KR101004749B1

KR101004749B1 - 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 60종 이상 마약성분의 다성분 동시분석법

Info

Publication number: KR101004749B1
Application number: KR1020100049579A
Authority: KR
Inventors: 정재철; 인문교; 서용준; 고범준; 서승일
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2010-05-27
Filing date: 2010-05-27
Publication date: 2011-01-07

Abstract

소변 시료를 인산완충용액으로 pH 5~8로 조절하는 단계; 상기 단계의 소변 시료를 염산이 혼합된 30% 알코올을 정제용 용매로 사용하여 시료를 정제한 후 추출용매를 사용하여 추출하는 고체상(solid phase) 추출단계; 상기 단계의 추출 후 건고된 마약성분을 N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide(MSTFA)를 이용하여 트리메틸실릴(trimethylsilylation) 유도체화 하는 단계; 및 상기 유도체화한 마약성분을 기체크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 60종 이상 마약성분의 다성분 동시분석법이 개시된다.
본 발명에 의하면 암페타민계(amphetamine-type drugs), 대마(cannabinoids), 아편계(opiates), 코카인계(cocaines), 벤조디아제핀계(benzodiazepines), 바비탈계(barbiturates) 성분 등의 주요 마약류성분들이 포함된 총 60종 성분을 소변에서 고체상 자동추출법(ASPE)을 이용하므로써 간편하게 추출할 수 있어 편리성이 탁월하며 소요 노동력이 낮다.
또한 화학적 구조와 물리적 특성이 각각 틀린 각 성분들을 동시에 TMS 유도체화하여 높은 분석 감도로 동시에 확인할 수 있어 검출농도가 낮으며, 각 성분별로 가장 적합한 3쌍의 이온(ion)들을 선택하여 온도 프로그램에 따라 분리 할 수 있는 기체크로마토그래피법을 이용하므로 경제성과 실용성 면에서 가치가 높다.

Description

기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 60종 이상 마약성분의 다성분 동시분석법{Simultaneous analysis of more than 60 drugs in urine by gas chromatography}

본 발명은 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 60종 이상 마약성분의 다성분 동시분석법에 관한 것으로써, 더욱 상세하게는 더욱 상세하게는 시료의 pH 를 5~8로 조절하는 단계, 고체상 추출 및 유도체화 단계를 거쳐 마약 다성분을 동시 분석하는 방법이다.

국내에서는 메스암페타민(methamphetamine)과 대마성분이 남용빈도가 가장 높은 마약성분들이다. 다음으로 MDMA(3,4-methylenedioxymethamphetamine), 아편(opiate), 코카인(cocaine), 날부핀(nalbuphine, NBP), 덱스트로메토르판( dextromethorphan, DMP), 카르소프로돌(carisoprodol, CSP), 케타민( ketamine, KET), 디아제팜(diazepam), 펜터민(phentermine) 등이 남용되고 있으며, 이들 성분들은 현재 법적으로 규제를 받고 있는 약물들이다.

특히 NBP, DMP, CSP, KET성분은 새롭게 남용되는 신종마약류들로 다른 마약성분의 대체 약물로 남용되곤 한다. 이들 성분들은 일반의약품 또는 조제약으로 사용되었지만 과량으로 남용할 경우 정신적ㆍ육체적으로 심각한 폐해를 주는 것으로 알려지게 되었다.

그래서 2000년 초부터 이들 약물들의 남용이 지속적으로 진행되고 사회적인 문제를 유발시키는 원인으로 법적 제재를 받기 시작하게 된 것이다. 하지만 이들 성분들에 대한 남용 확인은 일상적인 마약성분 분석에서는 확인과정을 거치지 않는다.

그것은 메스암페타민과 대마성분처럼 남용 빈도가 높지 않아 높은 비용과 소요 노동력을 들여 분석 시료마다 매번 확인 할 수는 없다. 남용 정보가 있거나 외부의 분석요구가 있을 경우에만 확인이 이뤄진다. 또한 이들 성분들의 복용여부를 확인하기 위해서는 각각의 개별 분석방법으로 확인하기 위해서는 별도의 시료 처리과정을 거쳐 성분을 확인해야하므로 비용과 노동력이 추가로 필요한 실정이다.

