CN108828094A - 利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法及应用 - Google Patents

利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用高效液相色谱‑串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法及应用，涉及化学检测技术领域，本发明提供的利用高效液相色谱‑串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，以酮洛芬‑D3为检测内标，采用内标标准曲线法定量。该方法专属性强，检测限低，并且，标准曲线的线性范围内的相关系数都大于0.999，表明在此线性范围内的线性关系良好，重复性高。此外，该方法还具有分析时间快，需样量少的优点，能够大大提高样品分析效率。综上，本发明提供的利用高效液相色谱‑串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，整个操作过程简单易行，方法科学、可靠、可控，适于实际应用和推广，具有广阔的应用前景。

Description

利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法及 应用
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域，尤其是涉及一种利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法及应用。
背景技术
酮洛芬(Ketoprofen)又名酮基布洛芬，属于芳基丙酸群，非甾体类抗炎药。白色结晶性粉末，无臭或几乎无臭。在甲醇中极易溶，在乙醇、丙酮或乙醚中易溶，在水中几乎不溶。酮洛芬消炎作用强，副作用小，毒性低。其主要作用机理是通过抑制花生四烯酸的环氧化酶通路，从而导致炎症因子的减少，如前列腺素和血栓素。这种作用机理导致的结果是产生抗炎、解热和镇痛等效果。
目前在兽医上，酮洛芬使用越来越广泛，国外将其应用于猪、马、牛、山羊等。在牛上，酮洛芬可以用来治疗发热、疼痛和炎症等相关症状的疾病，包括乳腺炎、乳腺水肿、关节炎和肌肉骨骼外伤。
建立动物血浆中酮洛芬含量的检测方式，可以指导临床合理用药。而目前检测血浆中酮洛芬含量的方法主要有：滴定法、紫外可见分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)等，其中国内外最常用的是高效液相色谱法 (HPLC)，但高效液相色谱法灵敏度不高，检测限的浓度高，检测时间长，需要样品量较大。同时，动物在注射酮洛芬24小时后，药物在动物血液中的含量均小于30ng/mL，这低于现有的高效液相色谱法的检测限度。
因此，开发一种快速、高效、灵敏度高的酮洛芬含量检测方式尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，以缓解现有技术中存在的检测方法灵敏度不高，检测限的浓度高，检测时间长，需要样品量较大的技术问题。
本发明的第二个目的在于提供上述利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法在指导酮洛芬用药中的应用。
本发明提供了一种利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，所述方法以酮洛芬-D3为检测内标，采用内标标准曲线法定量。
进一步地，所述利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法包括：
提供酮洛芬标准溶液、酮洛芬内标溶液以及预处理后的待测样品，利用液相色谱-串联质谱仪对酮洛芬标准溶液和预处理后的待测样品分别进行检测，通过绘制标准曲线，得到血浆中酮洛芬的含量；
其中，将待测样品与酮洛芬内标溶液按体积比为10-30:1混合后的混合液进行沉淀蛋白处理，取上清稀释除杂后，得到所述预处理后的待测样品。
进一步地，将酮洛芬标准品用低碳醇溶解，制备浓度为0.1-2.0mg/mL 的酮洛芬醇溶液，得到所述酮洛芬标准溶液；
