CN109696500A - 采用高效液相色谱法测定目标杂质校正因子的方法及其应用 - Google Patents

采用高效液相色谱法测定目标杂质校正因子的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在杂质对照品难以获得的情况下，采用高效液相色谱法测定特定杂质校正因子的方法，具体是在主成分转化为特定杂质的反应中，通过控制反应条件如稀释溶剂、反应时间、溶液浓度等，以杂质峰面积的增加值为自变量，主成分峰面积的减少值为因变量进行线性回归分析，然后由线性方程的斜率、主成分和待测杂质的相对分子质量及转化反应的摩尔系数计算出特定杂质的校正因子。本发明在对转化反应条件进行考察和优化的基础上，成功测定了头孢地尼原料药中目标杂质的校正因子，取得了满意的结果，与传统方法相比，本发明无需杂质对照品，且结果准确，操作简单，应用范围广阔。

Description

采用高效液相色谱法测定目标杂质校正因子的方法及其应用
技术领域
本发明属于药物分析技术，特别是涉及一种在杂质对照品难以获得的情况下，采用高效液相色谱法测定特定杂质校正因子的方法。
背景技术
在进行药物的有关物质检查时，多采用高效液相色谱法，其计算方法有外标法、面积归一化法、不加校正因子的自身稀释对照法、加校正因子的自身稀释对照法。其中，加校正因子的自身稀释对照法充分考虑到杂质与主成分在特定波长下紫外响应的差异，定量结果准确可靠，是目前比较常用的杂质定量方法。因此，对于特定杂质的控制，校正因子的研究和测定是非常必要的。
通常，校正因子的测定多采用对照品标准曲线法。将主成分对照品和各杂质对照品配制成一定浓度的储备液，逐步稀释成系列线性溶液。分别进样后按照最小二乘法以响应值(如峰面积)对浓度进行线性回归，绘制主成分和各杂质的线性标准曲线。主成分和各杂质线性方程斜率的比值即为各杂质的校正因子。该方法既验证了主成分和杂质的线性，又可得到准确的校正因子，是目前较为常用的方法。
然而，在实际工作中，杂质对照品的获得通常需要较高成本。除此之外，很多主药的稳定性杂质如光降解杂质往往性质不稳定，难以制备纯度较高的对照品，这给杂质的准确定量带来了较大的难度。因此，迫切需要找到一种方法，能够在杂质对照品无法获得的情况下准确、快速、简便地对杂质的校正因子进行估测，从而实现药物有关物质的有效控制。
部分第3代、4代头孢菌素类药物分子结构中存在顺式甲氧亚氨基，如头孢唑肟、头孢曲松等。该基团对于头孢菌素的抗菌活性起着重要作用，如头孢噻肟(顺式结构)抗菌活性要比反式结构强40～100倍。在光照或亲核试剂的进攻下顺式结构容易转变为反式甲氧亚氨基结构使得药物活性降低。
头孢地尼(Cefdinir)化学名为(6R,7R)-7-[[(2-氨基-4-噻唑基)-(肟基)乙酰基]氨基]-3-乙烯基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，是日本藤泽药品株式会于1988年首次合成的第3代口服头孢类抗菌药物，在水、乙醇或乙醚中不溶。与其他第3代口服头孢菌素相比，头孢地尼口服吸收性好，对β-内酰胺酶具有高度稳定性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌如葡萄球菌属、链球菌属等的抗菌活性明显增强，临床上用于治疗皮肤感染，术后伤口感染，呼吸道感染等。
在光照条件下，头孢地尼分子结构中的顺式甲氧亚氨基可以转变为反式结构，即中国药典中规定的杂质R，如下图所示。然而，杂质R对照品难以合成制备，且市售价格较为昂贵。
因此，本发明以头孢地尼原料药中杂质R校正因子的测定为例，建立了一种在杂质对照品难以获得的情况下采用高效液相色谱法，通过控制反应条件以主成分峰面积的减少值对杂质峰面积的增加值进行线性回归分析，从而进一步测定特定杂质校正因子的新方法。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术存在的技术问题，本申请提供了一种在杂质对照品无法获得的情况下准确、快速测定药物中特定杂质校正因子的方法。
技术方案：本发明所述的一种采用高效液相色谱法测定目标杂质校正因子的方法，包括以下步骤：
(1)定义待测化合物中主成分A转化为目标杂质B的反应如下式：
xA→yB+C，
其中，C表示除目标杂质B以外的其余所有副产物，x和y分别表示转化反应中主成分A和目标杂质B的摩尔反应系数；
(2)以副反应程度最小为评价指标，优化确定最终转化反应条件，然后配制待测化合物的样品溶液，立即采用高效液相色谱法测定主成分A和目标杂质B的初始峰面积值AA0和AB0；任意i时刻的副反应程度按下式计算：
其中，AA0％、AAi％和AC0％、ACi％分别表示主成分和副产物在初始0时刻和i时刻的峰面积，以面积归一化法计；
(3)在优化确定的反应条件下，于若干个不同时刻采用高效液相色谱法测定待测化合物中主成分A和目标杂质B的峰面积值AAi和ABi，当转化反应进行到一定时间时，根据反应摩尔系数比存在如下等式：
