CN112394115A - 一种聚乙二醇化重组粒细胞刺激因子peg俢饰度的检测方法 - Google Patents

一种聚乙二醇化重组粒细胞刺激因子peg俢饰度的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物分析领域，涉及一种PEG俢饰度的检测方法，具体涉及一种聚乙二醇化重组粒细胞刺激因子的PEG俢饰度的检测方法。本发明以分子排阻色谱法和高效液相色谱法联合应用进行分析检测，本方法操作简单，测定结果准确，稳定性高，耐用性好，专属性高。

Description

一种聚乙二醇化重组粒细胞刺激因子PEG俢饰度的检测方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，涉及一种PEG俢饰度的检测方法，具体涉及一种聚乙二醇化重组粒细胞刺激因子的PEG俢饰度的检测方法。
背景技术
20世纪50年代末期，用化学修饰的方法研究蛋白质分子的结构和功能的关系称为生物化学和分子生物学领域的热点。蛋白质修饰的目的是用于生物医学和生物技术方面。在生物医学方面，化学修饰可以降低免疫原性的免疫反应性、抑制免疫球蛋白E的产生等；在生物技术领域，酶经过化学修饰后能够在有机溶剂中高效地发挥催化作用，并表现出新颖的催化性能。
蛋白质修饰剂与蛋白质发生反应的性质，主要可以分为四种类型：(1)酰化及其相关反应，这类修饰剂可以与蛋白质的侧链基团发生酰基化反应；(2)烷基化反应，这类修饰剂的特点是带有活泼的卤素原子，由于卤素原子的电负性，使烷基带有部分正电荷，很容易导致蛋白质分子的亲核基团发生烷基化；(3)氧化和还原反应，这类修饰剂具有氧化性，能将侧链基团氧化；(4)芳香环取代反应，蛋白质氨基酸残基的酚羟基在3和5位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应。有代表性的修饰剂有乙酰咪唑、卤代乙酸、N-乙基马来酰亚胺碳化二亚胺、焦碳酸二乙酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰亚胺、乙二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯/顺丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、聚氨基酸、葡聚糖、环糊精、聚乙二醇(PEG)等。
其中，聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来，PEG已经被广泛地应用于蛋白多肽类药物的修饰研究，蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性、改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一。由于蛋白质上可以发生PEG修饰的位点较多，因此，反映PEG对蛋白质修饰程度的平均修饰率或PEG结合数，对该类药物构效关系研究与质量控制具有重要意义。修饰蛋白药物的PEG结合数的检测方法有：三硝基苯磺酸法(TNBS法)、荧光胺法、核磁共振、毛细管电泳(CE)、基质辅助激光扫描系统(MALDI-MS)，傅里叶变换红外光谱(FTIR)、拉曼散射光谱等。
李晶等，荧光胺衍生物法测定3种聚乙二醇化重组人生长激素的平均修饰率，药物分析杂志，2014，34(8)，1368-1372；公开了一种通过对游离氨基进行荧光胺衍生化，测定三种不同结构聚乙二醇化重组人生长激素(PEG-rhGH)的平均修饰率，具体的为采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定PEG-rhGH的相对分子质量，求得理论平均修饰率，通过激发波长与发射波长的选取、正交试验、游离PEG干扰试验、反应稳定性考察等方法学考察，建立荧光胺衍生法测定PEG-rhGH平均修饰率。
李永红等，聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子平均俢饰度高效液相色谱蒸发光散射检测方法的建立及验证，中国生物制品学杂质，2018年7月第31卷第7期，758-762；公开了一种高效液相蒸发光散射(HPLC-ELSD)检测方法，采用Jupiter 5u C4 300A色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以含0.1％三氟乙酸(TFA)的水溶液为A流动相，含0.1％TFA的乙腈为B流动相，流速1mL/min，在35℃柱温条件下经分段线性洗脱的方式分离样品，蒸发光散射器漂移管温度90℃，载气流速2.0L/min，用外标法和双对数校正曲线定量溶液中游离PEG含量。采用蛋白酶K消化去除PEG-rhG-CSF的蛋白部分后，经相同方法测定溶液中的总PEG含量，并计算结合PEG的含量和PEG的平均俢饰度。
CN108267590A公开了一种PEG修饰蛋白的PEG结合数检测方法，将待测PEG修饰蛋白样品处理后将PEG全部释放出来，检测PEG的含量，通过蛋白及PEG的摩尔比推算出PEG修饰蛋白中PEG结合数。该方法需要将待测样品进行处理，再对其处理后的样品测算游离PEG含量。
CN106645536A公开了一种低分子量PEG修饰剂含量测定方法，该方法主要针对分子量为2000以内的PEG修饰剂。