优选地，所述酮洛芬醇溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL，优选为0.8-1.2 mg/mL；
优选地，所述低碳醇为C1-C4醇，优选为甲醇；
优选地，在避光条件下制备所述酮洛芬标准溶液。
进一步地，将酮洛芬-D3标准品用低碳醇溶解，制备浓度为0.1-2.0 mg/mL的酮洛芬-D3醇溶液，得到所述酮洛芬内标溶液；
优选地，所述酮洛芬-D3醇溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL，优选为0.8-1.2 mg/mL；
优选地，所述低碳醇为C1-C4醇，优选为甲醇；
优选地，在避光条件下制备所述酮洛芬内标溶液。
进一步地，将待测样品与酮洛芬内标溶液按体积比为10-30:1混合后的混合液静置，再加入乙腈进行蛋白沉淀；
优选地，所述乙腈与酮洛芬内标溶液的体积比为15-25:1，优选为 18-22:1，更优选为18-20:1；
优选地，在避光条件下静置。
进一步地，取一系列不同浓度的酮洛芬标准溶液加入空白血浆样品中，经预处理后，利用液相色谱-串联质谱仪进行检测，并分别记录每个浓度的酮洛芬对应的峰面积，以酮洛芬与内标峰面积比值Y为纵坐标，以酮洛芬浓度X为横坐标，绘制所述标准曲线。
进一步地，高效液相色谱条件如下：
色谱柱：Agilent RS-C18色谱柱；和/或，
柱温：30-50℃；和/或，
流动相：A相为0.1％(V/V)的甲酸溶液，B相为乙腈；和/或，
流速：0.1-1.0mL/min；和/或，
进样量：1-10μL；和/或，
线性梯度洗脱程序：起始比例A相为87％，B相为13％，维持1min；1-1.5min，A相降至10％，B相升至90％，维持至7.5min；7.5-8min，A 相升至87％，B相降至13％，维持至12.0min。
进一步地，质谱条件如下：
离子源：ESI；和/或，
干燥气温度：300-400℃；和/或，
干燥气流量：5-15L/min；和/或，
雾化气压力：30-50psi；和/或，
毛细管电压：3500-4500V；和/或，
检测模式：正离子扫描的多反应检测模式。
进一步地，所述酮洛芬和酮洛芬-D3的质谱参数见下表：
注：*标注的子离子为定量离子。
另外，本发明还提供了上述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法在指导酮洛芬用药中的应用。
本发明提供的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，以酮洛芬-D3为检测内标，采用内标标准曲线法定量。该方法专属性强，检测限低，在牛血浆中酮洛芬的含量的检测限为1ng/mL，定量限为5 ng/mL，远远低于目前酮洛芬在高效液相色谱法中检测限为100ng/mL，定量限为200ng/mL。并且，标准曲线的线性范围内的相关系数都大于0.999，表明在此线性范围内的线性关系良好，重复性高。此外，该方法还具有分析时间快，需样量少的优点，能够大大提高样品分析效率。综上，本发明提供的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，整个操作过程简单易行，方法科学、可靠、可控，适于实际应用和推广，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的空白样品总离子色谱图；
图2为本发明实施例2提供的基质中添加酮洛芬浓度10ng/mL的总离子色谱图；
图3为本发明实施例3提供的基质中添加酮洛芬浓度1ng/mL的总离子色谱图；
图4为本发明实施例3提供的基质中添加酮洛芬浓度5ng/mL的总离子色谱图；
图5为本发明实施例4提供的第一批牛血浆添加标准曲线回归方程与相关系数图；
图6为本发明实施例4提供的第二批牛血浆添加标准曲线回归方程与相关系数图；
图7为本发明实施例4提供的第三批牛血浆添加标准曲线回归方程与相关系数图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，以酮洛芬-D3为检测内标，采用内标标准曲线法定量。
其中，酮洛芬-D3为液相色谱的内标物。