법 과학분야에서 암페타민류계, 대마, 아편계, 코카인계, 벤조디아제핀계, 바비탈계 성분과 같은 마약류들은 일반적으로 면역반응측정법(immunological method)을 이용한 예비분석(screening analysis)이 수행되고 가스크로마토그래피-질량분석기(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)를 이용한 확인분석이 수행된다.

예비 분석결과는 수분 이내에 결과를 확인할 수는 있지만, 분석비용이 많이 들며, 결과 또한 정확성이 떨어지고 분석 성분도 한정적으로 단점이 많다. 확인분석방법으로 많이 사용되는 GC-MS법과 액체크로마토그래피-질량분석법(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)이 있다. LC-MS법은 유도체화 과정 (derivatization) 없이 바로 분석할 수 있어 GC-MS법 보다 전처리과정이 줄어드는 장점이 있다.

하지만 GC-MS법 보다 분석비용이 높고 일상적인 분석방법으로 적용하기에는 장비 운용면에서는 편리성이 매우 떨어지는 단점이 있다. 그래서 법과학분야의 일상적인 마약류성분 분석에서 확인분석법으로 GC-MS법을 선호하는 이유도 여기에 있다.

전처리과정 중 추출과정으로 분석자의 노동력을 최소화 해주는 고체상 추출방법(solid-phase extraction, SPE)과 분석자의 노동력이 많이 소요되며 각 단계마다 수작업으로 진행되어 편리성이 떨어지는 액체상 추출방법(liquid-liquid extraction, LLE)이 많이 사용된다.

유도체화 과정은 사용되는 유도체 시약에 따라 유도체화되는 성분들이 각각 다르다. 즉 성분에 따라 유도체 시약이 각각 달라 모든 성분을 동시에 유도체화 하는 것은 쉽지가 않다.

분석시료인 혈액에서 대마, 아편계, 코카인계, 벤조디아제핀계 성분을 LLE법과 tert-butyldimethylsilylation and MSTFA 유도체화법으로 분석하는 방법(Gunnar et al., J. Chromatogr. B., 806 (2004) 205)이 개시되어 있다. 소변에서는 대마, 아편계, 코카인계 성분을 LLE법과 MSTFA 유도체화법으로 분석하는 방법(Strano-Rossi et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 19 (2005) 1529)이, 암페타민계, 대마, 아편계, 코카인계, 벤조디아제핀계, 에페드린계 성분을 LLE법과 pentafluoropropionic anhyride과 2,2,3,3,3-penfafluoro-1-propanol의 시약을 이용한 유도체화법으로 분석하는 방법(Satio et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 43 (2007) 358)이 보고되었으며, 암페타민계, 아편계, 에페드린계 성분을 수동 SPE법과 acetic anhydride의 시약을 이용한 유도체화법으로 분석하는 방법(Ishida et al., J. Anal. Toxicol., 30 (2006) 468)이 보고되어 있다. 모발에서는 암페타민계, 아편계, 코카인계 성분을 SPE법과 MSTFA 유도체화법으로 분석하는 방법(Cordero et al., J. Chromatogr. B., 850 (2007) 423 )이 보고되어 있다.

그러나 전처리과정으로 고체상 자동추출법(Automatic SPE, ASPE)과 MSTFA의 시약을 이용한 TMS 유도체화법으로 암페타민계, 대마, 아편계, 코카인계, 벤조디아제핀계, 바비탈계, 에페드린 성분을 소변에서 동시에 분석할 수 있는 다성분 동시분석방법이 제시되어 있지는 않다.

남용 빈도가 높은 메스암페타민과 MDMA와 같은 암페타민계 성분과 대마 성분을 화학적 구조와 물리적 특성이 달라 동시분석이 쉽지는 않으나 이들 성분들을 동시에 확인할 수 있는 분석법을 개발하고 또한 다른 마약성분들도 동시에 분석할 수 있는 경제적이면서 실용적인 최적화된 분석법 개발이 필요한 실정이다.

본 발명의 일 측면은 소변 시료를 인산완충용액을 사용하여 pH 5~8로 조절하는 단계; 상기 단계의 소변 시료를 염산이 혼합된 30% 알코올을 정제용 용매로 사용하여 시료를 정제한 후 추출용매를 사용하여 추출하는 고체상(solid-phase) 추출단계; 상기 단계의 추출 후 건고된 마약성분을 N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide(MSTFA)를 이용하여 트리메틸실릴(trimethylsilylation) 유도체화 하는 단계; 및 상기 유도체화한 마약성분을기체크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 마약성분의 다성분 동시분석법을 제공하는 것이다.

