CN111208219A - 测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的hplc-ms/ms方法 - Google Patents

测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的hplc-ms/ms方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC‑MS/MS方法，包括：储备液的制备；将储备液稀释成硫酸氢氯吡格雷工作液、CCAM工作液和内标工作液；正标准品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；质控样品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；样品的检测分析。本发明所提供的方法，具有提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应、快捷性、灵敏度高、精密度和准确度良好等优点。

Description

测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC-MS/MS 方法
技术领域
本发明涉及了临床血药浓度监测控制技术领域，具体的是一种测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC-MS/MS方法。
背景技术
氯吡格雷，可用于预防和治疗因血小板高聚集引起的心、脑及其他动脉循环障碍疾病，如近期发作的脑卒中、心肌梗死和确诊的外周动脉疾病。为了保证药物进入人体后能达到有效的治疗浓度和避免不良反应，临床上通常需要监测药物浓度，结合病人病情等个体化给药剂量的调整，以提高药物疗效，减少毒副反应的发生。因此，采用准确、灵敏、快速的定量分析方法测定氯吡格雷及其非活性代谢物(Clopidogrel Impurity1，简称CCAM)在血浆中的浓度十分必要。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明实施例提供了一种测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC-MS/MS方法，其具有灵敏度高、定量准确、检测时间短等优点。
本申请实施例公开了：一种测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC-MS/MS方法，所述方法中采用氯雷他定和卡马西平-d8作为内标，所述方法包括以下步骤：
储备液的制备：用HPLC甲醇作为溶剂，分别将硫酸氢氯吡格雷、CCAM和氯雷他定加入HPLC甲醇中，配置得到硫酸氢氯吡格雷储备液、CCAM储备液以及氯雷他定储备液；
工作液的制备：用HPLC甲醇和水作为溶剂，将所述硫酸氢氯吡格雷储备液和所述CCAM储备液分别稀释，获得硫酸氢氯吡格雷工作液、CCAM工作液；用乙腈作为溶剂，将所述氯雷他定储备液和卡马西平-d8加入所述乙腈溶剂中，获得内标工作液；
校正标准品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；
质控样品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；
样品的检测分析：取96孔板，在所述96孔板上做标示，并向各个样品孔内加入对应的样品；向对应的样品中相应地加入内标工作液或乙腈以进行蛋白沉淀；对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用，并分别提取上清液；在30℃下采用氮气将各上清液吹干，再向各上清液中加入复溶液；封板、涡旋均匀，然后进样分析。
具体的，所述复溶液为乙腈体积分数为25％的乙腈水溶液。
具体的，所述氯雷他定的浓度为20ng/mL，所述卡马西平-d8的浓度为4ng/mL。
具体的，所述方法中，液相色谱参数如下：
色谱柱：Xbridge C18 2.1*50mm，3.5μm，柱温为35℃；
流动相：包括流动相A和流动相B，所述流动相A为：甲酸体积分数为0.1％的甲酸水溶液，所述流动相B为：甲酸体积分数为0.1％的甲酸乙腈溶液；
质谱条件：采用电喷雾离子原，正离子检测，选择多反应监测工作方式进行一/二级质谱分析，质谱检测工作参数如下：硫酸氢氯吡格雷的母离子/特征子离子的检测离子对为322.1/212.2，CCAM的母离子/特征子离子的检测离子对为308.2/198.2，氯雷他定的母离子/特征子离子的检测离子对为383.2/337.1，卡马西平-d8的母离子/特征子离子的检测离子对为237.1/194.1。