根据内标物的选择原则，内标物应当和被分析的目标物有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是分析的目标物的一个同系物。酮洛芬-D3的分子式为C16H11O3D3，分子量：257.31，与分析的目标物是同系物，两者的物理化学性质相似，色谱峰位置也相近，所以酮洛芬-D3完全符合内标物的选择要求。加入酮洛芬-D3作为内标物质，能够校准和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，提高分析结果的准确度。
高效液相色谱是一种准确度高，分离范围广的快速分离方法，它对化合物的结构破坏性小，适合有机分子和生物分子的分离。质谱具有其他分析方法无可比拟的灵敏度，对于未知化合物的结构分析定性十分准确，对相应的标准样品要求也比较低。由于色谱和质谱灵敏度相当，再加上分离效果很好的色谱可以作为质谱的进样系统，质谱作为色谱的鉴定仪速度快，分离好，应用广。
本发明应用液相色谱-串联质谱法进行检测，将色谱的分离能力和质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析，同时简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。该方法专属性强，检测限低，特别是通过内标校正，避免了复杂混合物体系定量分离、纯化的困难，减少基质效应的发生，从而能够有效提高测量精度和准确度，达到在牛血浆中酮洛芬的含量的检测限为1ng/mL，定量限为5ng/mL，远远低于目前酮洛芬在高效液相色谱法中检测限为100ng/mL，定量限为200ng/mL。并且，标准曲线的线性范围内的相关系数都大于0.999，表明在此线性范围内的线性关系良好，重复性高。此外，该方法还具有分析时间快，需样量少的优点，分析一个样品仅需要样品5μL，分析一个样品需要7分钟，能够大大提高样品分析效率。
在一种优选的实施方式中，利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法包括：
提供酮洛芬标准溶液、酮洛芬内标溶液以及预处理后的待测样品，利用液相色谱-串联质谱仪对酮洛芬标准溶液和预处理后的待测样品分别进行检测，通过绘制标准曲线，得到血浆中酮洛芬的含量。
用酮洛芬标准溶液绘制工作曲线，测出各峰的峰面积对应的样品浓度，绘制出标准曲线。在检测待测样品时，测出待测样品的峰面积对应标准曲线，就可以得到待测样品浓度。
将待测样品与酮洛芬内标溶液按体积比为10-30:1混合后的混合液进行沉淀蛋白处理，取上清稀释除杂后，得到预处理后的待测样品。
通过除去蛋白质水化膜和中和蛋白质电荷，使蛋白质凝聚成团下沉，达到沉淀蛋白的作用。将样品中的蛋白质沉淀，能够使样品在检测时减小误差，达到有效提高测量精度和准确度的目的。上述方法整个操作过程简单易行，方法科学、可靠、可控，适于实际应用和推广，具有广阔的应用前景。
其中，待测样品与酮洛芬内标溶液的体积比例如可以为，但不限于 10:1、15:1、20:1、25:1或30:1，优选为20:1。可通过静置沉淀或离心的方式取上清液，优选通过离心的方式取上清液。可通过物理除杂的方式进行除杂，优选通过过滤的方式进行除杂，优选使用滤膜进行过滤，优选使用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤。
在一种优选的实施方式中，将酮洛芬标准品用低碳醇溶解，制备浓度为0.1-2.0mg/mL的酮洛芬醇溶液，得到酮洛芬标准溶液。
优选地，酮洛芬醇溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL，例如可以为，但不限于0.5mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL或1.5mg/mL，优选为 0.8-1.2mg/mL。
通过对酮洛芬醇溶液的浓度进行优化，能够实现峰型的最佳化。
优选地，低碳醇为C1-C4醇，优选为甲醇。
优选地，在避光条件下制备酮洛芬标准溶液。
避光即避免日光直射，避光条件下配制能够进一步保证溶液的稳定性，在本发明中可以通过在对光线阻隔性较强的容器中进行酮洛芬标准溶液的配制，以避免日光直射，如在棕色瓶或不透明容器中进行配制。
在一种具体的实施方式中，酮洛芬标准溶液的制备方法包括：
