CN115166083B - 一种磷霉素氨丁三醇有关物质的检测方法以及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请适用于药物检测技术领域，提供了一种磷霉素氨丁三醇有关物质的检测方法以及应用，本申请提供的磷霉素氨丁三醇有关物质的检测方法具有如下优势：色谱系统更加稳定，磷霉素与各杂质保留时间较原方法稳定，使得采用相对保留时间对杂质进行定位更加准确；可以改善色谱峰型，使磷霉素与相邻杂质杂质D分离更佳，杂质D可准确检出；杂质B的检出不再受溶剂峰干扰，检出更准确；杂质检出个数多，可有效控制其他杂质(其他未知和已知杂质)；降低氨基柱的流失，色谱柱寿命延长，降低检测成本，利于产业化，增加企业竞争力。

Description

一种磷霉素氨丁三醇有关物质的检测方法以及应用
技术领域
本申请属于药物检测技术领域，尤其涉及一种磷霉素氨丁三醇有关物质的检测方法以及应用。
背景技术
磷霉素氨丁三醇(fosfomycin trometamol)是磷霉素衍生物，以其安全性好、杀菌谱广、尿药浓度高、对细菌耐药选择压力低、与其他抗菌药物无交叉耐药性的优势，且可以降低联用抗生素的肾毒性，是一种值得推荐用于治疗妇女、儿童、老人、成年人急性单纯性下尿路感染及预防外科手术中尿路感染及经尿路诊断手法引起的感染的口服抗菌物。磷霉素氨丁三醇被作为单剂治疗急性单纯性下泌尿道感染的首选药物，在国外广泛应用。
目前磷霉素氨丁三醇原料药质量标准被欧洲药典(EP)、英国药典(BP)、美国药典(USP)、中国药典(ChP)等收载，制剂(散剂)仅中国药典收载，但有关物质项(分析方法及杂质限度)并没有列入散剂标准。
各国药典磷霉素氨丁三醇原料的质量标准中有关物质检测均采用高效液相色谱法，且色谱条件相同：色谱柱为氨丙基键合硅胶柱，流动相为10.89g/L磷酸二氢钾溶液，检测器为示差检测器。该色谱条件可以将杂质A、杂质B和杂质C有效检出，但是由于该色谱条件下因磷霉素色谱峰拖尾严重，磷霉素相邻杂质D被磷霉素包裹而不能被有效分离而不能够被检出，且氨丙基键合硅胶柱在纯水相流动相中极易水解，导致氨基柱的柱效快速下降，导致色谱系统不稳定，各杂质及主成分保留时间在使用过程中逐渐前移，使得采用相对保留时间对杂质定位变的困难，杂质B易被溶剂峰干扰儿导致积分不准确，且色谱柱的寿命极短。
除以上四个已知结构的杂质(杂质A、杂质B、杂质C、杂质D)外，磷霉素氨丁三醇原料药及其制剂中还可能存在其他杂质如杂质E和F以及含磷酸酯警示结构的潜在基因毒杂质。因磷霉素氨丁三醇无紫外吸收，各国药典中收载的有关物质方法检测器均为示差检测器，经过大量文献和专利检索可知，现有技术中虽然有用毛细管电泳、电喷雾离子阱质谱法和核磁共振(NMR)检测磷霉素氨丁三醇有关物质的报道，但是这两种方法因检测仪器设备的可及性问题而通用性差，检测成本高，产业化难度大等问题未被广泛采用。
各国药典方法均采用色谱柱为氨丙基键合硅胶柱，流动相为10.89g/L磷酸二氢钾溶液，检测器为示差检测器的分析系统，鉴于上述杂质是影响药品安全性和有效性的关键质量控制指标，因此，开发一种系统更加稳定、杂质分离度更佳、成本更低的且可准确检出的磷霉素氨丁三醇及其制剂有关物质的检测方法，对其质量控制及产业化具有非常重要的意义。
发明内容
本申请实施例的目的在于提供一种磷霉素氨丁三醇有关物质的检测方法，旨在解决现有的检测磷霉素氨丁三醇有关物质的方法存在通用性差，检测成本高，产业化难度大等问题。
本申请实施例是这样实现的，一种磷霉素氨丁三醇有关物质的检测方法，包括：
在待测试磷霉素氨丁三醇样品中加入磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的混合液进行溶解并稀释处理，得到供试品溶液；
将供试品溶液用磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的混合液进行稀释处理，得到对照溶液；
将待测试磷霉素氨丁三醇样品用氢氧化钠溶液进行浸润以及加热处理后，加入磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的混合液进行溶解并稀释处理，得到系统适用性溶液；
将所述系统适用性溶液、对照溶液和供试品溶液分别注入液相色谱仪，按照色谱条件，进样分析并记录色谱图，以主成分自身对照法计算磷霉素氨丁三醇有关物质的含量；
所述色谱条件包括：以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.02～0.12mol/L；所述乙腈-甲醇溶液中乙腈、甲醇的体积比为(0:100)～(20:80)；所述磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的体积比为(100:0)～(50:50)；流速为0.8ml/min～1.5ml/min；进样量为10μL～80μL；柱温为30℃～40℃，检测器温度为30℃～40℃。
