CN104251896A - 一种半合成紫杉醇的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种半合成紫杉醇的质量控制方法，该方法包括：1)制备溶液：将紫杉醇对照品和紫杉醇样品分别制成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液和供试品溶液；2)紫杉醇含量的测定：用高效液相色谱法对所述供试品溶液进行紫杉醇含量的测定；3)紫杉醇有关物质的测定：用高效液相色谱法对所述供试品溶液进行紫杉醇有关物质的测定；4)评价供试品是否满足质量要求。该方法可控制半合成紫杉醇的质量，解决了原E.P质量标准中保留时间的漂移过大和测量过程中基线波动过大的问题，减少了实验误差，本发明所述方法操作简便，采用的分析方法科学、合理，适用于半合成紫杉醇含量和有关物质的测定。

Description

一种半合成紫杉醇的质量控制方法

技术领域

本发明涉及药物的质量控制技术领域，尤其涉及一种半合成紫杉醇的质量控制方法。

背景技术

紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是具有抗癌活性的天然二萜类化合物，其结构新颖、抗癌机理独特、抗癌效果显著、抗癌谱广，对转移性卵巢癌和乳腺癌具有很好的治疗作用，并且对肺癌、食管癌也有一定疗效，因此紫杉醇被认为是迄今所发现最好的抗癌药物之一，已在40多个国家被批准上市。然而，紫杉醇供应匮乏大大限制了它在临床上的应用。目前，药用紫杉醇的主要来源是从天然红豆杉属植物的树皮中提取分离。但由于该种属植物数量少，生长慢，含量低，且提取难度颇大，从长远考虑根本无法满足日益增长的临床需求。

近年来，紫杉醇化学全合成获得成功，但合成路线复杂，成本过高，故而仅具有研究意义，尚无商业价值。相比较而言，紫杉醇类化学半合成是具有实用价值的一种制备方法，因而显得尤为重要。目前，文献报道了多条半合成紫杉醇的方法，该方法是以红豆杉属植物(以枝叶为主)中提取分离的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-Deacety baccatinⅢ)和巴卡亭Ⅲ(Baccatin-Ⅲ)等紫杉烷类二萜化合物为前体，通过选择性保护羟基，然后在C-13羟基上接上合成的侧链，再去掉保护基团得到紫杉醇，其中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)为前体的半合成紫杉醇已占据紫杉醇销售总量的2/3，其合成紫杉醇的路线如下：

为保证患者用药安全，药品监管部门对半合成紫杉醇的质量要求不断提高，大部分制药企业已通过对合成工艺产生的杂质进行深入研究，将单个未知杂质限度定在0.1％以下。因此，半合成紫杉醇的质量控制显得尤为重要。目前，已有研究者研究了半合成紫杉醇的质量控制方法，如昆明医学院药学院研究人员建立HPLC法同时测定半合成紫杉醇中的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ、7-三氯乙氧羰酰巴卡亭Ⅲ、13-O-[(4S，5R)-2-(4-甲氧基苯基)-N-苯甲酰基-4-苯基-噁唑烷基]-7-三氯乙氧羰酰巴卡亭Ⅲ和紫杉醇的含量(《药物分析杂志》2011年第2期383-386页)。但是运用该质量控制方法在控制紫杉醇质量的过程中并不能有效分离半合成紫杉醇样品的所有相关杂质，而且实验误差较大，并且流动相中添加0.1％的乙酸使基线的波动较大，影响了有关物质的测定。因此，有必要进一步研究更有效的半合成紫杉醇质量控制方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种半合成紫杉醇的质量控制方法，该方法可控制半合成紫杉醇的质量，解决原E.P质量标准中保留时间漂移较大和测量过程中基线波动较大的问题，减少了实验误差，且操作更简便。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种半合成紫杉醇的质量控制方法，包括如下步骤：