以上方法中，三硝基苯磺酸法容易受反应pH、温度、时间及蛋白质在修饰前后构象变化的影响较大，测定结果一般偏高；荧光胺法中丙酮易挥发，荧光胺对水很敏感，荧光值不稳定，测定结果重复性较差；质谱法与核磁共振法测定结果较为准确，但仪器昂贵，很难应用于研发和生产。因此急需提供一种操作简单，结果准确，重复性高，方法稳定的PEG俢饰度的检测方法应用于产品的质量控制中。
发明内容
基于现有技术中PEG修饰蛋白中PEG修饰率检测方法中的成本较高、检测结果不稳定、重复性差、灵敏度低等缺陷，本发明提供一种操作简单、结果准确，重复性高的PEG修饰度的检测方法。
本发明的发明目的是这样实现的。建立SEC-HPLC/RI-UV联用测定聚乙二醇化修饰蛋白的PEG修饰度的方法。
聚乙二醇化重组蛋白中蛋白RI和UV吸收值均与蛋白浓度呈线性相关，PEG的RI吸收值与PEG浓度也成线性相关，且PEG修饰后PEG部分与蛋白部分各自在RI和UV中的吸收互不干扰。即：聚乙二醇化重组蛋白中PEG部分没有UV吸收，相同蛋白含量的聚乙二醇化重组蛋白的UV吸收值与未修饰蛋白UV吸收值相同，聚乙二醇化修饰蛋白的RI吸收值为PEG部分和中间体蛋白部分RI吸收值之和；因此建立一种SEC-HPLC/RI-UV联用测定PEG俢饰度的方法。通过测定蛋白中间体的UV、RI吸收值，PEG的RI吸收值，PEG化蛋白的UV、RI吸收值等，计算出PEG化蛋白中蛋白部分和PEG部分的绝对含量，再通过计算蛋白部分和PEG部分的摩尔含量比得出PEG修饰个数，根据蛋白中共有的修饰位点个数，PEG修饰个数与修饰位点个数的比值即为PEG修饰度。
一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子PEG俢饰度的检测方法，采用分子排阻色谱法和高效液相色谱法联合应用进行分析检测。
一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子PEG俢饰度的检测方法，以硅胶柱为填料的色谱柱，以无机盐缓冲溶液-有机溶剂体系为流动相，检测器为紫外检测器与示差遮光检测器联用，以检测波长为280nm进行分析检测。
优选地，所述检测方法所用的色谱柱以硅胶为填料；进一步优选地，所述的色谱柱为TSKgel G3000SWXL，TSKgel G2000SWXL，TSKgel G2500SWXL；色谱柱规格为7.8mmI.D.×30cm，5μm。
优选地，所述检测方法以无机盐缓冲体系即A相与有机溶剂即B相的混合溶液为流动相。
进一步优选地，所述检测方法中流动相A相为无机盐缓冲体系为磷酸盐缓冲体系；浓度为0.005～0.02mol/L，pH为6.80～7.05；更加优选为0.01mol/L磷酸缓冲液，pH为6.90。
优选地，所述检测方法中流动相B相有机溶剂为甲醇或乙醇，进一步优选为乙醇。
更加优选地，所述无机盐缓冲溶液A相中还加入氯化钠或硫酸钠，以改善检测过程中检测峰拖尾的现象；优选地，所述氯化钠或硫酸钠的浓度为0.05～0.2mol/L。
优选地，所述的检测方法中流动相A相无机盐缓冲溶液与B相有机溶剂的体积比为80～100:20～0。
进一步优选地，所述流动相中A相无机盐缓冲溶液与B相有机溶剂的体积比为90:10。
优选地，所述的检测方法流动相流速为0.4～0.6mL/min，进一步优选为0.5ml/min。
优选地，所述的检测方法色谱柱柱温为20～30℃，示差遮光散射器的温度为30～40℃；进一步优选色谱柱柱温为25℃，示差遮光散射器温度为35℃。
优选地，所述的的检测方法紫外检测器的检测波长为280nm。
优选地，所述的检测方法进样量为10～20μL。
一种聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子俢饰度的检测方法，可通过以下步骤实现。
(1)样品溶液的制备：
A：称取约25mg的mPEG-丁醛(20KDa)作为对照品，置25ml量瓶中，加A相缓冲盐溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为mPEG-丁醛(20KDa)储备液；精密量取mPEG-丁醛(20KDa)储备液5ml，置10ml量瓶中，加A相缓冲盐溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL中约含0.5mg的溶液为PEG对照品溶液。
B：取未被PEG修饰的rhG-CSF对照品1支，用A相溶液稀释至每1mL中含有0.5mg样品的溶液为rhG-CSF中间体样品溶液。
C：用A相溶液将已知蛋白含量的PEG-rhG-CSF原液稀释至每1mL中含0.5mg样品的溶液为PEG-rhG-CSF原液样品溶液。
(2)SEC-HPLC/RI-UV检测，记录结果：
将上述PEG对照品溶液，rhG-CSF中间体样品溶液及PEG-rhG-CSF原液样品溶液分别进行SEC-HPLC检测，分别记录UV色谱图和RI色谱图的峰面积；
检测条件为：
色谱柱：硅胶色谱柱；
色谱柱柱温：20～30℃；
示差散射器温度：30～40℃；
流动相：0.005～0.02mol/L磷酸盐缓冲液(含有0.05～0.2mol/L的氯化钠或硫酸钠，)-乙醇体系(80～100):(20～0)；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.4～0.6mL/min；
检测波长：280nm；
进样量：10～20μL。
在一个优选的实施方案中，所述检测条件为：
色谱柱：TSKgel G3000SWXL；
色谱柱柱温：25℃；
示差散射器温度：35℃；
