JPH09508003A - 未知の生物をスクリーニングするための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 試料中の核酸のヌクレオチド配列を既知のヌクレオチド配列と比較し、該試料中に未知のヌクレオチド配列が存在することを確定することによる、未知生物の同定方法。

Description

【発明の詳細な説明】 未知の生物をスクリーニングするための方法 発明の分野 本発明は一般に、ヌクレオチド配列が不明な生物の核酸をスクリーニングする ための方法に関し、さらに詳細には、生物の同定のためにヌクレオチド配列を用 いる方法に関する。 発明の背景 ヌクレオチド配列を決定することにより、種々の程度の冗長性を伴った配列情 報が提供される。ヌクレオチド配列から得られる情報は、生物のゲノムに関する 一次配列の情報源として用いることができ、いったんヌクレオチド配列がわかれ ば、配列決定した遺伝子発現のために用いることができ、また配列決定した遺伝 子を含む生物の診断のために用いることができる。しかしながら、配列決定すべ き生物の実体についての知見を必要としない、ヌクレオチド配列決定のための他 の用途での利点が期待される。 発明の要約 本発明により、ヌクレオチド配列が未知である生物の存在について、核酸を含 有する試料をスクリーニングする方法が提供され、該方法は、試料中の全核酸を 配列決定する工程；配列決定工程で得られたヌクレオチド配列を、既知の生物か らのヌクレオチド配列と比較する工程；既知のヌクレオチド配列に対応しないも のとしてヌクレオチド配列の一続きの連なり(continuous run)を同定する工程； 及びそのヌクレオチド配列 の一続きの連なりが、かつてヌクレオチド配列が知られていなかった生物のヌク レオチド配列であることを確認する工程を含む。 本発明の方法は、既知の配列のプローブを用いたハイブリダイゼーションによ り核酸を配列決定する工程を含んでもよい。 本発明の方法は、好ましくは、未知の配列中には見出されるが既知の配列中に は見出されない、一続きのヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を有する オリゴヌクレオチドプローブを構築する工程；かかるオリゴヌクレオチド配列を 包含することが疑われる試料に、ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを厳密 なハイブリダイゼーション条件下で曝露する工程；及び、ラベルしたオリゴヌク レオチドプローブと試料中の核酸との間に、ハイブリダイゼーション複合体が存 在することを同定する工程を含む、確認工程を包含するものである。厳密なハイ ブリダイゼーション条件とは、完全にマッチするヌクレオチド配列がプローブと ハイブリダイズし、マッチしないヌクレオチド配列はハイブリダイズしないとい う結果が得られる、当該技術分野において理解される条件をいう。 本発明の方法は、さらに第２の比較工程を含んでよく、該比較工程において、 ヌクレオチド配列の第２の一続きの連なりが、既知のヌクレオチド配列と比較さ れる。 本発明の確認工程は、未知のヌクレオチド配列の一部と相補的であるが既知の ヌクレオチド配列とは相補的でないオリゴヌクレオチドプローブに、厳密なハイ ブリダイゼーション条件下で試料を曝露する工程；及び、試料の他の画分から、 ラベルしたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする核酸を含む画分を分離する 工程を含んでもよい。本発明の方法は、ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブ を含む画分を顕微鏡にて調べる工程、 ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを含む画分中の核酸を配列決定する工程 、及び／または厳密なハイブリダイゼーション条件下にて第２の試料にラベルし たオリゴヌクレオチドプローブを曝露する工程をさらに含んでもよい。 本発明の方法は、第２の個体からの試料または同じ個体からの第２の試料を得 る工程を含む、第２の曝露工程を含んでもよい。 発明の詳細な説明 核酸及びかかるヌクレオチド配列を単離しクローニングするための方法は、当 業者によく知られているものである。例えば、Ausubelら、Current Protocols i n Molecular Biology、１〜２巻、John Wiley & Sons Publs．(1989)；及びSamb rookら、Molecular Cloning A Laboratory Manual、第２版、１〜３巻、Cold Sp ring Harbor Press(1989)を参照されたい（これら文献を引用することにより、 本明細書に組み入れる）。 ハイブリダイゼーションによる配列決定（「SBH」）は、当該技術分野におい て知られた数多くの方法により実施されうる、充分に開発がなされた方法である 。特に、以下の文献のハイブリダイゼーションによる配列決定に関連する技術を 、参照することにより本明細書に組み入れる： Drmanacら、米国特許第5,202,231号（1993年4月13日発行）；Drmanacら、Genomj cs、４巻、114〜128頁（1989）；Drmanacら、Proceedings of the Fjrst Int'l Conf．Electrophoresjs Supercomputing Human Genome Cantor、 DR & Lim HA編 、World Scientific Pub．Co.