本申请实施例的另一目的在于一种上述的磷霉素氨丁三醇有关物质的检测方法在控制磷霉素氨丁三醇相关药品质量中的应用。
本申请实施例在药典方法的基础上，优化色谱条件，提供了一种HPLC的磷霉素氨丁三醇及其制剂(散剂、和颗粒剂)有关物质控制方法，该方法具有如下优势：1)色谱系统更加稳定，磷霉素与各杂质保留时间较原方法稳定，使得采用相对保留时间对杂质进行定位更加准确；2)可以改善色谱峰型，使磷霉素与相邻杂质杂质D分离更佳，杂质D可准确检出；3)杂质B的检出不再受溶剂峰干扰，检出更准确；4)杂质检出个数多，可有效控制其他杂质(其他未知和已知杂质)；5)降低氨基柱的流失，色谱柱寿命延长，降低检测成本，利于产业化，增加企业竞争力。
附图说明
图1是本申请实施例1提供的色谱图；
图2是本申请实施例2提供的色谱图；
图3是本申请实施例3提供的色谱图；
图4是本申请实施例4提供的色谱图；
图5是本申请实施例5提供的色谱图；
图6是本申请实施例6提供的色谱图；
图7是本申请实施例7提供的色谱图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
当前，现有的检测磷霉素氨丁三醇有关物质的方法均存在以下问题：1)磷霉素相邻杂质(如杂质D和其他杂质)被包裹，不能被有效分离而不能够被检出；2)色谱峰峰型差，易拖尾，且杂质B易被溶剂峰干扰儿导致积分不准确；杂质检出个数少，不能有效控制其他杂质(其他未知和已知杂质)；3)色谱系统不稳定，各杂质及主成分保留时间在使用过程中逐渐前移，使得采用相对保留时间对杂质定位变的困难；4)传统的色谱系统导致氨基色谱柱流失严重，色谱柱柱效下降，色谱系统不稳定，色谱柱寿命极短。
本申请在药典方法的基础上，优化色谱条件，开发一种HPLC的磷霉素氨丁三醇及其制剂(散剂、和颗粒剂)有关物质控制方法，该方法具有如下优势：1)色谱系统更加稳定，磷霉素与各杂质保留时间较原方法稳定，使得采用相对保留时间对杂质进行定位更加准确；2)可以改善色谱峰型，使磷霉素与相邻杂质杂质D分离更佳，杂质D可准确检出；3)杂质B的检出不再受溶剂峰干扰，检出更准确；4)杂质检出个数多，可有效控制其他杂质(其他未知和已知杂质)；5)降低氨基柱的流失，色谱柱寿命延长，降低检测成本，利于产业化，增加企业竞争力。
本申请实施例提供了一种磷霉素氨丁三醇有关物质的检测方法，包括：
在待测试磷霉素氨丁三醇样品中加入磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的混合液进行溶解并稀释处理，得到供试品溶液；
将供试品溶液用磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的混合液进行稀释处理，得到对照溶液；
将待测试磷霉素氨丁三醇样品用氢氧化钠溶液进行浸润以及加热处理后，加入磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的混合液进行溶解并稀释处理，得到系统适用性溶液；
将所述系统适用性溶液、对照溶液和供试品溶液分别注入液相色谱仪，按照色谱条件，进样分析并记录色谱图，以主成分自身对照法计算磷霉素氨丁三醇有关物质的含量。
其中，所述色谱条件包括：以十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为0.02～0.12mol/L；所述乙腈-甲醇溶液中乙腈、甲醇的体积比为(0:100)～(20:80)，优选；(0:100)～(5：95)；所述磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的体积比为(100:0)～(50:50)，优选60：40；0.8ml/min～1.5ml/min；进样量为10μL～80μL；柱温为30℃～40℃，检测器温度为30℃～40℃。
优选地，所述磷酸二氢钾溶液浓度为0.03～0.08mol/L，优选0.03mol/L。
优选地，所述示高效液相色谱仪品牌为岛津或者安捷伦。
优选地，所述色谱柱为AgilentZorbax-NH2，250×4.6mm，5μm。
其中，所述磷霉素氨丁三醇样品为磷霉素氨丁三醇原料药或其制剂。
可选地，所述在待测试磷霉素氨丁三醇样品中加入磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的混合液进行溶解并稀释处理，得到供试品溶液的步骤，包括：
在待测试磷霉素氨丁三醇样品中加入磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的混合液进行溶解并稀释制成每lmL中含磷霉素60mg的溶液，得到供试品溶液。