流动相：0.005～0.02mol/L磷酸盐缓冲液(含有0.05～0.2mol/L的氯化钠或硫酸钠，)-乙醇体系＝90:10；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.5mL/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μL。
(3)俢饰度结果推算
测定并记录中间体溶液UV峰面积和RI峰面积，蛋白原液溶液UV峰面积和RI峰面积，以及PEG样品溶液的RI峰面积。
①因蛋白原液中的PEG部分在波长280nm处没有UV吸收，相同蛋白含量的蛋白原液的UV吸收值与修饰前中间体的UV吸收值相同，通过单点外标法计算出蛋白原液中的中间体蛋白部分的含量：
Figure BDA0002171163450000051
②因蛋白原液、中间体溶液的RI吸收值与相对应的浓度均呈线性关系，通过单点外标法可计算出蛋白原液中的中间体蛋白部分提供的RI值
Figure BDA0002171163450000052
将①式中的C原-中代入后，得出蛋白原液中的中间体蛋白部分提供的RI值为
Figure BDA0002171163450000053
③因蛋白原液的RI吸收值为蛋白原液中PEG部分RI吸收值和蛋白原液中F中间体蛋白部分RI吸收值之和，可计算出蛋白原液中的PEG部分RI吸收值为RI原-PEG＝RI原-RI原-中，将②式中的RI原-中代入后，得出蛋白原液中PEG部分RI吸收值为
Figure BDA0002171163450000054
④因PEG的RI吸收值与相对应的浓度呈线性关系，通过单点外标法可计算出蛋白原液中PEG部分的含量为
Figure BDA0002171163450000061
将③式中的RI原-PEG代入后，得出蛋白原液中的PEG部分的含量为
Figure BDA0002171163450000062
⑤PEG修饰个数即为蛋白原液中PEG部分的摩尔数/蛋白原液中中间体蛋白部分的摩尔数，在根据中间体蛋白中修饰位点个数n，计算得出的PEG修饰个数与n的比值即为PEG修饰度(其中：摩尔数为含量与摩尔质量的比值，蛋白原液中PEG部分的摩尔数＝C原-PEG/MPEG；蛋白原液中中间体蛋白部分的摩尔数＝C原-中/M中)。即
Figure BDA0002171163450000063
将①式中的C原-中及④式中的C原-PEG代入⑤式可计算出蛋白原液中PEG修饰度为
Figure BDA0002171163450000064
式中：M中为中间体蛋白的理论分子量；
MPEG为PEG实际测定分子量(Da)；
CPEG为PEG浓度(mg/ml)；
C中为中间体蛋白质含量，0.5mg/ml；
UV原为蛋白原液UV峰面积；
RI原为蛋白原液RI峰面积；
UV中为中间体蛋白UV峰面积；
RI中为中间体蛋白RI峰面积；
RIPEG为PEG RI峰面积；
n为中间体蛋白修饰位点个数。
本发明所述分子排阻色谱法和高效液相色谱法联合应用进行分析检测PEG俢饰度的方法，不仅适用于聚乙二醇化重组粒细胞刺激因子，同样适用于PEG修饰过氧歧化酶，PEG修饰天冬酰胺酶，PEG修饰尿酸酶，PEG修饰白细胞介素-2等。
本发明SEC-HPLC/RI-UV联用测定PEG俢饰度的检测方法，操作简单，测定结果准确，稳定性高，耐用性好，专属性高。
附图说明
图1：实施例1的PEG-RI色谱图；
图2：实施例1的rhG-CSF中间体-RI色谱图；
图3：实施例1的PEG-rhG-CSF原液-RI色谱图；
图4：实施例1的rhG-CSF中间体-UV色谱图；
图5：实施例1的PEG-rhG-CSF原液-UV色谱图；
图6：实施例2的PEG-RI色谱图；
图7：实施例2的rhG-CSF中间体-RI色谱图；
图8：实施例2的PEG-rhG-CSF原液-RI色谱图；
图9：实施例2的rhG-CSF中间体-UV色谱图；
图10：实施例2的PEG-rhG-CSF原液-UV色谱图；
图11：实施例3的PEG-RI色谱图；
图12：实施例3的rhG-CSF中间体-RI色谱图；
图13：实施例3的PEG-rhG-CSF原液-RI色谱图；
图14：实施例3的rhG-CSF中间体-UV色谱图；
图15：实施例3的PEG-rhG-CSF原液-UV色谱图；
图16：实施例4的PEG-RI色谱图；
图17：实施例4的rhG-CSF中间体-RI色谱图；
图18：实施例4的PEG-rhG-CSF原液-RI色谱图；
图19：实施例4的rhG-CSF中间体-UV色谱图；
图20：实施例4的PEG-rhG-CSF原液-UV色谱图；
图21：实施例5的PEG-RI色谱图；
图22：实施例5的rhG-CSF中间体-RI色谱图；
图23：实施例5的PEG-rhG-CSF原液-RI色谱图；
图24：实施例5的rhG-CSF中间体-UV色谱图；
图25：实施例5的PEG-rhG-CSF原液-UV色谱图；
图26：实施例6的PEG-RI色谱图；
图27：实施例6的rhG-CSF中间体-RI色谱图；
图28：实施例6的PEG-rhG-CSF原液-RI色谱图；
图29：实施例6的rhG-CSF中间体-UV色谱图；
图30：实施例6的PEG-rhG-CSF原液-UV色谱图；
图31：实施例7的PEG-RI色谱图；
图32：实施例7的rhG-CSF中间体-RI色谱图；
图33：实施例7的PEG-rhG-CSF原液-RI色谱图；
图34：实施例7的rhG-CSF中间体-UV色谱图；
图35：实施例7的PEG-rhG-CSF原液-UV色谱图。
具体实施方式