精确称取酮洛芬标准品10.0mg，置于10mL棕色容量瓶中，用适量甲醇溶解，再定容至刻度，即制成1.0mg/mL的酮洛芬标准溶液。
该酮洛芬标准溶液-20℃保存备用，有效期3个月。
在一种优选的实施方式中，将酮洛芬-D3标准品用低碳醇溶解，制备浓度为0.1-2.0mg/mL的酮洛芬-D3醇溶液，得到酮洛芬内标溶液。
优选地，酮洛芬-D3醇溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL，例如可以为，但不限于0.5mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL或1.5mg/mL，优选为0.8-1.2mg/mL。
通过对酮洛芬-D3醇溶液的浓度进行优化，能够实现峰型的最佳化。
优选地，低碳醇为C1-C4醇，优选为甲醇；
优选地，在避光条件下制备所述酮洛芬内标溶液。
配制酮洛芬内标溶液与配制酮洛芬标准溶液所用的避光条件相同。
在一种具体的实施方式中，酮洛芬内标溶液的制备方法包括：
准确称取酮洛芬-D3标准品10.05mg于10mL棕色容量瓶中，用适量甲醇溶解，再定容至刻度，即制成1mg/mL的酮洛芬内标溶液。
该酮洛芬内标溶液-20℃保存备用，有效期3个月。
在一种优选的实施方式中，将待测样品与酮洛芬内标溶液按体积比为 10-30:1混合后的混合液静置，再加入乙腈进行蛋白沉淀。
静置能够使待测样品与酮洛芬内标溶液充分混合反应，保证后续沉淀蛋白更全面、更彻底。
使用乙腈进行蛋白沉淀，一方面是由于乙腈是流动相中的B相，便于后续检测试验，另一方面，乙腈对血浆样品中的蛋白沉淀效率远高于其他沉淀剂，使用乙腈作为沉淀剂保证沉淀蛋白更全面、更彻底。
优选地，乙腈与酮洛芬内标溶液的体积比为15-25:1，例如可以为，但不限于15:1、18:1、20:1、22:1或25:1，优选为18-22:1，更优选为19:1。
通过对乙腈与酮洛芬内标溶液的体积比进行优化，能够使蛋白沉淀的更全面、更彻底，并且保证后续检测的准确性更高。
优选地，在避光条件下静置。
静置与配制酮洛芬标准溶液所用的避光条件相同。
优选地，取上清5倍稀释后过滤，优选使用双蒸水进行稀释。
在一种具体的实施方式中，待测样品的预处理包括：
取出保存的血浆样品，自然解冻，摇匀。准确吸取500μL血浆样品于 2mL EP管中，加入1mg/mL酮洛芬-D3(内标)溶液25μL，旋涡混合器混匀，暗室静置20min，准确吸取475μL乙腈加入样品中沉淀蛋白，涡旋 2min，12000r/min离心10min，吸取上清液200μL至800μL的双蒸水中，涡旋混匀，经0.22mm滤膜过滤，得到可上机待测样品。
在一种优选的实施方式中，高效液相色谱条件如下：
色谱柱：Agilent RS-C18色谱柱，优选柱长为150mm，柱径为2.0mm 和填料粒径为5mm；和/或，
柱温：30-50℃；和/或，
流动相：A相为0.1％(V/V)的甲酸溶液，B相为乙腈；和/或，
流速：0.1-1.0mL/min；和/或，
进样量：1-10μL；和/或，
线性梯度洗脱程序：起始比例A相为87％，B相为13％，维持1min； 1-1.5min，A相降至10％，B相升至90％，维持至7.5min；7.5-8min，A 相升至87％，B相降至13％，维持至12.0min。
其中，进样量例如可以为，但不限于1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、 6μL、7μL、8μL、9μL或10μL。
柱温例如可以为，但不限于30℃、32℃、35℃、38℃、40℃、42℃、 45℃、48℃或50℃。
流速例如可以为，但不限于0.1mL/min、0.2mL/min、0.3mL/min、0.4 mL/min、0.5mL/min、0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min 或1.0mL/min。
流速决定了样品的出峰时间，柱温对柱效和产品分离也有一定影响，通过对流速和柱温的设定，以获得良好的分离效果。
在一种优选的实施方式中，质谱条件如下：
离子源：ESI；和/或，
干燥气温度：300-400℃，例如可以为，但不限于300℃、320℃、350℃、 380℃或400℃；和/或，