可选地，所述将供试品溶液用磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的混合液进行稀释处理，得到对照溶液的步骤，包括：
取供试品溶液1mL，用磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的混合液稀释至100mL，摇匀后从中取1mL溶液，再用磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的混合液稀释至100mL，摇匀，得到对照溶液。
可选地，所述将待测试磷霉素氨丁三醇样品用氢氧化钠溶液进行浸润以及加热处理后，加入磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的混合液进行溶解并稀释处理，得到系统适用性溶液的步骤，包括：
取相当于磷霉素3g的待测试磷霉素氨丁三醇样品，用1mol/L氢氧化钠溶液1mL浸润，置75℃烘箱中加热2小时，加入磷酸二氢钾溶液与乙腈-甲醇溶液的混合液进行溶解并稀释制成每1mL中约含磷霉素60mg的溶液，滤过，取续滤液作为系统适用性溶液。
本申请还提供了一种上述的磷霉素氨丁三醇有关物质的检测方法在控制磷霉素氨丁三醇相关药品质量中的应用。
以下给出本申请某些实施方式的实施例，其目的不在于对本申请的范围进行限定。另外，需要说明的是，以下实施例中所给出的数值是尽可能精确。
仪器与试药
仪器：岛津RID-20A高效液相色谱仪；安捷伦1260高效液相色谱仪；梅特勒XS205DU十万分之一电子天平；
试药：磷霉素氨丁三醇、磷霉素氨丁三醇颗粒、磷霉素氨丁三醇散剂；磷酸二氢钾(国药集团化学试剂有限公司)；乙腈、甲醇(Merck)。
实施例1
(1)供试品溶液：取磷霉素氨丁三醇颗粒适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每lmL中约含60mg的溶液。临用新制，作为供试品溶液。
(2)对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(3)系统适用性溶液(此降解溶液中含杂质A、B、C、D)取本品适量(约相当于磷霉素3g)，用1mol/L氢氧化钠溶液1mL浸润，置75℃烘箱中加热2小时，取适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含磷霉素氨丁三醇60mg的溶液，滤过，取续滤液作为系统适用性溶液。
(4)色谱条件：用氨丙基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，所述色谱柱为AgilentZorbax-NH2(250×4.6mm，5μm)；以水相为流动相A，所述水相为磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液浓度为0.08mol/L，乙腈-甲醇为流动相B，所述乙腈-甲醇比例为(0:100)至(20:80)；流动相A与流动相B的体积比为100:0；流速为0.8mL/min；进样量为80μL；柱温为30℃，检测器温度为30℃。等度洗脱。所述液相品牌为安捷伦。
(5)有关物质测定：取步骤(1)、(2)和(3)的供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，按步骤(4)所述色谱条件，进样分析并记录色谱图，以主成分自身对照法计算各杂质的含量。
(6)检测结果：溶剂峰干扰杂质B的检出，杂质B与杂质C、杂质A与磷霉素分离度良好，杂质D被磷霉素拖尾处包裹，如附图1所示；各杂质含量见表1。
实施例2
(1)供试品溶液：取磷霉素氨丁三醇颗粒适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每lmL中约含磷霉素60mg的溶液。临用新制，作为供试品溶液。
(2)对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(3)系统适用性溶液(此降解溶液中含杂质A、B、C、D)取本品适量(约相当于磷霉素3g)，用1mol/L氢氧化钠溶液1mL浸润，置75℃烘箱中加热2小时，取适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含磷霉素氨丁三醇60mg的溶液，滤过，取续滤液作为系统适用性溶液。
(4)色谱条件：用氨丙基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，所述色谱柱为AgilentZorbax-NH2(250×4.6mm，5μm)；以水相为流动相A，所述水相为磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液浓度为0.12mol/L，乙腈-甲醇为流动相B，所述乙腈-甲醇比例为20:80；流动相A与流动相B的体积比为85:15；流速为1.0mL/min；进样量为10μL；柱温为30℃，检测器温度为30℃。等度洗脱。所述液相品牌为安捷伦。