其中，mA0、mAi和mB0、mBi分别表示主成分A和目标杂质B在初始0时刻和任意i时刻的质量，MA和MB分别表示主成分A和目标杂质B的相对分子质量；
(4)令ΔmA＝(mA0-mAi)，ΔmB＝(mBi-mB0)和ΔPeak AreaA＝(AA0-AAi)，ΔPeak AreaB＝(ABi-AB0)，根据如下所示的校正因子的对照品法计算公式：
且对于上式中的ΔConcA、ΔConcB，在同一反应体系中，存在下式：
ΔConcA＝ΔmA×V，ΔConcB＝ΔmA×V，其中V相同，
结合(3)、(4)中各等式，以杂质峰面积的增加值(AB0-ABi)为自变量，主成分峰面积的减少值(AA0-AAi)为因变量，进行线性回归分析可得到线性方程如下：
(5)由(4)中线性方程的斜率结合主成分A和目标杂质B的相对分子质量及转化反应的摩尔反应系数进一步计算出目标杂质的校正因子F。
步骤(2)中，所述优化的转化反应条件为照射光源、稀释溶剂、光照时间或者样品溶液浓度等。
步骤(3)中，所述若干是6以上。
本发明公开的方法可用于测定药物杂质校正因子，特别是用于测定头孢地尼原料药中杂质校正因子。
具体的，采用上述方法测定头孢地尼原料药中杂质校正因子的方法，包括以下步骤：
(1)配制头孢地尼原料药溶液，对反应条件进行考察；
(2)以副反应程度最小为评价指标，最终确定主成分头孢地尼转化为目标杂质的最佳反应条件；
(3)按照最佳反应条件配制头孢地尼原料药溶液后，分别于不同时刻采用高效液相色谱法测定样品溶液中主成分峰面积和目标杂质峰面积；
(4)以目标杂质峰面积的增加值(AB0-ABi)为自变量，主成分峰面积的减少值(AA0-AAi)为因变量，按照最小二乘法进行线性回归分析，得到线性方程如下：
(5)由(4)中线性方程的斜率结合主成分和目标杂质的相对分子质量以及转化反应的摩尔反应系数计算出特定杂质的校正因子。
其中，步骤(2)中，根据副反应程度计算公式确定优化的转化反应条件包括照射光源、稀释溶剂、光照时间和样品溶液浓度。
步骤(3)中，高效液相色谱条件是：流动相初始比例：3％～7％B，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶，流速：0.9～1.1mL/min，柱温：38～42℃，检测波长：253～255nm。
本申请还公开了将本申请方法应用于测定头孢地尼原料药中杂质R的校正因子。
当所述目标杂质为头孢地尼杂质R时，步骤(2)中，所述反应条件主要考察了溶液浓度0.5～5.0mg/mL，稀释溶剂柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液pH 3.0～8.0，照射光源包括紫外灯(UV，254nm)和光照试验箱(光照强度4500±500lx)以及光照时间0～24小时。
步骤(2)中，根据副反应程度计算公式确定最佳反应条件：照射光源强度为4500±500lx，稀释溶剂为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.0)，样品溶液浓度为0.5mg/mL，光照时间为12小时。
步骤(3)中，高效液相色谱条件是：流动相初始比例：3％～7％B，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶，流速：0.9～1.1mL/min，柱温：38～42℃，检测波长：253～255nm。具体可以是：0.25％四甲基氢氧化铵水溶液(用磷酸调pH至5.5)，每1000mL中加入0.1mol/L EDTA-2Na水溶液0.4mL为流动相A；0.25％四甲基氢氧化铵水溶液(用磷酸调pH至5.5)-乙腈-甲醇(500:300:200)，每1000mL中加入0.1mol/L EDTA-2Na水溶液0.4mL为流动相B；梯度洗脱程序(A:B)如下：0min(95:5)→2min(95:5)→25min(75:25)→42min(50:50)→43min(95:5)→60min(95:5)。色谱柱为Waters C18(4.6mm×250mm,5μm)，流速为1.0mL/min，柱温为40℃，检测波长为254nm，进样体积为20μL。
有益效果：本方法以高效液相色谱为检测手段，通过优化主成分转化为目标杂质的反应条件，控制副反应在可接受的合理范围内，解决了在缺乏杂质对照品的情况下，如何对药物中特定杂质进行准确定量的难题。与传统对照品标准曲线法相比，该方法校正因子的测定结果准确度良好，大大节约了实验成本，且操作简单，快速，同时为药物有关物质控制提供了新思路，具有重要的应用价值。
附图说明
图1是实施例1中主成分头孢地尼转化为杂质R的线性关系图；
图2是对比例1中头孢地尼的线性标准曲线；
图3是对比例1中杂质R的线性标准曲线；
图4为0.5mg/mL的头孢地尼原料药溶液(稀释溶剂为pH 8.0柠檬酸-磷酸氢二钠)0时刻的液相色谱图；
