CN113252804B - 测定血浆中马索亚内酯、五味子醇甲和五味子乙素浓度的方法及其内标工作液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定血浆中马索亚内酯、五味子醇甲和五味子乙素浓度的方法及其内标工作液。所述方法包括：制备储备液；将储备液稀释成马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液和柳胺酚工作液；制备校正标准品：将所述马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液加入到同一空白血浆中，获得校正标准品；制备质控样品：将所述马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液加入到同一空白血浆中，获得质控样品；检测分析样品。本方法具有检测灵敏度高、准确性良好、检测快捷、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应等优点。

Description

测定血浆中马索亚内酯、五味子醇甲和五味子乙素浓度的方 法及其内标工作液
技术领域
本发明涉及了临床血药浓度监测控制技术领域，具体的是一种测定血浆中马索亚内酯、五味子醇甲和五味子乙素浓度的方法及其内标工作液。
背景技术
肝纤维化是肝病中的一种。人体患有肝纤维化后，容易出现疲乏无力、食欲减退等症状，可能还会出现慢性消化不良、出血等症状，这些症状会给人体造成很大伤害。
扶正化瘀片是常用的治疗肝纤维化的中成药之一，其主要成分包括：五味子醇甲(Schisandrin)、五味子乙素(γ-Schisandrin)、马索亚内酯(Massoia Lactone)、丹参素钠(Sodium Danshensu)、野黑樱苷(Prunasin)、苦杏仁苷(Amygdalin)、柚皮素(Naringenin)、槲皮素(Quercetin)、芦丁(Rutin)、商陆苷(Ombuoside)及其代谢产物商陆素(Ombuin)、槲皮苷(Quercitrin)、山奈酚(Kaempferol)、葵烯酸钠(Sodium 5-Hydroxy-2-Decenoic)。检测比格犬(Beagle犬)血浆中扶正化瘀片的毒代动力学特征，评估药物主要成分在比格犬体内的暴露水平，对于帮助了解药物在人体内的作用效果具有重要意义。因此，本领域技术人员持续致力于研究测定血浆中扶正化瘀片主要成分浓度的HPLC-MS/MS方法。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明实施例提供了一种测定血浆中马索亚内酯、五味子醇甲和五味子乙素浓度的方法及其内标工作液，其具有检测方法方便快捷、检测灵敏度高、准确性高等优点。
本申请实施例公开了：一种测定血浆中马索亚内酯、五味子醇甲和五味子乙素浓度的方法，所述方法中采用柳胺酚作为内标，所述方法包括以下步骤：
制备储备液：将马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素和柳胺酚分别溶于HPLC甲醇中，获得到马索亚内酯储备液、五味子醇甲储备液、五味子乙素储备液和柳胺酚储备液；
制备工作液：采用HPLC甲醇和水作为溶剂，将所述马索亚内酯储备液、五味子醇甲储备液、五味子乙素储备液分别稀释，获得马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液；采用HPLC甲醇作为溶剂，将所述柳胺酚储备液稀释成柳胺酚工作液，所述柳胺酚工作液中柳胺酚的浓度为50ng/mL；
制备校正标准品：将所述马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液加入到同一空白血浆中，获得校正标准品；
制备质控样品：将所述马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液加入到同一空白血浆中，获得质控样品；
检测分析样品：在96孔板上做出多个样品标示，向各个样品孔内加入对应的样品；在96孔板上相应的样品中加入柳胺酚工作液或HPLC甲醇；对各个样品进行封板、涡旋离心，并分别提取上清液；对各上清液进行稀释，分别取样分析。
具体的，所述空白血浆为比格犬血浆。
具体的，所述马索亚内酯储备液、五味子醇甲储备液、五味子乙素储备液中，马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素的浓度分别介于200～200000ng/mL之间。
具体的，所述质控样品中，所述马索亚内酯、五味子甲醇、五味子乙素的浓度分别介于10.0～7500ng/mL之间。
具体的，所述校正标准品中，所述马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素的浓度分别介于10.0～10000ng/mL之间。
具体的，所述方法中，液相色谱参数如下：
色谱柱：Inertstain AQ-C18 2.1*50mm，5μm，柱温为35℃；
流动相：包括流动相A和流动相B，所述流动相A为：乙酸体积分数为0.1％的乙酸水溶液，所述流动相B为：乙醇和乙腈的体积比为70％：30％的乙醇乙腈；