具体的，流动相梯度洗脱条件为：第0.01～0.2min，所述流动相A的体积分数为80％；第0.8～1.00min，所述流动相A的体积分数为40％；第1.80～2.50min，所述流动相A的体积分数为0％；第2.51～2.70min，所述流动相A的体积分数为80％；第2.71～3.30～min，所述流动相A的体积分数为0％；第3.31～4.60min，所述流动相A的体积分数为80％。
具体的，对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用的条件包括：在10℃，4000rpm条件下离心15min。
具体的，所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液中，所述硫酸氢氯吡格雷和所述CCAM的浓度分别介于20～20000ng/mL之间。
具体的，所述校正标准品中，所述硫酸氢氯吡格雷和所述CCAM的浓度分别介于1.00～1000ng/mL之间。
具体的，所述质控样品中，硫酸氢氯吡格雷和所述CCAM的浓度分别介于1～750ng/mL之间。
具体的，所述空白血浆为食蟹猴血浆。
本发明至少具有如下有益效果：本方法具有提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应、快捷性、灵敏度高、精密度和准确度良好等优点。
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中溶剂样品中硫酸氢氯吡格雷的质谱图；
图2是本发明实施例中BK样品中硫酸氢氯吡格雷的质谱图；
图3是本发明实施例中QC0样品中硫酸氢氯吡格雷的质谱图；
图4是本发明实施例中残留效应中硫酸氢氯吡格雷的质谱图；
图5是本发明实施例中质控样品5中硫酸氢氯吡格雷的质谱图；
图6是本发明实施例中溶剂样品中CCAM的质谱图；
图7是本发明实施例中BK样品中CCAM的质谱图；
图8是本发明实施例中QC0样品中CCAM的质谱图；
图9是本发明实施例中残留效应中CCAM的质谱图；
图10是本发明实施例中质控样品5中CCAM的质谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例的仪器如下：
Shimadzu LC-30AD高效液相色谱仪
自动进样器，自动进样器的温度采用10℃
柱温箱
试药：硫酸氢氯吡格雷、氯吡格雷非活性代谢物(Clopidogrel Impurity1，以下简称CCAM)、氯雷他定、卡马西平-d8、HPLC甲醇、去离子化纯净水、分析纯级乙腈
一、储备液的制备
用HPLC甲醇作为溶剂，分别将硫酸氢氯吡格雷、CCAM和氯雷他定加入HPLC甲醇中，配置得到硫酸氢氯吡格雷储备液、CCAM储备液以及氯雷他定储备液。上述三种储备液中，相应的化合物的浓度均为1.00mg/mL。
二、工作液的制备：
用纯乙腈作为溶剂，将上述氯雷他定储备液和卡马西平-d8分别配置，获得内标工作液，在该内标工作液中，氯雷他定的浓度为20.0ng/mL，卡马西平-d8的浓度为4.00ng/mL。采用HPLC甲醇和水作为溶剂，将上述硫酸氢氯吡格雷储备液和CCAM储备液分别通过稀释配置，获得硫酸氢氯吡格雷工作液、CCAM工作液。在硫酸氢氯吡格雷储备液和CCAM储备液的稀释过程中，用作溶剂的HPLC甲醇和水的体积比为90:10。在硫酸氢氯吡格雷工作液中，硫酸氢氯吡格雷的浓度介于20～20000ng/mL之间，在CCAM工作液中，CCAM的浓度介于20～20000ng/mL之间。
进一步的，硫酸氢氯吡格雷工作液和CCAM工作液可以分为用于制备校正标准品的工作液和用于制备质控样品的工作液，两种不同用途的工作液的浓度可以不同。更进一步来说，用于制备校正标准品的硫酸氢氯吡格雷工作液和CCAM工作液可以具有以下多种浓度：20.0ng/mL、40.0ng/mL、160ng/mL、1600ng/mL、4000ng/mL、16000ng/mL、20000ng/mL；用于制备质控样品的硫酸氢氯吡格雷工作液和CCAM工作液可以具有以下多种浓度：20.0ng/mL、60.0ng/mL、600ng/mL、10000ng/mL、15000ng/mL。
三、校正标准品的制备
取空白的食蟹猴血浆，血浆中的抗凝素为EDTA-K2(乙二胺四乙酸二钾)，将上述用于制备校正标准品的硫酸氢氯吡格雷工作液和CCAM工作液加入到空白的食蟹猴血浆中，获得校正标准品。具体来说，将硫酸氢氯吡格雷工作液和CCAM工作液加入同一空白的食蟹猴血浆中以获得的校正标准品，其中，硫酸氢氯吡格雷和CCAM的浓度介于1.00～1000ng/mL之间，更具体来说，具有如下表1中的多种浓度。
表1：校正标准品中硫酸氢氯吡格雷和CCAM的浓度
Figure BDA0002352353920000041
Figure BDA0002352353920000051
四、质控样品的制备
取空白的食蟹猴血浆，将上述用于制备质控样品的硫酸氢氯吡格雷工作液和CCAM工作液加入到空白的食蟹猴血浆中，获得质控样品。进一步的，将硫酸氢氯吡格雷工作液和CCAM工作液加入同一空白的食蟹猴血浆中以获得的质控样品，其中，硫酸氢氯吡格雷和CCAM的浓度介于1.0～750ng/mL之间，更具体来说，具有如下表2中的多种浓度。