다만, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 또 다른 기타 기술적 문제점들은 아래의 기재로부터 보편적 기술자들에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 측면에 따라 소변 시료를 인산완충용액을 사용하여 pH 5~8로 조절하는 단계;

상기 단계의 소변시료를 염산이 혼합된 30% 알코올을 정제용 용매로 사용하여 마약성분을 정제한 후 추출용매를 사용하여 추출하는 고체상(solid-phase) 추출단계;

상기 단계의 추출 후 건고된 마약성분을 N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide(MSTFA)를 이용하여 트리메틸실릴(trimethylsilylation) 유도체화 하는 단계; 및

상기 유도체화한 마약성분을 기체크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 마약성분의 다성분 동시분석법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 따라, 상기 마약성분은 마약성분과 그 대사체 성분으로써, 암페타민계(amphetamine-type drugs), 대마 대사체, 아편계(opiates), 코카인계(cocaines), 벤조디아제핀계(benzodiazepines), 바비탈계(barbiturates) 성분 및 carisoprodol(CSP), cathinone(Khat), ephedrine(EP), fenfluramine(FFA), ketamine(KET), lysergic acid diethylamide(LSD), mazindol(MZD), meprobamate(MPB), methadone(MTHD), methaqualone (MTQ), methoxyphenamine(MPHA), methylephedrine(MEP), methylphenidate(MPH, ritalin), mescaline(MES), norfentanyl(NFT), norketamine(NKET), norpethidine(normepridine, NPTHD), pemoline(PML), pentazocine(PTZC), pethidine(PTHD), phencyclidine(PCP), phendimetrazine(PDMT), phenmetrazine(PMT), ritalinic acid(methylphenidate metabolite, RTA), selegiline(SEL), zolpidem(ZPD), 2-oxo-3-hydroxy-LSD(OHLSD), 4-bromo-2,5-dimethoxyphenethylamine(2CB)을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 따라, 상기 암페타민계 성분은 amphetamine(AP), methamphetamine(MA), 3,4-methylenedioxyamphetamine(MDA), 3,4-methylenedioxyethylamphetamine(MDEA), 3,4-methylenedioxymethamphetamine(MDMA), p-methoxyamphetamine(PMA), p-methoxymethamphetamine(PMMA) 및 phentermine(PT), 상기 대마 대사체는 11-nor-9-carboxy-△⁹-tetrahydrocannabinol(THCCOOH), 상기 아편계 성분은 codeine(COD), dextromethorphan(DMP), dextrorphan(DRP), 6-monoacetylmorphine(6MAM), morphine(MOR), nalbuphine(NBP), papaverine(PAP), 상기 코카인계 성분은 benzoylecgonine(BE), cocaine(COC) 및 ecgonine methylester(EME), 상기 벤조디아제핀계 성분은 alprazolam(ALPZ), diazepam(DZ), hydroxyalprazolam(OHALPZ), hydroxytriazolam(OHTZ), lorazepam(LZP), nordiazepam(NDZP), oxamzepam(OXZP), temazepam(TMZP) 및 7-aminoflunitrazepam(7AFTZP), 상기 바비탈계성분은 amobarbital(AMB), pentobarbital(PTB), secobarbital(SCB) 및 phenobarbital(PNB)을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 따라, 상기 유도체화 하는 단계는 60~80℃에서 10~30분간 반응시키다.

본 발명의 일 구체예에 따라, 상기 기체크로마토그래피로 분리하는 단계에서 컬럼 온도는 120℃~300℃사이의 120℃~180℃, 180℃~220℃, 220℃~255℃, 255℃~290℃, 290℃~300℃ 및 300℃~310℃의 각 구간에서 각기 다른 온도경사를 이용하여 승온 시켜 수행된다.

본 발명의 일 구체예에 따라, 상기 기체크로마토그래피로 분리하는 단계이후에 질량분석기를 더 추가한다.

본 발명의 일 구체예에 따라, 상기 질량분석기로 분석시 분석물질에 대해 9종의 동위원소가 치환된 내부표준물질을 이용한다.

기타 본 발명의 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명은 고체상 자동추출법(ASPE), 유도체화법, 및 기체크로마토그래피법으로 이루어진 단일 분석방법으로 60종 성분을 동시에 분석할 수 있어 매우 경제적이며, 분석의 편리성과 신속성 면에서 실제 활용도가 높다.