下面以具体实施例的方式进一步阐述本发明，应当理解为以下实施例仅用于例证的目的，不用来限制本发明。
本发明所述rhG-CSF对照品及PEG-rhG-CSF原液可参考现有技术制备，其他试剂或原料或材料、HPLC色谱柱等除非特殊说明均可通过商业途径获得。
以下实施例所用的rhG-CSF对照品的蛋白含量为1.98mg/ml，PEG-rhG-CSF工作对照品蛋白含量为1.94mg/ml，PEG-rhG-CSF原液的蛋白含量为4.0mg/ml。HPLC色谱仪型号：Thermo Ultimate 3000。
实施例1
1、样品溶液配制：
(1)对照品溶液的配制
流动相A相：称取磷酸二氢钠0.480g、磷酸氢二钠2.149g、氯化钠6.43g，加入适量水溶解，氢氧化钠或磷酸调pH6.90，加水稀释至1L，0.45μm滤膜过滤所得溶液即为流动相A相。
PEG对照品溶液：称取mPEG-丁醛(20KDa)对照品25.00mg，置25ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为mPEG-丁醛(20KDa)储备液；精密量取mPEG-丁醛储备液5ml，置10ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml中含约0.5mg的mPEG-丁醛的PEG对照品溶液。
rhG-CSF中间体对照品溶液：用流动相A相将rhG-CSF工作对照品逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的rhG-CSF的溶液，作为rhG-CSF中间体对照品溶液。
(2)PEG-rhG-CSF原液样品溶液的配制
用流动相A相将PEG-rhG-CSF原液逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的PEG-rhG-CSF，即为PEG-rhG-CSF原液样品溶液。
2、SEC-HPLC/RI-UV检测，记录结果：
将上述rhG-CSF工作对照品溶液，PEG-rhG-CSF原液样品溶液和PEG对照品溶液分别进行SEC-HPLC检测，分别记录UV色谱图和RI色谱图的峰面积；
检测条件为：
色谱柱：TSKgel G3000SWXL；色谱柱规格为7.8mmI.D.×30cm，5μm；
色谱柱柱温：25℃；
示差散射器温度35℃；
流动相：流动相A相：乙醇＝90:10；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.5mL/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μL。
(3)俢饰度结果计算
步骤(2)所得HPLC色谱图、RI色谱图见图1-5。将步骤(2)测得的峰面积代入PEG俢饰度检测方程式即得待测样品的PEG俢饰度为20.04％。
实施例2
1、样品溶液配制：
(1)对照品溶液的配制
流动相A相：称取磷酸二氢钾0.816g、磷酸氢二钾0.913g、氯化钠11.69g，加入适量水溶解，氢氧化钾或磷酸调pH6.80，加水稀释至1L，0.45μm滤膜过滤所得溶液即为流动相A相。
PEG对照品溶液：称取mPEG-丁醛(20KDa)对照品25.00mg，置25ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为mPEG-丁醛(20KDa)储备液；精密量取mPEG-丁醛储备液5ml，置10ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml中含约0.5mg的mPEG-丁醛的PEG对照品溶液。
rhG-CSF中间体对照品溶液：用流动相A相将rhG-CSF工作对照品逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的rhG-CSF的溶液，作为rhG-CSF中间体对照品溶液。
(2)PEG-rhG-CSF原液样品溶液的配制
用流动相A相将PEG-rhG-CSF原液逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的PEG-rhG-CSF，即为PEG-rhG-CSF原液样品溶液。
2、SEC-HPLC/RI-UV检测，记录结果：
将上述对照品溶液，蛋白原液样品溶液和PEG样品溶液分别进行SEC-HPLC检测，分别记录UV色谱图和RI色谱图的峰面积；
检测条件为：
色谱柱：TSKgel G2000SWXL；色谱柱规格为7.8mmI.D.×30cm，5μm；
色谱柱柱温：20℃；
示差散射器温度30℃；
流动相：流动相A相；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.6mL/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μL。
(3)俢饰度结果计算
步骤(2)所得HPLC色谱图、RI色谱图见图6-10。将步骤(2)测得的峰面积代入PEG俢饰度检测方程式即得待测样品的PEG俢饰度19.30％。
实施例3
1、样品溶液配制：
(1)对照品溶液的配制
流动相A相：称取磷酸钠3.279g、氯化钠5.84g，加入适量水溶解，氢氧化钠或磷酸调pH6.95，加水稀释至1L，0.45μm滤膜过滤所得溶液即为流动相A相。