图5为0.5mg/mL的头孢地尼原料药溶液(稀释溶剂为pH 8.0柠檬酸-磷酸氢二钠)于光照强度为4500±500lx的光照试验箱中放置12小时的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请作出详细说明。
实施例1
下面采用高效液相色谱法在没有获得头孢地尼杂质R对照品的情况下，通过优化反应条件合理控制副反应程度，对杂质R的校正因子进行测定，同时以传统对照品标准曲线法的测定结果作为辅助验证，进一步证实本发明的准确性。
测定条件如下：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪，Waters Empower 3.0数据工作站，SHH-100GD-2药品光照实验箱，紫外灯。
试剂：25％四甲基氢氧化铵水溶液、乙二胺四乙酸二钠、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸，柠檬酸均为分析纯；乙腈、甲醇为色谱纯；试验用水为蒸馏水。
材料：头孢地尼原料药(生产厂家：浙江普洛得邦制药有限公司，批号：AP006-1703-006)；头孢地尼工作对照品(生产厂家：常州亚邦药业有限公司，批号：180205，纯度：98.5％)；头孢地尼杂质R对照品(生产厂家：深圳卓越生物科技有限公司，批号：ZY997，纯度：97.99％)。
溶剂：0.1mol/LpH 7.0磷酸盐缓冲液(v:v，0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：0.1mol/L磷酸二氢钾溶液＝2:1)
色谱条件：0.25％四甲基氢氧化铵水溶液(用磷酸调pH至5.5)，每1000mL中加入0.1mol/L EDTA-2Na水溶液0.4mL为流动相A；0.25％四甲基氢氧化铵水溶液(用磷酸调pH至5.5)-乙腈-甲醇(500:300:200)，每1000mL中加入0.1mol/L EDTA-2Na水溶液0.4mL为流动相B；梯度洗脱程序(A:B)如下：0min(95:5)→2min(95:5)→25min(75:25)→42min(50:50)→43min(95:5)→60min(95:5)。色谱柱为WatersC18(4.6mm×250mm，5μm)，流速为1.0mL/min，柱温为40℃，检测波长为254nm，进样体积为20μL。
具体测定步骤如下：
(1)头孢地尼转化为杂质R反应条件的优化
1.稀释溶剂和照射光源的优化
精密称取头孢地尼原料药约37.5mg，置25ml棕色量瓶中，加入0.1mol/LpH7.0磷酸盐缓冲液4.0mL使溶解，以不同pH值的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(A液是浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液，B液是浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液，配制方法见表1)作为稀释溶剂定容至刻度，摇匀，滤过(0.45μm微孔滤膜)，取续滤液作为样品溶液。将上述样品溶液于紫外灯(UV，254nm)下和光照试验箱(Light，光照强度4500±500lx)中分别放置24小时。取出后按照所述色谱条件进样20μL，记录色谱图。根据主成分和副产物的峰面积(AAi％和ACi％，以面积归一化法计)按照上述副反应程度计算公式评价各条件下的副反应大小，结果见表2-1到表2-4。
表1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制方法
表2-1pH 3.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作稀释溶剂的副反应程度
表2-2pH 5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作稀释溶剂的副反应程度
表2-3pH 7.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作稀释溶剂的副反应程度
表2-4pH 8.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作稀释溶剂的副反应程度
由表2-1到表2-4的结果表明，当样品溶液以pH 8.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作为稀释溶剂，于光照强度为4500±500lx的光照试验箱中放置24小时，主成分头孢地尼转化为杂质R的副反应程度最低，为8.93％。
2.溶液浓度和光照时间的优化
