KR101495450B1 - 온-컬럼 메틸화 반응을 이용한 말 혈액 시료 내 산성약물의 분석방법 - Google Patents

온-컬럼 메틸화 반응을 이용한 말 혈액 시료 내 산성약물의 분석방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101495450B1
KR101495450B1 KR20130143174A KR20130143174A KR101495450B1 KR 101495450 B1 KR101495450 B1 KR 101495450B1 KR 20130143174 A KR20130143174 A KR 20130143174A KR 20130143174 A KR20130143174 A KR 20130143174A KR 101495450 B1 KR101495450 B1 KR 101495450B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
blood sample
acid
horse
present
acidic drug
Prior art date
Application number
KR20130143174A
Other languages
English (en)
Inventor
유준동
허만배
한관석
Original Assignee
한국마사회
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국마사회 filed Critical 한국마사회
Priority to KR20130143174A priority Critical patent/KR101495450B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101495450B1 publication Critical patent/KR101495450B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/491—Blood by separating the blood components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N2030/009—Extraction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/025—Gas chromatography

Abstract

본 발명은 말의 혈액 시료 중 산성약물의 분석방법에 관한 것으로, 말의 혈액 시료 내에 존재할 수 있는 산성약물을 간단한 전처리 후 m-(트리플루오로메틸페닐)트리메틸암모늄 하이드록사이드(TTMA-OH)를 가하여 짧은 시간 내에 GC-MS를 이용하여 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 말의 혈액 내에 존재하는 미량의 산성약물을 빠른 시간 내에 정확하게 정량분석할 수 있으므로, 경주마의 도핑테스트 분야, 특히 경주전 검사에서 유용하게 적용할 수 있다.