PEG对照品溶液：称取mPEG-丁醛(20KDa)对照品25.00mg，置25ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为mPEG-丁醛(20KDa)储备液；精密量取mPEG-丁醛储备液5ml，置10ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml中含约0.5mg的mPEG-丁醛的PEG对照品溶液。
rhG-CSF中间体对照品溶液：用流动相A相将rhG-CSF工作对照品逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的rhG-CSF的溶液，作为rhG-CSF中间体对照品溶液。
(2)PEG-rhG-CSF原液样品溶液的配制
用流动相A相将PEG-rhG-CSF原液逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的PEG-rhG-CSF，即为PEG-rhG-CSF原液样品溶液。
2、SEC-HPLC/RI-UV检测，记录结果：
将上述对照品溶液，蛋白原液样品溶液和PEG样品溶液分别进行SEC-HPLC检测，分别记录UV色谱图和RI色谱图的峰面积；
检测条件为：
色谱柱：TSKgel G2500SWXL；色谱柱规格为7.8mmI.D.×30cm，5μm；
色谱柱柱温：30℃；
示差散射器温度40℃；
流动相：流动相A相：乙醇＝95:5；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.5mL/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μL。
(3)俢饰度结果计算
步骤(2)所得HPLC色谱图、RI色谱图见图11-15。将步骤(2)测得的峰面积代入PEG俢饰度检测方程式即得待测样品的PEG俢饰度为19.82％。
实施例4
1、样品溶液配制：
(1)对照品溶液的配制
流动相A相：称取磷酸钾1.061g，氯化钠2.92g，加入适量水溶解，氢氧化钾或磷酸调pH7.05，加水稀释至1L，0.45μm滤膜过滤所得溶液即为流动相A相。
PEG对照品溶液：称取mPEG-丁醛(20KDa)对照品25.00mg，置25ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为mPEG-丁醛(20KDa)储备液；精密量取mPEG-丁醛储备液5ml，置10ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml中含约0.5mg的mPEG-丁醛的PEG对照品溶液。
rhG-CSF中间体对照品溶液：用流动相A相将rhG-CSF工作对照品逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的rhG-CSF的溶液，作为rhG-CSF中间体对照品溶液。
(2)PEG-rhG-CSF原液样品溶液的配制
用流动相A相将PEG-rhG-CSF原液逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的PEG-rhG-CSF，即为PEG-rhG-CSF原液样品溶液。
2、SEC-HPLC/RI-UV检测，记录结果：
将上述对照品溶液，蛋白原液样品溶液和PEG样品溶液分别进行SEC-HPLC检测，分别记录UV色谱图和RI色谱图的峰面积；
检测条件为：
色谱柱：TSKgel G3000SWXL；色谱柱规格为7.8mmI.D.×30cm，5μm；
色谱柱柱温：25℃；
示差散射器温度35℃；
流动相：流动相A相：甲醇＝80:20；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.5mL/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μL。
(3)俢饰度结果计算
步骤(2)所得HPLC色谱图、RI色谱图见图16-20。将步骤(2)测得的峰面积代入PEG俢饰度检测方程式即得待测样品的PEG俢饰度为19.45％。
实施例5
1、样品溶液配制：
(1)对照品溶液的配制
流动相A相：称取磷酸二氢钠0.480g、磷酸氢二钠2.149g、氯化钠6.43g，加入适量水溶解，氢氧化钠或磷酸调pH6.90，加水稀释至1L，0.45μm滤膜过滤所得溶液即为流动相A相。
PEG对照品溶液：称取mPEG-丁醛(20KDa)对照品25.00mg，置25ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为mPEG-丁醛(20KDa)储备液；精密量取mPEG-丁醛储备液5ml，置10ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml中含约0.5mg的mPEG-丁醛的PEG对照品溶液。
rhG-CSF中间体对照品溶液：用流动相A相将rhG-CSF工作对照品逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的rhG-CSF的溶液，作为rhG-CSF中间体对照品溶液。
(2)PEG-rhG-CSF原液样品溶液的配制
用流动相A相将PEG-rhG-CSF原液逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的PEG-rhG-CSF，即为PEG-rhG-CSF原液样品溶液。
2、SEC-HPLC/RI-UV检测，记录结果：
