ１３０４；およびストレプトコッカス
ミュータンスＪＢＰ。
ンタル センターＣＦｏｒｓｙｔｈ ＤｅｎｔａｌＣｅ
％ｔｅｒ）のアンネ タナ−（Ａ％％ＩＩ Ｔａｎｎｅ
ｔ ） 博士およびジオアン ジンク（ＪｏＡｎｎ
Ｄｇｉｎｋ）嬢から入手した：アクチノバチルス アク
チノマイセテムコタンス ストレインＹ４；バクテロイ
デスインテルメデイウス５８１；バクテロイデス ギン
ギバリス３８１；７ゾバクテリウム ヌクレアツム３６
４；エイテネラコロデンス３フ３；ウオリネラ レジタ
３フ１；カプノシトフアガ オクラセア６；セレノモナ
ス スプチゲナ１３０４；およびストレプトコッカス
ミュータンスＪＢＰ。
これらの微生物は、報告された方法に従って培養しくジ
ンクら、Ｊ、 Ｃ１１ｔＬ、 Ｍｉｃｒｏ、 １９ ：
５９９．１９８４）、収穫して遠心により細胞ペレッ
トとし、凍結礼燥した。全細胞ＤＮＡは凍結乾燥細胞０
．１２から、次の方法により抽出した。細胞をＴＢＳバ
ック・ア（１０惧Ｍ トリス−ＢＯ２；１１００ｔｎ
ＮａＣ１； １ ｍｕ ＥＤＴＡ ％ｐＥ ８−０）
２０−に再懸濁させ、８０００ ｒｐｒｎ （５０００
Ｘｒ）で１０分間遠心し、上澄を捨てた。ペレットヲ次
いで２５ｔＸ、シュークロースｆ含ムＴ Ｂ Ｓバッフ
ァー１０７！に再懸濁させて細胞溶解させた。
ンクら、Ｊ、 Ｃ１１ｔＬ、 Ｍｉｃｒｏ、 １９ ：
５９９．１９８４）、収穫して遠心により細胞ペレッ
トとし、凍結礼燥した。全細胞ＤＮＡは凍結乾燥細胞０
．１２から、次の方法により抽出した。細胞をＴＢＳバ
ック・ア（１０惧Ｍ トリス−ＢＯ２；１１００ｔｎ
ＮａＣ１； １ ｍｕ ＥＤＴＡ ％ｐＥ ８−０）
２０−に再懸濁させ、８０００ ｒｐｒｎ （５０００
Ｘｒ）で１０分間遠心し、上澄を捨てた。ペレットヲ次
いで２５ｔＸ、シュークロースｆ含ムＴ Ｂ Ｓバッフ
ァー１０７！に再懸濁させて細胞溶解させた。
ダラム陽注菌（例えばＳ、ミュータンス）については、
Ｎ−アセチルムラミダーゼ（マイルス（Ｈｉｌｔｓ）ラ
ボラトリーズ社）５ｒｎ９全溶解混合物１０−に加えた
。ダラム陰性菌（例えば上記列挙の他の全てのもの）に
ついては、リゾチーム（シグマ（Ｓｉ ｇｔｎα）社）
５■を溶解混合物ｌＯ−に加えた。菌の分類が不明であ
る場合またはＢ、ギンギバリスのようなある種のダラム
陰性酌では、両方の酵素を加えてもよい。いずれの酵素
による処理も３７℃で３０分間行った。
Ｎ−アセチルムラミダーゼ（マイルス（Ｈｉｌｔｓ）ラ
ボラトリーズ社）５ｒｎ９全溶解混合物１０−に加えた
。ダラム陰性菌（例えば上記列挙の他の全てのもの）に
ついては、リゾチーム（シグマ（Ｓｉ ｇｔｎα）社）
５■を溶解混合物ｌＯ−に加えた。菌の分類が不明であ
る場合またはＢ、ギンギバリスのようなある種のダラム
陰性酌では、両方の酵素を加えてもよい。いずれの酵素
による処理も３７℃で３０分間行った。
このインキュベーションに続いて、２５％Ｗ／Ｖラウリ
ル硫酸ナトリウム０．８７！および０．５−のプロナー
ゼ（シグマ社）を添加し、混合物を７０℃で３０分間イ
ンキュベートした。次に混合物を氷冷し、過塩素酸ナト
リウム（５Ｍ）２．８７！を加えて十分混合し、氷上で
１５分間冷装した。冷やしたクロロホルム：イソアミル
アルコール（２４：ＩＶ／Ｖ）１５−を加えた。混合の
後、混合物を氷上で１５分間冷装した。混合物を６００
０７ｐｍ（２８００ｘｆ）で１０分間遠心した。水ｍｔ
広コロピペット取り出し、１２．０００７ｐｍ（１１，
２００ｘｆ）で１０分間遠心した。上澄を集めて氷上で
１５分分間中し、２倍量の９５％エタノールを加えた。
ル硫酸ナトリウム０．８７！および０．５−のプロナー
ゼ（シグマ社）を添加し、混合物を７０℃で３０分間イ
ンキュベートした。次に混合物を氷冷し、過塩素酸ナト
リウム（５Ｍ）２．８７！を加えて十分混合し、氷上で
１５分間冷装した。冷やしたクロロホルム：イソアミル
アルコール（２４：ＩＶ／Ｖ）１５−を加えた。混合の
後、混合物を氷上で１５分間冷装した。混合物を６００
０７ｐｍ（２８００ｘｆ）で１０分間遠心した。水ｍｔ
広コロピペット取り出し、１２．０００７ｐｍ（１１，
２００ｘｆ）で１０分間遠心した。上澄を集めて氷上で
１５分分間中し、２倍量の９５％エタノールを加えた。
氷上に３０分放置の後、混合物を８０００デｐ惰（５０
００Ｘｆ）で１５分間遠心し、上澄を捨てた。
００Ｘｆ）で１５分間遠心し、上澄を捨てた。
乾燥後、ペレットｆＴＥバッファー（１０ｍｕトリスＨ
ＣＬ、 １ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０）の１−に
再懸濁させた。１０ｍ９／ｍｔＥＮアーゼ５０μｔを加
工た（ＲＮアーゼはシグマ社から入手し、１０ｔｈＭ
）リス ｐＥ ？、５、ｌ ５ ｒｎＭ ＮａＣＬに溶
解して用いたが、１００℃で１５分間加熱し、徐々に冷
却し、少量ずつ分注して一２０℃に保存することにより
予め調製しておいた）。このＲＮプアー反応は３７℃で
１時間行った。
ＣＬ、 １ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０）の１−に
再懸濁させた。１０ｍ９／ｍｔＥＮアーゼ５０μｔを加
工た（ＲＮアーゼはシグマ社から入手し、１０ｔｈＭ
）リス ｐＥ ？、５、ｌ ５ ｒｎＭ ＮａＣＬに溶
解して用いたが、１００℃で１５分間加熱し、徐々に冷
却し、少量ずつ分注して一２０℃に保存することにより
予め調製しておいた）。このＲＮプアー反応は３７℃で
１時間行った。
ＲＮアーゼ処理に続いて、フェノール：クロロホルム：
イソアミルアルコール（４９：４９：１）で２〜３回抽
出を行ない、水層を回収した。２．５倍量の１００％エ
タノールを、Ｖ、倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，
５）とともに加えた。氷上に３０分放置した後、混合物
を８００ Ｏｒｐｍ（５０００ｘｆ）で１０分間遠心し
た。ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥さ
せ、ＴＥバッファー１−に再懸濁させた。ＤＮＡの濃度
を０Ｄ２ＩＳＯで測定した。
イソアミルアルコール（４９：４９：１）で２〜３回抽
出を行ない、水層を回収した。２．５倍量の１００％エ
タノールを、Ｖ、倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，
５）とともに加えた。氷上に３０分放置した後、混合物
を８００ Ｏｒｐｍ（５０００ｘｆ）で１０分間遠心し
た。ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥さ
せ、ＴＥバッファー１−に再懸濁させた。ＤＮＡの濃度
を０Ｄ２ＩＳＯで測定した。
ヒト白血球細胞は、脱繊維素処理した血球から、フィコ
ール−プラック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕａ） （
ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ ｉα）社）により、同
社の規定した方法で単離し、ＤＮＡｆメンツ・ヅ イン
エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｈｎｚｙｔ
ｎｏｌｏｇｙ）６５：４１０．１９８０に記載された方
法で単離した。
ール−プラック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕａ） （
ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ ｉα）社）により、同