Description

온-컬럼 메틸화 반응을 이용한 말 혈액 시료 내 산성약물의 분석방법{A method for analysis of acidic drugs in equine blood sample using on-column methylation}
본 발명은 기체크로마토그래프-질량분석기를 이용하여 말의 혈액 시료로부터 산성약물을 빠른 시간 내에 분석하는 방법에 관한 것이다.
경주마에 대해 도핑테스트를 실시해온 지 약 100년이 지났지만 세계 각국의 대부분 경마당국은 경주 후 시료에 대해서만 검사를 실시해 오고 있다. 이는 여러 가지 이유가 있겠지만 기술적인 한계에 의해 단시간 내에 검사할 수 있는 약물의 범위가 극히 한정적이었던 것도 큰 이유가 되겠다. 이로 인해 우리나라의 유일한 경마시행체인 한국마사회는 경마공정성 확보를 위해 경주전 검사를 도입하여 시행하고 있으나, 시간적 제약으로 인하여 가스크로마토그래프-질량분석기(GC/MS)를 이용한 경주 전 검사 대상 약물은 유도체화 과정이 필요 없는 일부 염기성 약물에 한정되어 있다.
경주마의 도핑테스트에서 가장 문제가 되고 있는 산성약물로는 비 스테로이드성 진통소염제류(NSAIDs)와 바비투레이트(barbiturate) 유도체류를 들 수 있다. 비 스테로이드성 진통소염제(NSAID)로 불리우는 약물은 사이클로옥시게나제 억제제로서 급성 및 만성 통증과 염증 및 발열에 사용된다. NSAIDs는 상대적으로 안전한 약물로 알려져 있으나, 과다 투여 또는 장기간 남용되었을 때 심각한 독성효과를 나타낼 수 있다. NSAIDs의 형태는 diclofenac과 같은 phenylacetic acid 유도체, ibuprofen, ketoprofen 등과 같은 propionic acid 유도체, diflunisal과 같은 salicylate 유도체, 그리고 flufenamic acid, mefenamic acid 등과 같은 fenamate 유도체 등 다양한 구조를 가지고 있어 분석과정 중 나타내는 특성에도 약물별 차이가 있다.
Barbiturates는 요소(Urea)와 malonic acid이 결합한 diureide로 오랫동안 가장 대표적인 진정 수면제로 널리 사용되어 왔다. 장시간 반복 사용시 의존성이 생기며 여러 가지 부작용과 함께 과다투여 시 사망에 이를 수 있다. Barbiturates는 사용되는 약물의 종류에 비해 분석된 자료는 많지 않다.
이러한 산성약물들의 경우 앞서 언급한 바와 같이 그 특성에 의해 유도체화 과정이 없이는 GC나 GC-MS에서 분석이 될 수 없으며, 일반적인 유도체화 과정은 시간이 많이 걸리므로 경주전 검사에서 사용될 수 없었다.
한편, On-Column 메틸화 반응을 이용한 분석법으로서 1963년 롭과 웨스트브록(Robb, E. W., and Westbrook, J.J., Analitical Chemistry. 35, (1963) 1644)이 tetramethylammonium hydroxide (TMH)를 이용해 카르복실산 등에 대한 직접적인 메틸화 반응을 통한 분석을 발표한 후 trimethylanilium hydroxide(TMAH)(Brochmann-Hanssen, E., and Oke, T. O., Journal of Pharmaceutical Sciences, 58, (1969) 370), trimethylsulfonium hyrdoxide (TMSH)(Butte W., Journal of chromatography, 261, (1983) 142-145), phenyltrimethylammonium fluoride(PTMA-F)(Amijee, M., Cheung, J. and Wells, R. J., Journal of Chromatography A, 738, (1996) 43-55) 등을 이용한 약물분석의 연구와 활용이 이어졌다. 그러나, 아직까지 경주마의 혈액 시료 분석에 On-Column 메틸화 반응을 이용한 분석법을 활용한 예는 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 말의 혈액 시료 내에 존재할 수 있는 산성약물을 간단한 전처리 후 m-(트리플루오로메틸페닐)트리메틸암모늄 하이드록사이드(TTMA-OH)를 가하여 On-Column 메틸화 반응을 이용함으로써 짧은 시간 내에 GC-MS를 이용하여 분석할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기체크로마토그래프-질량분석기를 이용하여 말의 혈액 시료로부터 산성약물을 빠른 시간 내에 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 말의 혈액 시료 중의 산성약물의 분석방법을 제공한다.
말의 혈액 시료를 포함하는 혼합물을 pH 2-4로 조절하는 단계(단계 1);
상기 혼합물을 디클로로메탄, 헥산 및 에테르를 포함하는 용매로 추출하여 추출물을 얻는 단계(단계 2);
상기 추출물을 m-(트리플루오로메틸페닐)트리메틸암모늄 하이드록사이드와 반응시키는 단계(단계 3); 및
상기 반응물을 분석하는 단계(단계 4).
바람직하기로, 본 발명의 말의 산성약물의 분석방법은 상기 단계 2) 이후에 상기 추출물의 수분 및 용매를 제거하는 단계(단계 2-1)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 말의 혈액 시료 내에 존재할 수 있는 산성약물을 간단한 전처리 후 m-(트리플루오로메틸페닐) 트리메틸암모늄 하이드록사이드(TTMA-OH)를 가하여 짧은 시간 내에 GC-MS를 이용하여 분석할 수 있는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
상기 단계 1은 말의 혈액 시료를 포함하는 혼합물을 pH 2-4로 조절하는 단계로서, 말의 혈액 시료 내에 존재할 수 있는 산성약물의 해리도를 낮추어 비이온형의 비율을 높여 검출율을 높이기 위한 단계이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "혈액 시료"는 산성약물의 분석이 필요한 말의 혈액 시료를 의미하며, 예컨대 말의 혈액, 혈장, 또는 혈청일 수 있다.
바람직하기로, 상기 단계 1에서 pH는 2.5-3.5로 조절할 수 있다. 이때 상기 pH 조절은 HCl을 첨가하여 수행할 수 있다.
상기 단계 2는 상기 말의 혈액 시료를 포함하는 혼합물을 디클로로메탄, 헥산 및 에테르를 포함하는 용매로 추출하여 추출물을 얻는 단계로서, 말의 혈액 시료 중에 존재할 수 있는 산성약물을 특정 유기용매를 사용하여 추출하여 유기층을 분리함으로써 산성약물을 포함하는 추출물을 얻는 단계이다.
상기 단계 2)에서, 말의 혈액 시료를 포함하는 혼합물의 추출 용매로는 디클로로메탄, 헥산 및 에테르의 혼합 용매를 사용하는 것이 말의 혈액 시료 중에 존재할 수 있는 산성약물의 추출 효율면에서 바람직하다. 또한, 상기 디클로로메탄, 헥산 및 에테르는 0.5~2:0.5~2:0.5~2의 부피비로 사용되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하기로는 동량으로, 즉 1:1:1로 사용하는 것이 추출 효율면에서 바람직하다.
상기 단계 2-1은 상기 추출물의 수분 및 용매를 제거하는 단계로서, 상기 추출물 내에 포함되어 있을 수 있는 수분 및 용매를 제거하여 GC 투입용 시료를 얻는 단계이다.
바람직하기로, 상기 단계 2-1은 상기 추출물을 무수황산나트륨에 통과시켜 수분을 제거한 후 유기용매를 질소 하에서 휘발시킴으로써 수행할 수 있다.
상기 단계 3은 상기 추출물을 m-(트리플루오로메틸페닐)트리메틸암모늄 하이드록사이드와 반응시키는 단계로서, 상기 추출물 내에 포함되어 있을 수 있는 산성약물을 메틸화시켜 휘발성을 부여함으로써 분석 효율성을 증진시키고 시료 정제 효과를 동시에 거두기 위한 단계이다.
본 발명에서, 상기 m-(트리플루오로메틸페닐)트리메틸암모늄 하이드록사이드는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이다.
[화학식 1]
Figure 112013106702846-pat00001