表2：质控样品中硫酸氢氯吡格雷和CCAM的浓度
Figure BDA0002352353920000052
五、回收率和基质效应实验纯溶液的制备
用纯乙腈作为溶剂，将上述用于制备质控样品的硫酸氢氯吡格雷工作液、CCAM工作液和内标工作液加入溶剂中进行稀释，获得回收率和基质效应实验纯溶液，为了方便记录，以下采用neat溶液来表示回收率和基质效应实验纯溶液。在neat溶液中，硫酸氢氯吡格雷、CCAM、氯雷他定和卡马西平-d8各化合物的浓度如下表3所示。
表3：neat溶液中硫酸氢氯吡格雷、CCAM、氯雷他定和卡马西平-d8
Figure BDA0002352353920000053
六、样品的检测分析
取96孔板，在所述96孔板上做标示，并向各个样品孔内加入对应的样品；向对应的样品中相应地加入内标工作液或乙腈以进行蛋白沉淀；对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用，并分别提取上清液；在30℃下采用氮气将各上清液吹干，再向各上清液中加入复溶液；封板、涡旋均匀，然后进样分析。该分析过程具体包括如下步骤：
S1：在96孔板上分别标注各样品名称如下：校正标准品、质控样品、BK样品、QC0样品、溶剂样品、基质效应样品、回收率样品以及neat样品。其中，校正标准品孔中加入20μL校正标准品；质控样品孔中加入20μL质控样品；BK样品孔中加入20μL空白血浆，该空白血浆中既不含有内标，也不含有待分析的硫酸氢氯吡格雷和CCAM化合物；QC0样品孔中加入20μL空白血浆，该空白血浆中包含内标，但不包含硫酸氢氯吡格雷和CCAM化合物；溶剂样品孔中加入20μL水；基质效应样品孔中加入20μL基质效应样品；回收率样品孔中加入20μL回收率样品；neat样品孔中加入20μL水或乙腈。上述多种校正标准品和多种质控样品，可以分别放入不同的孔内，并做好标示后，同时进行检测。各样品使用前先经过涡旋处理，如果样品需要融化，可以现在室温下融化后在涡旋。
S2：向校正标准品和质控样品中分别加入280μL内标工作液；向BK样品、QC0样品、溶剂样品、基质效应样品、回收率样品以及neat样品中分别加入280μL乙腈。
S3：对所有的样品封板，在10℃，4000rpm的条件下对各样品进行分离15min，使各样品涡旋混匀。
S4：对校正标准品、质控样品、BK样品、QC0样品和溶剂样品，取离心后的上清液各150μL至96孔板中(做好相应标示)，在30℃的温度下，采用氮气吹干上述上清液(大约30min)，然后向吹干后的各样品中加入300μL复溶液，该复溶液为乙腈体积分数为25％的乙腈水溶液；
对基质效应样品、回收率样品和neat样品，取离心后的上清液各150μL至96孔板中(同样做好相应标示)，在30℃的温度下，采用氮气吹干上述上清液(大约30min)，然后向吹干后的各样品中加入300μL neat溶液以进行复溶。基质效应样品至少设置6个批次，回收率样品可以设置多个批次，若基质效应样品和回收率样品中，硫酸氢氯吡格雷和CCAM的浓度高，则采用neat溶液2加入基质效应样品和回收率样品中；若基质效应样品和回收率样品中，硫酸氢氯吡格雷和CCAM的浓度低，则采用neat溶液1加入基质效应样品和回收率样品中。
S5：对S4中获得的各样品进行封板、低速涡旋混匀，然后各取5.0μL进样分析。
具体的液相色谱参数如下：
进样量5.0μL；
色谱柱：Xbridge C18 2.1*50mm，3.5μm，柱温为35℃；
质谱条件：采用电喷雾离子原(ESI)，正离子检测，选择多反应监测工作方式进行一/二级质谱分析，质谱检测工作参数如下：硫酸氢氯吡格雷的母离子/特征子离子的检测离子对为322.1/212.2，CCAM的母离子/特征子离子的检测离子对为308.2/198.2，氯雷他定的母离子/特征子离子的检测离子对为383.2/337.1，卡马西平-d8的母离子/特征子离子的检测离子对为237.1/194.1。雾化气体、干燥气体均为氮气。
流动相：包括流动相A和流动相B，所述流动相A为：甲酸体积分数为0.1％的甲酸水溶液，所述流动相B为：甲酸体积分数为0.1％的甲酸乙腈溶液。流动相梯度洗脱条件为：第0.01～0.2min，所述流动相A的体积分数为80％；第0.8～1.00min，所述流动相A的体积分数为40％；第1.80～2.50min，所述流动相A的体积分数为0％；第2.51～2.70min，所述流动相A的体积分数为80％；第2.71～3.30～min，所述流动相A的体积分数为0％；第3.31～4.60min，所述流动相A的体积分数为80％。
七、回归和数据处理
采用线性回归模型：y＝ax+b，权重因子：1/x2，其中，y是指分析物(硫酸氢氯吡格雷、CCAM)与内标的峰面积比，x是指校正标准品中分析物的浓度。各分析物的校正曲线范围均为1.00～1000ng/mL。