社の規定した方法で単離し、ＤＮＡｆメンツ・ヅ イン
エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｈｎｚｙｔ
ｎｏｌｏｇｙ）６５：４１０．１９８０に記載された方
法で単離した。
全細胞ＤＮＡの調製物は、例えば以下に示すような各種
の標準方法を用いてニックトランスレーションによって
標識することができる。以下に記載する方法は、３２Ｐ
で標識したヌクレオチドをニックトランスレーション化
ＤＮＡ中に標識として取９込む。しかしながら、ニック
トランスレーション反応においては他の標識ヌクレオチ
ドもＤＮＡポリメラーゼＩの基質として用いることがで
きる。
の標準方法を用いてニックトランスレーションによって
標識することができる。以下に記載する方法は、３２Ｐ
で標識したヌクレオチドをニックトランスレーション化
ＤＮＡ中に標識として取９込む。しかしながら、ニック
トランスレーション反応においては他の標識ヌクレオチ
ドもＤＮＡポリメラーゼＩの基質として用いることがで
きる。
このような標識の例としては、ランガー（Ｌａｎ−１Ｈ
ｒ）らＣＰＮＡＳ ７８：６６３３．１９８１）の記
載によるｄＵＴＰのピオチン−標識類似体が、ある。ま
た、二重らせんの安定性や二重らせん形成の力学に実質
的に影響を及ぼすことなくＤＮＡポリメラーゼｌによっ
てポリヌクレオチド中に取り込まれ５る全ての分子（例
えば螢光標識したヌクレオチド）もこのような例に含ま
れる。
ｒ）らＣＰＮＡＳ ７８：６６３３．１９８１）の記
載によるｄＵＴＰのピオチン−標識類似体が、ある。ま
た、二重らせんの安定性や二重らせん形成の力学に実質
的に影響を及ぼすことなくＤＮＡポリメラーゼｌによっ
てポリヌクレオチド中に取り込まれ５る全ての分子（例
えば螢光標識したヌクレオチド）もこのような例に含ま
れる。
１０倍希釈緩衝液（０，５Ｍトリス−塩酸、ｐＨ７−２
； ０−ＩＡｆ ＭｇＳＯ４，１ｍＭ ジチオスレイト
ールおよび５００μ？／−ウシ血清アルブミン）５μｔ
：未標識デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ １０μＭお
よびｄＣＴＰ％ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各１００μＭ）４
μｔ；・α−３２Ｐ−ｄＡＴＰｃ２８００ｃｉ／惧ｍｏ
ｔ）３０μｔ； および蒸留水を加えて全量４８μｔと
した反応混合物中に上記で調製した細菌または白血球細
胞ＤＮＡ （上記した棟から得たもの）１〜２μｔを加
えた。この四合物を０℃に冷却し、ＤＮアーゼ（シグマ
社製二０．１μｆ／１ｄ）１μｔと大腸菌ＣＢ、 ｃｏ
ｌｉ） ＤＮＡポリメラーゼＩ（べ−リンガーマンハ
イム社製＝５単位／−〕１μｔを加えた。該反応物’ｉ
１６℃で１時間インキュベートし、０．５Ｍ ＥＤＴＡ
を２μを加えて反応を停止し、次いで蒸留水５０μｔを
加えた。標識ニックトランスレーション化ＤＮＡｆ１−
のシリンジ中でセファデックス（５ｔｒｐｈａｄｅｚ
） Ｇ ５０カラムを用いて遠心分離することによって
、取り込まれなかった標識物から分離した。
； ０−ＩＡｆ ＭｇＳＯ４，１ｍＭ ジチオスレイト
ールおよび５００μ？／−ウシ血清アルブミン）５μｔ
：未標識デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ １０μＭお
よびｄＣＴＰ％ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各１００μＭ）４
μｔ；・α−３２Ｐ−ｄＡＴＰｃ２８００ｃｉ／惧ｍｏ
ｔ）３０μｔ； および蒸留水を加えて全量４８μｔと
した反応混合物中に上記で調製した細菌または白血球細
胞ＤＮＡ （上記した棟から得たもの）１〜２μｔを加
えた。この四合物を０℃に冷却し、ＤＮアーゼ（シグマ
社製二０．１μｆ／１ｄ）１μｔと大腸菌ＣＢ、 ｃｏ
ｌｉ） ＤＮＡポリメラーゼＩ（べ−リンガーマンハ
イム社製＝５単位／−〕１μｔを加えた。該反応物’ｉ
１６℃で１時間インキュベートし、０．５Ｍ ＥＤＴＡ
を２μを加えて反応を停止し、次いで蒸留水５０μｔを
加えた。標識ニックトランスレーション化ＤＮＡｆ１−
のシリンジ中でセファデックス（５ｔｒｐｈａｄｅｚ
） Ｇ ５０カラムを用いて遠心分離することによって
、取り込まれなかった標識物から分離した。
一方、特定生物の全ＤＮＡ配列を表わすクローン化ＤＮ
Ａライブラリーを構築することによって核酸プローブを
調製することができる。ＤＮＡライブラリーを調製し、
核酸配列を標識する方法を以下に記載する。目的とする
生物または細胞と相同性を有し且つ他の口腔微生物また
は細胞と相同性を有しない個々の核酸配列は全て目的細
胞用に適したプローブたジうる。このような配列の多く
は、以下に述べる方法で調製されるライブラリーまたは
類似の方法で調製されるライブラリー中に存在している
と思われる。このような配列はいずれも例えば以下に述
べる分画ハイブリダイゼーション（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｉａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｔｏｎ）検定法によって
同定され、ＤＮＡライブラリーから単離することができ
る。かかる配列を単独でまたは組み合せて用いることが
でき、また全ライブラリーをプローブとして用いること
も可能である。
Ａライブラリーを構築することによって核酸プローブを
調製することができる。ＤＮＡライブラリーを調製し、
核酸配列を標識する方法を以下に記載する。目的とする
生物または細胞と相同性を有し且つ他の口腔微生物また
は細胞と相同性を有しない個々の核酸配列は全て目的細
胞用に適したプローブたジうる。このような配列の多く
は、以下に述べる方法で調製されるライブラリーまたは
類似の方法で調製されるライブラリー中に存在している
と思われる。このような配列はいずれも例えば以下に述
べる分画ハイブリダイゼーション（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｉａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｔｏｎ）検定法によって
同定され、ＤＮＡライブラリーから単離することができ
る。かかる配列を単独でまたは組み合せて用いることが
でき、また全ライブラリーをプローブとして用いること
も可能である。
特異的配列プローブ： ＤＮＡプローブ上記生物および
細胞から得られるり、Ｎ Ａの１本鎖ライブラリーはＭ
１３ファージをベクターとして用いることによって調製
することができる。
細胞から得られるり、Ｎ Ａの１本鎖ライブラリーはＭ
１３ファージをベクターとして用いることによって調製
することができる。
製法を説明するためのものである。ファージＭ１３の複
製型から得られるＤＮＡＣＭ１３ ＲＦ ｍｐ７；メ
ツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、ｈｈｂｃ ｌ 、 Ａ
ｃ ｉｄｓＲｇｓ、 ９ ： ３０９．１９８１；Ｐ−
Ｚ、バイオケミカル社から入手） ｆ ＢａｍＥ Ｉで
切断すると、ＧＡＴＣ粘着末粘着末端金線状２本鎖ＤＮ
Ａ分子を与えた。
製型から得られるＤＮＡＣＭ１３ ＲＦ ｍｐ７；メ
ツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、ｈｈｂｃ ｌ 、 Ａ
ｃ ｉｄｓＲｇｓ、 ９ ： ３０９．１９８１；Ｐ−
Ｚ、バイオケミカル社から入手） ｆ ＢａｍＥ Ｉで