도 1은 본 발명에 따른 마약 성분 60종의 화합물에 대해 기체크로마토그래피-질량분석기로 분석한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.

이하, 본 발명의 구현예를 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며, 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명은 소변 시료를 인산완충용액을 사용하여 pH 5~8로 조절하는 단계; 소변 시료를 고체상추출법을 이용하여 추출하는 단계; N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide(MSTFA)를 이용하여 트리메틸실릴(trimethylsilylation) 유도체화 하는 단계; 및 기체크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 60종 이상 마약성분 다성분 동시분석법을 제공한다.

본 발명의 분석 방법으로 하기의 60종 이상 화합물을 분석할 수 있다: alprazolam(ALPZ), amobarbital(AMB), amphetamine(AP), benzoylecgonine(BE), carisoprodol(CSP), cathinone(Khat), cocaine(COC), codeine(COD), dextromethorphan(DMP), dextrorphan (DRP), diazepam(DZ), ecgonine methylester(EME), ephedrine(EP), fenfluramine(FFA), hydroxyalprazolam(OHALPZ), hydroxytriazolam(OHTZ), ketamine(KET), lorazepam(LZP), lysergic acid diethylamide(LSD), mazindol(MZD), meprobamate(MPB), methamphetamine(MA), methadone (MTHD), methaqualone (MTQ), methoxyphenamine(MPHA), methylephedrine (MEP), methylphenidate(MPH, ritalin,), mescaline (MES), morphine(MOR), nalbuphine(NBP), nordiazepam(NDZP), norfentanyl(NFT), norketamine(NKET), norpethidine(normepridine, NPTHD), oxamzepam(OXZP), papaverine(PAP), p-methoxyamphetamine(PMA), p-methoxymethamphetamine(PMMA), pemoline(PML), pentazocine(PTZC), pentobarbital(PTB), pethidine(PTHD), phencyclidine(PCP), phendimetrazine(PDMT), phenmetrazine(PMT), phenobarbital(PNB), phentermine(PT), ritalinic acid(methylphenidate metabolite, RTA), secobarbital(SCB), selegiline(SEL), temazepam(TMZP), zolpidem(ZPD), 2-oxo-3-hydroxy-LSD(OHLSD), 3,4-methylenedioxyamphetamine(MDA), 3,4-methylenedioxyethylamphetamine(MDEA), 3,4-methylenedioxymethamphetamine(MDMA), 4-bromo-2,5-dimethoxyphenethylamine(2CB), 6-monoacethylmorphine(6MAM), 7-aminoflunitrazepam(7AFTZP), 11-nor-9-carboxy-△⁹-tetrahydrocannabinol(THCCOOH).

다음 화학구조에서 상기 화합물의 화학구조를 보여 준다.

[화학구조]

(계속)

(계속)

(계속)

본 발명은 소변 시료를 인산완충용액을 사용하여 pH 5~8로 조절하는 단계;

상기 단계의 소변 시료를 염산이 혼합된 30% 알코올을 정제용 용매로 사용하여 시료를 정제한 후 추출용매를 사용하여 추출하는 고체상(solid-phase) 추출단계;

본 발명의 제 1 단계에서 0.1M 인산완충용액을 사용하여 pH 5~8로 조절한다. 소변 시료 속에 존재하는 마약성분들은 pH의 조건에 따라 추출량이 달라지기 때문에 안정적으로 추출될 수 있도록 pH를 조절해야 하며 사용되는 추출용매의 희석에 따른 기질 효과(matrix effect; 정량하고자 하는 이온이 소변 자체의 기질의 영향으로 실제보다 적게 검출되거나 그 반대로 실제보다 많은 양이 있는 것처럼 나타나는 현상)를 줄이고 보다 높은 농도로 원하는 마약성분들을 추출하기 위해 인산완충용액을 첨가한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 pH 5-8이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 pH 6-7이며, 가장 바람직하게는 pH 6이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 소변 시료량의 경우 1mL 이상의 많은 양을 취하는 경우 기질 효과로 소변 자체에 포함되어 있는 미지의 성분들에 의한 방해물질 영향이 커져 검출하고자 하는 마약성분 확인이 용의하지 않으므로 소변 시료량은 1mL로 채취하는 것이 바람직하다.