干燥气流量：5-15L/min，例如可以为，但不限于5L/min、8L/min、 10L/min、12L/min或15L/min；和/或，
雾化气压力：30-50psi，例如可以为，但不限于30psi、35psi、40psi、 45psi或50psi；和/或，
毛细管电压：3500-4500V，例如可以为，但不限于3500V、3600V、 3700V、3800V、3900V、4000V、4100V、4200V、4300V、4400V或 4500V；和/或，
检测模式：正离子扫描的多反应检测模式。
ESI是电喷雾离子源，电喷雾可以提供一个相对简单的方式使非挥发性溶液相离子(具有高的离子化效率，对蛋白质而言接近100％)转入到气相 (主要用来产生分子离子)，从而提供一个灵敏的直接检测，精密度好、准确度高，检测快速。
通过对质谱条件的进一步选择和优化，使得本发明应用的液相色谱-串联质谱法检测结果更准确。
另一方面，本发明还提供了上述利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法在指导酮洛芬用药中的应用。
通过本发明提供的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法检测用药者体内的酮洛芬含量，可以进一步推算出酮洛芬在该用药者体内的半衰期。而给药剂量和频率根据检测出的酮洛芬在用药者体内的半衰期而不同，在半衰期较长的用药者中，以相对低频率的间隔长期给予相对低的剂量。在半衰期较短的用药者中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量。
需要说明的是，本发明中所述的指导酮洛芬用药为非疾病的诊断和治疗目的。
为了进一步了解本发明的具体操作过程和有益效果，下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。
实施例1
本实施例提供了一种利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，包括如下步骤：
(a)、酮洛芬标准溶液的配制：
精确称取酮洛芬标准品10.0mg，置于10mL棕色容量瓶中，用适量甲醇溶解，再定容至刻度，即制成1.0mg/mL的酮洛芬储备液，-20℃保存备用，有效期3个月。
(b)、酮洛芬内标溶液的配制：
准确称取酮洛芬-D3标准品10.05mg于10mL棕色容量瓶中，用适量甲醇溶解，再定容至刻度，即成1mg/mL的酮洛芬-D3标准液，-20℃保存备用，有效期3个月。
(c)、待测样品的预处理：
取出保存的血浆样品，自然解冻，摇匀。准确吸取500μL血浆样品于 2mL EP管中，加入1mg/mL酮洛芬-D3(内标)溶液25μL，旋涡混合器混匀，暗室静置20min，准确吸取475μL乙腈加入样品中沉淀蛋白，涡旋 2min，12000r/min离心10min，吸取上清液200μL至800μL的双蒸水中，涡旋混匀，经0.22mm滤膜过滤，得到可上机待测样品。
(d)、液相色谱-串联质谱检测：
色谱条件如下：
色谱柱：Agilent RS-C18色谱柱，优选柱长为150mm，柱径为2.0mm 和填料粒径为5mm；和/或，
柱温：40℃；和/或，
流动相：A相为0.1％(V/V)的甲酸溶液，B相为乙腈；和/或，
流速：0.4mL/min；和/或，
进样量：5μL；和/或，
线性梯度洗脱程序：起始比例A相为87％，B相为13％，维持1min； 1-1.5min，A相降至10％，B相升至90％，维持至7.5min；7.5-8min，A 相升至87％，B相降至13％，维持至12.0min。
质谱条件如下：
离子源：ESI；和/或，
干燥气温度：340℃；和/或，
干燥气流量：9L/min；和/或，
雾化气压力：40psi；和/或，
毛细管电压：4000V；和/或，
检测模式：正离子扫描的多反应检测模式。
酮洛芬和酮洛芬-D3的质谱参数见下表：
注：*标注的子离子为定量离子。
(e)、绘制标准曲线，计算血浆中酮洛芬的含量：