精密称取头孢地尼原料药约12.5mg，37.5mg，125.0mg，分别置25ml棕色量瓶中，加入0.1mol/LpH 7.0磷酸盐缓冲液适量使溶解，以pH 8.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作为稀释溶剂定容至刻度，摇匀，滤过(0.45μm微孔滤膜)，取续滤液分别作为浓度约为0.5mg/mL，1.5mg/mL，5.0mg/mL的样品溶液。将上述样品溶液于光照试验箱(光照强度4500±500lx)中放置24小时。分别于0、12、24小时取出样品溶液，按照上述色谱条件进样20μL，记录色谱图。根据主成分和副产物的峰面积(AAi％和ACi％，以面积归一化法计)按照上述副反应程度计算公式评价各条件下的副反应大小，结果见表3-1到表3-3。
表3-1 0.5mg/mL头孢地尼样品溶液的副反应程度
表3-2 1.5mg/mL头孢地尼样品溶液的副反应程度
表3-3 5.0mg/mL头孢地尼样品溶液的副反应程度
由表3-1到表3-3的结果表明，当样品溶液浓度为0.5mg/mL，于光照强度为4500±500lx的光照试验箱中放置12小时，主成分头孢地尼转化为杂质R的副反应程度最低，为6.52％。
(2)以副反应程度最小为评价指标，确定转化反应最佳条件：以pH 8.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作为稀释溶剂配制浓度为0.5mg/mL的头孢地尼原料药溶液，将该样品溶液于光照强度为4500±500lx的光照试验箱中放置12小时。
(3)配制最佳反应条件下的头孢地尼原料药溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12小时从光照试验箱中取出样品溶液，采用高效液相色谱法按照上述色谱条件测定样品溶液中各个时刻主成分和杂质R的峰面积值(AA和AB)，结果见表4；图4和图5分别是优化后所确定的最佳反应条件下，初始时刻0小时和反应结束时刻12小时的液相色谱图。
表4头孢地尼与杂质R转化数据组
(4)以杂质R峰面积的增加值(AB0-ABi)为自变量，主成分峰面积的减少值(AA0-AAi)为因变量，按照最小二乘法进行线性回归分析，得到线性方程如下：
y＝1.03x+21158.6
主成分头孢地尼转化为杂质R的线性关系图如图1所示。
(5)由(4)中线性方程的斜率结合头孢地尼和杂质R的相对分子质量(MA和MB)以及转化反应的摩尔反应系数(x和y)计算出杂质R的校正因子F，F＝1.03。
对比例1
为了验证实施例1测定的准确性，发明人按照现有对照品标准曲线法测定了头孢地尼杂质R的校正因子，具体操作如下：
精密称取头孢地尼对照品和杂质R对照品适量，分别配制浓度约为100μg/mL的对照品储备液。以pH 8.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液作为稀释溶剂配制浓度范围约在0.5～5μg/mL的系列线性溶液，按照上述色谱条件分别进样，每个浓度样品溶液进样2针，峰面积以平均值计。以峰面积对浓度按照最小二乘法进行线性回归分析，得到头孢地尼和杂质R两条标准曲线，二者斜率之比即为杂质R的校正因子。线性测定结果见表5-到表5-2。
表5-1头孢地尼线性测定结果
头孢地尼线性方程：y＝39269.15x-1607.9
表5-2杂质R线性测定结果
杂质R线性方程：y＝36336.41x-1615.7
头孢地尼和杂质R的线性标准曲线分别如图2和图3所示。
杂质R的校正因子即为头孢地尼和杂质R的线性方程斜率之比，F＝1.08。
实施例1和对比例1的两种方法测定结果的比较(见表6)表明，本发明实施例1测得的校正因子准确度较高。需要指出的是，两种方法测得的杂质R校正因子并非完全一致，我们初步推测这可能与对照品标准曲线法的验证试验中所采用的杂质R对照品纯度以及转化反应中存在一定程度的副反应有关。通常，用于杂质定量的对照品纯度应该是在HPLC纯度的基础上扣除水分、有机溶剂和炽灼残渣后的纯度，而本次验证试验中所采用的杂质R对照品仅具备HPLC纯度。除此之外，尽管在校正因子测定之前，我们进行了一系列的反应条件优化工作，最大程度减少副反应的发生，但在实际反应过程中副产物的产生难以避免，这对校正因子测定结果的准确度也会产生一定的影响。
表6头孢地尼杂质R校正因子测定结果的比较
本发明提出一种在杂质对照品难以获得的情况下，准确测定特定杂质校正因子的方法。该方法以传统的高效液相色谱为检测手段，操作简单易行，并且通过转化反应条件的全面优化，大大降低副反应对测定结果的干扰，保证了良好的准确性。除此之外，本发明按照最小二乘法以主成分峰面积的减少值(AA0-AAi)对目标杂质峰面积的增加值(AB0-ABi)进行线性回归分析，得到线性方程后结合相对分子质量及转化反应的摩尔反应系数即可进一步得到杂质的校正因子，计算过程简便、快速。
与目前常用的对照品标准曲线法相比，本发明所建立的新方法最大优势在于校正因子的测定无需获得杂质对照品，使得测定成本大幅降低，同时应用范围也更为广阔，尤其对于一些含量较高，特定波长下的光谱行为与主成分存在较大差异且性质不稳定，对照品通常难以合成制备的杂质来说，该方法具有极为重要的实际应用价值。因此，本发明在杂质的定量分析领域具有巨大的潜在意义。

