CN111157639A - 一种高效液相质谱法测定大鼠血浆中布洛芬的浓度的方法 - Google Patents

一种高效液相质谱法测定大鼠血浆中布洛芬的浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效液相质谱法测定大鼠血浆中布洛芬的浓度的方法，包括以下步骤：制备校正标示样、质控样品、空白样品、QC0样品、ULOQ without IS样品、Reagent样品、基质效应样品和回收率样品。利用所述校正标示样和所述质控样品制得标准曲线，将待测样品根据所述标准曲线得到待测样品中的布洛芬浓度。利用所述空白样品、所述QC0样品、所述ULOQ without IS样品和Reagent样品用来相互校正，减少干扰性。利用所述基质效应样品和所述回收率样品来评价该方法的基质效应和回收率。应用HPLC‑MS/MS(高效液相质谱)法同时测量大鼠血浆中布洛芬的浓度，该测试方法的准确度高，基质效应的影响小，干扰性小，回收率高。

Description

一种高效液相质谱法测定大鼠血浆中布洛芬的浓度的方法
技术领域
本发明涉及了一种高效液相质谱法测定大鼠血浆中布洛芬的浓度的方法。
背景技术
布洛芬是世界卫生组织、美国FDA唯一共同推荐的儿童退烧药，是公认的儿童首选抗炎药。此外，布洛芬具有抗炎、镇痛、解热作用，适用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊椎炎和神经炎等。
在实验中通过检测大鼠血浆中布洛芬的浓度来评估药物在大鼠体内的暴露水平，对于帮助了解药物在人体内的作用效果具有重要意义。因此，本领域技术人员持续致力于研究测定布洛芬浓度的HPLC-MS/MS方法。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明实施例提供了一种高效液相质谱法测定大鼠血浆中布洛芬的浓度的方法，包括以下步骤：
(1)在浓度范围20～2*104ng/mL内配置梯度浓度的布洛芬校正标示样；在浓度范围20～1.5*104ng/mL内配置梯度浓度的布洛芬质控样品；配置50、2*104ng/mL的内标工作液，其中内标为双氯芬酸钠；
在96孔板的孔上分别标示校正标示样、质控样品、空白样品、QC0样品、ULOQwithout IS样品、Reagent样品、基质效应样品和回收率样品,分别取10μL的所述校正标示样、所述质控样品至对应的所述96孔板的孔中，各取10μL空白基质至所述96孔板中空白样品、QC0样品、ULOQ without IS样品和回收率样品的孔中，取10.0μL水至所述96孔板中的Reagent样品的孔中，吸取单个供体(n≥6)的10μL的空白基质放入基质效应样品孔中，取单个供体的空白基质，再吸取10μL的多个供体的混合的所述空白基质放入回收率样品孔中；
(2)在所述校正标示样、所述质控样品和所述QC0样品中加入190μL的所述内标工作液，在所述空白样品、所述Reagent样品、所述ULOQ without IS样品，所述基质效应样品和所述回收率样品中加入190μL甲醇溶液；
(3)封板后涡旋混匀，在10℃，4000rpm条件下离心10min；
(4)对所述校正标示样、所述质控样品、所述QC0样品、所述空白样品、所述Reagent样品、所述ULOQ without IS样品，取离心后的上清液100μL至所述96孔板中，并加入200μL水溶液进行稀释；对所述基质效应样品和所述回收率样品，取离心后的上清液100μL至所述96孔板中，并加入100μLNeat溶液和100μL水溶液进行稀释。
(5)离心取上清液稀释后，密封所述96孔板，低速涡旋混匀，各个所述样品取3.0μL在高效液相质谱联用仪(HPLC-MS/MS)上进样分析。
进一步地，在步骤(1)中，所述校正标示样的制备方法包括：取1.00mg/mL的布洛芬，并且分别溶解于等体积的MeOH-DMSO溶液，配置得到布洛芬储备液，将所述布洛芬储备液用甲醇-水溶液稀释成梯度浓度为400～4*105ng/mL的校正标示样品工作液，将所述校正标示样品工作液用空白基质稀释成梯度浓度为20～2*104ng/mL的所述校正标示样，所述空白基质为不含所述分析物与所述内标的大鼠血浆。
进一步地，在步骤(1)中，所述质控样品的制备方法包括：将所述布洛芬储备液用甲醇-水溶液稀释成梯度浓度为400～3*105ng/mL的质控样品工作液，将所述质控样品工作液用所述空白基质稀释成梯度浓度为20～1.5*104ng/mL的所述质控样品。
进一步地，在步骤(1)中，所述内标工作液的制备方法包括：取2.00mg/mL的双氯芬酸钠，并且分别溶解于等体积的MeOH-DMSO溶液，配置得到双氯芬酸钠储备液，将所述双氯芬酸钠储备液用甲醇-水溶液稀释成所述内标工作液。