将上述对照品溶液，蛋白原液样品溶液和PEG样品溶液分别进行SEC-HPLC检测，分别记录UV色谱图和RI色谱图的峰面积；
检测条件为：
色谱柱：TSKgel G3000SWXL；色谱柱规格为7.8mmI.D.×30cm，5μm；
色谱柱柱温：25℃；
示差散射器温度35℃；
流动相：流动相A相：乙醇＝90:10；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.4mL/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μL。
(3)俢饰度结果计算
步骤(2)所得HPLC色谱图、RI色谱图见图21-25。将步骤(2)测得的峰面积代入PEG俢饰度检测方程式即得待测样品的PEG俢饰度为20.24％。
实施例6
1、样品溶液配制：
(1)对照品溶液的配制
流动相A相：称取磷酸二氢钾0.816g、磷酸氢二钾0.913g、氯化钠5.84g，加入适量水溶解加入适量水溶解，氢氧化钾或磷酸调pH6.90，加水稀释至1L，0.45μm滤膜过滤所得溶液即为流动相A相。
PEG对照品溶液：称取mPEG-丁醛(20KDa)对照品25.00mg，置25ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为mPEG-丁醛(20KDa)储备液；精密量取mPEG-丁醛储备液5ml，置10ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml中含约0.5mg的mPEG-丁醛的PEG对照品溶液。
rhG-CSF中间体对照品溶液：用流动相A相将rhG-CSF工作对照品逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的rhG-CSF的溶液，作为rhG-CSF中间体对照品溶液。
(2)PEG-rhG-CSF原液样品溶液的配制
用流动相A相将PEG-rhG-CSF原液逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的PEG-rhG-CSF，即为PEG-rhG-CSF原液样品溶液。
2、SEC-HPLC/RI-UV检测，记录结果：
将上述对照品溶液，蛋白原液样品溶液和PEG样品溶液分别进行SEC-HPLC检测，分别记录UV色谱图和RI色谱图的峰面积；
检测条件为：
色谱柱：TSKgel G3000SWXL；色谱柱规格为7.8mmI.D.×30cm，5μm；
色谱柱柱温：25℃；
示差散射器温度35℃；
流动相：流动相A相：乙醇＝90:10；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.6mL/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μL。
(3)俢饰度结果计算
步骤(2)所得HPLC色谱图、RI色谱图见图26-30。将步骤(2)测得的峰面积代入PEG俢饰度检测方程式即得待测样品的PEG俢饰度为19.91％。
实施例7
1、样品溶液配制：
(1)对照品溶液的配制
流动相A相：称取磷酸二氢钠0.480g、磷酸氢二钠2.149g、氯化钠6.43g，加入适量水溶解，氢氧化钠或磷酸调pH7.50，加水稀释至1L，0.45μm滤膜过滤所得溶液即为流动相A相。
PEG对照品溶液：称取mPEG-丁醛(20KDa)对照品25.00mg，置25ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为mPEG-丁醛(20KDa)储备液；精密量取mPEG-丁醛储备液5ml，置10ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml中含约0.5mg的mPEG-丁醛的PEG对照品溶液。
rhG-CSF中间体对照品溶液：用流动相A相将rhG-CSF工作对照品逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的rhG-CSF的溶液，作为rhG-CSF中间体对照品溶液。
(2)PEG-rhG-CSF原液样品溶液的配制
用流动相A相将PEG-rhG-CSF原液逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的PEG-rhG-CSF，即为PEG-rhG-CSF原液样品溶液。
2、SEC-HPLC/RI-UV检测，记录结果：
将上述对照品溶液，蛋白原液样品溶液和PEG样品溶液分别进行SEC-HPLC检测，分别记录UV色谱图和RI色谱图的峰面积；
检测条件为：
色谱柱：TSKgel G5000SWXL；色谱柱规格为7.8mmI.D.×30cm，5μm；
色谱柱柱温：25℃；
示差散射器温度35℃；
流动相：流动相A相：甲醇＝75:25；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.5mL/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μL。
(3)俢饰度结果计算
步骤(2)所得HPLC色谱图、RI色谱图见图31-35。将步骤(2)测得的峰面积代入PEG俢饰度检测方程式即得待测样品的PEG俢饰度为21.07％。
验证实施例
1、样品溶液配制：
(1)对照品溶液的配制
流动相A相：称取磷酸二氢钠0.480g、磷酸氢二钠2.149g、氯化钠6.43g，加入适量水溶解，氢氧化钠或磷酸调pH6.90，加水稀释至1L，0.45μm滤膜过滤所得溶液即为流动相A相。