상기 m-(트리플루오로메틸페닐)트리메틸암모늄 하이드록사이드는 GC의 주입구(Injection port temperature, 150~300℃) 내에서 -OH, -NH, -COOH와 같은 기능기의 수소를 -CH3로 치환시키는 역할을 한다. 이로써 시료 전처리 시간 중 유도체화 과정에 소요되는 많은 시간을 단축할 수 있다.
상기 단계 4는 상기 반응물을 분석하는 단계로서, 상기 반응물 내에 포함되어 있을 수 있는 메틸화된 산성약물을 검출하는 단계이다.
본 발명에서, 상기 단계 4)는 기체 크로마토그라프-질량분석기(GC-MS)로 분석할 수 있다.
GC-MS는 혼합물 상태인 유기물을 기체 크로마토그라프 (GC)에 의해 분리 후, 이 성분들을 질량분석기(MS)에 연결시켜 정량 분석이 가능하도록 한 기기이다. 구체적으로, 혼합물 상태인 유기물이 기체크로마토그래프에 의해 분리된 후 질량분석기 이온원 전자에너지에 의해 이온화 되면, 이때 생성된 이온은 사중극자에서 질량 대 전하비(m/z)로 분리된다. 각 이온들의 상대 세기를 해석 및 Library를 탐색하여 분리된 물질의 화학적 구조, 화학반응, 분자량 등을 규명할 수 있다. 또한, 혼합물 시료를 GC에서 분리 후 이온발생장치에서 생성된 여러 가지 이온 중에서 특정 이온들만을 선택할 수 있는 SIM (Selective Ion Monitoring)을 사용하여 미지의 시료에 존재하는 측정 물질의 양을 정량할 수 있는 장비이다.
본 발명에서는 GC-MS를 사용하여 상기 반응물 내에 포함되어 있을 수 있는 메틸화된 산성약물을 빠른 시간 내에 정량분석할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “산성약물”은 산성 조건에서 비이온형의 비율이 더욱 증가함에 따라 결과적으로 산성 조건에서 약물의 흡수율이 더욱 증가하게 되는 약물을 의미한다.
본 발명에서, 산성약물은 비 스테로이드성 진통소염제류(NSAIDs), 바비투레이트(barbiturate) 유도체류 또는 이의 조합일 수 있다.
구체적으로, 상기 산성약물은 바비탈(barbital), 알로바비탈(allobarbital), 아프로바비탈(aprobarbital), 티오살리실산(thiosalicylic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 부탈비탈(butalbital), 부타르비탈(butarbital), 아모바비탈(amobarbital), 펜토바비탈(pentobarbital), 세코바비탈(secobarbital), 헥소바비탈(hexobarbital), 페노바비탈(phenobarbital), 안티피린(antipyrine), 플루페남산(flufenamic acid), 페노프로펜(fenoprofen), 플루비프로펜(flurbiprofen), 니플룸산(niflumic aicd), 디플루니살(diflunisal), 나프록센(naproxen), 플루닉신(flunixin), 메페남산(mefenamic acid), 케토프로펜(ketoprofen), 디클로페낙(diclofenac), 토페남산(tofenamic acid), 에토돌락(etodolac), 톨메틴(tolmetin), 메클로페남산(meclofenamic acid), 페닐부타존(phenylbutazone), 조메피락(zomepirac), 옥시펜부타존(oxyphenbutazone) 및 부메타니드(bumetanide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 도 1에 TTMA-OH를 이용한 말의 혈액 중 약물검사 순서도를 나타내었다.
GC/MS을 이용한 검사는 검출능력이나 적용범위 및 정확도 등에 있어서 다른 분석기기의 한계를 훨씬 뛰어넘은 성능으로 현재의 도핑테스트에서 주종을 차지하는 장비가 되었다. 그러나, 비 휘발성 약물을 분석하고자 할 때 유도체화 과정은 필수적이며 많은 시간을 소모될 수밖에 없었고, 이러한 조건은 제한된 시간 내에 검사와 판정이 이루어져야 하는 경주마의 경주전 검사에서 상당한 제약으로 작용하였다. 도 1을 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 TTMA-OH를 이용한 ON-Column 메틸화법은 종래 도핑테스트의 가장 큰 단점인 시간 문제를 해결할 수 있게 해주고, 단 한 번의 검사를 위하여 약 65분 정도로 시간을 단축시킬 수 있으며, 1차 양성 판정시 2차 검사까지 약 115분 정도면 충분하다. 현재 경주전 검사의 제한 시간이 150분이므로 본 발명의 TTMA-OH를 이용한 검사법을 31종의 산성약물을 경주전 검사로 적용할 수 있는 장점을 갖는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 2ml의 말의 혈장을 pH 3으로 조정한 후 DCM:Hex:Ether(1:1:1) 6ml로 추출하고 유기용매를 제거한 후 0.04N TTMA-OH 메탄올 용액으로 희석시킨 후 GC-MS로 분석하였다. 그 결과, 31종의 Barbiturates와 NSAIDs의 전체적인 검출한계(LOD)는 0.21ng/ml 내지 6.22ng/ml이었으며, 50ng/ml의 농도에서 회수율은 20.32(±3.42)~92.19(±4.89)%이고, CV는 1.61~16.93%, Bias는 0.08~6.54%임을 확인하였다. 또한, 120ng/ml의 농도에서 회수율은 35.21(±2.23)~95.17(±6.51)%이었으며, CV는 0.86~22.32%, Bias는 0.11~7.47%임을 확인하였으며, 170ng/ml의 농도에서 회수율은 29.62(±1.51)~95.51(±4.03)%이었으며, CV는 2.16~20.15%, Bias는 0.01~10.66%임을 확인하였다.
