CN113189210B - 测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的hplc-ms/ms方法 - Google Patents

测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的hplc-ms/ms方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC‑MS/MS方法，包括以下步骤：储备液的制备；将各储备液稀释成苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液和柳胺酚工作液；校正标准品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；控样品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；样品的检测分析。本发明所述的方法，具有快捷性、灵敏度高、精密度和准确度良好、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应的优点。

Description

测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC-MS/MS方法
技术领域
本发明涉及了临床血药浓度监测控制技术领域，具体的是一种测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC-MS/MS方法。
背景技术
肝纤维化是肝病中的一种。人体患有肝纤维化后，容易出现疲乏无力、食欲减退等症状，可能还会出现慢性消化不良、出血等症状，这些症状会给人体造成很大伤害。
扶正化瘀片是常用的治疗肝纤维化的中成药之一，其主要成分包括：五味子醇甲(Schisandrin)、五味子乙素(γ-Schisandrin)、马索亚内酯(Massoia Lactone)、丹参素钠(Sodium Danshensu)、野黑樱苷(Prunasin)、苦杏仁苷(Amygdalin)、柚皮素(Naringenin)、槲皮素(Quercetin)、芦丁(Rutin)、商陆苷(Ombuoside)及其代谢产物商陆素(Ombuin)、槲皮苷(Quercitrin)、山奈酚(Kaempferol)、葵烯酸钠(Sodium 5-Hydroxy-2-Decenoic)。检测比格犬(Beagle犬)血浆中扶正化瘀片的毒代动力学特征，评估药物主要成分在比格犬体内的暴露水平，对于帮助了解药物在人体内的作用效果具有重要意义。因此，本领域技术人员持续致力于研究测定血浆中扶正化瘀片主要成分浓度的HPLC-MS/MS方法。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明实施例提供了一种测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC-MS/MS方法，其检测时间短、灵敏度高、定量准确。
本申请实施例公开了：一种测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC-MS/MS方法，所述方法中采用柳胺酚作为内标，所述方法包括以下步骤：
储备液的制备：用HPLC甲醇作为溶剂，配置得到苦杏仁苷储备液、柚皮素储备液、槲皮素储备液以及柳胺酚储备液；
工作液的制备：用HPLC甲醇和水作为溶剂，将所述苦杏仁苷储备液、柚皮素储备液、槲皮素储备液分别配置，获得苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液；用HPLC甲醇作为溶剂，将所述柳胺酚储备液制备成柳胺酚工作液，所述柳胺酚工作液中的柳胺酚浓度为50ng/mL；
校正标准品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；
质控样品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；
样品的检测分析：取96孔板，在所述96孔板上做标示，并向各个样品孔内加入对应的样品；向对应的样品中相应地加入柳胺酚工作液或HPLC甲醇以进行蛋白沉淀；对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用，并分别提取上清液；将各上清液进行稀释，然后进样分析。
具体的，所述方法中，液相色谱参数如下：
色谱柱：Inertstain AQ-C18 2.1*50mm，5μm，柱温为40℃；
流动相：所述流动相的体积为500μL，包括流动相A和流动相B，所述流动相A为：乙酸体积分数为0.2％的乙酸水溶液，所述流动相B为：乙酸体积分数为0.2％的乙酸甲醇溶液；
质谱条件：采用电喷雾离子原，负离子检测，选择多反应监测工作方式进行一/二级质谱分析，质谱检测工作参数如下：苦杏仁苷的母离子/特征子离子的检测离子对为456.2/323.1，柚皮素的母离子/特征子离子的检测离子对为271.1/151.2，槲皮素的母离子/特征子离子的检测离子对为301.1/151.1，柳胺酚的母离子/特征子离子的检测离子对为228.1/210.0。
具体的，流动相梯度洗脱条件为：第0.01～0.1min，所述流动相A的体积分数为85％；第0.5min，所述流动相A的体积分数为60％；第1min，所述流动相A的体积分数为20％；第2～3min，所述流动相A的体积分数为0；第3.01～3.40min，所述流动相A的体积分数为50％；第3.41～4.50min，所述流动相A的体积分数为0；第4.51～5.80min，所述流动相A的体积分数为85％。