质谱条件：采用电喷雾离子原，正离子检测，选择多反应监测工作方式进行一/二级质谱分析，质谱检测工作参数如下：马索亚内酯的母离子/特征子离子的检测离子对为169.2/123.2，五味子醇甲的母离子/特征子离子的检测离子对为433.1/415.1，五味子乙素的母离子/特征子离子的检测离子对为401.1/300.2，柳胺酚的母离子/特征子离子的检测离子对为230.2/121.2。
具体的，流动相梯度洗脱条件为：第0.01～0.1min，所述流动相B的体积分数为52％；第1.5min，所述流动相B的体积分数为88％；第1.9min，所述流动相B的体积分数为95％；第2.3～2.8min，所述流动相B的体积分数为100％；第2.81～3.1min，所述流动相B的体积分数为20％；第3.11～3.60min，所述流动相B的体积分数为100％；第3.61～4.80min，所述流动相B的体积分数为52％。
本实施例还公开了一种内标工作液，其采用以下方法制备：
S1：称取一定量的柳胺酚溶解于甲醇中，获得柳胺酚储备液；
S2：采用甲醇对所述柳胺酚储备液进行稀释，获得内标工作液，所述内标工作液中，柳胺酚的浓度为50ng/mL。
具体的，在S1和S2中，所述甲醇均为HPLC甲醇。
具体的，所述柳胺酚储备液中，所述柳胺酚的浓度为1.00mg/mL，在S2中，将10μL所述柳胺酚储备液溶于200000μLHPLC甲醇中，获得柳胺酚浓度为50ng/mL的内标工作液。
本发明至少具有如下有益效果：本方法具有检测灵敏度高、准确性良好、检测快捷、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应等优点。
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中溶剂样品中马索亚内酯的质谱图；
图2是本发明实施例中溶剂样品中五味子醇甲的质谱图；
图3是本发明实施例中溶剂样品中五味子乙素的质谱图；
图4是本发明实施例中BK样品中马索亚内酯的质谱图；
图5是本发明实施例中BK样品中五味子醇甲的质谱图；
图6是本发明实施例中BK样品中五味子乙素的质谱图；
图7是本发明实施例中QC0样品中马索亚内酯的质谱图；
图8是本发明实施例中QC0样品中五味子甲醇的质谱图；
图9是本发明实施例中QC0样品中五味子乙素的质谱图；
图10是本发明实施例中残留效应中马索亚内酯的质谱图；
图11是本发明实施例中残留效应中五味子甲醇的质谱图；
图12是本发明实施例中残留效应中五味子乙素的质谱图；
图13是本发明实施例中质控样品5中马索亚内酯的质谱图；
图14是本发明实施例中质控样品5中五味子甲醇的质谱图；
图15是本发明实施例中质控样品5中五味子乙素的质谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例的仪器如下：
Shimadzu LC-30AD高效液相色谱仪
自动进样器，自动进样器的温度采用10℃
柱温箱
试药：马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素、柳胺酚、HPLC甲醇、去离子化纯净水、分析纯级乙酸、分析级乙腈
一、制备储备液：
用HPLC甲醇作为溶剂，配置得到马索亚内酯储备液、五味子醇甲储备液、五味子乙素储备液和柳胺酚储备液。四种储备液中，对应化合物的浓度均为1.00mg/mL。
二、制备工作液：
用200000μL HPLC甲醇作为溶剂，将10μL上述柳胺酚储备液稀释，制备成柳胺酚工作液(也即内标工作液)，柳胺酚工作液中，柳胺酚的浓度为50ng/mL。用HPLC甲醇和水作为溶剂，将上述马索亚内酯储备液、五味子醇甲储备液、五味子乙素储备液分别稀释配置，获得马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液。在上述稀释的过程中，用作溶剂的HPLC甲醇和水的体积比为80:20。马索亚内酯工作液中，马索亚内酯的浓度介于200～200000ng/mL之间；五味子醇甲工作液中，五味子醇甲的浓度介于200～200000ng/mL之间；五味子乙素工作液中，五味子乙素的浓度介于200～200000ng/mL之间。
更具体的来说，马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液均可以分为用于制备校正标准品的工作液和制备质控样品的工作液，两种用途的工作液的浓度可以不同。进一步来说，用于制备校正标准品的马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液可以具有以下多种浓度：200ng/mL、260ng/mL、400ng/mL、450ng/mL、630ng/mL、525ng/mL；用于制备质控样品的马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液可以具有以下多种浓度：550ng/mL、600ng/mL、700ng/mL、940ng/mL、1260ng/mL。
三、校正标准品的制备
取空白的比格犬血浆(血浆中的抗凝剂为肝素钠)，将上述用于制备校正标准品的马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液加入到空白的比格犬血浆中，获得校正标准品。具体来说，将马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液加入同一空白的比格犬血浆中，所获得校正标准品中，马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素的浓度介于10.0～10000ng/mL之间。更具体来说，校正标准品具有如下表1中的多种浓度。