본 발명에 따른 말의 혈액 시료 내 산성약물의 분석방법은 말의 혈액 시료 내에 존재할 수 있는 산성약물을 간단한 전처리 후 m-(트리플루오로메틸페닐)트리메틸암모늄 하이드록사이드(TTMA-OH)를 가하여 짧은 시간 내에 GC-MS를 이용하여 분석할 수 있다는 특징이 있다. 이에 따라, 말의 혈액 내에 존재하는 미량의 산성약물을 빠른 시간 내에 정확하게 정량분석할 수 있으므로, 경주마의 도핑테스트 분야, 특히 경주전 검사에서 유용하게 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 TTMA-OH를 이용한 말의 혈액 중 약물검사 순서도를 나타낸다.
도 2는 아프로바비탈의 검량선을 나타낸다. 여기에서, X축은 Calibration 시료 농도와 첨가된 Internal Standard의 농도비를 나타내며 Y축은 각 농도에서 Calibration 시료의 피크 면적과 Internal Standard의 피크면적의 비율을 나타낸다(n=4).
도 3은 barbital과 2-메틸화 유도체의 구조(A), 및 barbital-2Me의 질량 스펙트럼(B)을 나타낸다.
도 4는 tolfenamic acid와 이의 유도체의 구조(A), tolfenamic acid-Me의 질량 스펙트럼(B), 및 tolfenamic acid-2Me의 질량 스펙트럼(C)을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
1. 시약
m-(trifluoromethylphenyl)trimethylammonium hydroxide(TTMA-OH)은 제품명 Methprep II®(alltech, USA)로 판매되고 있는 0.2N anhydrous methanol 용액을 구매하여 다시 메탄올로 5배 희석하여 사용하였다.
추출용매는 Dichloromethane(HPCL용, Fisher, USA)과 Hexane(GR, Junsei, Japan) 그리고 Diethylether(GR, Junsei, Japan)를 각각 1:1:1로 혼합하여 사용하였다.
2. 표준용액 및 시료제조
NSAIDs(RM, Sigma, USA & USP,USA)와 Barbiturates(향정신성의약품, 보건복지부) 표준용액은 1000㎍/ml의 메탄올 용액으로 제조되어 4℃에서 저장된 후 사용시 20㎍/ml의 혼합 용액으로 희석 후 사용되었다.
실험에 사용된 혈장은 검사를 위해 채취된 혈액시료 중 음성시료의 혈장을 모아 사용하였다. 실험 당일 상온에 1시간 이상 정치 후 사용되었고 실험에 사용된 시료에는 내부표준물질(I.S.)로 Cyclopentobarbital이 200ng/ml의 농도로 첨가되었다.
3. 분석장비
6890 Gas Chromatograph(Agilent, USA)와 5973N Mass-Selective Detector (Agilent, USA) 그리고 7683 series Injector(Agient, USA)를 사용하여 분석하였다. 분석 Column은 Ultra 2(25m x 0.22(Ø) x 0.33㎛, Agilent, USA)를 사용하였고 Carrier gas로는 Helium(99.999%)를 사용하였다.
4. 분석조건
GC: Injection temperature는 260℃에서 Splitless mode(Purge time : 1min, Purge flow : 50ml/min)에서 시료는 1㎕를 주입하였다. Oven temperature는 80℃에서 30℃/min의 속도로 150℃까지 상승, 10℃/min의 속도로 250℃까지 상승, 다시 30℃/min의 속도로 300℃까지 상승 후 6분간 유지하였다(총 20분).
MSD: 정성분석 시에는 SCAN mode를 사용하여 (m/z range : 50~450, 3.62scan/sec) 분석하였고, 정량분석 시에는 SIM mode를 사용하여 각 약물당 3개의 ion을 선택하여 25개 그룹으로 나누어 분석하였다(dwell time = 10msec/ion).
5. 검량선(Calibration Curve)의 작성
검정곡선 작성을 위해 7개 농도(10, 40, 70, 100, 130, 160, 200ng/ml)에서 각각 4개씩의 Calibration 시료와 3개 농도(50, 120, 170ng/ml)에서 각각 4개씩의 QC 시료 그리고 4개의 Blank 시료를 준비하였다. 각 시료에는 내부표준물질(I.S.)이 200ng/ml의 농도로 첨가되었다. 얻어진 데이터는 Enhanced Data Anaysis(Enhanced Chemstation G1701 CA Ver. C.00.00)에서 RTEINT을 이용하여 Integration 하였다. Integration Data는 CSV file로 변환되어 Excell(Microsoft (R) Ecell 2000)을 사용하여 계산되었다.
6. 회수율( Recovery )
회수율을 측정하기 위하여 12개의 Blank 시료를 준비한 후 각각 내부표준물질(Internal Standard, I.S.)을 가하고 시료 전처리 과정을 거친 후 TTMA-OH용액으로 희석 직전에 각 약물들이 100, 240, 340ng씩 첨가되도록 표준약물 혼합용액을 가한 후 건조시켰다. 회수율 측정용 시료는 같은 양의 약물이 첨가된 3개 농도의 QC 시료와 각각 농도를 비교하여 각 약물의 회수율을 하기 수학식 1에 따라 구할 수 있었다.
[수학식 1]
Figure 112013106702846-pat00002