소변 시료로부터 분석 대상 마약류 성분을 추출하기 위해서는 알칼리성분과 산성성분을 동시에 추출 가능한 SPE(solid-phase extraction) 컬럼을 사용하는 것이다. 사용되는 컬럼은 특별히 한정되지는 않으나, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 컬럼은 추출되어지는 성분의 pH 범위가 2-14로 넓은 60 mg의 고분자(hydrophilic-lipophilic balanced copolymer)로 충진된 상용화된 카트리지를 사용할 수 있다.

상기 단계의 소변 시료는 염산이 혼합된 30% 알코올을 정제용 용매로 사용하여 시료를 정제한 후 추출용매를 사용하여 추출하는 고체상(solid-phase) 추출단계를 거친다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 고체상 추출단계에서는 칼럼 정제용 용매로는 30% 메탄올을 사용하는 것이 바람직하며, 특히 메탄올과 휘발성이 높은 마약성분들의 휘발을 막기 위해 0.1M 염산이 혼합된 용매를 사용함이 바람직하다.

상기 단계의 추출 후 건고된 마약성분을 N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide(MSTFA)를 이용하여 트리메틸실릴(trimethylsilylation) 유도체화 하는 단계를 거친다.

Trimethylsilylation으로 시료를 유도체화함으로써, 마약성분 60종 중 특징적인 작용기인 아민기(-NH, -NH₂), 카르복실기(-COOH), 수산화기(-OH)가 trimethylsilylation되어 피이크(peak) 모양과 인텐서티(intensity)의 증가를 이룰 수 있어 정성 또는 정량 분석 감도를 향상시킬 수 있다.

유도체화법을 사용하지 않았을 경우 모세분리관에 분석 대상물질의 흡착으로 분석이 어려운 마약 성분들을 효과적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, trimethylsilyl derivatization을 위해 MSTFA, pentafluoropropionic anhyride, acetic anhydride를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 MSTFA이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 유도체화 조건은 60-80℃에서 10-20분이 바람직하다.

다음은 상기 유도체화된 마약성분을 기체크로마토그래피로 분리하는 단계이다.

상기 기체크로마토그래피로 분리하는 단계에서는 모세분리관을 사용함으로써, 분석물질을 바람직하게 검출할 수 있다. 분석컬럼은 특별히 한정되지는 않으나 본 발명의 일 구체예에 따르면, 모세분리관은 5% phenyl-과 95% methyl-polysiloxane으로 정지상이 구성되어 있고 모세관의 길이가 30 m, 직경이 0.25 mm, 정지상의 두께가 0.25 μm인 모세분리관을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 기체크로마토그래피의 분석컬럼을 통과하여 분리된 시료는 질량분석기로 도입하여 전자충격(electron impact) 이온화장치를 이용하여 이온화시킬 수 있다.

상기 질량분석기로 분석하는 단계에서 60종 성분을 정성 또는 정량분석시 질량분석기의 SIM(selected ion monitoring) 방식에서 정성 또는 정량분석하는 것은 신호대잡음비(signal to noise ratio)을 개선하기 위한 것이다. 즉, 분석 대상물질에 대한 특성 이온을 선정하여 사중극자에서 검출하는 SIM 방식으로 분석하는 것이 많은 성분을 동시에 높은 감도로 분석하고자 할 때 바람직하다.

특히 SIM 방식을 이용하여 정량분석하는 경우에는 분석 대상 물질에 대해 서로 다른 3개의 특성이온을 선정하고 해당되는 성분에 대한 중수소가 치환된 내부표준물질의 특성이온을 함께 검출하는 경우 선택성(selectivity)이 높아지고 분석감도(sensitivity)가 개선되어 다양한 종류의 마약성분들을 동시에 정량분석할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예 및 비교예를 기재한다. 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1

1. 소변 시료를 인산완충용액을 사용하여 pH를 5-8로 조절하는 제 1 단계

시료 1 mL를 시험관에 넣은 후, 50 μL의 9종의 내부표준용액(혼합용액 2 ng/μL: AP-d₅, BE-d₃, MA-d₅, MDA-d₅ _, MDEA-d₅, MDMA-d₅, MOR-d₃, OXZP-d₃, THCCOOH-d₃)을 첨가한다. 0.1M 인산완충액 1 mL(pH 6.0)를 첨가한 후 교반기를 이용하여 혼합한 후 최종 2 mL의 시료가 되도록 한다.