切断すると、ＧＡＴＣ粘着末粘着末端金線状２本鎖ＤＮ
Ａ分子を与えた。
上記の如く調製される精製細菌ＤＮＡをＳａｓ ３Ａで
切断すると、Ｍ１３粘着末端に相補的な粘着末端を有す
るフラグメントを生じた。この被制限細菌ＤＮＡｔ−Ｍ
１３ ＤＮＡと混合し、混合物をライゲーションし、コ
ンピテント大腸菌（Ａ’、ｃｏ（（）株、７Ｍ１０７ｔ
−１０：１のモル比でトランスフェクトするために用い
、了シピシリン耐性コロニーを選択した。
切断すると、Ｍ１３粘着末端に相補的な粘着末端を有す
るフラグメントを生じた。この被制限細菌ＤＮＡｔ−Ｍ
１３ ＤＮＡと混合し、混合物をライゲーションし、コ
ンピテント大腸菌（Ａ’、ｃｏ（（）株、７Ｍ１０７ｔ
−１０：１のモル比でトランスフェクトするために用い
、了シピシリン耐性コロニーを選択した。
Ｂａｍ Ｉｉ Ｉ制限部位におけるＤＮＡ挿入物はファ
ージのこの株によって保持される１ａｃ−Ｚ遺伝子の正
常な発現を阻止する。この部位に挿入物を保持するＭ１
３分子は、１−ａｃＺ遺伝子からβ−ガラクトシダーゼ
を発現させることかできず、従って５−フロモ、４−ク
ロロ、３−インドイル、β−Ｄ−ガラクトシド（Ｚ−ｇ
αｔ）を含むプレート上で成育させると無色のプラーク
を与える。これによって、Ｘ−ｇａＬプレート上で青い
プラークを呈する挿入物を肩しないクローンから、挿入
物を有するクローンを区別することができる。
ージのこの株によって保持される１ａｃ−Ｚ遺伝子の正
常な発現を阻止する。この部位に挿入物を保持するＭ１
３分子は、１−ａｃＺ遺伝子からβ−ガラクトシダーゼ
を発現させることかできず、従って５−フロモ、４−ク
ロロ、３−インドイル、β−Ｄ−ガラクトシド（Ｚ−ｇ
αｔ）を含むプレート上で成育させると無色のプラーク
を与える。これによって、Ｘ−ｇａＬプレート上で青い
プラークを呈する挿入物を肩しないクローンから、挿入
物を有するクローンを区別することができる。
細菌ＤＮＡ挿入物を有するＭ２Ｓ １本ｍＤＮＡ分子
は、メソッド・イン・エンザイモロジーＣＭｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ ＥｎｚｉＩｍｏＬｏｇｙ） １０１ ： ２
０．１９８３に記載の方法によって大腸菌ＣＥ、 ｃｏ
ｌｉ） Ｎａ胞から精製する。３２ ｐで標識したＭ１
３プローブは以下のようにして調製した。
は、メソッド・イン・エンザイモロジーＣＭｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ ＥｎｚｉＩｍｏＬｏｇｙ） １０１ ： ２
０．１９８３に記載の方法によって大腸菌ＣＥ、 ｃｏ
ｌｉ） Ｎａ胞から精製する。３２ ｐで標識したＭ１
３プローブは以下のようにして調製した。
Ｍ２Ｓ １本鎖ＤＮＡ （５０ｎｆ／μＬ） ２０μｔ
；プライマー（２Ｏｎνμｔ）１２μｔ；１０倍希釈ア
ニーリング用緩衝液（１０ｙａＡｆ）リス−塩酸ｐＨ７
，５，５００ｍＭ ＮａＣＬ、 １００ ｍｕ ＤＴＴ
。
；プライマー（２Ｏｎνμｔ）１２μｔ；１０倍希釈ア
ニーリング用緩衝液（１０ｙａＡｆ）リス−塩酸ｐＨ７
，５，５００ｍＭ ＮａＣＬ、 １００ ｍｕ ＤＴＴ
。
１００情Ｍ ＭｇＣｌ２） ５μｔ；および蒸留水８μ
ｔからなる反応混会物中でＭ２Ｓ １本鎖ＤＮＡをアニ
ーリングし、３’−ＣＡＡＣＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣ
−５’の配列を有する合成りＮＡプライマーを作成した
。
ｔからなる反応混会物中でＭ２Ｓ １本鎖ＤＮＡをアニ
ーリングし、３’−ＣＡＡＣＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣ
−５’の配列を有する合成りＮＡプライマーを作成した
。
該混合物を１００℃に加熱し、続いて１時間かけて室温
まで徐冷した。アニーリング後、該混合物をα−３２Ｐ
−ｄＡＴＰ （３２００Ｃ”ｉ／ｍ １ｎｏｔ） ２５
μｔ；ｄＡＴＰ １０μＭおよびｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ
ｌｄＴＴＰを各１００μＭ含むｄＮＴＰ２０μｔ：１０
倍希釈アニーリング用緩衝液５μｔ；ＤＮＡポリメラー
ゼ（大フラグメント〕（４単位／μｔ〕中に添加した。
まで徐冷した。アニーリング後、該混合物をα−３２Ｐ
−ｄＡＴＰ （３２００Ｃ”ｉ／ｍ １ｎｏｔ） ２５
μｔ；ｄＡＴＰ １０μＭおよびｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ
ｌｄＴＴＰを各１００μＭ含むｄＮＴＰ２０μｔ：１０
倍希釈アニーリング用緩衝液５μｔ；ＤＮＡポリメラー
ゼ（大フラグメント〕（４単位／μｔ〕中に添加した。
得られる混付物を室温で２時間インキュベートした。０
．２５ Ｍ ＥＤＴＡ １０μｔを加えて反応を停止
し、３り標識Ｍ１３プローブを、１−シリンジ中でセフ
ァデックスＧ５０によって遠心分離することにより取り
込まれなかった３２Ｐ −ｄＡＴＰから分離した。
．２５ Ｍ ＥＤＴＡ １０μｔを加えて反応を停止
し、３り標識Ｍ１３プローブを、１−シリンジ中でセフ
ァデックスＧ５０によって遠心分離することにより取り
込まれなかった３２Ｐ −ｄＡＴＰから分離した。
上述の微生物及び細胞からの細菌性ＤＮＡライブラリー
は、ｐＳＰ６４ｔ−ベクターとして使用して製造できる
。下記例は、エイ・アクチノマイセテムコミタンスＣＡ
、 ｒｙ：ｔｉｎｏｒｎｙｃｇｔｅｔｎｃｏｍｉｔａｘ
ｓ）。
は、ｐＳＰ６４ｔ−ベクターとして使用して製造できる
。下記例は、エイ・アクチノマイセテムコミタンスＣＡ
、 ｒｙ：ｔｉｎｏｒｎｙｃｇｔｅｔｎｃｏｍｉｔａｘ
ｓ）。
ニス・ミュータンス（Ｓ、 ｍｕｔａｓｓ ）ｓニス・
スプチゲナ（Ｓ、 ａｐｕｔｉ（Ｈｎα）、ビー イン
テルメジウスＣＢ、 ｉ％ｔｇｒｍｓｄｉｕｅ ）、ビ
ー・ギ／ギバリスＣＢ。
スプチゲナ（Ｓ、 ａｐｕｔｉ（Ｈｎα）、ビー イン
テルメジウスＣＢ、 ｉ％ｔｇｒｍｓｄｉｕｅ ）、ビ
ー・ギ／ギバリスＣＢ。
ｇｉ％ｇｉｖａｌゼ８ン、エフ・ヌクンアツム（Ｆ、
ｎｕｃ−Ｉｇａｔｘｍ）、イー・コロテンス（Ｅ、 ｃ
ｏｒｒｏｄｇｎｓ ）、タフリュー・レクタ（’Ｗ、ｒ
ｍａｔα）、シー・オクラセアＣＣ，ｏｃｈｒａｃｇα
）および白血球を使用してこの方法を詳述するものであ
る。プロメガ・バイオチクＣＰｔｏ’ｒｎａｇａ Ｂｉ
ｏｔｅａ ）から得られるプラスミドｐＳＰ６４をＢａ
ｒｎ ＨＩで消化してＧＡＴＣ接着末端を有する線状二
重鎖ＤＮＡ分子を得た。上記の如く製造された精製され
た細菌性Ｄ Ｎ Ａ ｆ ５ａｘ３Ａで消化してｐｓＰ
６４付着末端と相補性の粘着末端を有するフラグメント
ラ得た。この制限された細菌性ＤＮＡをｐｓＰ６４ｃモ
ル比１〇二１）と混合し、混合物をリゲート（結合）さ
せ、使用して能力大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ＨＢ
１０１を形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選別
した。
ｎｕｃ−Ｉｇａｔｘｍ）、イー・コロテンス（Ｅ、 ｃ
ｏｒｒｏｄｇｎｓ ）、タフリュー・レクタ（’Ｗ、ｒ
ｍａｔα）、シー・オクラセアＣＣ，ｏｃｈｒａｃｇα
）および白血球を使用してこの方法を詳述するものであ
る。プロメガ・バイオチクＣＰｔｏ’ｒｎａｇａ Ｂｉ
ｏｔｅａ ）から得られるプラスミドｐＳＰ６４をＢａ
ｒｎ ＨＩで消化してＧＡＴＣ接着末端を有する線状二
重鎖ＤＮＡ分子を得た。上記の如く製造された精製され
た細菌性Ｄ Ｎ Ａ ｆ ５ａｘ３Ａで消化してｐｓＰ