7. 검출 한계(Limit of Detection, LOD)
LOD를 측정하기 위하여 7개 농도(0.1, 0.2, 1, 2, 5, 10, 20ng/ml)에서 각각 4개씩의 Calibration 시료와 7개의 Blank 시료를 준비하였으며, 각각의 시료에는 I.S.가 50ng/ml 농도로 첨가되었다. LOD는 하기 수학식 2와 같이 계산하였다.
[수학식 2]
Figure 112013106702846-pat00003

① 계산된 LOD, ② 가장 낮은 Calibration 시료 농도, ③ x절편 중에서 높은 값을 LOD로 선택하였다.
8. 정확도, 정밀도, 반복성 및 재현성
QC 시료의 측정값을 이용하여 정확도를 나타내기 위하여 Bias, 정밀도를 나타내기 위하여 CV(%)를 이용하였으며 반복성과 재현성은 Bias와 CV를 각각 Intra-day와 Inter-day(3일간) 데이터로 나타냈다. 이때 Bias는 하기 수학식 3과 같이 계산하였으며, CV는 하기 수학식 4와 같이 계산하였다.
[수학식 3]
Figure 112013106702846-pat00004
상기 식에서, M.V.는 평균값이고, N.V.는 공칭값이다.
[수학식 4]
Figure 112013106702846-pat00005
상기 식에서, SD는 표준 편차이고, M.V.는 평균값이다.
9. 불확도(U c )
QC 시료의 각 측정값에서의 불확도는 하기 수학식 5를 이용하여 구했다.
[수학식 5]
Figure 112013106702846-pat00006