2. 소변 시료를 SPE법을 이용하여 자동으로 추출하는 제 2 단계

칼럼(60 mg, 3 mL)을 2 mL의 메탄올(methanol)과 증류수로 순서대로 각각 흘려줘 활성화시킨다. 활성화된 칼럼을 다시 30% 메탄올로 흘려줘 세척한 후 N₂ 가스로 3분 동안 칼럼을 건조시킨다. 3mL 의 추출용매(methanol/0.1M HCl, 98:2(v/v)) 주입하여 각 성분들을 추출한다. 칼럼에서 유출된 추출액을 45 ℃의 수욕조와 N₂(30kPa) 하에 증발건고시켰다.

3. TMS를 이용하여 유도체화 하는 제 3 단계

상기 제 1 단계에서 얻은 추출액을 증발시킨 잔사에 50 μL의 MSTFA 를 첨가한 후, 70℃로 유지된 반응기에서 15분간 반응시키는 유도체화 실험을 수행하였다.

4. 기체크로마토그래피와 검출기로써 질량분석기를 이용하여 60여종의 마약성분 농도를 정성 또는 정량분석 하는 제 4 단계

상기 제 3 단계에서 얻은 유도체화된 분석 대상물질들이 포함된 용액 중 일부(1 μL)를 가스크로마토그래피-질량분석기에 주입하였다.

기체크로마토그래피는 자동주입기가 장착된 미국 에질런트사의 가스크로마토그래피(6890 GC)를 사용하였다.

이때 분리관의 온도는 초기 온도를 120℃로 설정하여 0.5분간 유지시킨 다음 10℃/min으로 180℃까지 승온하여 다시 15℃/min으로 220℃까지 승온 후 0.4분간 유지시킨다. 그리고 35/min으로 255℃로 설정하여 0.5분간 유지시킨 다음 10℃/min으로 290℃까지 승온 후 0.5분간 유지시키고 다시 30℃/min으로 300℃까지 승온 후 5.5분간 유지한 후 최종 310℃까지 35℃로 승온 후 2.7분간 유지시킨다. 이때 가스크로마토그래피의 주입구와 질량분석기의 연결부위의 온도는 260과 280℃로 설정하였고 비분할방식(splitless mode)으로 시료를 주입하였다.

상기와 같이 시간에 따라 모세분리관의 온도를 달리하여 분리하는 것은 분석시간을 단축하고 분석 후 남아 있을 수도 있는 방해물질을 효과적으로 제거할 수 있기 때문이다.

그 결과, 본 발명의 기체크로마토그래피와 질량분석기를 이용한 소변 중 60종 이상 마약성분 60종에 대한 다성분 동시분석법을 이용할 경우 모세분리관을 통과시키는 단계에서 화학적 물성이 서로 다른 분석 물질을 22분 이내에 분리해 낼 수 있었다.

이때 검출기로 사용한 질량분석장치(MS, mass spectrometer)는 미국 에이질런트사의 5973N MS 검출기로 물질을 이온화시킬 때의 조건은 전자충격 이온화 방식으로 이때 이온화장치와 사중극자의 온도는 230℃과 150℃로 설정하였다.

또한 신호대잡음비(signal to noise ratio)를 개선하고 검출감도를 향상하기 위하여 분석 대상물질이 이온화장치에서 전자 충돌에 의해 충돌에 의해 발생된 특징적인 이온들을 검출하는 SIM 방식으로 분석을 수행하였다.

정성 또는 정량분석을 위한 분석 대상물질의 특성 이온들을 표 1에 나타내었고, SIM 방식으로 질량분석기로 검출한 바탕소변, 일정량의 표준물질이 첨가된 소변 분석결과를 도 1에 나타내었다.

60종 성분에 대한 검출한계(limit of detection, LOD)를 표 2에 내었으며, 이들 성분 중 정량분석한 24종은 크로마토그램에서 나타난 피이크의 면적을 합한 후, 내부표준법을 적용하여 검량선을 그려 함량을 결정하였다.

정량분석의 회수율은 저, 중, 고 농도의 QC 시료(n=5)로, 일간 정밀도와 정확도 그리고 실험자간 정밀도와 정확도는 QC 시료(n=3)로 측정하였고 그 결과를 표 3에 나타내었다. 또한 실제 남용자들의 소변 시료의 정량분석 결과를 표 4에 나타내었다.