６４付着末端と相補性の粘着末端を有するフラグメント
ラ得た。この制限された細菌性ＤＮＡをｐｓＰ６４ｃモ
ル比１〇二１）と混合し、混合物をリゲート（結合）さ
せ、使用して能力大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ） ＨＢ
１０１を形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選別
した。
細菌性ＤＮＡがｐｓＰ６４の中にとり込まれたこと１＆
：実証するために、各細菌性ライブラリーからの２０ク
ローンをランダムに選択した。これらのプラスミドを情
実し、Ｆ：ｃｏＲＩおよびＰｓｔｌで消化して制限地図
を作製することにより挿入物の存在を確認した。
：実証するために、各細菌性ライブラリーからの２０ク
ローンをランダムに選択した。これらのプラスミドを情
実し、Ｆ：ｃｏＲＩおよびＰｓｔｌで消化して制限地図
を作製することにより挿入物の存在を確認した。
挿入物を含有するプラスミドをＥｃｏＲＩで線状化し、
下記方法によりこのＤＮＡを転写することにより各ＤＮ
Ａライブラリー由来の３２Ｐ−標識ＲＮＡプローブを製
造した（該方法はプロメガ・バイオチクにより提供〕。
下記方法によりこのＤＮＡを転写することにより各ＤＮ
Ａライブラリー由来の３２Ｐ−標識ＲＮＡプローブを製
造した（該方法はプロメガ・バイオチクにより提供〕。
１０μｔの５×緩衝液（２００倶Ｍ トリス−ＥＣ１；
３０常Ｍ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭスペルミジン）ニジエ
チルピロカルボネートにより処理しておいた蒸留水９μ
ｔ；Ｏ，Ｓμｔの１Ｍジチオトレイトール；２μｔのア
ールナシン（ＲＮα８ｉ％）（商標名）リボヌクレアー
ゼ阻害剤（３０Ｕ／１ｔｔ）；５μｔずつの５ｔｎＭＧ
ＴＰ。
３０常Ｍ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭスペルミジン）ニジエ
チルピロカルボネートにより処理しておいた蒸留水９μ
ｔ；Ｏ，Ｓμｔの１Ｍジチオトレイトール；２μｔのア
ールナシン（ＲＮα８ｉ％）（商標名）リボヌクレアー
ゼ阻害剤（３０Ｕ／１ｔｔ）；５μｔずつの５ｔｎＭＧ
ＴＰ。
ＣＴＰ、ＡＴＰ； ２．５μｔの０．１２５鴬Ｍｖｒｐ
；１０μｔのＤＮＡ（ｐＳＰ６４クローン（５μｔ１５
０μｔ）由来）；１０μｔのα−”Ｐ−ＵＴＰ（３００
０Ｃｉ／ミリモル）；１μｔのリボプローブ（Ｒｉｂｏ
ｐｒｏｂｅ ） （商標名）ＲＮＡポリメラーゼ（１５
Ｕ／μｔ）からなる５０μｔの反応物中で転写を行なっ
た。４０℃で１時間インキュベートした。
；１０μｔのＤＮＡ（ｐＳＰ６４クローン（５μｔ１５
０μｔ）由来）；１０μｔのα−”Ｐ−ＵＴＰ（３００
０Ｃｉ／ミリモル）；１μｔのリボプローブ（Ｒｉｂｏ
ｐｒｏｂｅ ） （商標名）ＲＮＡポリメラーゼ（１５
Ｕ／μｔ）からなる５０μｔの反応物中で転写を行なっ
た。４０℃で１時間インキュベートした。
反応後、ｌμｔＯＤＮＡ分′ｐＩＩｌ酵素（１ダ／−）
と１．８μｔのアールナシン（ＲＮαｇｊｓ） （３０
Ｕ／μｔ）を加え、混合物を３７℃で１０分間インキュ
ベートした。１００μｔの蒸留水を加え、溶液をフェノ
ールで２１」抽出し、水性相を、１０ｍＭトリス、ｐＨ
７，０； １ ｒｎＭ ＥＤＴＡ； ０．１％ＳＤＳ中
で平衡にしておいたＧ５０セファデックスＣ８ｇｐｈａ
ｄｇｚ）全通して遠心分離した。
と１．８μｔのアールナシン（ＲＮαｇｊｓ） （３０
Ｕ／μｔ）を加え、混合物を３７℃で１０分間インキュ
ベートした。１００μｔの蒸留水を加え、溶液をフェノ
ールで２１」抽出し、水性相を、１０ｍＭトリス、ｐＨ
７，０； １ ｒｎＭ ＥＤＴＡ； ０．１％ＳＤＳ中
で平衡にしておいたＧ５０セファデックスＣ８ｇｐｈａ
ｄｇｚ）全通して遠心分離した。
ランゲル（ＬａＴＬｇｅｒ）らの上記文献に記載のＵＴ
Ｐのビオチン標識同族体を標識として使用してもよい。
Ｐのビオチン標識同族体を標識として使用してもよい。
プローブとして使用するために、クローン化されたＤＮ
Ａライブラリーから特異的核酸配列を選択できる。望ま
しい配列は、標的細胞に対して強いハイブリダイゼーシ
ョンを示すが、非標的細胞に対して非特異的反応性をほ
とんどまたは全く示さないものである。そのような配列
は分別ハイブリダイゼーション検定によって選別される
。下記工程においてはプローブ源は３つの微生物のＤＮ
Ａライブラリーおよび１つの微先物のＲＮＡライブラリ
ーから選択されており、数種の微生物についてプローブ
源を選択するのに使用できる工程を以下に詳述する。
Ａライブラリーから特異的核酸配列を選択できる。望ま
しい配列は、標的細胞に対して強いハイブリダイゼーシ
ョンを示すが、非標的細胞に対して非特異的反応性をほ
とんどまたは全く示さないものである。そのような配列
は分別ハイブリダイゼーション検定によって選別される
。下記工程においてはプローブ源は３つの微生物のＤＮ
Ａライブラリーおよび１つの微先物のＲＮＡライブラリ
ーから選択されており、数種の微生物についてプローブ
源を選択するのに使用できる工程を以下に詳述する。
エイ・アクチノマイセテムコミタンス（Ａ。
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｇｍｃｏｍｉｔａｎｓ ）、ニ
ス・ミュータンス（Ｓ、 ｍｘｔａｎｓ ）およびニス
・フプチゲナ（Ｓ。
ス・ミュータンス（Ｓ、 ｍｘｔａｎｓ ）およびニス
・フプチゲナ（Ｓ。
ａｐｗｔｉｇｅｎａ）のＭ１３ライブラリーをスクリー
ニングして他の２梅の微生物に対して交叉反応性を示さ
ないクローンを同定した。各ライブラリーから、Ｍ２Ｓ
に有する挿入物をとり込んでいる５０個の大腸菌クロー
ンを１−エツペンドルフ（Ｅｐｐｇｎｄｏｒｆ）試験管
中で別個に生育させ、各クローンからの全大腸菌菌体の
数μｔ２二枚用意し一ニトロセルロースフィルターの上
にスポットシ固定し、各フィルターが単一の微生物のラ
イブラリーからのクローンのみを示す５０スポツトを含
むようにした。スポットするのには、マイクロピペット
で上記フィルターに細胞懸濁液１〜２μｔを滴下し、約
３０分間風乾した。スクリーニングすべき各ライブラリ
ーについて、全細胞性Ｄ Ｎ Ａの２つの調製物がつく
られた＝（ａ）″′標的細胞”ＤＮＡ；（ｂ）他の２つ
の“非標的”細胞からプールされたＤＮＡ０これらの調
製物は上述のように３２Ｐ標識でニック翻訳し、各々を
インキュベートして下記の方法などの標準的ハイブリダ
イゼーション法によって上記二枚のフィルターの１枚に
交雑した。プールされた６非標的”ＤＮＡに対してハイ
ブリダイゼーションを示すクローンはいずれも適当なプ
ローブではない。６非標的”ＤＮＡに対してハイブリダ
イゼーションをほとんど示さないあるいは全く示さない
が、１標的”ＤＮＡにはよく交雑するクローンはいずれ
も適当なプローブ候補である。この方法を使用して、エ
イ・アクチノマイセテムコミタンス（Ａ、 ａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｇｔｅｍｃ −ｏｍｉｔａｎｓ）、ニス向ミュ
ータンス（Ｓ、 ｍｕｔａｎｓ）およびニス・スブチゲ
ナ（Ｓ、 ｓｐｕｔｉｇｅｎａ）の各ライブラリーから
のプローブ候補として約２０．個のＭ１３クローンを同
定した。
ニングして他の２梅の微生物に対して交叉反応性を示さ
ないクローンを同定した。各ライブラリーから、Ｍ２Ｓ
に有する挿入物をとり込んでいる５０個の大腸菌クロー
ンを１−エツペンドルフ（Ｅｐｐｇｎｄｏｒｆ）試験管
中で別個に生育させ、各クローンからの全大腸菌菌体の