(5)有关物质测定：取步骤(1)、(2)和(3)的供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，按步骤(4)所述色谱条件，进样分析并记录色谱图，以主成分自身对照法计算各杂质的含量。
(6)检测结果：溶剂峰不干扰杂质B的检出，可准确积分，磷霉素主峰峰型变窄，改善拖尾，杂质D与磷霉素峰重合，如附图2；各杂质含量见表1。
实施例3
(1)供试品溶液：取磷霉素氨丁三醇颗粒适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每lmL中约含磷霉素60mg的溶液。临用新制，作为供试品溶液。
(2)对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(3)系统适用性溶液(此降解溶液中含杂质A、B、C、D)取本品适量(约相当于磷霉素3g)，用1mol/L氢氧化钠溶液1mL浸润，置75℃烘箱中加热2小时，取适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含磷霉素氨丁三醇60mg的溶液，滤过，取续滤液作为系统适用性溶液。
(4)色谱条件：用氨丙基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，所述色谱柱为AgilentZorbax-NH2(250×4.6mm，5μm)；以水相为流动相A，所述水相为磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液浓度为0.03mol/L，乙腈-甲醇为流动相B，所述乙腈-甲醇比例为20:80；流动相A与流动相B的体积比为80:20；流速为1.0mL/min；进样量为10μL；柱温为30℃，检测器温度为30℃。等度洗脱。所述液相品牌为岛津。
(5)有关物质测定：取步骤(1)、(2)和(3)的供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，按步骤(4)所述色谱条件，进样分析并记录色谱图，以主成分自身对照法计算各杂质的含量。
(6)检测结果：溶剂峰不干扰杂质B的检出，可准确积分，磷霉素主峰峰型变窄，改善拖尾，杂质D在磷霉素前出峰，与磷霉素表现出分离趋势，如附图3；各杂质含量见表1。
实施例4
(1)供试品溶液：取磷霉素氨丁三醇适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每lmL中约含60mg的溶液。临用新制，作为供试品溶液。
(2)对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(3)系统适用性溶液(此降解溶液中含杂质A、B、C、D)取本品适量(约相当于磷霉素3g)，用1mol/L氢氧化钠溶液1mL浸润，置75℃烘箱中加热2小时，取适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含磷霉素氨丁三醇60mg的溶液，滤过，取续滤液作为系统适用性溶液。
(4)色谱条件：用氨丙基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，所述色谱柱为AgilentZorbax-NH2(250×4.6mm，5μm)；以水相为流动相A，所述水相为磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液浓度为0.03mol/L，乙腈-甲醇为流动相B，所述乙腈-甲醇比例为0:100；流动相A与流动相B的体积比为65:35；流速为0.8mL/min；进样量为10μL；柱温为35℃，检测器温度为35℃。等度洗脱。所述液相品牌为岛津。
(5)有关物质测定：取步骤(1)、(2)和(3)的供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，按步骤(4)所述色谱条件，进样分析并记录色谱图，以主成分自身对照法计算各杂质的含量。
(6)检测结果：有机相比例为30％甲醇(不加乙腈)，杂质D仍然与杂质A重合，但显示出与杂质A分离的趋势，如附图4；各杂质含量见表1。
实施例5
(1)供试品溶液：取磷霉素氨丁三醇适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每lmL中约含60mg的溶液。临用新制，作为供试品溶液。