、Singpore、47〜59頁（1991）；Drmanacら、Scje nce、260巻、1649〜1652頁（1993）；Lehrachら、Genome Analysjs:Genetjc and Physjcal Mapping、１巻、39〜 81頁（1990）、Cold Spring Harbor Laboratory Press；Drmanacら、Nucl.Acids Res.、4691頁（1986）；Stevanovicら、Gene、79巻、139頁（1989）；Panuesku ら、Mol.Biol.Evol.、１巻、607頁（1990）；Drmanacら、DNA and Cell Biol.、 ９巻、527頁（1990）；Nizeticら、Nucl.Acids Res.、19巻、182頁（1991）；Dr manacら、J.Bjomol.Struct.Dyn.、５巻、1085頁（1991）；Hoheiselら、Mol.Gen .、４巻、125〜132頁（1991）；Strezoskaら、Proc.Nat'l.Acad.Sci．(USA)、88 巻、10089頁（1991）；Drmanacら、Nucl.Acids Res.、19巻、5839頁（1991）及 び；Drmanacら、Int.Genome Res.、１巻、59〜79頁（1992）。 SBH技術は、既知の生物のゲノムの全てまたは一部に対するヌクレオチド配列 情報を得るために適用することができる。このプロセスにおいて、例えば7-マー の、所定の長さを持つ数多くのオリゴヌクレオチドプローブが、ハイブリダイゼ ーション条件下にて、配列決定すべき試料に別々に曝露される。種々の技術を用 いて、所定の長さを有する考えうるプローブの総数を下回る数だけ用いうるが、 結果を改善するためにハイブリダイゼーション条件下にて、ある長さのもの以上 のプローブを曝露することが採用されうる。未知試料の配列すべてを得るために 、ゲル配列決定によりSBHを相補してもよい。 本発明によれば、SBHは核酸の試料に適用され、ヌクレオチド配列が未知であ る１つの生物に由来する核酸を含んでいるかどうかを決定しうる。好ましくは、 試料は１以上のゲノムを含むものである。試料中の核酸に対して得られるヌクレ オチド配列を、考慮より除外されうる既知生物のゲノムに対するヌクレオチド配 列と比較する。試料から得られた一連のヌクレオチド配列であって、既知の生物 に関する既知のヌクレオチド配列のいずれにも対応しない配列により、これまで には未知の生物の存 在が同定される。 そして、SBHによって得られるこれまでには未知の生物に対するヌクレオチド 配列は、該生物の有無を診断するためにラベルしたオリゴヌクレオチドプローブ を作製するのに、また、これまでには未知の生物を同定及び単離する補助手段と して、用いることができる。濾過、遠心及びクロマトグラフィーなどの技術を、 これまでに既知の生物から前記未知生物を分離するために適用することができる 。かかる生物の精製試料を得るために、分離した画分中のこれまでには未知の生 物の存在を同定するマーカーとして、ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを 用いることができる。その生物の精製試料を、これまでには末知の生物の存在の 当初の決定を確かめるために、また、その生物に対するヌクレオチド配列が、ど の程度所望の完全性まで得られたかを立証するために、配列決定するとよい。 SBHによるこれまでには未知の生物の同定は、疾患を惹き起こす誘因に対応す る生物を決定するための診断系(diagnostic setting)においても用いられうる。 同様に、本発明の方法は例えば土壌、空気及び水といった試料中の新規生物を同 定するために適用してもよい。これらを決定することで、土壌、空気または水と いった試料から観察される望ましい効果または望ましくない効果（汚染物の分解 または硝化など）を有する生物をスクリーニングするために使用することができ るようになる。同様に、食物中の有害効果または有益な効果を有する微生物を、 本発明の方法を使用することによって検出することができる。例えば、ある表現 型が所望される場合、その所望の表現型が試料中に存在する場合のSBHに基づい て構築したラベルされたプローブとのハイブリダイゼーションの有無を対比させ ることにより、未知生物の混合物からでも、SBHによって所望の特性を有す る微生物を同定することができる。 実施例 本発明により、疾患症候を呈する被験者からの血液試料をスクリーニングした 。疾患症候に関与するかもしれない微生物を含むことが疑われる血液試料の画分 を調製用に処理して、スクリーニングに有用なcDNAライブラリーを得る。かかる 調製には、ベクターでのDNAクローニング及びクローニングした核酸のPCRによる 増幅が含まれうる。 SBH法を適用した後、配列情報を得る。配列情報は、試料からクローニングし たDNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列の 重複する連なり（１以上の重複するプローブ配列により形成される連続配列であ る連なり）を表すヌクレオチド配列のストレッチの形で提供される。例えばGENB ANK（BBN Laboratories，Inc．10 Moulton Street，Cambridge、マサチューセッ ツ州）または他のヌクレオチド配列の情報源から、既知のヌクレオチド配列が除 外され、一方残った配列はさらに以下の実験に付される。 ある例では、２以上のクローンに由来する配列が部分的に重複するかもしれず 、ここに分岐点が存在することが示唆される。このような分岐点は、試料中の生 物におけるヌクレオチド配列の類似のストレッチを示唆するかもしれず、または 、試料中の２以上の生物における配列の共通部分を示唆するのかもしれない。分 岐点の各枝部分の配列を、既知の配列と比較する。