1)制备溶液：将紫杉醇对照品和紫杉醇样品分别制成含量为1.0mg/ml的对照品溶液和供试品溶液，备用；

2)紫杉醇含量的测定：用高效液相色谱法对步骤1)所述供试品溶液进行紫杉醇含量的测定；

3)紫杉醇有关物质的测定：用高效液相色谱法对步骤1)所述供试品溶液进行紫杉醇有关物质的测定；

4)评价供试品是否满足质量要求：根据步骤2)和3)的测定结果评价供试品是否满足质量要求。

本发明所述方法满足质量要求的紫杉醇的质量百分数为97.0％～102.0％；有关物质中的杂质及其限度，见表1

表1

优选地，在供试品进行紫杉醇含量测定和紫杉醇有关物质测定之前进行系统适用性测试。

优选地，所述系统适用性溶液为紫杉醇对照品和杂质E、N、H对照品质量比为100:1的浓度为1.0mg/mL的溶液。

所述溶液的溶剂为乙腈、水和冰醋酸的混合液，所述乙腈和水的体积比为80:20，所述冰醋酸的体积为乙腈和水的总体积的0.05％。

步骤3)所述用高效液相色谱法进行紫杉醇含量的测定时进样量为10μL，进行紫杉醇有关物质的测定时进样量为15μL。

步骤3)所述高效液相色谱法中所用的色谱柱为C18小粒径快速分析柱，规格为150*4.60mm，3.0um。

步骤3)所述高效液相色谱法采用流动相梯度洗脱的方式。

步骤3)所述高效液相色谱法的检测条件为：

填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；检测波长为227nm；流动相为乙腈和纯水：0-20min时乙腈的体积百分数为40％，20-60min时乙腈的体积百分数为40％-96％，60-62min时乙腈的体积百分数为96％-40％，62-70min时乙腈的体积百分数为40％。

步骤3)所述高效液相色谱法流动相的流速为1.2mL/min。

步骤3)所述高效液相色谱法柱温为35℃。

步骤3)所述高效液相色谱法测定中理论板数按紫杉醇峰计算应不低于5000。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的方法可控制半合成紫杉醇的质量，实验证明该方法在准确度、精密度、专属性、线性、范围、定量限、耐用性和溶液的稳定性等方面均能达到要求的分析能力，解决了原E.P质量标准中保留时间的漂移过大和测量过程中基线波动较大的问题，减少了实验误差；本发明的方法操作简便，采用的分析方法科学、合理，适用于紫杉醇含量和有关物质的测定。

附图说明

图1是本发明所述紫杉醇对照品高效液相色谱图；

图2是本发明所述紫杉醇对照线性图

图3(a)是本发明所述有关物质系统适用性高效液相色谱图，(b)是(a)的放大图；

图4(a)是本发明所述杂质A、G、L定位的高效液相色谱图，(b)是(a)的放大图；

图5是本发明所述杂质N线性图；

图6是本发明所述杂质H线性图；

图7是本发明所述杂质E线性图；

图8是本发明所述杂质G线性图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

本发明所用的仪器与试剂如下：

高效液相色谱仪：Agilent1260(二极管阵列检测器)

电子天平：梅特勒(型号：XS105du)

试剂：乙腈(色谱纯，Tedia)、纯水(自制)、冰醋酸(分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司)。

对照品：E.P(Eode:Y0000698，含量99.8％)

样品：自制(批号：20140301-1)

实施例1

1、紫杉醇含量的测定和紫杉醇有关物质的测定

1.1高效液相色谱法测定条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，采用C18(150*4.60mm，3.0um)色谱柱，乙腈-纯水为流动相：A相为纯水，B相为乙腈。

梯度条件：

梯度时间(min)	0	20	60	62	70
						B％	40	96	96	40	40

检测波长为227nm，流速1.2mL/min，柱温35℃，理论板数按紫杉醇峰计算应不低于5000，测定紫杉醇含量时进样量为10μL，测定紫杉醇有关物质时进样量为15μL。

1.2高效液相色谱法测定紫杉醇的含量和紫杉醇的有关物质

对照品溶液的制备：精密称取紫杉醇对照品约10mg，加溶剂(乙腈、纯水和冰醋酸的混合溶液，其中乙腈和纯水的体积比为80:20，冰醋酸的体积为乙腈和纯水总体积的0.05％)适量使溶解，定容至10mL，摇匀，制成含紫杉醇含量为1.0mg/ml的溶液，备用。

系统适用性溶液制备：精密称取紫杉醇对照品，杂质E、N、H对照品，分别用溶剂(乙腈、纯水和冰醋酸的混合溶液，其中乙腈和纯水的体积比为80:20，冰醋酸的体积为乙腈和纯水总体积的0.05％)溶解，按照主成分与杂质比例100:1配成浓度约为1.0mg/mL的溶液，摇匀，备用。