表1：校正标准品中马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素的浓度
Figure BDA0002868139270000041
Figure BDA0002868139270000051
四、质控样品的制备
取空白的比格犬血浆，将上述用于制备质控样品的马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液加入到空白的比格犬血浆中，获得质控样品。具体来说，将马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液加入同一空白的比格犬血浆中，所获得质控样品中，马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素的浓度介于10.0～7500ng/mL之间。更具体来说，质控样品具有如下表2中的多种浓度。
表2：质控样品中马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素的浓度
质控样品编号 马索亚内酯浓度(ng/mL) 五味子醇甲浓度(ng/mL) 五味子乙素浓度(ng/mL)
质控样品1 10.0 10.0 10.0
质控样品2 30.0 30.0 30.0
质控样品3 300 300 300
质控样品4 5000 5000 5000
质控样品5 7500 7500 7500
五、制备回收率和基质效应实验纯溶液
用体积比为50:50的HPLC甲醇和水作为溶剂，将上述用于制备质控样品的马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液和柳胺酚工作液加入到溶剂中进行稀释，获得回收率和基质效应实验纯溶液。为了方便标示，以下采用neat溶液来表示回收率和基质效应实验纯溶液。在neat溶液中，马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素和柳胺酚的浓度如下表3所示。
表3：neat溶液中，马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素和柳胺酚的浓度
Figure BDA0002868139270000052
六、检测分析样品
在96孔板上做出多个样品标示，向各个样品孔内加入对应的样品；在96孔板上相应的样品中加入柳胺酚工作液或HPLC甲醇；对各个样品进行封板、涡旋离心，并分别提取上清液；对各上清液进行稀释，分别取样分析。具体步骤如下：
S1：在96孔板上分别标注各样品名称如下：校正标准品、质控样品、BK样品、QC0样品、溶剂样品、基质效应样品、回收率样品以及neat样品。其中，校正标准品孔中加入30μL校正标准品；质控样品孔中加入30μL质控样品；BK样品孔中加入30μL空白血浆，该空白血浆中既不含有内标，也不含有待分析的马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素；QC0样品孔中加入30μL空白血浆，该空白血浆中包含内标，但不包含马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素这些化合物；溶剂样品孔中加入30μL水；基质效应样品孔中加入30μL基质效应样品；回收率样品孔中加入30μL回收率样品；neat样品孔中加入30μL水或HPLC甲醇。上述多种校正标准品和多种质控样品，可以分别放入不同的孔内，并做好标示后，同时进行检测。各样品使用前先经过涡旋处理，如果样品需要融化，可以现在室温下融化后在涡旋。
S2：向校正标准品和质控样品中分别加入270μL内标工作液(也即柳胺酚工作液)；向BK样品、QC0样品、溶剂样品、基质效应样品、回收率样品以及neat样品中分别加入270μLHPLC甲醇。
S3：对所有的样品封板，在10℃，4000rpm的条件下对各样品进行分离10min，使各样品涡旋混匀。
S4：对校正标准品、质控样品、BK样品、QC0样品和溶剂样品，取离心后的上清液各100μL至96孔板中(做好相应标示)，然后向各样品中加入300μLHPLC甲醇进行稀释；
对基质效应样品、回收率样品和neat样品，取离心后的上清液各100μL至96孔板中(同样做好相应标示)，然后向各样品中加入300μL neat溶液以进行稀释。基质效应样品至少设置6个批次，回收率样品可以设置多个批次，若基质效应样品和回收率样品中，马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素的浓度高，则采用neat溶液1加入基质效应样品和回收率样品中；若基质效应样品和回收率样品中，马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素的浓度低，则采用neat溶液2加入基质效应样品和回收率样品中。
S5：对S4中获得的各样品进行封板、低速涡旋混匀，然后各取3.0μL进样分析。
具体的液相色谱参数如下：
进样量3.0μL；
色谱柱：Inertstain AQ-C18 2.1*50mm，5μm，柱温为35℃；