具体的，所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液中，苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素的浓度分别介于100ng/mL～100000ng/mL之间。
具体的，所述校正标准品中，所述苦杏仁苷、柚皮素和槲皮素的浓度分别介于5.0～5000ng/mL之间。
具体的，所述质控样品中，所述苦杏仁苷、柚皮素和槲皮素的浓度分别介于5.0～3750ng/mL之间。
具体的，对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用的条件包括：在10℃，4000rpm条件下离心10min。
具体的，所述空白血浆为比格犬血浆。
本发明至少具有如下有益效果：本方法具有快捷性、灵敏度高、精密度和准确度良好、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应的优点。
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中所述溶剂样品中苦杏仁苷的质谱图；
图2是本发明实施例中所述溶剂样品中柚皮素的质谱图；
图3是本发明实施例中所述溶剂样品中槲皮素的质谱图；
图4是本发明实施例中所述第二空白样品中苦杏仁苷的质谱图；
图5是本发明实施例中所述第二空白样品中柚皮素的质谱图；
图6是本发明实施例中所述第二空白样品中槲皮素的质谱图；
图7是本发明实施例中所述第一空白样品中苦杏仁苷的质谱图；
图8是本发明实施例中所述第一空白样品中柚皮素的质谱图；
图9是本发明实施例中所述第一空白样品中槲皮素的质谱图
图10是本发明实施例中所述质控样品5中苦杏仁苷的质谱图；
图11是本发明实施例中所述质控样品5中柚皮素的质谱图；
图12是本发明实施例中所述质控样品5中槲皮素的质谱图
图13是本发明实施例中残留效应中苦杏仁苷的质谱图；
图14是本发明实施例中残留效应中柚皮素的质谱图；
图15是本发明实施例中残留效应中槲皮素的质谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例的仪器如下：
Shimadzu LC-30AD高效液相色谱仪
自动进样器，自动进样器的温度采用15℃
柱温箱
试药：苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素、柳胺酚、HPLC甲醇、去离子化纯净水、分析纯级乙酸
一、储备液的制备：
用HPLC甲醇作为溶剂，配置得到苦杏仁苷储备液、柚皮素储备液、槲皮素储备液以及柳胺酚储备液。四种储备液中，对应化合物的浓度均为1.00mg/mL。
二、工作液的制备：
用HPLC甲醇和水作为溶剂，将上述苦杏仁苷储备液、柚皮素储备液、槲皮素储备液分别稀释配置得到苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液。用HPLC甲醇作为溶剂，将上述柳胺酚储备液稀释制备成柳胺酚工作液，柳胺酚工作液中，柳胺酚的浓度为50ng/mL。在苦杏仁苷储备液、柚皮素储备液、槲皮素储备液的稀释过程中，用作溶剂的HPLC甲醇和水的体积比均为90:10。苦杏仁苷工作液中，苦杏仁苷的浓度介于100ng/mL～100000ng/mL之间；柚皮素工作液中，柚皮素的浓度介于100ng/mL～100000ng/mL之间；槲皮素工作液中，槲皮素的浓度均介于100ng/mL～100000ng/mL之间。具体来说，用于制备校正标准品的苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液和槲皮素工作液，分别具有以下多种浓度：100ng/mL、200ng/mL、800ng/mL、8000ng/mL、20000ng/mL、80000ng/mL和100000ng/mL；用于制备质控样品的苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液和槲皮素工作液，分别具有以下多种浓度：100ng/mL、300ng/mL、3000ng/mL、50000ng/mL、75000ng/mL。
三、校正标准品的制备
取空白的比格犬血浆(血浆中的抗凝剂为肝素钠)，将上述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到空白的比格犬血浆中，获得校正标准品。具体来说，将苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入同一空白的比格犬血浆中，所获得的校正标准品中，苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素的浓度介于5.0～5000ng/mL之间，更具体来说，具有如下表1中的多种浓度。
表1：校正标准品中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素的浓度
校正标准品编号 苦杏仁苷浓度(ng/mL) 柚皮素浓度(ng/mL) 槲皮素浓度(ng/mL)
校正标准品1 5.00 5.00 5.00
校正标准品2 10.0 10.0 10.0