数μｔ２二枚用意し一ニトロセルロースフィルターの上
にスポットシ固定し、各フィルターが単一の微生物のラ
イブラリーからのクローンのみを示す５０スポツトを含
むようにした。スポットするのには、マイクロピペット
で上記フィルターに細胞懸濁液１〜２μｔを滴下し、約
３０分間風乾した。スクリーニングすべき各ライブラリ
ーについて、全細胞性Ｄ Ｎ Ａの２つの調製物がつく
られた＝（ａ）″′標的細胞”ＤＮＡ；（ｂ）他の２つ
の“非標的”細胞からプールされたＤＮＡ０これらの調
製物は上述のように３２Ｐ標識でニック翻訳し、各々を
インキュベートして下記の方法などの標準的ハイブリダ
イゼーション法によって上記二枚のフィルターの１枚に
交雑した。プールされた６非標的”ＤＮＡに対してハイ
ブリダイゼーションを示すクローンはいずれも適当なプ
ローブではない。６非標的”ＤＮＡに対してハイブリダ
イゼーションをほとんど示さないあるいは全く示さない
が、１標的”ＤＮＡにはよく交雑するクローンはいずれ
も適当なプローブ候補である。この方法を使用して、エ
イ・アクチノマイセテムコミタンス（Ａ、 ａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｇｔｅｍｃ −ｏｍｉｔａｎｓ）、ニス向ミュ
ータンス（Ｓ、 ｍｕｔａｎｓ）およびニス・スブチゲ
ナ（Ｓ、 ｓｐｕｔｉｇｅｎａ）の各ライブラリーから
のプローブ候補として約２０．個のＭ１３クローンを同
定した。
は生化学的類似性及び遺伝的類似性があり〔ターナ−（
Ｔａｎｎｇｒ）等のＪ、 Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ、 Ａ’
＃１１．１７ ：５８５．１９８２；ボツッ（Ｐｏｔｔ
ａ）等、ｉｄ、 ）、そしてこれらの菌は時には歯フロ
ーラに存在する。
Ｔａｎｎｇｒ）等のＪ、 Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ、 Ａ’
＃１１．１７ ：５８５．１９８２；ボツッ（Ｐｏｔｔ
ａ）等、ｉｄ、 ）、そしてこれらの菌は時には歯フロ
ーラに存在する。
明の全ゲノムプローブはこれらのハエモフイラス種の細
胞に対してかなりの交差反応性を示したが、ＤＮＡ−Ｄ
ＮＡ９９種形成の研究（上記の結果と一致する〕がボツ
ツ等の上記の文献に報告されていス特異性Ａ、アクチノ
マイセテムコミタンスｐＳＰ６４クローンを選択するこ
とにした。
胞に対してかなりの交差反応性を示したが、ＤＮＡ−Ｄ
ＮＡ９９種形成の研究（上記の結果と一致する〕がボツ
ツ等の上記の文献に報告されていス特異性Ａ、アクチノ
マイセテムコミタンスｐＳＰ６４クローンを選択するこ
とにした。
Ａ、アクチノマイセテムコミタンスｐｓＰ６４ライブラ
リーからの１００イ固のＥ、コリ（Ｅ、ｃｏＨ）の各ク
ローンを上記の方法でスクリーニングした。
リーからの１００イ固のＥ、コリ（Ｅ、ｃｏＨ）の各ク
ローンを上記の方法でスクリーニングした。
これらのクローンを１−のエツペンドルフ管（Ｅｐｐｇ
ｎｄｏｒｆ ｔｕｂｅ）で個別に生長させ、そして各ク
ローンからの数マイクロリッターの全１ユ１’Ｊ ｉｆ
ｆ 胞にニトロセルロースのフィルターに二重にスポッ
トし、固定させた。スポツティングは１〜２マイクロリ
ツターの細胞懸濁液をフィルターにマイクロピペットで
適用し、はぼ３０分間風乾して行った。
ｎｄｏｒｆ ｔｕｂｅ）で個別に生長させ、そして各ク
ローンからの数マイクロリッターの全１ユ１’Ｊ ｉｆ
ｆ 胞にニトロセルロースのフィルターに二重にスポッ
トし、固定させた。スポツティングは１〜２マイクロリ
ツターの細胞懸濁液をフィルターにマイクロピペットで
適用し、はぼ３０分間風乾して行った。
総細胞ＤＮＡの２種の別個の標本、すなわち（α）のプ
ールＤＮＡｆ調衷した。これらの標本を上記の通り３２
Ｆ標識でニックトランスレーションし下記雑種形成法で
一組のフィルターに雑種形成のためにインキュベーショ
ンした。ｐｓＰ６４の数クローンを選ヒ、Ａ、アクチノ
マイセテムコミタンスなかった。これらのうち、最良の
特異性を示すものとして５種のクローン（、％１５４．
１５７．１９８．２００及び２０７）を選択した。
ールＤＮＡｆ調衷した。これらの標本を上記の通り３２
Ｆ標識でニックトランスレーションし下記雑種形成法で
一組のフィルターに雑種形成のためにインキュベーショ
ンした。ｐｓＰ６４の数クローンを選ヒ、Ａ、アクチノ
マイセテムコミタンスなかった。これらのうち、最良の
特異性を示すものとして５種のクローン（、％１５４．
１５７．１９８．２００及び２０７）を選択した。
コレらの５棟のクローンからの３２Ｐ−標識ＲＮＡＮコ
ムタンス゛（菌株Ｙ４．５１１．６５２、ＡＴＣＣ２９
５２２、ＡＴＣＣ２９５２３、ＡＴＣＣ２９５２４，６
５０，６５１，６５２，２０４３，２０９７，２１１２
、Ｎ２７、ＮＣＴＣ９７１０）；Ｈ，アフロフィラス（
菌株６２１．６２６．６５４．６５５、Ｈ７７、Ｈ８０
、Ｒ８１、ＡＴＣＣ１３２５２、ＡＴＣＣ１９４１５、
ＮＣＴＣ５９０６）；Ｈ，バラフロフィラス（菌株Ｒ７
６、Ｈ７８、ＡＴＣＣ２９２４１）及びＢ。
ムタンス゛（菌株Ｙ４．５１１．６５２、ＡＴＣＣ２９
５２２、ＡＴＣＣ２９５２３、ＡＴＣＣ２９５２４，６
５０，６５１，６５２，２０４３，２０９７，２１１２
、Ｎ２７、ＮＣＴＣ９７１０）；Ｈ，アフロフィラス（
菌株６２１．６２６．６５４．６５５、Ｈ７７、Ｈ８０
、Ｒ８１、ＡＴＣＣ１３２５２、ＡＴＣＣ１９４１５、
ＮＣＴＣ５９０６）；Ｈ，バラフロフィラス（菌株Ｒ７
６、Ｈ７８、ＡＴＣＣ２９２４１）及びＢ。
インフルエンザＣＨ，二組ｂ１ｇ ｎ ｚ ａ ） （
菌株Ｒ９、Ｈｌ ０４ ）からの全細胞をそれぞれ５つ
のニトロセルロースフィルター（こ上記のようにスポッ
トした。５種のクローンからの３２Ｐ標識ＲＮＡを個別
にそれらフィルターに下記の方法で雑種形成させエモフ
イラスの細胞にはバックグランド以上の肩意の雑種形成
は示さなかった。Ｅ、コリの代表的な特異性クローンＡ
１９８（Ａ’、コリに１２／ｐｓＰ６４−Ａα１９８と
表示）をゼ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションＣｔｈａＡ情ｇｒｔｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｒ
ｂｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託した。これには
ＡＴＣＣアクセツション（ＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓ −ｉ
ｏ％）／％５３２１９が与えられた。出願人（譲受人）
であるバイオテクニカ・インターナショナル社（Ｂｉｏ
Ｔｍｃｈｎｉｃａ Ｉｎｔｇｒｔ＊ａｔｉｏｎａｌ＋
Ｉｎｃ、）は死滅した場合、このカルチャーを特許期間
の満了前に交換する責任及びこのような特許の発行につ
いてＡＴＣＣに通知する責任が存在することを認める。
菌株Ｒ９、Ｈｌ ０４ ）からの全細胞をそれぞれ５つ
のニトロセルロースフィルター（こ上記のようにスポッ
トした。５種のクローンからの３２Ｐ標識ＲＮＡを個別
にそれらフィルターに下記の方法で雑種形成させエモフ
イラスの細胞にはバックグランド以上の肩意の雑種形成
は示さなかった。Ｅ、コリの代表的な特異性クローンＡ
１９８（Ａ’、コリに１２／ｐｓＰ６４−Ａα１９８と
表示）をゼ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションＣｔｈａＡ情ｇｒｔｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｒ
ｂｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託した。これには
ＡＴＣＣアクセツション（ＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓ −ｉ
ｏ％）／％５３２１９が与えられた。出願人（譲受人）
であるバイオテクニカ・インターナショナル社（Ｂｉｏ
Ｔｍｃｈｎｉｃａ Ｉｎｔｇｒｔ＊ａｔｉｏｎａｌ＋
Ｉｎｃ、）は死滅した場合、このカルチャーを特許期間
の満了前に交換する責任及びこのような特許の発行につ
いてＡＴＣＣに通知する責任が存在することを認める。
その時点でこの寄託物は公衆に入手可能となる。その時
点までは寄託物は３７ＣＦＲξ１．１４及び３５ＵＳＣ
ξ１１２によジアメリカ特許庁長官が入手できる。
点までは寄託物は３７ＣＦＲξ１．１４及び３５ＵＳＣ
ξ１１２によジアメリカ特許庁長官が入手できる。
プローブは単一シーケンスであるか、シーケンスの組み
合せであるか、あるいは全ライブラリーであるかにかか
わらず、上記組換ＤＮＡ法で大規模合成が可能である。
合せであるか、あるいは全ライブラリーであるかにかか
わらず、上記組換ＤＮＡ法で大規模合成が可能である。
単一シーケンスのＤＮＡプローブ又はその組み合せは、
代りに、常法及び／又は自動合成装置を用いて化学的に
合成することもできる。但し、ヌクレオチドシーケンは
常用のシーケンス法で定量した。
代りに、常法及び／又は自動合成装置を用いて化学的に
合成することもできる。但し、ヌクレオチドシーケンは
常用のシーケンス法で定量した。
プローブは実際の診断用に十分な量で調製することがで
き、本明細書で述べる通り標識することができる。別法
として、両核酸は合成後に化学的又は生化学的標識結合
方法で標識することができる。３２ｐが標識である場食
は、プローブはそのアイソトープの半減期が短かいので
、合成から約２週間以内に使用すべきである。
き、本明細書で述べる通り標識することができる。別法
として、両核酸は合成後に化学的又は生化学的標識結合
方法で標識することができる。３２ｐが標識である場食
は、プローブはそのアイソトープの半減期が短かいので
、合成から約２週間以内に使用すべきである。
歯周の病気を検出するための診断方法において、歯垢サ
ンプルは患者の口から採取しなければならない。歯周の
ポケットからの歯垢のサンプルは歯周用キューレットま
たはその他の歯科用器具を用いて、どんな標準的歯垢回
収法によって採取できる。別法としてはニューマン等（
Ｊ、 Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ。
ンプルは患者の口から採取しなければならない。歯周の
ポケットからの歯垢のサンプルは歯周用キューレットま
たはその他の歯科用器具を用いて、どんな標準的歯垢回
収法によって採取できる。別法としてはニューマン等（
Ｊ、 Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ。
４７：３７３．１９７６）によって説明された改良有林
ブローチのような特殊なサンプル採取用器具を用いるこ
ともできる。我々は歯周ポケットからサンプルを取出す
のに有用な紙製針を見出した。
ブローチのような特殊なサンプル採取用器具を用いるこ
ともできる。我々は歯周ポケットからサンプルを取出す
のに有用な紙製針を見出した。
どの場合でも、歯垢サンプルは口から取出され、捕捉さ
れている細菌を分散するためにリンガ−浴数（Ｒｉｎｇ
ｇｒ′８ｓｏｌｕｔｉｏｎ）のような溶液に入れる。分
散＆′＠１０秒以下の音彼振動により、または渦動によ
って無菌灸件下で行われる。次いで、す／プルは希釈さ
れ、交雑反応に使用される。歯垢サンフルは、前述のよ
うに先ずＮ−アセテルムラミダーゼ、または細胞の溶解
を促進する他の酵素によって処理し、次いでマイクロピ
ペットニヨ’）濾紙上に１〜２μｔの細胞分散ｉを滴下
し、約１０分間風乾することによってニトロセルロース
濾紙上にスポットし、固定化する。
れている細菌を分散するためにリンガ−浴数（Ｒｉｎｇ
ｇｒ′８ｓｏｌｕｔｉｏｎ）のような溶液に入れる。分
散＆′＠１０秒以下の音彼振動により、または渦動によ
って無菌灸件下で行われる。次いで、す／プルは希釈さ
れ、交雑反応に使用される。歯垢サンフルは、前述のよ
うに先ずＮ−アセテルムラミダーゼ、または細胞の溶解
を促進する他の酵素によって処理し、次いでマイクロピ
ペットニヨ’）濾紙上に１〜２μｔの細胞分散ｉを滴下
し、約１０分間風乾することによってニトロセルロース
濾紙上にスポットし、固定化する。
むし歯感受性を検出する１こめの診断方法において、歯
垢サンプルまたは患者の唾液中でニス ミュータンス（
Ｓ ｎｕｂｔａｎｓ ）を検出できる。唾液を吸引する
１こめの普通の方法としては患者がパラフィンをかんだ
後、唾ｇを採取する方法がある。パラフィンをかむこと
によって唾液の生産が増加し、歯からのＳｍｕｔａｎｓ
の脱落が増す。
垢サンプルまたは患者の唾液中でニス ミュータンス（
Ｓ ｎｕｂｔａｎｓ ）を検出できる。唾液を吸引する
１こめの普通の方法としては患者がパラフィンをかんだ
後、唾ｇを採取する方法がある。パラフィンをかむこと
によって唾液の生産が増加し、歯からのＳｍｕｔａｎｓ
の脱落が増す。
標識化プローブに対する交雑は標準的方法（例えばファ
ルコー等米国特許４，３５８．５３５およびロバート等
（１９８４） Ｊ、Ｃ１１ｎ、 Ｍｉ、ｒ、 ２０．
８２６に記述されており、これらの記述は本明細書の一
部にされる）ζこよって行われ、ハイブリッド複合体は
オートラジオグラフィーまたは他の検査方法（例えば、
螢光法）によって検出される。
ルコー等米国特許４，３５８．５３５およびロバート等
（１９８４） Ｊ、Ｃ１１ｎ、 Ｍｉ、ｒ、 ２０．
８２６に記述されており、これらの記述は本明細書の一
部にされる）ζこよって行われ、ハイブリッド複合体は
オートラジオグラフィーまたは他の検査方法（例えば、
螢光法）によって検出される。
試験された生物についての陽性テストは、濾紙上に有意
な結合した放射性または他の標識が濾紙上で検出可能な
場合に生じる。１つのハイブリダイゼーション法は以下
のように行われる。クロモソームブローブは１００℃で
５分間処理することにより変性され、そしてハイブリダ
イゼーション前に氷水上に直ちに置かれる。この工程は
ＲＮＡおよびＭ１３プローブについては不要である。Ｄ
ＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションでは、濾紙に結合
したサンプル中のＤＮＡは帆５ Ｍ ＮａＯＨ，１，５
Ｍ ＮａＣＬに５分間浸漬して変性させ、次いで１・５
Ｍ ＮａＣ１−０，５Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ （ｐＥ
８−０ ）で５分間中和される。１６時間の７１イブ
リダイゼーシヨン後の洗浄が６５℃でＩ Ｘ Ｓ Ｓ
Ｃ＋０．１％ＳＤＳ。
な結合した放射性または他の標識が濾紙上で検出可能な
場合に生じる。１つのハイブリダイゼーション法は以下
のように行われる。クロモソームブローブは１００℃で
５分間処理することにより変性され、そしてハイブリダ
イゼーション前に氷水上に直ちに置かれる。この工程は
ＲＮＡおよびＭ１３プローブについては不要である。Ｄ
ＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションでは、濾紙に結合
したサンプル中のＤＮＡは帆５ Ｍ ＮａＯＨ，１，５
Ｍ ＮａＣＬに５分間浸漬して変性させ、次いで１・５