PEG对照品溶液：称取mPEG-丁醛(20KDa)对照品25.00mg，置25ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为mPEG-丁醛(20KDa)储备液；精密量取mPEG-丁醛储备液5ml，置10ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml中含约0.5mg的mPEG-丁醛的PEG对照品溶液。
rhG-CSF中间体对照品溶液：用流动相A相将rhG-CSF工作对照品逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的rhG-CSF的溶液，作为rhG-CSF中间体对照品溶液。
(2)PEG-rhG-CSF原液样品溶液的配制
用流动相A相将PEG-rhG-CSF原液逐步稀释至每1ml中含有0.5mg的PEG-rhG-CSF，即为PEG-rhG-CSF原液样品溶液。
2、SEC-HPLC/RI-UV检测，
色谱检测条件如实施例1，具体为：
色谱柱：TSKgel G3000SWXL；色谱柱规格为7.8mmI.D.×30cm，5μm；
色谱柱柱温：25℃；
示差散射器温度35℃；
流动相：流动相A相：乙醇＝90:10；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.5mL/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μL。
3、系统适用性试验
配制PEG对照品溶液、rhG-CSF中间体对照品溶液、PEG-rhG-CSF原液对照品溶液，依法连续进样5次，按照上述实施例1的色谱条件进行检测分析，记录rhG-CSF中间体UV峰面积、RI峰面积；PEG-rhG-CSF原液UV峰面积、RI峰面积；PEG的RI峰面积。结果见表1。
表1系统适用性试验测定结果
Figure BDA0002171163450000161
从表1结果可以看出，PEG、RI主峰面积的RSD％为0.79％；rhG-CSF中间体主峰UV峰面积的RSD％为0.4％。RI峰面积的RSD％为1.77％；PEG-rhG-CSF原液主峰UV峰面积的RSD％为0.35％，RI峰面积的RSD％为0.22％；均小于2.0％，表明该方法系统适用性良好。
4、线性试验
①PEG对照品溶液：称取mPEG-丁醛(20KDa)对照品约25mg，置25ml量瓶中，加流动相A相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为mPEG-丁醛(20KDa)储备液；分别取mPEG-丁醛(20KDa)储备液200μl、400μl、600μl、800μl、1000μl置于1.5ml离心管中，补加溶液A至1ml，混匀，制成每1ml中约含0.2mg、0.4mg、0.6mg、0.8mg、1.0mg的溶液为PEG线性溶液，分别取20μl注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行检测分析，记录RI色谱图，以mPEG-丁醛主峰的RI峰面积对应其相应的mPEG-丁醛浓度做线性回归，求得线性回归方程和线性相关系数，结果见表2。
②rhG-CSF中间体对照品溶液：取rhG-CSF工作对照品，用流动相A稀释至每1ml中含1.0mg的溶液为rhG-CSF中间体对照品储备液；分别取rhG-CSF中间体对照品储备液200μl、400μl、600μl、800μl、1000μl置于1.5ml离心管中，补加流动相A至1ml，混匀，制成每1ml中含0.2mg、0.4mg、0.6mg、0.8mg、1.0mg的溶液为rhG-CSF中间体对照线性溶液，分别取20μl注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行检测分析，记录UV色谱图峰面积和RI色谱图，以rhG-CSF中间体主峰的UV峰面积对应其相应的rhG-CSF中间体浓度做线性回归，求得线性回归方程和线性相关系数，结果见表3。以rhG-CSF中间体主峰的RI峰面积对应其相应的rhG-CSF中间体浓度做线性回归，求得线性回归方程和线性相关系数，结果见表4。
③PEG-rhG-CSF原液对照品溶液：取PEG-rhG-CSF工作对照品，用流动相A稀释至每1ml中含1.0mg的溶液为PEG-rhG-CSF原液对照品储备液；分别取PEG-rhG-CSF原液对照品储备液200μl、400μl、600μl、800μl、1000μl置于1.5ml离心管中，补加流动相A至1ml，混匀，制成每1ml中含0.2mg、0.4mg、0.6mg、0.8mg、1.0mg的溶液为PEG-rhG-CSF原液对照品线性溶液，分别取20μl注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行检测分析，记录UV色谱图和RI色谱图，以PEG-rhG-CSF原液主峰的UV峰面积对应其相应的PEG-rhG-CSF原液浓度做线性回归，求得线性回归方程和线性相关系数，结果见表5。以PEG-rhG-CSF原液主峰的RI峰面积对应其相应的PEG-rhG-CSF原液浓度做线性回归，求得线性回归方程和线性相关系数，结果见表6。
表2 PEG对照品溶液RI峰面积与浓度的线性关系
Figure BDA0002171163450000171