상기 식에서, Uc는 표준합성불확도이고, sy는 잔차의 표준편차, p는 측정 반복 횟수, n은 검량선 작성시의 반복횟수, Co는 측정값, Cavr은 검량구간의 평균값이며, Sxx는 (x i )2-nCavr 2 이다.
실시예 2: 말의 혈액 분석
1. 시료 전처리
준비된 혈장시료 2ml를 15ml tube에 담았다. 여기에 내부표준물질(Internal Standard, IS)인 cyclopentobarbital을 가하고 2N HCl을 150 ㎕ 가하여 pH 3으로 조정하였다. 추출용매(DCM:Hex:Ether=1:1:1) 6ml를 가하고 10분간 교반하였다. 원심분리 후 상층액(유기층)을 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거한 후 유기용매를 질소 하에서 휘발시켰다. 잔사에 Meth-prep II 5배 희석액을 50 ㎕ 가한 후 진탕한 후 1 ㎕를 GC/MS에 주입하였다.
2. 결과 분석
먼저, 각 약물별 회귀분석 값(검량선 y = ax + b)을 구하여 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112013106702846-pat00007

TTMA-OH와 약물들이 GC의 Injection port(260℃)에서 반응한 결과 검량선은 좋은 직선성을 보여주어 R2값이 0.9974(Phenobarbital) ~ 0.9994 (Amobarbital)로 나타났다(표 1). 일례로, 아프로바비탈의 검량선을 도 2에 나타내었다. 도 2에서, X축은 Calibration 시료 농도와 첨가된 Internal Standard의 농도비를 나타내며 Y축은 각 농도에서 Calibration 시료의 피크 면적과 Internal Standard의 피크면적의 비율을 나타낸다(n=4).
한편, 각각의 약물들은 TTMA-OH와 반응하여 각각 유도체화되어 검출되었다. 분석되는 Barbiturates 및 NSAIDs의 구조와 유도체를 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure 112013106702846-pat00008
Figure 112013106702846-pat00009
Figure 112013106702846-pat00010
Figure 112013106702846-pat00011
Figure 112013106702846-pat00012

더 나아가, 각각의 약물별 RT, RRT 및 검출한계(LOD)를 하기 표 3에 나타내었다.
[표 3]
Figure 112013106702846-pat00013

또한, 각각의 약물별 회수율을 하기 표 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure 112013106702846-pat00014

또한, 각각의 약물별 Intra-day Analysis(n=4) 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
[표 5]
Figure 112013106702846-pat00015

또한, 각각의 약물별 Inter-day Analysis(n=12) 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
[표 6]
Figure 112013106702846-pat00016