校正标准品3 40.0 40.0 40.0
校正标准品4 400 400 400
校正标准品5 1000 1000 1000
校正标准品6 4000 4000 4000
校正标准品7 5000 5000 5000
四、质控样品的制备
取空白的比格犬血浆，将上述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到空白的比格犬血浆中，获得质控样品。具体来说，将苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入同一空白的比格犬血浆中，所获得的质控样品中，苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素的浓度介于5.0～3750ng/mL之间，更具体来说，具有如下表2中的多种浓度。
表2：质控样品中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素的浓度
质控样品编号 苦杏仁苷浓度(ng/mL) 柚皮素浓度(ng/mL) 槲皮素浓度(ng/mL)
质控样品1 5.00 5.00 5.00
质控样品2 15.0 15.0 15.0
质控样品3 150 150 150
质控样品4 2500 2500 2500
质控样品5 3750 3750 3750
五、回收率和基质效应实验纯溶液的制备
用HPLC甲醇和水作为溶剂(HPLC甲醇和水的体积比为50:50)，将上述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液和柳胺酚工作液加入溶剂中稀释配置，获得回收率和基质效应实验纯溶液(以下简称neat溶液)。具体来说，neat溶液中，苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素和柳胺酚的浓度如下表3中所示。
表3：neat溶液中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素和柳胺酚的浓度
Figure BDA0002869517720000051
六、样品的检测分析
在该过程中，取96孔板，在所述96孔板上做标示，并向各个样品孔内加入对应的样品；向对应的样品中相应地加入柳胺酚工作液或HPLC甲醇以进行蛋白沉淀；对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用，并分别提取上清液；将各上清液进行稀释，然后进样分析。具体来说，包括以下步骤：
S1：取96孔板，在96孔板的孔上分别标注各样品名称如下：校正标准品、质控样品、第一空白样品、第二空白样品、溶剂样品、基质效应样品、回收率样品以及neat样品。其中，校正标准品孔中加入30μL校正标准品；质控样品孔中加入30μL质控样品；第一空白样品孔中加入30μL空白血浆，该空白血浆中含有柳胺酚(内标)，而不含有苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素(分析物)；第二空白样品孔中加入30μL空白血浆，该空白血浆中既不含柳胺酚，也不含苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素；溶剂样品孔中加入30μL水；基质效应样品孔中加入30μL基质效应样品；回收率样品孔中加入30μL回收率样品；neat样品孔中加入30μL水或HPLC甲醇。需要说明的是，上述多种校正标准品和多种质控样品，可以分别放入不同的孔内，并做好标示后，同时进行检测。向各个相应的孔内加入样品前，各样品先经过涡旋处理，如果样品需要融化，可以现在室温下融化后在涡旋。
S2：向校正标准品和质控样品中分别加入270μL柳胺酚工作液；向第一空白样品、第二空白样品、溶剂样品、基质效应样品、回收率样品以及neat样品中分别加入270μLHPLC甲醇。
S3：对所有的样品封板，在10℃，4000rpm的条件下对各样品进行分离10min，使各样品涡旋混匀。
S4：对校正标准品、质控样品、第一空白样品、第二空白样品和溶剂样品，取离心后的上清液各150μL至96孔板中(做好相应标示)，并分别向各上清液中加入100μLHPLC甲醇；对基质效应样品、回收率样品和neat样品，取离心后的上清液各150μL至96孔板中(同样做好相应标示)，并分别向各个上清液中同时加入50μL neat溶液和50μLHPLC甲醇。需要说明的是，基质效应样品至少设置6个批次，回收率样品可以设置多个批次，若基质效应样品和回收率样品中，苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素的浓度高，则采用neat溶液1加入基质效应样品和回收率样品中；若基质效应样品和回收率样品中，苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素的浓度低，则采用neat溶液2加入基质效应样品和回收率样品中。
S5：对S4中获得的各样品进行封板、低速涡旋混匀，然后各取1.0μL进样分析。
具体的液相色谱参数如下：
进样量1.0μL；
色谱柱：Inertstain AQ-C18 2.1*50mm，5μm，柱温为40℃；