系统适用性评价：精密量取系统适用性溶液10μl进样测定，使杂质H峰与紫杉醇峰之间的分离度大于1.5，理论板数以紫杉醇峰计算应不低于5000，拖尾因子不得过2.0。

供试品溶液的制备：精密称取紫杉醇样品约10mg，加溶剂(乙腈、纯水和冰醋酸的混合溶液，其中乙腈和纯水的体积比为80:20，冰醋酸的体积为乙腈和纯水总体积的0.05％)适量使溶解，定容至10mL，摇匀，制成紫杉醇含量为1.0mg/ml的溶液，备用。

测定：用高效液相色谱分别测定供试品溶液中紫杉醇的含量和紫杉醇有关物质，如图1所示为紫杉醇对照品的高效液相色谱图，紫杉醇保留时间在26.5min左右。

2对紫杉醇的含量测定方法进行验证

2.1进样精密度

精密称取紫杉醇对照品约10mg，加溶剂适量使溶解，定容至10mL,制成每1ml中约含紫杉醇1.0mg的溶液，取该溶液连续进样6次，记录峰面积，计算进样精密度，结果见表2。

表2

由表2可见，进样精密度的峰面积的RSD％为0.20，小于1.0，符合要求。

2.2重复性试验

取紫杉醇样品(140301-1批)约10mg，用溶剂溶解并定容至10mL的容量瓶中，制成每1ml中约含紫杉醇1mg的溶液，摇匀，同法配制6份，照紫杉醇含量测定项下的方法，测定每份样品紫杉醇的含量，计算精密度，结果见表3。

表3

由表3可见，重复性的RSD％为0.34，小于2.0，符合要求。

2.3供试品溶液的放置稳定性

精密称取供试品约10mg，用溶剂溶解并定容至10mL容量瓶中，制成浓度为1mg/mL的溶液，摇匀，置室温下放置，分别于0h、2h、6h、12h、24h进样，计算主峰含量的变化程度，结果见表4。

表4

由表4可见，在水溶液状态下紫杉醇的峰面积随着时间的推移变化较小，溶液在24h内稳定性较好。

2.4线性关系

精密称取紫杉醇对照品约20mg，加溶剂适量使溶解，用溶剂定容至10mL,制成浓度约为2.0mg/mL的溶液，作为储备液。精密量取储备液4ml、5ml、6ml、8ml分别置于10ml的容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液3、线性溶液4、线性溶液5和线性溶液6。精密量取5ml线性溶液3置于10ml的量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液1。精密量取6ml线性溶液4置于10ml的量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液2。照紫杉醇含量测定项下的方法操作，以浓度(c)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表5，紫杉醇对照线性如图2所示(线性回归方程为：A＝16411c，r＝0.9997)。

表5

由表5可见，紫杉醇浓度在0.2～1.6mg/mL范围内，有较好的线性，相关系数r＝0.9997。

2.5回收率试验

精密称取供试品(140301-1批)适量，置容量瓶中，分别以限度0.8倍(80％)、限度1.0倍(100％)、限度1.2倍(120％)的量加入紫杉醇对照品，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。各配制3份，照紫杉醇含量测定项下的色谱条件测定紫杉醇的含量，结果见表6。

表6

由表6可见，紫杉醇的平均回收率为99.72％，RSD％为0.02，符合要求。

2.6中间精密度试验

取供试品(140301-1批)，在不同的时间，由不同的实验者，在不同的仪器上，照紫杉醇含量测定项下的方法测定紫杉醇的含量，计算中间精密度，测定结果见表7。

表7

2.7耐用性

取供试品(140301-1批)，分别微调波长、流速及柱温，照紫杉醇含量测定项下的方法测定，考察紫杉醇含量的变化程度，测定结果见表8。

表8

由表8可见，此色谱系统的耐用性良好，但流速的变化对含量的测定有些影响，需要注意不要轻易改动。

3对紫杉醇有关物质的测定方法进行验证

3.1系统适用性试验

精密称取紫杉醇对照品，杂质E、N、H对照品，分别用溶剂溶解，按照主成分与杂质比例100:1配成浓度约为1.0mg/mL的溶液，摇匀，进样。结果见表9。

表9

由表9可见，紫杉醇与杂质H的分离度大于1.5，理论塔板数大于5000，对称因子在0.9～1.1，杂质N、H、E峰面积RSD％小于2.0，保留时间RSD％小于1.0，均符合要求，如图3所示为有关物质系统适应性高效液相色谱图。