Barbiturates의 경우 비슷한 구조로 인하여 대부분 두 개의 -NH기에 각각 메틸기가 치환되어 N,N-Dimethyl- barbiturates를 형성하며 Hexobarbital의 경우는 한 개의 -NH를 포함하고 있으므로 한 개의 메틸기만이 치환된 형태로 검출되었다(표 2). 일례로, barbital과 2-메틸화 유도체의 구조(A), 및 barbital-2Me의 질량 스펙트럼(B)을 도 3에 나타내었다.
질량스펙트럼 상에서 분자이온 피크는 약하거나 발견되지 않으며 두 개의 카보닐 그룹 사이의 5-탄소에 결합된 그룹들이 이탈되면서 생성되는 이온들(m/z 169, 195, 196, 232 & 235)이 Base Peak로 나타났다. 피크머무름 시간(Retention Time, RT)은 NSAIDs에 비해 빠르며 5.32분 (Barbital) ~ 9.77분(Phenobarbital) 이었다. LOD는 0.37ng/ml(Phenobarbital) ~ 0.63ng/ml (Hexobarbital)로 나타났다(표 3).
한편, NSAIDs의 경우 -COOH, -OH 그리고 -NRH의 기능기를 동시에 포함하는 약물들이 있으므로 다양한 메틸화 형태를 보여주는데, Antipyrine은 반응을 하지 않았고, Ketoprofen과 Diflunisal은 1개와 2개의 메틸이 각각 치환되어 단일한 생성물로 검출이 되었다. zomepirac은 1개와 2개의 메틸이 치환된 유도체가 각각 검출되었으며 etodolac, diclofenac 등은 다양한 유도체들이 검출되었다(표 2). 일례로, tolfenamic acid와 이의 유도체의 구조(A), tolfenamic acid-Me의 질량 스펙트럼(B), 및 tolfenamic acid-2Me의 질량 스펙트럼(C)을 도 4에 나타내었다.
NSAIDs의 피크머무름 시간(Retention Time, RT)은 6.38 (Thiosalicylic acid) ~ 14.97분 (Oxyphenbutazone) 이었다. LOD는 상대적으로 약물별 차이가 커서 0.21ng/ml (Ketoprofen) ~ 6.25ng/ml (Phenylbutazone)으로 나타났다(표 3). 2개 이상이 유도체가 검출된 화합물의 정량분석을 수행할 때는 주생성물 또는 정량분석 결과의 재현성이 뛰어난 유도체를 선택하여 SIM Mode Analysis를 하였다.
50, 120, 170ng/ml에서 각각 측정된 회수율은 일관적인 값을 보여주었다(표 4). 50 ng/ml의 농도에서 Barbiturates는 74.05±4.78(Phenobarbital) ~ 98.25±4.09% (Allobarbital)로 나타났다. 이에 비해 NSAIDs는 20.32±3.42(Diflunisal) ~ 87.23±6.24% (Tolmetin)로 상대적으로 편차가 큰 회수율을 보였으나 전반적으로는 60~80%의 회수율을 보였고, Diflunisal과 같이 낮은 회수율을 보이는 약물도 정밀도와 재현성에서 만족할 만한 값은 보여 주었다(표 5 및 표 6).
세 가지 농도에서 측정된 CV(%, 기준 20이하)와 Bias(%, 기준 10이하) 값은 Intra-day(표 5) 및 Inter-day Analysis(표 6)에서 좋은 정확도와 정밀도(또는 반복성과 재현성)을 보여주었다.

Claims (9)

  1. 말의 혈액 시료를 포함하는 혼합물을 pH 2-4로 조절하는 단계(단계 1);
    상기 혼합물을 디클로로메탄, 헥산 및 에테르를 포함하는 용매로 추출하여 추출물을 얻는 단계(단계 2);
    상기 추출물을 m-(트리플루오로메틸페닐)트리메틸암모늄 하이드록사이드와 반응시키는 단계(단계 3); 및
    반응물을 분석하는 단계(단계 4)를 포함하는 말의 혈액 시료 중의 산성약물의 분석방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 2) 이후에 상기 추출물의 수분 및 용매를 제거하는 단계(단계 2-1)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 말의 혈액 시료는 말의 혈액, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 분석방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 1에서 pH 2.5-3.5로 조절하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 1은 HCl을 첨가하여 pH를 조절하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 2)의 디클로로메탄, 헥산 및 에테르는 0.5~2:0.5~2:0.5~2의 부피비로 사용되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 4)는 기체 크로마토그라피-질량분석기로 분석하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 산성약물은 비 스테로이드성 진통소염제류(NSAIDs), 바비투레이트(barbiturate) 유도체류 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 분석방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 산성약물은 바비탈(barbital), 알로바비탈(allobarbital), 아프로바비탈(aprobarbital), 티오살리실산(thiosalicylic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 부탈비탈(butalbital), 부타르비탈(butarbital), 아모바비탈(amobarbital), 펜토바비탈(pentobarbital), 세코바비탈(secobarbital), 헥소바비탈(hexobarbital), 페노바비탈(phenobarbital), 안티피린(antipyrine), 플루페남산(flufenamic acid), 페노프로펜(fenoprofen), 플루비프로펜(flurbiprofen), 니플룸산(niflumic aicd), 디플루니살(diflunisal), 나프록센(naproxen), 플루닉신(flunixin), 메페남산(mefenamic acid), 케토프로펜(ketoprofen), 디클로페낙(diclofenac), 토페남산(tofenamic acid), 에토돌락(etodolac), 톨메틴(tolmetin), 메클로페남산(meclofenamic acid), 페닐부타존(phenylbutazone), 조메피락(zomepirac), 옥시펜부타존(oxyphenbutazone) 및 부메타니드(bumetanide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 분석방법.
KR20130143174A 2013-11-22 2013-11-22 온-컬럼 메틸화 반응을 이용한 말 혈액 시료 내 산성약물의 분석방법 KR101495450B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130143174A KR101495450B1 (ko) 2013-11-22 2013-11-22 온-컬럼 메틸화 반응을 이용한 말 혈액 시료 내 산성약물의 분석방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130143174A KR101495450B1 (ko) 2013-11-22 2013-11-22 온-컬럼 메틸화 반응을 이용한 말 혈액 시료 내 산성약물의 분석방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101495450B1 true KR101495450B1 (ko) 2015-03-02