[표 2]

[표 3]

[표 4]

비교예 1

종래기술로써 Strano-Rossi 발명자의 방법으로 소변 시료의 마약성분을 분석해 보았다. 이들 방법은 Rapid Commun. Mass Spectrom., 19 (2005) p 1529에 개시되어 있으며 다음과 같다. Strano-Rossi 발명은 60종 성분 중 10종을 액체상추출법(liquid-liquid extraction, LLE)과 MSTFA 유도체화한 후 GC/MS를 이용하여 분석하는 방법이다.

소변을 pH 9로 조정한 후 chloroform/isopropanol(9:1, v/v) 혼합 용액으로 LLE법으로 추출하고 건고한 후 MSTFA/trimethylchlorosilane로 70℃, 20분 동안 유도체화한 시료를 모세분리관을 통과시켜 60종 마약류 성분 중 대마 대사체 성분(THCCOOH), 아편계(COD, MOR, 6MAM), 코카인계(BE, EME), 기타성분(MTHD, PML, PTHD, PTZC) 10 종의 물질을 검출하였다.

비교예 2

종래기술로써 Ishida 발명자의 방법으로 소변 시료의 마약성분을 분석해 보았다. 이들 방법은 J. Anal. Toxicol., 30 (2006) 468에 개시되어 있으며 다음과 같다. Ishida 발명은 60종 성분 중 12종을 수동 SPE법과 acetic anhydride 유도체화한 후 GC/MS를 이용하여 분석하는 방법이다.

소변을 acetonitrile/distilled water/trifluoroacetic acid(90:10:0.1, v/v/v) 혼합 용액으로 수동 SPE법으로 추출하고 건고한 후 acetic anhydride 로 60℃, 30분 동안 유도체화한 시료를 모세분리관을 통과시켜 60종 마약류 성분 중 암페타민계(AP, MA, MDA, MDMA, PMA, PMMA), 아편계(COD, MOR), 에페드린계(EP, MEP), 기타성분(KET, 2CB) 12종의 물질을 검출하였다.

비교예 3

종래기술로써 Satio 발명자의 방법으로 소변 시료의 마약성분을 분석해 보았다. 이들 방법은 J. Pharm. Biomed. Anal., 43 (2007) 358에 개시되어 있으며 다음과 같다. Satio 발명은 60종 성분 중 12종을 LLE법과 pentafluoropropionic anhyride/ 2,2,3,3,3-penfafluoro-1-propanol 유도체화한 후 GC/MS를 이용하여 분석하는 방법이다.

소변을 pH 9로 조정한 후 diethylether/chloroform(4:1, v/v) 혼합 용액으로 LLE법으로 추출하고 건고한 후 pentafluoropropionic anhydride/2,2,3,3,3-pentafluoro-1-propanol로 70℃, 40분 동안 유도체화한 시료를 모세분리관을 통과시켜 마약류 성분 중 암페타민계(AM, MA, MDA, MDMA, MDEA), 아편계(MOR, COD, 6MAM), 코카인계(COC, EME), 에페드린계(EP, MEP) 성분 12 종의 물질을 검출하였다.

본 발명과 비교예 1~3의 분석 대상성분, 시료량, 추출방법 및 추출용매, 유도체 시간, 검출한계(LOD, limit of detection) 값에 대해 비교한 결과를 표 5에서 보여주고 있다.

[표 5]

결과적으로 비교예 1-3과 비교했을 때 본 발명의 분석방법이 종래의 성분 뿐만 아니라 다른 성분들까지도 매우 경제적이면서 편리하게 분석할 수 있음을 알 수 있다. 이는 작은 양의 시료량을 자동으로 추출하는 고체상추출 단계, 화학적 구조와 물리적 성질이 다른 많은 마약류 성분을 동시에 유도체화하는 단계, 그리고 각 성분별로 분리해 내고 검출할 수 있는 기체크로마토그래피와 질량분석기를 이용한 기기분석 단계를 포함하는 상기 분석방법을 이용할 경우 60종의 많은 성분들을 낮은 검출한계로 동시에 분석할 수 있으며, 또한 높은 경제성, 분석의 편리성 및 신속성의 장점이 있다.