取空白血浆，依次加入酮洛芬标准溶液，配制相当于酮洛芬标准品质量浓度为5、10、50、100、500、1000、2500ng/mL的酮洛芬溶液和浓度为1μg/mL的酮洛芬内标溶液。按照牛血浆样品预处理的方法操作后，得到浓度依次为0.5、1、5、10、50、100、250ng/mL，然后按照样品检测的方法分析样品。以酮洛芬峰面积与内标峰面积之比值为纵坐标(Y)，酮洛芬系列浓度(X)为横坐标进行线性回归得到血浆酮洛芬浓度标准曲线回归方程和相关系数。
(f)、检测结果：
按3mg/kg体重给5头健康黄牛肌注酮洛芬注射液后，用本实施例提供的方法检测给药后1、10、30小时的血药浓度，实测值见表1。
表1剂量(3mg/kg)肌注酮洛芬注射液的血药浓度(ng/mL)
实施例2
本实施例对本发明提供的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法的专属性进行测定：
根据欧盟2002/657/EC指令要求，高效液相色谱-串联质谱联用分析在目标物保留时间偏差2.5％以内应该无干扰峰出现。本实验分析了空白样品和基质中添加药物浓度10ng/mL的总离子色谱图，结果如图1、图2所示，由结果图可知，空白样品中无干扰峰，基质中添加药物的出峰时间为7.04 min。
实施例3
本实施例对本发明提供的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法的检测限和定量限进行测定：
用空白血浆制得1、2、3、4、5ng/mL标准添加样品，每个浓度样品做5个重复，按照牛血浆样品预处理的方法处理并检测，SNR值＝3为方法检测限(LOD)，SNR值＝10为方法定量限(LOQ)。
1ng/mL和5ng/mL的检测结果见图3和图4，1ng/mL的SNR值为35.4， 5ng/mL的SNR值为188.5，所以本方法的检测限为1ng/mL，定量限为5 ng/mL。
实施例4
本实施例对本发明提供的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法的标准曲线和线性范围进行测定：
取空白血浆，依次加入酮洛芬标准溶液，配制相当于酮洛芬标准品质量浓度为5、10、50、100、500、1000、2500ng/mL的酮洛芬溶液和浓度为1μg/mL的酮洛芬内标溶液。按照牛血浆样品预处理的方法操作后，得到浓度依次为0.5、1、5、10、50、100、250ng/mL，然后按照样品检测的方法分析样品。以酮洛芬峰面积与内标峰面积之比值为纵坐标(Y)，酮洛芬系列浓度(X)为横坐标进行线性回归得到血浆酮洛芬浓度标准曲线回归方程和相关系数。
3批标准曲线的线性范围是5～2500ng/mL，3批的准曲线回归方程分别为y＝1.068804x+0.0089(R2＝0.9996)、y＝1.080531x+0.006574(R2＝0.9998)、 y＝1.154596x+0.017182(R2＝0.9994)，3批结果见图5、图6、图7。结果表明在此线性范围内，线性关系良好，达到分析要求。
实施例5
本实施例对本发明提供的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法的回收率与变异系数进行测定：
准确吸取0.5mL空白血浆，分别加入低(0.2μg/mL)、中(2μg/mL)、高(20μg/mL)3个系列浓度的标准工作液25μL，再加入定量内标液，每个浓度平行5次，共做3个批次，按牛血浆样品预处理的方法进行处理，上机检测，以峰面积之比计算酮洛芬与内标比值的回收率。同时将经过血浆样品预处理后样品的内标峰面积与直接进样的内标物峰面积之比计算酮洛芬内标物的回收率；计算比值和酮洛芬内标物每批内和批间的回收率的平均值和标准差，以及批内和批间的变异系数。
根据测定结果进行统计，酮洛芬与内标比值的回收率为92.73％～ 103.95％，变异系数小于5％，内标回收率为93.92％～102.51％％，变异系数小于5％，与酮洛芬与内标比值的回收率数值吻合。具体数据见表2、表 3。
表2牛血浆中酮洛芬与内标物比值的回收率和变异系数
表3牛血浆中酮洛芬内标物的回收率和变异系数
批次 回收率％(X±S.D，n＝5) 变异系数％
1 93.92±2.61 3.91
2 99.88±2.34 1.22
3 102.51±3.17 2.02
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，所述方法以酮洛芬-D3为检测内标，采用内标标准曲线法定量。