表3 rhG-CSF中间体UV峰面积与浓度的线性关系
Figure BDA0002171163450000172
表4 rhG-CSF中间体RI峰面积与浓度的线性关系
Figure BDA0002171163450000181
表5 PEG-rhG-CSF原液UV峰面积与浓度的线性关系
Figure BDA0002171163450000182
表6 PEG-rhG-CSF原液RI峰面积与浓度的线性关系
Figure BDA0002171163450000183
从表2-6的结果可以看出，PEG-RI、rhG-CSF中间体UV和RI、PEG-rhG-CSF原液UV和RI的线性回归方程R2≥0.999，线性关系良好。
5、精密度试验
(1)重复性试验
操作者A配制浓度为0.5mg/ml的PEG对照品溶液6份、浓度为0.5mg/ml的rhG-CSF中间体对照品溶液6份、PEG-rhG-CSF原液供试品溶液6份，按照上述色谱条件进行检测分析，记录PEG主峰的RI峰面积、rhG-CSF中间体主峰的RI峰面积和UV峰面积、PEG-rhG-CSF原液主峰的RI峰面积和UV峰面积，根据计算公式依法计算出PEG-rhG-CSF原液的PEG修饰度。
(2)中间精密度试验
操作者A、B分别于第二天各配制浓度为0.5mg/ml的PEG对照品溶液6份、浓度为0.5mg/ml的rhG-CSF中间体对照品溶液6份、PEG-rhG-CSF原液供试品溶液6份，按照上述色谱条件进行检测分析，记录PEG主峰的RI峰面积、rhG-CSF中间体主峰的RI峰面积和UV峰面积、PEG-rhG-CSF原液主峰的RI峰面积和UV峰面积，根据计算公式依法计算出PEG-rhG-CSF原液的PEG修饰度。重复性试验及中间精密度试验结果见表7。
表7精密度试验结果
Figure BDA0002171163450000184
Figure BDA0002171163450000191
重复性试验中PEG-rhG-CSF原液PEG修饰度的RSD％为0.97％，精密度试验中PEG-rhG-CSF原液PEG修饰度的RSD％为1.54％，表明该方法的精密度良好。
6、稳定性试验
依法配制mPEG-丁醛(20KDa)溶液、rhG-CSF中间体对照品溶液、PEG-rhG-CSF原液供试品溶液，室温下放置8小时，按照上述色谱条件分别于0、2h、4h、6h和8h进样分析，记录PEG的RI峰面积、rhG-CSF中间体UV峰面积和RI峰面积、PEG-rhG-CSF原液UV峰面积和RI峰面积，计算峰面积的标准偏差及PEG俢饰度，结果见表8。
表8稳定性试验结果
Figure BDA0002171163450000192
Figure BDA0002171163450000201
从表8结果可知，PEG的RI峰面积RSD为0.18％；rhG-CSF中间体UV峰面积RSD％为0.14％，RI峰面积的RSD％为0.73％；PEG-rhG-CSF原液UV峰面积RSD％为0.36％，RI峰面积RSD％为0.63％；PEG-rhG-CSF原液PEG修饰度的RSD％为1.64％，本发明的方法稳定性良好。
经过验证，本发明的其他技术方案也能达到与实施例1类似的技术效果，其稳定性，耐用性，专属性均较好。

Claims (10)

1.一种聚乙二醇化重组粒细胞刺激因子PEG俢饰度的检测方法，其特征在于，通过色谱柱，将分子排阻色谱法和高效液相色谱法联合应用进行分析检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的填料为硅胶柱，其以无机盐缓冲溶液A相与有机溶剂B相的混合溶液为流动相；所述高效液相色谱的检测器为紫外检测器，所述分子排阻色谱的检测器为示差折光检测器，以检测波长280nm进行分析检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为TSKgel G3000SWXL，TSKgelG2000SWXL或TSKgel G2500SWXL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的流动相A相为磷酸盐缓冲溶液，浓度为0.005～0.02mol/L，pH为6.80～7.05。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述流动相B相为甲醇或乙醇，优选为乙醇。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述流动相A相无机盐缓冲溶液与B相有机溶剂的体积比100～80:0～20。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.4～0.6mL/min。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为20～30℃，所述示差遮光检测器的温度为30～40℃。
9.根据权利要求2～8任一项所述的方法，其特征在于，所述无机盐缓冲溶液A相中还加入氯化钠或硫酸钠，所述氯化钠或硫酸钠的浓度为0.05～0.2mol/L。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该方法同样适用于PEG修饰过氧歧化酶，PEG修饰天冬酰胺酶，PEG修饰尿酸酶，PEG修饰白细胞介素-2的PEG俢饰度的检测。
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