八、结果
通过上述方法检测出，各成分的回收率和基质效应如下：
回收率：硫酸氢氯吡格雷，70.9％～99.1％；CCAM，78.6％～81.6％。
基质效应：硫酸氢氯吡格雷，93％～109％；CCAM，95％～108％。
本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种测定血浆中氯吡格雷及其非活性代谢物浓度的HPLC-MS/MS方法，其特征在于，所述方法中采用氯雷他定和卡马西平-d8作为内标，所述方法包括以下步骤：
储备液的制备：用HPLC甲醇作为溶剂，分别将硫酸氢氯吡格雷、CCAM和氯雷他定加入HPLC甲醇中，配置得到硫酸氢氯吡格雷储备液、CCAM储备液以及氯雷他定储备液；
工作液的制备：用HPLC甲醇和水作为溶剂，将所述硫酸氢氯吡格雷储备液和所述CCAM储备液分别稀释，获得硫酸氢氯吡格雷工作液、CCAM工作液；用乙腈作为溶剂，将所述氯雷他定储备液和卡马西平-d8加入所述乙腈溶剂中，获得内标工作液；
校正标准品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得校正标准品；
质控样品的制备：取空白血浆，将所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液加入到所述空白血浆中，获得质控样品；
样品的检测分析：取96孔板，在所述96孔板上做标示，并向各个样品孔内加入对应的样品；向对应的样品中相应地加入所述内标工作液或乙腈以进行蛋白沉淀；对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用，并分别提取上清液；在30℃下采用氮气将各上清液吹干，再向各上清液中加入复溶液；封板、涡旋均匀，然后进样分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复溶液为乙腈体积分数为25％的乙腈水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标工作液中，所述氯雷他定的浓度为20ng/mL，所述卡马西平-d8的浓度为4ng/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，液相色谱参数如下：
色谱柱：Xbridge C18 2.1*50mm，3.5μm，柱温为35℃；
流动相：包括流动相A和流动相B，所述流动相A为：甲酸体积分数为0.1％的甲酸水溶液，所述流动相B为：甲酸体积分数为0.1％的甲酸乙腈溶液；
质谱条件：采用电喷雾离子原，正离子检测，选择多反应监测工作方式进行一/二级质谱分析，质谱检测工作参数如下：硫酸氢氯吡格雷的母离子/特征子离子的检测离子对为322.1/212.2，CCAM的母离子/特征子离子的检测离子对为308.2/198.2，氯雷他定的母离子/特征子离子的检测离子对为383.2/337.1，卡马西平-d8的母离子/特征子离子的检测离子对为237.1/194.1。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，流动相梯度洗脱条件为：第0.01～0.2min，所述流动相A的体积分数为80％；第0.8～1.00min，所述流动相A的体积分数为40％；第1.80～2.50min，所述流动相A的体积分数为0％；第2.51～2.70min，所述流动相A的体积分数为80％；第2.71～3.30～min，所述流动相A的体积分数为0％；第3.31～4.60min，所述流动相A的体积分数为80％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对蛋白沉淀后的各样品进行离心作用的条件包括：在10℃，4000rpm条件下离心15min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸氢氯吡格雷工作液和所述CCAM工作液中，所述硫酸氢氯吡格雷和所述CCAM的浓度分别介于20～20000ng/mL之间。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述校正标准品中，所述硫酸氢氯吡格雷和所述CCAM的浓度分别介于1.00～1000ng/mL之间。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质控样品中，硫酸氢氯吡格雷和所述CCAM的浓度分别介于1～750ng/mL之间。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述空白血浆为食蟹猴血浆。
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