枝部分の配列のヌクレオチド 配列が１つの生物に対する既知のヌクレオチド配列に対応しなければ、該枝部分 のヌクレオチド配列を決定することで未知生物の同定が行われたとみなされる。 ヌクレオチド配列が既知である生物からのヌクレオチド配列 に対応しない、重複配列の非連続的な連なり(discontinuous run)によって、１ より多くの生物が存在することが示唆されうる。このような配列の非連続的な連 なりを、既知の生物からのヌクレオチド配列と比較する。かくして、試料から得 られた配列が既知配列に対応しない限りにおいて、少なくとも１つの生物の存在 が同定される。 未知生物由来であると同定されたヌクレオチド配列の連続的な連なりの独自の 部分に対応するオリゴヌクレオチドプローブや、かかる配列の相補配列に対応す るオリゴヌクレオチドプローブを合成することによって、未知生物の存在が実証 される。このようなプローブを適用して、試料中に決定した配列が存在すること を確認する。このようなプローブは、第１の試料を採取したと同じ個体からの別 の試料、第１の個体と類似する特性を表す疾患症候を有する第２の個体からの試 料、及び、第１の個体と類似の疾患症候を有さない第３の個体からの試料に適用 される。第１及び第２の個体からの試料中のみにヌクレオチド配列が存在し、第 ３の個体からの試料中に該ヌクレオチド配列が存在しないことで、かかる配列が これまでには未知の生物からのものであるとの同定がなされる。 前記核酸を含むとして同定される個体からの試料の画分の同定を行うために、 オリゴヌクレオチドプローブを作製し、使用する。これまでには末知の生物のヌ クレオチド配列と同じかまたはその相補体を有するラベルされたプローブとハイ ブリダイズする画分の含量を、これまでには未知の生物を視覚的に検出するため に顕微鏡技術を用いて調べる。当該技術分野において知られた精製手法で得られ た画分にて、これまでには未知の生物の存在を追跡するために、これまでには未 知の生物を含む画分に分離技術を適用する。前記精製手法は、試料中の既知の生 物からこれまでには未知の生物を分離するものである。 いったん試料中の他の生物を分離すれば、ハイブリダイゼーションによる配列 決定を適用し、これまでには未知の生物の核酸に対応する完全な核酸配列を得る 。 本発明は特定の実施態様で説明を行っている。しかしながら、本願明細書及び 請求の範囲を考慮すれば、当業者が変更や改良を想起することが予期される。例 えば、本明細書中ではSBHを用いる好ましい方法が例示されているが、ゲル配列 決定または他のヌクレオチド配列決定技術を単独で、または互いにもしくはSBH と組み合わせて用いることもできる。従って、本発明のあらゆる変更や改良は、 請求の範囲に包含されることを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヌクレオチド配列が未知である生物の存在について、核酸を含有する試料 をスクリーニングする方法であって、以下の工程すなわち、 試料中の全核酸を配列決定し； 該配列決定工程で得られたヌクレオチド配列を、既知の生物からのヌクレオチ ド配列と比較し； 既知のヌクレオチド配列に対応しないものとしてヌクレオチド配列の一続きの 連なりを同定し；及び 前記ヌクレオチド配列の一続きの連なりが、ヌクレオチド配列がかつて知られ ていなかった生物のヌクレオチド配列であることを確認する工程を含む方法。 ２．前記配列決定工程が、既知の配列のプローブを用いたハイブリダイゼーシ ョンにより核酸を配列決定する工程を含む、請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記確認工程が以下の工程すなわち、 未知の配列中には見出されるが既知の配列中には見出されない、ヌクレオチド の一連の配列またはそれに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを 構築し； 該オリゴヌクレオチド配列を包含することが疑われる試料に、ラベルしたオリ ゴヌクレオチドプローブを厳密なハイブリダイゼーション条件下で曝露し；及び 、 ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブと試料中のこれまでには未知の核酸と の間に、ハイブリダイゼーション複合体が存在することを同定する工程を含む、 請求の範囲第１項記載の方 法。 ４．ヌクレオチドの第２の一続きの連なりが、既知のヌクレオチド配列と比較 される第２の比較工程をさらに含む、請求の範囲第１項記載の方法。 ５．前記確認工程が以下の工程すなわち、 前記未知のヌクレオチド配列の一部と相補的であるが、既知のヌクレオチド配 列とは相補的でないオリゴヌクレオチドプローブに、厳密なハイブリダイゼーシ ョン条件下で試料を曝露し；及び、 試料の他の画分から、ラベルしたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする核 酸を含む画分を分離する工程を含む、請求の範囲第１項記載の方法。 ６．ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを含む画分を顕微鏡にて調べる工 程をさらに含む、請求の範囲第５項記載の方法。 ７．ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを含む画分中の核酸を配列決定す る工程をさらに含む、請求の範囲第５項記載の方法。 ８．厳密なハイブリダイゼーション条件下にて第２の試料にラベルしたオリゴ ヌクレオチドプローブを曝露する、第２の曝露工程をさらに含む、請求の範囲第 ５項記載の方法。 ９．前記第２の曝露工程が、第２の個体からの試料を得る工 程を含む、請求の範囲第８項記載の方法。 １０．前記第２の曝露工程が、同じ個体からの第２の試料を得る工程を含む、請 求の範囲第８項記載の方法。