进一步地，所述步骤(5)中高效液相质谱联用仪的工作条件为：
(1)色谱条件为：
色谱柱：Inertstain AQ-C18 5.0μm(2.1mm x 50mm,5.0μm)；
自动进样器温度：10℃；
流动相A：H2O/AA/NH4Ac(1000/0.1/1，v/v)；
流动相B：ACN/AA(1000/0.1，v/v)；
进样器清洗液：R0:MeOH/H2O(25/75，v/v)；R3:ACN/H2O(50/50，v/v)；
洗脱方式：梯度洗脱；
(2)质谱条件为：
质谱仪：AB SCIEX-4000Q TRAP-LC/MS/MS system；
离子源：ESI电喷雾电离；
离子化模式：Negative；
检测模式：MRM多反应监测；
涡旋离子喷雾温度：550℃。
进一步地，包括标准曲线的制作：以布洛芬比内标双氯芬酸钠的色谱峰面积比为纵坐标，以大鼠血浆中布洛芬的浓度为横坐标制作标准曲线；待测样品根据所述标准曲线计算得到所述待测样品中的布洛芬浓度。
进一步地，所述校正标示样品工作液的梯度浓度分别为4*105、3.2*105、8*104、3.2*104、3200、800、400ng/mL；所述校正标示样的梯度浓度分别为2*104、1.6*104、4*103、1.6*103、160、40、20ng/mL。
进一步地，所述质控工作液的梯度浓度分别为3*105、2*105、1.2*104、1200、400ng/mL；所述质控样品的梯度浓度分别为1.5*104、1*104、600、60、20ng/m。
本发明的有益效果如下：应用HPLC-MS/MS(高效液相质谱)法同时测量大鼠血浆中布洛芬的浓度，该测试方法的准确度高，基质效应的影响小，干扰性小，回收率高。
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中布洛芬-Reagent样品的谱图；
图2是本发明实施例中布洛芬-Blank空白样品的谱图；
图3是本发明实施例中布洛芬-QC0样品的谱图；
图4是本发明实施例中布洛芬-Carryover Blank样品的谱图；
图5是本发明实施例中布洛芬-LLOQ样品的谱图；
图6是本发明实施例中布洛芬-ULOQ样品的谱图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或隐含地包括一个或者更多个该特征。
为达到上述目的，本发明提供一种高效液相质谱法测定大鼠血浆中布洛芬的浓度的方法，包括以下步骤：
一、样品的配置
储备液的配置：取1.00mg/mL的布洛芬，并且溶解于等体积的MeOH-DMSO溶液，配置得到布洛芬储备液；取2.00mg/mL的双氯芬酸钠，并且溶解于甲醇溶液，配置得到双氯芬酸钠储备液，所述布洛芬储备液和双氯芬酸钠储备液需要≤-15℃，密闭、避光保存。所述如表1所示。
Figure BDA0002350439090000041
校正标示样品工作溶液的配置：将所述布洛芬储备液用甲醇-水溶液稀释成梯度浓度为4*105、3.2*105、8*104、3.2*104、3200、800、400ng/mL的校正标示样品工作液，如表2所示。
Figure BDA0002350439090000042
质控工作液的配置：将所述布洛芬储备液用甲醇-水溶液稀释成梯度浓度为3*105、2*105、1.2*104、1200、400ng/mL的质控样品工作液，如表3所示。
Figure BDA0002350439090000051
内标工作液的配置：所述双氯芬酸钠储备液用甲醇-水溶液稀释成2**104、50ng/mL的所述内标工作液，如表4所示。
Figure BDA0002350439090000052
回收率和基质效应实验纯溶液的配置：将所述质控溶液和所述内标工作液用等体积的甲醇-水溶液稀释成回收率和基质效应实验纯溶液；如表5所示。
Figure BDA0002350439090000053
注：上述校正标示样品工作液、所述质控工作液、所述内标工作液和所述回收率和基质效应的纯溶液，只要终浓度不变，稀释过程/体积可以改变。只要溶液ID唯一，溶液ID可以改变，不影响实验的可追溯性。并且均在室温下制备。
校正标示样的配置：将所述校正标示样品工作液用空白基质稀释成梯度浓度为2*104、1.6*104、4*103、1.6*103、160、40、20ng/mL的所述校正标示样，所述空白基质为不含所述分析物与所述内标的大鼠血浆。如表6所示。
Figure BDA0002350439090000061
质控样品的配置：将所述质控样品工作液用所述空白基质稀释成梯度浓度为1.5*104、1*104、600、60、20ng/mL的所述质控样品，如表7所示。
Figure BDA0002350439090000062