(2)对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1mL，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(3)系统适用性溶液(此降解溶液中含杂质A、B、C、D)取本品适量(约相当于磷霉素3g)，用1mol/L氢氧化钠溶液1mL浸润，置75℃烘箱中加热2小时，取适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含磷霉素氨丁三醇60mg的溶液，滤过，取续滤液作为系统适用性溶液。
(4)色谱条件：用氨丙基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，所述色谱柱为AgilentZorbax-NH2(250×4.6mm，5μm)；以水相为流动相A，所述水相为磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液浓度为0.03mol/L，乙腈-甲醇为流动相B，所述乙腈-甲醇比例为5:95；流动相A与流动相B的体积比为60:40；流速为1.0mL/min；进样量为10μL；柱温为30℃，检测器温度为30℃。等度洗脱。所述液相品牌为岛津。
(5)有关物质测定：取步骤(1)、(2)和(3)的供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，按步骤(4)所述色谱条件，进样分析并记录色谱图，以主成分自身对照法计算各杂质的含量。
(6)检测结果：溶剂峰不干扰杂质B的检出，可准确积分，，磷霉素主峰峰型变窄，改善拖尾，杂质D(RT16.112min)在主峰前和杂质A(RT18.257min)前出峰，与磷霉素、杂质A均可分离，如附图5；各杂质含量见表1。
实施例6
(1)供试品溶液：取磷霉素氨丁三醇高温60℃5天样品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每lmL中约含60mg的溶液。临用新制，作为供试品溶液。
(2)对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(3)系统适用性溶液(此降解溶液中含杂质A、B、C、D)取本品适量(约相当于磷霉素3g)，用1mol/L氢氧化钠溶液1mL浸润，置75℃烘箱中加热2小时，取适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含磷霉素氨丁三醇60mg的溶液，滤过，取续滤液作为系统适用性溶液。
(4)色谱条件：用氨丙基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，所述色谱柱为AgilentZorbax-NH2(250×4.6mm，5μm)；以水相为流动相A，所述水相为磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液浓度为0.03mol/L，乙腈-甲醇为流动相B，所述乙腈-甲醇比例为0:100；流动相A与流动相B的体积比为60:40；流速为1.0mL/min；进样量为10μL；柱温为40℃，检测器温度为40℃。等度洗脱。所述液相品牌为岛津。
(5)有关物质测定：取步骤(1)、(2)和(3)的供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，按步骤(4)所述色谱条件，进样分析并记录色谱图，以主成分自身对照法计算各杂质的含量。
(6)检测结果：杂质D在杂质A前出峰，峰形较好，与杂质A可分离，如附图6；各杂质含量见表1。
实施例7
(1)供试品溶液：取磷霉素氨丁三醇适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每lmL中约含60mg的溶液。临用新制，作为供试品溶液。
(2)对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(3)系统适用性溶液(此降解溶液中含杂质A、B、C、D)取本品适量(约相当于磷霉素3g)，用1mol/L氢氧化钠溶液1mL浸润，置75℃烘箱中加热2小时，取适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含磷霉素氨丁三醇60mg的溶液，滤过，取续滤液作为系统适用性溶液。
(4)色谱条件：用氨丙基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，所述色谱柱为AgilentZorbax-NH2(250×4.6mm，5μm)；以水相为流动相A，所述水相为磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液浓度为0.03mol/L，乙腈-甲醇为流动相B，所述乙腈-甲醇比例为0:100；流动相A与流动相B的体积比为50:50；流速为1.5mL/min；进样量为10μL；柱温为35℃，检测器温度为30℃。等度洗脱。所述液相品牌为岛津。