流动相：流动相的体积为500μL，包括流动相A和流动相B，所述流动相A为：乙酸体积分数为0.2％的乙酸水溶液，所述流动相B为：乙酸体积分数为0.2％的乙酸甲醇溶液；流动相梯度洗脱条件为：第0.01～0.1min，所述流动相A的体积分数为85％；第0.5min，所述流动相A的体积分数为60％；第1min，所述流动相A的体积分数为20％；第2～3min，所述流动相A的体积分数为0；第3.01～3.4min，所述流动相A的体积分数为50％；第3.41～4.50min，所述流动相A的体积分数为0；第4.51～5.80min，所述流动相A的体积分数为85％。
质谱条件：采用电喷雾离子原(ESI)，负离子检测，选择多反应监测工作方式进行一/二级质谱分析，质谱检测工作参数如下：苦杏仁苷的母离子/特征子离子的检测离子对为456.2/323.1，柚皮素的母离子/特征子离子的检测离子对为271.1/151.2，槲皮素的母离子/特征子离子的检测离子对为301.1/151.1，柳胺酚的母离子/特征子离子的检测离子对为228.1/210.0。雾化气体、干燥气体均为氮气。
七、回归和数据处理
采用线性回归模型：y＝ax+b，权重因子：1/x2，其中，y是指分析物(苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素)与内标(柳胺酚)的峰面积比，x是指校正标准品中分析物的浓度。各分析物的校正曲线范围均为5.00～5000ng/mL。
八、结果
通过上述方法检测出，各成分的回收率和基质效应如下：
回收率：苦杏仁苷，100％；柚皮素，81％～84％；槲皮素，120％～140％。
基质效应：苦杏仁苷，65％～73％；柚皮素，120％～125％；槲皮素，100％～120％。
本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (6)

1.一种测定血浆中苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素浓度的HPLC-MS/MS方法，其特征在于，所述方法中采用柳胺酚作为内标，所述方法包括以下步骤：
储备液的制备：用HPLC甲醇作为溶剂，配置得到苦杏仁苷储备液、柚皮素储备液、槲皮素储备液以及柳胺酚储备液；
工作液的制备：用HPLC甲醇和水作为溶剂，将所述苦杏仁苷储备液、柚皮素储备液、槲皮素储备液分别配置，获得苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液；用HPLC甲醇作为溶剂，将所述柳胺酚储备液制备成柳胺酚工作液，所述柳胺酚工作液中的柳胺酚浓度为50ng/mL；
校正标准品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；
质控样品的制备：取空白血浆，将所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；
样品的检测分析：取96孔板，在所述96孔板上做标示，并向各个样品孔内加入对应的样品；向对应的样品中相应地加入柳胺酚工作液或HPLC甲醇以进行蛋白沉淀；对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用，并分别提取上清液；将各上清液进行稀释，然后进样分析；
所述方法中，液相色谱参数如下：
色谱柱：Inertstain AQ-C182.1*50mm，5μm，柱温为40℃；
流动相：所述流动相的体积为500μL，包括流动相A和流动相B，所述流动相A为：乙酸体积分数为0.2％的乙酸水溶液，所述流动相B为：乙酸体积分数为0.2％的乙酸甲醇溶液；
流动相梯度洗脱条件为：第0.01～0.1min，所述流动相A的体积分数为85％；第0.5min，所述流动相A的体积分数为60％；第1min，所述流动相A的体积分数为20％；第2～3min，所述流动相A的体积分数为0；第3.01～3.40min，所述流动相A的体积分数为50％；第3.41～4.50min，所述流动相A的体积分数为0；第4.51～5.80min，所述流动相A的体积分数为85％；
质谱条件：采用电喷雾离子源，负离子检测，选择多反应监测工作方式进行一/二级质谱分析，质谱检测工作参数如下：苦杏仁苷的母离子/特征子离子的检测离子对为456.2/323.1，柚皮素的母离子/特征子离子的检测离子对为271.1/151.2，槲皮素的母离子/特征子离子的检测离子对为301.1/151.1，柳胺酚的母离子/特征子离子的检测离子对为228.1/210.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苦杏仁苷工作液、柚皮素工作液、槲皮素工作液中，苦杏仁苷、柚皮素、槲皮素的浓度分别介于100ng/mL～100000ng/mL之间。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述校正标准品中，所述苦杏仁苷、柚皮素和槲皮素的浓度分别介于5.0～5000ng/mL之间。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质控样品中，所述苦杏仁苷、柚皮素和槲皮素的浓度分别介于5.0～3750ng/mL之间。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用的条件包括：在10℃，4000rpm条件下离心10min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述空白血浆为比格犬血浆。
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