流动相：包括流动相A和流动相B，所述流动相A为：乙酸体积分数为0.1％的乙酸水溶液，所述流动相B为：乙醇和乙腈的体积比为70％：30％的乙醇乙腈；流动相梯度洗脱条件为：第0.01～0.1min，所述流动相B的体积分数为52％；第1.5min，所述流动相B的体积分数为88％；第1.9min，所述流动相B的体积分数为95％；第2.3～2.8min，所述流动相B的体积分数为100％；第2.81～3.1min，所述流动相B的体积分数为20％；第3.11～3.60min，所述流动相B的体积分数为100％；第3.61～4.80min，所述流动相B的体积分数为52％。
质谱条件：采用电喷雾离子原，正离子检测，选择多反应监测工作方式进行一/二级质谱分析，质谱检测工作参数如下：马索亚内酯的母离子/特征子离子的检测离子对为169.2/123.2，五味子醇甲的母离子/特征子离子的检测离子对为433.1/415.1，五味子乙素的母离子/特征子离子的检测离子对为401.1/300.2，柳胺酚的母离子/特征子离子的检测离子对为230.2/121.2。雾化气体、干燥气体均为氮气。
七、回归和数据处理
采用线性回归模型：y＝ax+b，权重因子：1/x2，其中，y是指分析物(马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素)与内标的峰面积比，x是指校正标准品中分析物的浓度。各分析物的校正曲线范围均为10.0～10000ng/mL。
八、结果
通过上述方法检测出，各成分的回收率和基质效应如下：
回收率：马索亚内酯，50～65％；五味子甲醇，84～87％；五味子乙素，82～90％。
基质效应：马索亚内酯，92～100％；五味子甲醇，92～96％；五味子乙素，93～100％。
本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (5)

1.一种测定血浆中马索亚内酯、五味子醇甲和五味子乙素浓度的方法，其特征在于，所述方法中采用柳胺酚作为内标，所述方法包括以下步骤：
制备储备液：将马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素和柳胺酚分别溶于HPLC甲醇中，获得到马索亚内酯储备液、五味子醇甲储备液、五味子乙素储备液和柳胺酚储备液；
制备工作液：采用HPLC甲醇和水作为溶剂，将所述马索亚内酯储备液、五味子醇甲储备液、五味子乙素储备液分别稀释，获得马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液；采用HPLC甲醇作为溶剂，将所述柳胺酚储备液稀释成柳胺酚工作液，所述柳胺酚工作液中柳胺酚的浓度为50ng/mL；
制备校正标准品：将所述马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液加入到同一空白血浆中，获得校正标准品；
制备质控样品：将所述马索亚内酯工作液、五味子醇甲工作液、五味子乙素工作液加入到同一空白血浆中，获得质控样品；
检测分析样品：在96孔板上做出多个样品标示，向各个样品孔内加入对应的样品；在96孔板上相应的样品中加入柳胺酚工作液或HPLC甲醇；对各个样品进行封板、涡旋离心，并分别提取上清液；对各上清液进行稀释，分别取样分析；
所述方法中，液相色谱参数如下：
色谱柱：Inertstain AQ-C18 2.1*50mm，5μm，柱温为35℃；
流动相：包括流动相A和流动相B，所述流动相A为：乙酸体积分数为0.1%的乙酸水溶液，所述流动相B为：乙醇和乙腈的体积比为70%：30%的乙醇乙腈；
流动相梯度洗脱条件为：第0.01~0.1min，所述流动相B的体积分数为52%；第1.5min，所述流动相B的体积分数为88%；第1.9min，所述流动相B的体积分数为95%；第2.3~2.8min，所述流动相B的体积分数为100%；第2.81~3.1min，所述流动相B的体积分数为20%；第3.11~3.60min，所述流动相B的体积分数为100%；第3.61~4.80min，所述流动相B的体积分数为52%；
质谱条件：采用电喷雾离子源 ，正离子检测，选择多反应监测工作方式进行一/二级质谱分析，质谱检测工作参数如下：马索亚内酯的母离子/特征子离子的检测离子对为169.2/123.2，五味子醇甲的母离子/特征子离子的检测离子对为433.1/415.1，五味子乙素的母离子/特征子离子的检测离子对为401.1/300.2，柳胺酚的母离子/特征子离子的检测离子对为230.2/121.2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述空白血浆为比格犬血浆。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述马索亚内酯储备液、五味子醇甲储备液、五味子乙素储备液中，马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素的浓度分别介于200~200000ng/mL之间。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质控样品中，所述马索亚内酯、五味子甲醇、五味子乙素的浓度分别介于10.0~7500ng/mL之间。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述校正标准品中，所述马索亚内酯、五味子醇甲、五味子乙素的浓度分别介于10.0~10000ng/mL之间。
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