3.2溶液稳定性

精密称取供试品约10mg，用溶剂溶解并定容至10mL容量瓶中，制成浓度为1mg/mL的溶液，摇匀，置室温下放置，分别于0h、2h、6h、12h、24h进样，计算主峰、杂质N和杂质E峰面积的变化程度，结果见表10。

表10

由表10可见，在水溶液状态下紫杉醇的峰面积随着时间的推移变化较小，溶液在24h内稳定性较好。

3.3破坏性试验

取本供试品(140301-1批)适量，分别对其进行酸、碱、氧化、光照和高温破坏试验，以考察方法的专属性。

酸破坏：取本供试品约10mg，精密称取，置10mL量瓶中，加5mL溶剂溶解，再加1mol/L盐酸溶液1ml混匀，室温下放置1小时后，加1mol/L氢氧化钠溶液1ml中和，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取15μl进样检测。

碱破坏：取本供试品约10mg，精密称取，置10mL量瓶中，加5mL溶剂溶解，再加0.003mol/L氢氧化钠溶液1ml使溶解，室温下放置5min后，加0.003mol/L盐酸溶液1ml中和，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取15μl进样检测。

氧化破坏：取本供试品约10mg，精密称取，置10mL量瓶中，加5mL溶剂溶解，再加30％过氧化氢1ml使溶解，80℃下放置3h后，加溶剂稀释至刻度，摇匀，精密量取15μl进样检测。

光破坏：取本供试品约10mg，精密称取，置10mL量瓶中，置强光条件下(4500Lx)照射5天后，加溶剂至刻度溶解，摇匀，精密量取15μl进样。

热破坏：取本供试品约10mg，精密称取，置10mL量瓶中，置105℃烘箱放置32小时后取出，放冷，加溶剂至刻度溶解，摇匀，精密量取15μl进样检测。

未破坏：取本供试品约10mg，精密称取，置10mL量瓶中，加溶剂至刻度溶解，摇匀，精密量取15μl进样检测。

精密称取紫杉醇及杂质N、H、E按照100:1制成每1ml中约含1mg的系统适用性溶液。

精密称取紫杉醇及杂质A、G、L按照100:1制成每1ml中约含1mg的杂质定位溶液，结果如图4所示，从图中可以看出杂质A、G、L都能与主峰很好的分离。

精密量取上述溶液和未破坏溶液各15μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算主峰，杂质N、H、E的及其他杂质按面积归一化法计算含量，并计算物料平衡情况。结果见表11。

表11

由表11可见，碱破坏主要在相对保留时间为0.20、0.53和1.23处有降解，产物分别为杂质N、杂质G、杂质E；酸破坏主要在相对保留时间为0.53、1.23和1.35处有降解，产物主要有杂质G和杂质E；氧化破坏主要在相对保留时间0.13、0.48、0.61和1.13处有降解，产物主要有杂质G；高温破坏主要在相对保留时间1.23处有少量降解，产物主要有杂质E，光破坏主要在相对保留时间0.46处有降解产物产生。在上述分析条件下，降解产物与主峰分离良好，没有重叠峰，且物料守恒。