본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

소변 시료를 인산완충용액으로 pH 5~8로 조절하는 단계;
상기 pH 5~8로 조절된 소변 시료를 염산이 혼합된 30% 알코올을 정제용 용매로 사용하여 시료를 정제한 후 추출용매를 사용하여 추출하는 고체상(solid phase) 추출 단계;
상기 고체상 추출 후 건고된 마약성분을 N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide(MSTFA)를 이용하여 트리메틸실릴(trimethylsilylation) 유도체화 하는 단계; 및
상기 유도체화한 시료를 기체크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 마약성분의 다성분 동시분석법.
제 1항에 있어서, 상기 소변 중 마약성분의 다성분은 암페타민계(amphetamine-type drugs), 대마 대사체, 아편계(opiates), 코카인계(cocaines), 벤조디아제핀계(benzodiazepines), 바비탈계(barbiturates) 성분 및 carisoprodol(CSP), cathinone(Khat), ephedrine(EP), fenfluramine(FFA), ketamine(KET), lysergic acid diethylamide(LSD), mazindol(MZD), meprobamate(MPB), methadone (MTHD), methaqualone (MTQ), methoxyphenamine(MPHA), methylephedrine (MEP), methylphenidate(MPH, ritalin), mescaline (MES), norfentanyl(NFT), norketamine(NKET), norpethidine(normepridine, NPTHD), pemoline(PML), pentazocine(PTZC), pethidine(PTHD), phencyclidine(PCP), phendimetrazine(PDMT), phenmetrazine(PMT), ritalinic acid(methylphenidate metabolite, RTA), selegiline(SEL), zolpidem(ZPD), 2-oxo-3-hydroxy-LSD(OHLSD), 4-bromo-2,5-dimethoxyphenethylamine(2CB)을 포함하는 것을 특징으로 하는 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 마약성분의 다성분 동시분석법.
제 2항에 있어서, 상기 암페타민계 성분은 amphetamine(AP), methamphetamine(MA), 3,4-methylenedioxyamphetamine(MDA), 3,4-methylenedioxyethylamphetamine(MDEA), 3,4-methylenedioxymethamphetamine(MDMA), p-methoxyamphetamine(PMA), p-methoxymethamphetamine(PMMA) 및 phentermine(PT), 상기 대마 대사체는 11-nor-9-carboxy-△⁹-tetrahydrocannabinol(THCCOOH), 상기 아편계 성분은 codeine(COD), dextromethorphan(DMP), dextrorphan(DRP), 6-monoacetylmorphine(6MAM), morphine(MOR), nalbuphine(NBP), papaverine(PAP), 상기 코카인계(cocaines) 성분은 benzoylecgonine(BE), cocaine(COC) 및 ecgonine methylester(EME), 상기 벤조디아제핀계 성분은 alprazolam(ALPZ), diazepam(DZ), hydroxyalprazolam(OHALPZ), hydroxytriazolam(OHTZ), lorazepam(LZP), nordiazepam(NDZP), oxamzepam(OXZP), temazepam(TMZP) 및 7-aminoflunitrazepam(7AFTZP), 상기 바비탈계 성분은 amobarbital(AMB), pentobarbital(PTB), secobarbital(SCB) 및 phenobarbital(PNB)을 포함하는 것을 특징으로 하는 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 마약성분의 다성분 동시분석법.
제 1항에 있어서, 상기 유도체화 하는 단계는 60~80 ℃에서 10~30분간 반응시키는 것을 특징으로 하는 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 마약성분의 다성분 동시분석법.
제 1항에 있어서, 상기 기체크로마토그래피로 분리하는 단계에서 컬럼 온도는 120℃~300℃사이의 120℃~180℃, 180℃~220℃, 220℃~255℃, 255℃~290℃, 290℃~300℃ 및 300℃~310℃ 각 구간에서 각기 다른 온도경사를 이용하여 승온시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 마약성분의 다성분 동시분석법.
제 1항에 있어서, 상기 기체크로마토그래피로 분리하는 단계이후에 질량분석기를 더 추가하는 것을 특징으로 하는 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 마약성분의 다성분 동시분석법.
제 6 항에 있어서, 상기 질량분석기로 분석시 분석물질에 대해 9종의 동위원소가 치환된 내부표준물질을 이용하는 것을 특징으로 하는 기체크로마토그래피를 이용한 소변 중 마약성분의 다성분 동시분석법.