Claims (10)

1.一种采用高效液相色谱法测定目标杂质校正因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)定义待测化合物中主成分A转化为目标杂质B的反应如下式：
xA→yB+C，
其中，C表示除目标杂质B以外的其余所有副产物，x和y分别表示转化反应中主成分A和目标杂质B的摩尔反应系数；
(2)以副反应程度最小为评价指标，优化确定最终转化反应条件，然后配制待测化合物的样品溶液，立即采用高效液相色谱法测定主成分A和目标杂质B的初始峰面积值(AA0和AB0)；任意i时刻的副反应程度按下式计算：
其中，AA0％、AAi％和AC0％、ACi％分别表示主成分和副产物在初始0时刻和i时刻的峰面积，以面积归一化法计；
(3)在优化确定的反应条件下，于若干个不同时刻采用高效液相色谱法测定待测化合物中主成分A和目标杂质B的峰面积值AAi和ABi，当转化反应进行到一定时间时，根据反应摩尔系数比存在如下等式：
其中，mA0、mAi和mB0、mBi分别表示主成分A和目标杂质B在初始0时刻和任意i时刻的质量，MA和MB分别表示主成分A和目标杂质B的相对分子质量；
(4)令ΔmA＝(mA0-mAi)，ΔmB＝(mBi-mB0)和ΔPeak AreaA＝(AA0-AAi)，ΔPeak AreaB＝(ABi-AB0)，根据如下所示的校正因子的对照品法计算公式：
且对于上式中的ΔConcA、ΔConcB，在同一反应体系中，存在下式：
ΔConcA＝ΔmA×V，ΔConcB＝ΔmA×V，其中V相同，
结合(3)、(4)中各等式，以杂质峰面积的增加值(AB0-ABi)为自变量，主成分峰面积的减少值(AA0-AAi)为因变量，进行线性回归分析可得到线性方程如下：
(5)由(4)中线性方程的斜率结合主成分A和目标杂质B的相对分子质量及转化反应的摩尔反应系数可进一步计算出目标杂质的校正因子F。
2.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定目标杂质校正因子的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述优化的转化反应条件为照射光源、稀释溶剂、光照时间或样品溶液浓度。
3.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定目标杂质校正因子的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述若干是6以上。
4.权利要求1-3中任一所述方法在测定药物杂质校正因子中的应用。
5.权利要求1-3中任一所述方法在测定头孢地尼原料药中杂质校正因子中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制头孢地尼原料药溶液，对反应条件进行考察；
(2)以副反应程度最小为评价指标，最终确定主成分头孢地尼转化为目标杂质的最佳反应条件；
(3)按照最佳反应条件配制头孢地尼原料药溶液后，分别于不同时刻采用高效液相色谱法测定样品溶液中主成分峰面积和目标杂质峰面积；
(4)以目标杂质峰面积的增加值(AB0-ABi)为自变量，主成分峰面积的减少值(AA0-AAi)为因变量，按照最小二乘法进行线性回归分析，得到线性方程如下：
(5)由(4)中线性方程的斜率结合主成分和目标杂质的相对分子质量以及转化反应的摩尔反应系数计算出特定杂质的校正因子。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，根据副反应程度计算公式确定优化的转化反应条件包括照射光源、稀释溶剂、光照时间和样品溶液浓度。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，高效液相色谱条件是：流动相初始比例：3％～7％B，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶，流速：0.9～1.1mL/min，柱温：38～42℃，检测波长：253～255nm。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述目标杂质为头孢地尼杂质R。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(2)中根据副反应程度计算公式确定的最佳反应条件为：照射光源强度为4500±500lx，稀释溶剂为pH 8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，样品溶液头孢地尼原料药溶液浓度为0.5mg/mL，光照时间为12小时。
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