3.4耐用性试验

取本供试品(140301-1批)，分别微调波长、流速及柱温，照紫杉醇有关物质测定项下的方法测定，考察紫杉醇与杂质H的分离度，各杂质的含量变化，测定结果见表12。

表12

由表12可见，此色谱系统的耐用性尚好，但流速的变化对各杂质含量的测定有些影响，需要注意不要轻易改动，波长变化对杂质N的含量测定影响较大。

3.5杂质的线性与相对响应因子

分别精密称取紫杉醇对照品及杂质N、H、E、G的对照品各4mg，分别加溶剂2mL使溶解，制成浓度约为2.0mg/mL的溶液，作为储备液。精密量取紫杉醇储备液0.5ml、0.6ml、0.8ml分别置于1ml的离心管中，加溶剂稀释，摇匀，制成浓度为1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL的溶液，分别作为线性溶液3、线性溶液2和线性溶液1。精密量取0.5ml线性溶液2分别置于1ml的离心管中，加溶剂稀释，摇匀，制成浓度为0.6mg/mL的溶液作为线性溶液4。精密量取0.25ml线性溶液1分别置于1ml的离心管中，加溶剂稀释，摇匀，制成浓度为0.4mg/mL的溶液作为线性溶液5。精密量取0.5ml线性溶液4分别置于1ml的离心管中，加溶剂稀释，摇匀，制成浓度为0.3mg/mL的溶液作为线性溶液6。精密量取0.5ml线性溶液5分别置于1ml的离心管中，加溶剂稀释，摇匀，制成浓度为0.2mg/mL的溶液作为线性溶液7。其他杂质N、H、E、G的配样方法同紫杉醇。将线性溶液7、6、5、4、3、1依次照紫杉醇含量测定项下的方法各进样15uL，以浓度(c)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程及相对响应因子，结果见表13，所得杂质线性图如图5-8。

表13

由表13及图5-8可见，紫杉醇及杂质N、H、E、G的线性较好，杂质N的校正因子超出0.9～1.1，可用加校正因子的主成分自身对照法计算含量。

3.6杂质的定量限与检测限

称取杂质对照品适量，加溶剂适量使溶解，用溶剂分别逐级稀释，精密量取15μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按10:1信噪比计算定量限，按3:1信噪比计算检测限，结果见表14。

表14

由表14可见，紫杉醇的定量限和检测限分别为：2.9ng、0.9ng；杂质N的定量限和检测限分别为：1.9ng、0.6ng；杂质G的定量限和检测限分别为：2.8ng、0.8ng。

4总结：

上述验证说明本发明所述的方法在准确度、精密度、专属性、线性、范围、定量限、耐用性和溶液的稳定性等方面均能达到要求的分析能力，采用的分析方法科学、合理，可以用于紫杉醇含量和有关物质的测定，并且所述方法相比于现有方法更简便、有效，更大限度减少了每次配制流动相的人为误差和由于溶剂挥发所引起的流动相比例变化的误差，也解决了保留时间漂移较大的问题和基线波动较大的问题。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种半合成紫杉醇的质量控制方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备溶液：将紫杉醇对照品和紫杉醇样品分别制成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液和供试品溶液，备用；

2)紫杉醇含量的测定：用高效液相色谱法对步骤1)所述供试品溶液进行紫杉醇含量的测定；

3)紫杉醇有关物质的测定：用高效液相色谱法对步骤1)所述供试品溶液进行紫杉醇有关物质的测定；

4)评价供试品是否满足质量要求：根据步骤2)和3)的测定结果评价供试品是否满足质量要求。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在对所述供试品溶液进行紫杉醇含量测定和紫杉醇有关物质测定之前进行系统适用性测试；

优选地，所述系统适用性溶液为紫杉醇对照品和杂质E、N、H对照品质量比为100:1的浓度为为1.0mg/ml的溶液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述溶液的溶剂为乙腈、水和冰醋酸的混合液，所述乙腈和水的体积比为80:20，所述冰醋酸的体积为乙腈和水的总体积的0.05％。

4.根据权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，步骤3)所述用高效液相色谱法进行紫杉醇含量的测定时进样量为10μL，进行紫杉醇有关物质的测定时进样量为15μL。

5.根据权利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，步骤3)所述高效液相色谱法中所用的色谱柱为C18小粒径快速分析柱，规格为150*4.60mm，3.0um。

6.根据权利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，步骤3)所述高效液相色谱法采用流动相梯度洗脱的方式。

7.根据权利要求1-6之一所述的方法，其特征在于，步骤3)所述高效液相色谱法的检测条件为：

填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；检测波长为227nm；流动相为乙腈和纯水：0-20min时乙腈的体积百分数为40％，20-60min时乙腈的体积百分数为40％-96％，60-62min时乙腈的体积百分数为96％-40％，62-70min时乙腈的体积百分数为40％。

8.根据权利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，步骤3)所述高效液相色谱法流动相的流速为1.2mL/min。

9.根据权利要求1-8之一所述的方法，其特征在于，步骤3)所述高效液相色谱法柱温为35℃。

10.根据权利要求1-9之一所述的方法，其特征在于，步骤3)所述高效液相色谱法测定中理论板数按紫杉醇峰计算应不低于5000。