二、PHLC-MS/MS分析测定过程的工作条件
(1)、色谱条件：
色谱柱：Inertstain AQ-C18 5.0μm(2.1mm x 50mm,5.0μm)；
自动进样器温度：10℃；
流动相A：H2O/AA/NH4Ac(1000/0.1/1，v/v)；
流动相B：ACN/AA(1000/0.1，v/v)；
进样器清洗液：R0:MeOH/H2O(25/75，v/v)；R3:ACN/H2O(50/50，v/v)；
洗脱方式：梯度洗脱；
泵梯度：
Figure BDA0002350439090000063
Figure BDA0002350439090000071
进样体积：3μL；
运行时间：4.00min；
保留时间：布洛芬，大约1.70min；双氯芬酸钠，大约1.80min；
(2)质谱条件为：
质谱仪：AB SCIEX-4000Q TRAP-LC/MS/MS system；
离子源：ESI电喷雾电离；
离子化模式：Negative；
检测模式：MRM多反应监测；
涡旋离子喷雾温度：550℃。
三、样品处理
(1)、在96孔板的孔上分别标示校正标示样、质控样品、空白样品、QC0样品、ULOQwithout IS样品、Reagent样品、基质效应样品和回收率样品,分别取10μL的所述校正标示样、所述质控样品至对应的所述96孔板的孔中。各取10μL空白基质至所述96孔板中空白样品、QC0样品、ULOQ without IS样品和回收率样品的孔中。取10.0μL水至所述96孔板中的Reagent样品的孔中。吸取单个供体(n≥6)的10μL的空白基质放入基质效应样品孔中。取单个供体的空白基质，再吸取10μL的多个供体的混合的所述空白基质放入回收率样品孔中。
(2)、在所述校正标示样、所述质控样品和所述QC0样品中加入190μL的所述内标工作液。在所述空白样品、所述Reagent样品、所述ULOQ without IS样品。所述基质效应样品和所述回收率样品中加入190μL甲醇溶液。
(3)、封板后涡旋混匀，在10℃，4000rpm条件下离心10min。
(4)、对所述校正标示样、所述质控样品、所述QC0样品、所述空白样品、所述Reagent样品、所述ULOQ without IS样品，取离心后的上清液100μL至所述96孔板中，并加入200μL水溶液进行稀释；对所述基质效应样品和所述回收率样品，取离心后的上清液100μL至所述96孔板中，并加入100μLNeat溶液和100μL水溶液进行稀释，其中所述Neat溶液是指所述基质效应纯溶液。
(5)、离心取上清液稀释后，密封所述96孔板，低速涡旋混匀，各个所述样品取3.0μL在高效液相质谱联用仪(HPLC-MS/MS)上进样分析。
四、直线回归模型的建立
按上述色谱和质谱条件对所述校正标示样、所述质控样品进行检测，色谱图采集和色谱峰积分由软件Analyst 1.6.3,Applied Biosystem进行处理。以布洛芬比内标双氯芬酸钠的色谱峰面积比为纵坐标，以大鼠血浆中布洛芬的浓度为横坐标，用加权(权重为1/X2)最小二乘法以大鼠血浆中布洛芬的浓度(X)与色谱峰面积比(Y)进行线性回归，所构建的线性回归方程(Y＝aX+b)即为标准曲线。结果表明，布洛芬的校正曲线范围在20.0ng/mL-20000ng/mL内线性良好制作标准曲线。
五、定量分析
取10μL待测样品按照上述的校正标示样处理步骤的方法处理，并按样品处理步骤所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中分析物布洛芬的浓度。
六、测试方法的评价
利用所述空白(BK)样品、所述QC0样品、所述ULOQ without IS样品和所述Reagent样品用来相互校正，减少干扰性。
利用所述基质效应样品和所述回收率样品用来评价该方法的基质效应和回收率。分析得到该方法的基质效应为88.6～101.9％，该方法的回收率为114.0％～117.6％。
应用HPLC-MS/MS(高效液相质谱)法同时测量大鼠血浆中布洛芬的浓度，该测试方法的准确度高，基质效应的影响小，干扰性小，回收率高。
本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种高效液相质谱法测定大鼠血浆中布洛芬的浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在浓度范围20～2*104ng/mL内配置梯度浓度的布洛芬校正标示样；在浓度范围20～1.5*104ng/mL内配置梯度浓度的布洛芬质控样品；配置50、2*104ng/mL的内标工作液，其中内标为双氯芬酸钠；