Family

ID=53025690

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR20130143174A KR101495450B1 (ko) 2013-11-22 2013-11-22 온-컬럼 메틸화 반응을 이용한 말 혈액 시료 내 산성약물의 분석방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101495450B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108828094A (zh) * 2018-06-29 2018-11-16 佛山市南海东方澳龙制药有限公司 利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010533283A (ja) * 2007-07-13 2010-10-21 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． ドーピング化合物の分析
KR101004749B1 (ko) * 2010-05-27 2011-01-07 대한민국 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 60종 이상 마약성분의 다성분 동시분석법
KR20120014736A (ko) * 2010-08-10 2012-02-20 한미홀딩스 주식회사 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 혈장 중의 아스피린의 분석방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010533283A (ja) * 2007-07-13 2010-10-21 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． ドーピング化合物の分析
KR101004749B1 (ko) * 2010-05-27 2011-01-07 대한민국 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 60종 이상 마약성분의 다성분 동시분석법
KR20120014736A (ko) * 2010-08-10 2012-02-20 한미홀딩스 주식회사 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 혈장 중의 아스피린의 분석방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108828094A (zh) * 2018-06-29 2018-11-16 佛山市南海东方澳龙制药有限公司 利用高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中酮洛芬的方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Peters et al. Method development in forensic toxicology
Farid et al. Determination of the active and inactive metabolites of prasugrel in human plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry
Leis et al. Quantitative analysis of memantine in human plasma by gas chromatography/negative ion chemical ionization/mass spectrometry
Schettgen et al. Simultaneous determination of mercapturic acids derived from ethylene oxide (HEMA), propylene oxide (2‐HPMA), acrolein (3‐HPMA), acrylamide (AAMA) and N, N‐dimethylformamide (AMCC) in human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry
CN104297409A (zh) 一种电子烟烟液中烟碱的手性分析方法
Tynon et al. Rapid and sensitive screening and confirmation of thirty‐four aminocarbonyl/carboxamide (NACA) and arylindole synthetic cannabinoid drugs in human whole blood
CN102680565B (zh) 同位素稀释电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿肌酐的分析方法
Sommer et al. Measurement of mercury species in human blood using triple spike isotope dilution with SPME-GC-ICP-DRC-MS
CN104359998B (zh) 一种气相色谱-串联质谱检测甲磺酸甲酯的方法
Kadioglu et al. Spectrofluorimetric determination of amlodipine in human plasma without derivatization
CN115308319A (zh) 一种全氟及多氟烷基化合物非靶向筛查的定量方法
Stewart et al. A rapid, sensitive, and selective method for quantitation of lamprey migratory pheromones in river water
Gao et al. Screening of imidazoles in atmospheric aerosol particles using a hybrid targeted and untargeted method based on ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry
Song et al. Reactive paper spray mass spectrometry for rapid analysis of formaldehyde in facial masks
Projean et al. Rapid and simple method to determine morphine and its metabolites in rat plasma by liquid chromatography–mass spectrometry
CN103175921B (zh) 液相色谱串联质谱分析尿液中苯和甲苯四种代谢产物的方法
KR101495450B1 (ko) 온-컬럼 메틸화 반응을 이용한 말 혈액 시료 내 산성약물의 분석방법
CN101169389A (zh) 一种快速测定溶液中三硝基甲苯或黑索金的方法
Mustafa et al. UHPLC/ESI‐Q‐TOF‐MS method for the measurement of dopamine in rodent striatal tissue: A comparative effects of intranasal administration of ropinirole solution over nanoemulsion
CN105092733B (zh) Lc‑ms测试物中不挥发性缓冲盐含量的降低方法和装置
Sabatini et al. Development and validation of a capillary high‐performance liquid chromatography/electrospray tandem mass spectrometric method for the quantification of bisphenol A in air samples
CN103776927B (zh) 一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法
CN104991028B (zh) Lc‑ms测试物中不挥发性缓冲盐含量的降低方法
CN106404925B (zh) 测定人全血中6种巴比妥类药物的方法
CN104991027A (zh) 降低lc-ms测试物中不挥发性缓冲盐含量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171228

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190126

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200108

Year of fee payment: 6