Ｍ ＮａＣ１−０，５Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ （ｐＥ
８−０ ）で５分間中和される。１６時間の７１イブ
リダイゼーシヨン後の洗浄が６５℃でＩ Ｘ Ｓ Ｓ
Ｃ＋０．１％ＳＤＳ。
次いで帆１ｘＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳでの３回の洗浄で
あることを除いて、デンノ１−） ＣＢＢＲＣ２３：６
４１：１９６６）の方法によってハイブリダイゼーショ
ンを行った。
あることを除いて、デンノ１−） ＣＢＢＲＣ２３：６
４１：１９６６）の方法によってハイブリダイゼーショ
ンを行った。
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは以下のように
行った。プロットした後、ニトロセルロース濾紙を８０
℃、２時間、真空下で加熱し、下記のバ□ツファーで４
２℃、４時間予備ハイブリダイゼーションを行った。
行った。プロットした後、ニトロセルロース濾紙を８０
℃、２時間、真空下で加熱し、下記のバ□ツファーで４
２℃、４時間予備ハイブリダイゼーションを行った。
５０％ホルムアミド； ５０ ｍＭリン酸ナトリウム（
ｐＨ６，５） ； ０．８ Ｍ ＮａＣ１； １ ｍＭ
ＥＤＴＡ；０．１％ＳＤＳ：０．０５％ＢＳＡ：０．０
５％フィコール；０．０５％ＰＶＰ； ２５０μｒ／ｍ
ｌ変性サケ精子ＤＮＡ；５００μｆ／＃Ｉｔ酵母ＲＮＡ
； 十／−ポリＡ（１０μ２／−）。
ｐＨ６，５） ； ０．８ Ｍ ＮａＣ１； １ ｍＭ
ＥＤＴＡ；０．１％ＳＤＳ：０．０５％ＢＳＡ：０．０
５％フィコール；０．０５％ＰＶＰ； ２５０μｒ／ｍ
ｌ変性サケ精子ＤＮＡ；５００μｆ／＃Ｉｔ酵母ＲＮＡ
； 十／−ポリＡ（１０μ２／−）。
ハイブリダイゼーションはプローブ全添加して４２℃で
上記の新鮮なバッファー中で５０ ｍｕＮａＣＬ ：
２０ ｍＭ リン酸ナトリウムＣｐＥ ６．５ ）
：１ｍＭ ＥＤＴＡ： ０−１％ＳＤＳで行われた。
上記の新鮮なバッファー中で５０ ｍｕＮａＣＬ ：
２０ ｍＭ リン酸ナトリウムＣｐＥ ６．５ ）
：１ｍＭ ＥＤＴＡ： ０−１％ＳＤＳで行われた。
オートラジオグラフィーへの露出時間は存在する放射線
活性標識の量で決定した。より長い露出強するにもかか
わらず、非特異的背景ハイブリダイゼーションの信号量
も増加させる。したがって、この点を考慮して曝露時間
全選択しなければならず、典型的には２〜６時間である
。
活性標識の量で決定した。より長い露出強するにもかか
わらず、非特異的背景ハイブリダイゼーションの信号量
も増加させる。したがって、この点を考慮して曝露時間
全選択しなければならず、典型的には２〜６時間である
。
その他の態様は特許請求の範囲に含まれるものである。
本発明の方法は、どんな歯の病気または状態の診断のた
めの、ヒトの口腔内に存在するどの微生物または他の細
胞の検出にも肩用である。
めの、ヒトの口腔内に存在するどの微生物または他の細
胞の検出にも肩用である。
その他の病気およびそれに伴う微生物の例は慢性歯肉炎
：フンバクテリウム種（Ｆｕｓｏｂａｃｔｇｒｉｕｍｓ
ｐｅｃｉｅｓ ）、カンピロバクタ一種（Ｃａｍｐｙ
ｌ ｏ ｂ ａ−ｃｔａｒ ５ｐｅｃｉｅｓ）、ビー
インターメジウスＣＢ。
：フンバクテリウム種（Ｆｕｓｏｂａｃｔｇｒｉｕｍｓ
ｐｅｃｉｅｓ ）、カンピロバクタ一種（Ｃａｍｐｙ
ｌ ｏ ｂ ａ−ｃｔａｒ ５ｐｅｃｉｅｓ）、ビー
インターメジウスＣＢ。
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｌＬｓ ） 、バクテリオネーママ
トラコチ（ＢａＣｔ ｙｉｏｎｅｍａ ｍａｔ ｒｗｃ
ｈｏ ｔ ｉ ） ｓ歯槽骨損失、例えば、アクチンマ
イセス ナエスランジー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃａｓ ｎ
ａｇｓＬｘｎｄｉｉ ）、ノカーディア種（Ｎｏｃａｒ
ｄｉａ ５ｐｅｃｉｅｓ）；急性壊死性潰瘍性歯肉炎：
フンバクテリウム種（Ｆｕｓｏｂａｃｔｇｒｉｕｍｓｐ
ｅｃｉｅｓ ）、ビー インターメジウス（Ｂ ｉ％
ｔ−ｇｒｍｅｄｉｕｓ ）、スピロヘータ（５ｐｉｒｏ
ｃｈｅｔｅｓ ）。
トラコチ（ＢａＣｔ ｙｉｏｎｅｍａ ｍａｔ ｒｗｃ
ｈｏ ｔ ｉ ） ｓ歯槽骨損失、例えば、アクチンマ
イセス ナエスランジー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃａｓ ｎ
ａｇｓＬｘｎｄｉｉ ）、ノカーディア種（Ｎｏｃａｒ
ｄｉａ ５ｐｅｃｉｅｓ）；急性壊死性潰瘍性歯肉炎：
フンバクテリウム種（Ｆｕｓｏｂａｃｔｇｒｉｕｍｓｐ
ｅｃｉｅｓ ）、ビー インターメジウス（Ｂ ｉ％
ｔ−ｇｒｍｅｄｉｕｓ ）、スピロヘータ（５ｐｉｒｏ
ｃｈｅｔｅｓ ）。
更に、本発明は健康な歯肉に伴われる微生物、例えば、
ストレプトコッカス サンクイス（８゜８α％ｑｘｉｓ
）、ストレプトコッカス ミテイスＣｓ、 ｍ１ｔｉ
ｓ ） 、アンチンマイセス ビスコサス（Ａ、 ｖｉ
ｓｃｏｓｓｓ ）およびバイロネラ種（１ｋｉｌｌ−ｏ
ｎｅｌｌ ５ｐｅｃｉｅｓ）の検出にも利用できる。
ストレプトコッカス サンクイス（８゜８α％ｑｘｉｓ
）、ストレプトコッカス ミテイスＣｓ、 ｍ１ｔｉ
ｓ ） 、アンチンマイセス ビスコサス（Ａ、 ｖｉ
ｓｃｏｓｓｓ ）およびバイロネラ種（１ｋｉｌｌ−ｏ
ｎｅｌｌ ５ｐｅｃｉｅｓ）の検出にも利用できる。
口腔微生物および細胞のクローン化ＤＮＡライブラリー
は別法で調製できる。ライブラリーは他の制限酵素、特
に目的ゲノムを平均１００〜５００ヌクレオチドのサイ
ズに切断する酵素を用いて調製できる。その他の一本鎖
ＤＮＡファージはφ×１７４およびＦｄｆ含む潜在的ク
ローニングベクターである。通常の二本鎖ＤＮＡベクタ
ーのどれでも（例えば、ｐＢＲ３２２）、ライブラリー
の調製に使用できる。ＲＮＡプローブはｐＴ７ベクター
を用いて調製できる。他の宿主微生物がＤＮＡライブラ
リーの調製できるが、大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）がクロー
ニングの容易さの点で好しい。
は別法で調製できる。ライブラリーは他の制限酵素、特
に目的ゲノムを平均１００〜５００ヌクレオチドのサイ
ズに切断する酵素を用いて調製できる。その他の一本鎖
ＤＮＡファージはφ×１７４およびＦｄｆ含む潜在的ク
ローニングベクターである。通常の二本鎖ＤＮＡベクタ
ーのどれでも（例えば、ｐＢＲ３２２）、ライブラリー
の調製に使用できる。ＲＮＡプローブはｐＴ７ベクター
を用いて調製できる。他の宿主微生物がＤＮＡライブラ
リーの調製できるが、大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）がクロー
ニングの容易さの点で好しい。
異なる特異の塩基配列分子を結合してプローブを形成す
ることができる。それらの結合される配列の数は必要な
特異性まγこは感受性に依存する。
ることができる。それらの結合される配列の数は必要な
特異性まγこは感受性に依存する。
異なる生物および／またはセロタイプのプローブは歯科
に従事する者に対してよ、！１１１Ｍ用な診断薬を与え
ることができる。
に従事する者に対してよ、！１１１Ｍ用な診断薬を与え
ることができる。
ハイブリダイゼーションの条件は本明細書に開示したも
のと異っていても艮い。特に、プローブ核酸はランキの
米国特許４，４８６．５３９のサンドインチ法を含む、
いくつかの異なる方法のどれによってもサンプルＤＮＡ
と接触させろことができる。最後（こ、組込まれた標識