2.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，所述利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法包括：
提供酮洛芬标准溶液、酮洛芬内标溶液以及预处理后的待测样品，利用液相色谱-串联质谱仪对酮洛芬标准溶液和预处理后的待测样品分别进行检测，通过绘制标准曲线，得到血浆中酮洛芬的含量；
其中，将待测样品与酮洛芬内标溶液按体积比为10-30:1混合后的混合液进行沉淀蛋白处理，取上清稀释除杂后，得到所述预处理后的待测样品。
3.根据权利要求2所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，将酮洛芬标准品用低碳醇溶解，制备浓度为0.1-2.0mg/mL的酮洛芬醇溶液，得到所述酮洛芬标准溶液；
优选地，所述酮洛芬醇溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL，优选为0.8-1.2mg/mL；
优选地，所述低碳醇为C1-C4醇，优选为甲醇；
优选地，在避光条件下制备所述酮洛芬标准溶液。
4.根据权利要求2所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，将酮洛芬-D3标准品用低碳醇溶解，制备浓度为0.1-2.0mg/mL的酮洛芬-D3醇溶液，得到所述酮洛芬内标溶液；
优选地，所述酮洛芬-D3醇溶液的浓度为0.5-1.5mg/mL，优选为0.8-1.2mg/mL；
优选地，所述低碳醇为C1-C4醇，优选为甲醇；
优选地，在避光条件下制备所述酮洛芬内标溶液。
5.根据权利要求2所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，将待测样品与酮洛芬内标溶液按体积比为10-30:1混合后的混合液静置，再加入乙腈进行蛋白沉淀；
优选地，所述乙腈与酮洛芬内标溶液的体积比为15-25:1，优选为18-22:1，更优选为18-20:1；
优选地，在避光条件下静置。
6.根据权利要求2所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，取一系列不同浓度的酮洛芬标准溶液加入空白血浆样品中，经预处理后，利用液相色谱-串联质谱仪进行检测，并分别记录每个浓度的酮洛芬对应的峰面积，以酮洛芬与内标峰面积比值Y为纵坐标，以酮洛芬浓度X为横坐标，绘制所述标准曲线。
7.根据权利要求1-6任一项所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，高效液相色谱条件如下：
色谱柱：Agilent RS-C18色谱柱；和/或，
柱温：30-50℃；和/或，
流动相：A相为0.1％(V/V)的甲酸溶液，B相为乙腈；和/或，
流速：0.1-1.0mL/min；和/或，
进样量：1-10μL；和/或，
线性梯度洗脱程序：起始比例A相为87％，B相为13％，维持1min；1-1.5min，A相降至10％，B相升至90％，维持至7.5min；7.5-8min，A相升至87％，B相降至13％，维持至12.0min。
8.根据权利要求1-6任一项所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，质谱条件如下：
离子源：ESI；和/或，
干燥气温度：300-400℃；和/或，
干燥气流量：5-15L/min；和/或，
雾化气压力：30-50psi；和/或，
毛细管电压：3500-4500V；和/或，
检测模式：正离子扫描的多反应检测模式。
9.根据权利要求8所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法，其特征在于，所述酮洛芬和酮洛芬-D3的质谱参数见下表：
注：*标注的子离子为定量离子。
10.如权利要求1-9任一项所述的利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法在指导酮洛芬用药中的应用。
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