(5)有关物质测定：取步骤(1)、(2)和(3)的供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，按步骤(4)所述色谱条件，进样分析并记录色谱图，以主成分自身对照法计算各杂质的含量。
(6)检测结果：杂质D在磷霉素前出峰，甲醇比例增高，杂质A与磷霉素重合，如附图7；各杂质含量见表1。
表1各实施例杂质含量汇总表
Figure BDA0003728253210000131
综上，本申请实现了采用HPLC法测定磷霉素氨丁三醇杂质的含量，克服了杂质B易被溶剂峰干扰导致积分不准确的问题，改善了杂质D与磷霉素分离度不佳问题，杂质检出个数多，可有效控制其他杂质(其他未知和已知杂质)，适用于磷霉素氨丁三醇及其制剂的质量控制。
本申请与现有技术比较，采用了加入甲醇、乙腈的流动相系统，色谱系统更加稳定，磷霉素与各杂质保留时间较原方法稳定，使得采用相对保留时间对杂质进行定位更加准确，降低氨基柱的流失，色谱柱寿命延长，降低检测成本，利于产业化，增加企业竞争力。所述方法具有简单快速、分离情况良好、峰形好、耐用性好、稳定性好等优点。
另外，本申请阐述了杂质D保留时间的变化规律，随着有机相比例从0到50％，保留逐渐减弱，保留位置会出现以下几种情况：
a从磷霉素主峰后逐渐迁移至主峰内；
b主峰与杂质A之间(可能情况：(1)部分包在主峰内；(2)杂质A与主峰间；(3)部分包在A内)；完全包在杂质A内；
在杂质A前(不小于40％有机相时)，图1为0％有机相，图3为20％有机相，图4为30％有机相，图6为40％有机相。
本申请阐述了不同品牌仪器对于杂质检出的影响：采用药典方法(磷酸盐水溶液，不含有机相)，安捷伦仪器会干扰杂质B的积分，影响杂质B含量的准确性，岛津仪器几乎不干扰杂质B的检出。
本申请阐述了本色谱系统下，适当比例的甲醇有利于改善分离，适量比例乙腈有利于改善峰形；磷酸盐浓度由30mm增加到80mm，磷霉素出峰变快，不利于主峰与杂质分离。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种磷霉素氨丁三醇有关物质的检测方法，其特征在于，包括：
(1)供试品溶液：取磷霉素氨丁三醇适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每lmL中含60mg的溶液；临用新制，作为供试品溶液；
(2)对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1mL，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；
(3)系统适用性溶液：取相当于磷霉素3g的待测试磷霉素氨丁三醇样品，用1mol/L氢氧化钠溶液1mL浸润，置75℃烘箱中加热2小时，取适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中含磷霉素氨丁三醇60mg的溶液，滤过，取续滤液作为系统适用性溶液；
(4)色谱条件：用氨丙基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，所述色谱柱为AgilentZorbax-NH2，250×4.6mm，5μm；以水相为流动相A，所述水相为磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液浓度为0.03mol/L，乙腈-甲醇为流动相B，所述乙腈-甲醇比例为5:95；流动相A与流动相B的体积比为60:40；流速为1.0mL/min；进样量为10μL；柱温为30℃，示差检测器RID-20A温度为30℃；等度洗脱；
(5)有关物质测定：取步骤(1)、(2)和(3)的供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液，分别注入岛津RID-20A高效液相色谱仪，按步骤(4)所述色谱条件，进样分析并记录色谱图，以主成分自身对照法计算各杂质的含量。
2.根据权利要求1所述的磷霉素氨丁三醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述磷霉素氨丁三醇样品为磷霉素氨丁三醇原料药或其制剂。
3.一种如权利要求1-2任一所述的磷霉素氨丁三醇有关物质的检测方法在控制磷霉素氨丁三醇相关药品质量中的应用。
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