（例えば、バイオチンまたは螢光体標識に結合されたヌ
クレオチドアナローブ）、または合成後に核酸に付加さ
れた標識（例えば、螢光体標識；酵素活性−ベース標識
等）を含むその他の検出方法も可能である。
のと異っていても艮い。特に、プローブ核酸はランキの
米国特許４，４８６．５３９のサンドインチ法を含む、
いくつかの異なる方法のどれによってもサンプルＤＮＡ
と接触させろことができる。最後（こ、組込まれた標識
（例えば、バイオチンまたは螢光体標識に結合されたヌ
クレオチドアナローブ）、または合成後に核酸に付加さ
れた標識（例えば、螢光体標識；酵素活性−ベース標識
等）を含むその他の検出方法も可能である。
（外５名）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）患者の口腔から得たサンプル中のヒト口腔病変関連
の微生物またはヒト細胞の検出用プローブであつて、前
記プローブは前記微生物または細胞の一本鎖ＤＮＡに対
してハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリ
ダイゼーションができるＤＮＡまたはＲＮＡの断片から
実質上成ることを特徴とするプローブ。 ２）前記プローブはサンプル中の１０＾３個の前記細胞
を検出できる特許請求の範囲第１項記載のプローブ。 ３）前記疾病が幼児歯周炎である特許請求の範囲第１項
に記載のプローブ。 ４）前記疾病がむし歯に対する感受性である特許請求の
範囲第１項に記載のプローブ。 ５）前記疾病が成人の歯周の疾病である特許請求の範囲
第１項に記載のプローブ。 ６）前記微生物細胞がアクチノバチルスアクチノマイセ
テムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃ
ｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉａｎｓ）またはストレ
プトコッカスミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｏｕ
ｓ ｍｕｔａ−ｎｓ）である特許請求の範囲第１項に記
載のプローブ。 ７）前記微生物細胞がバクテロイデスインテルメジウス
（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）
、バクテロイデスギンギバリス（Ｂａｔｅｒｏｉｄｅｓ
ｇｉｎ−ｇｉｒａｌｉｓ）、フソバクテリウムヌクレ
アツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔ
ｕｍ）、オイケネラコロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ
ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、ウオリネラレクタ（Ｗｏｌｉｎ
ｅｌｌａ ｒｅｃｔａ）、カプノサイトファーガオクラ
セア（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅ
ａ）またはセレノモナススプチゲナ（Ｓｅｌｅｎｏｍｏ
ｎａｓ ｓｐｕｔｉｇｅｎａ）のうちの１つである特許
請求の範囲第１項に記載のプローブ。 ８）病変関連の微生物細胞またはヒト細胞をヒト患者の
口腔から得たサンプル中から検出する方法において、該
方法が前記サンプルのＤＮＡを変性し； 前記細胞の変性したＤＮＡと選択的にハイブリダイゼー
ションできるプローブＲＮＡまたはＤＮＡと、ハイブリ
ダイゼーション条件下で接触させ；サンプル中の前記細
胞の存在を示すようなハイブリッド複合体を検出する； 各工程から成る方法。 ９）前記プローブＤＮＡまたはＲＮＡが細胞の全ゲノム
から成る特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １０）前記細胞がアクチノバチルスアクチノマイセテム
コミタンスまたはストレプトコッカスミュータンスのう
ちの１つである特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １１）前記細胞がバクテロイデスインテルメジウス、バ
クテロイデスギンギバリス、フソバクテリウムヌクレア
ツム、オイケネラコロデンス、ウオリネラレクタ、カプ
ノサイトファーガオクラセア、およびセレノモナススプ
チゲナのうちの１つである特許請求の範囲第８項に記載
の方法。 １２）前記細胞がヒト白血球細胞である特許請求の範囲
第８項に記載の方法。 １３）前記サンプルが患者の口腔の歯周ポケットから得
た歯肉下の歯垢から成る特許請求の範囲第８項に記載の
方法。 １４）前記サンプルが歯肉上の歯垢から成る特許請求の
範囲第８項に記載の方法。 １５）前記サンプルが唾液から成る特許請求の範囲第８
項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US70705485A | 1985-03-01 | 1985-03-01 | |
| US707054 | 1985-03-01 | ||
| US769565 | 1985-08-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61257200A true JPS61257200A (ja) | 1986-11-14 |
Family
ID=24840171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4513286A Pending JPS61257200A (ja) | 1985-03-01 | 1986-03-01 | 核酸ハイブリダイゼ−シヨンによるヒト口腔細胞の検出 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61257200A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007240513A (ja) * | 2006-02-08 | 2007-09-20 | Microdent:Kk | 歯科疾患確定装置 |
| JP5981350B2 (ja) * | 2010-12-28 | 2016-08-31 | ライオン株式会社 | 口腔状態の判定方法、並びにそのために用いられる分析用具、装置、及びプログラム |
-
1986
- 1986-03-01 JP JP4513286A patent/JPS61257200A/ja active Pending
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| INTECTION AND IMMUNITY=1974 * |
| INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY=1981 * |
| J.DENT.RES=1983 * |
| JOURNAL OF PERIODONTSL RESEARCH=1982 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007240513A (ja) * | 2006-02-08 | 2007-09-20 | Microdent:Kk | 歯科疾患確定装置 |
| JP5981350B2 (ja) * | 2010-12-28 | 2016-08-31 | ライオン株式会社 | 口腔状態の判定方法、並びにそのために用いられる分析用具、装置、及びプログラム |
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