在96孔板的孔上分别标示校正标示样、质控样品、空白样品、QC0样品、ULOQ withoutIS样品、Reagent样品、基质效应样品和回收率样品,分别取10μL的所述校正标示样、所述质控样品至对应的所述96孔板的孔中，各取10μL空白基质至所述96孔板中空白样品、QC0样品、ULOQ without IS样品和回收率样品的孔中，取10.0μL水至所述96孔板中的Reagent样品的孔中，吸取单个供体(n≥6)的10μL的空白基质放入基质效应样品孔中，取单个供体的空白基质，再吸取10μL的多个供体的混合的所述空白基质放入回收率样品孔中；
(2)在所述校正标示样、所述质控样品和所述QC0样品中加入190μL的所述内标工作液，在所述空白样品、所述Reagent样品、所述ULOQ without IS样品，所述基质效应样品和所述回收率样品中加入190μL甲醇溶液；
(3)封板后涡旋混匀，在10℃，4000rpm条件下离心10min；
(4)对所述校正标示样、所述质控样品、所述QC0样品、所述空白样品、所述Reagent样品、所述ULOQ without IS样品，取离心后的上清液100μL至所述96孔板中，并加入200μL水溶液进行稀释；对所述基质效应样品和所述回收率样品，取离心后的上清液100μL至所述96孔板中，并加入100μLNeat溶液和100μL水溶液进行稀释。
(5)离心取上清液稀释后，密封所述96孔板，低速涡旋混匀，各个所述样品取3.0μL在高效液相质谱联用仪(HPLC-MS/MS)上进样分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述校正标示样的制备方法包括：取1.00mg/mL的布洛芬，并且溶解于等体积的MeOH-DMSO溶液，配置得到布洛芬储备液，将所述布洛芬储备液用甲醇-水溶液稀释成梯度浓度为400～4*105ng/mL的校正标示样品工作液，将所述校正标示样品工作液用空白基质稀释成梯度浓度为20～2*104ng/mL的所述校正标示样，所述空白基质为不含所述分析物与所述内标的大鼠血浆。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述质控样品的制备方法包括：将所述布洛芬储备液用甲醇-水溶液稀释成梯度浓度为400～3*105ng/mL的质控样品工作液，将所述质控样品工作液用所述空白基质稀释成梯度浓度为20～1.5*104ng/mL的所述质控样品。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述内标工作液的制备方法包括：取2.00mg/mL的双氯芬酸钠，并且溶解于甲醇溶液，配置得到双氯芬酸钠储备液，将所述双氯芬酸钠储备液用甲醇-水溶液稀释成所述内标工作液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中高效液相质谱联用仪的工作条件为：
(1)色谱条件为：
色谱柱：Inertstain AQ-C18 5.0μm(2.1mm x 50mm,5.0μm)；
自动进样器温度：10℃；
流动相A：H2O/AA/NH4Ac(1000/0.1/1，v/v)；
流动相B：ACN/AA(1000/0.1，v/v)；
进样器清洗液：R0:MeOH/H2O(25/75，v/v)；R3:ACN/H2O(50/50，v/v)；
洗脱方式：梯度洗脱；
(2)质谱条件为：
质谱仪：AB SCIEX-4000Q TRAP-LC/MS/MS system；
离子源：ESI电喷雾电离；
离子化模式：Negative；
检测模式：MRM多反应监测；
涡旋离子喷雾温度：550℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括标准曲线的制作：以布洛芬比内标双氯芬酸钠的色谱峰面积比为纵坐标，以大鼠血浆中布洛芬的浓度为横坐标制作标准曲线；待测样品根据所述标准曲线计算得到所述待测样品中的布洛芬浓度。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述校正标示样品工作液的梯度浓度分别为4*105、3.2*105、8*104、3.2*104、3200、800、400ng/mL；所述校正标示样的梯度浓度分别为2*104、1.6*104、4*103、1.6*103、160、40、20ng/mL。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述质控工作液的梯度浓度分别为3*105、2*105、1.2*104、1200、400ng/mL；所述质控样品的梯度浓度分别为1.5*104、1*104、600、60、20ng/mL。
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